Bu eser oldu Grants-in-Aid tarafından bilimsel araştırmalara (15 K 07147, 17 K 07419) JSP'ler üzerinden (Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), bir Inamori Vakfı araştırma hibe (HI) ve ortak kullanım/Araştırma Merkezi Program gelişimsel tıp için desteklenen Enstitüsü Moleküler Embriyoloji ve genetik, Kumamoto Üniversitesi (HS için). Biz Dr Azusa Kamikouchi ve Bay Daichi Yamada görüntüleme sistemi kullanarak onların yardım için teşekkür ederiz.

1. larva beyin Explants hazırlanması
<ol><li>Bir görüntüleme odası yapmak. Not: İstikrarlı kayıt beyin explants gergin gerekir. Burada, düşük maliyetli, el yapımı görüntüleme odası görüntüleme sistemi Ca2 + içinde kullanılır.<ol>
<li>Forseps kullanarak, alt bölümünde ortada bulunan bir göçük montaj daha kolay (adım 1.3, Şekil 1) yapma larva beyin ventral sinir düğümü için oluşturmak için bir plastik kültür çanak (35 mm x 10 mm) kaşı.</li>
		<li>Bir kürdan ile yapıştırıcı küçük bir damla çukuru her iki yanına koyun ve bir tungsten çubuk (0,125 mm çap, 6-7 mm uzunluk) tutkal için ekleyebilirsiniz.</li>
		<li>Küçük bir parça macun gibi yeniden kullanılabilir yapıştırıcı kullanarak, yapmak dairesel duvar (10 mm çapında ve 3 mm yüksek) (Şekil 1) dent çevreleyen. Not: Duvar içinde boşluk daha sonra fosfat tamponlu tuz ile doldurulur (PBS; 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.01 M PO43 -, pH 7.4 ± 0,05 25 ° c).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hayvan hazırlık Not: kalsiyum görüntüleme için sık doku özgü GAL4 ve UAS-GCaMP6sbileşimlerini kullanarak elde edilir faiz hücre tipi kalsiyum göstergesi, GCaMP6s, ifade edilir. Sinyal aday reseptör aracılı emin olmak için GCaMP6s da bir mutant reseptör içinde arızalı ile ifade edilir.<ol>
<li>Deneysel karşılaştırmalar vahşi türü ve mutantlar gibi farklı genotip için gerekli olduğunda, maç test larva GCaMP6 ifade düzey varyasyonları ve fizyolojik farklılıklar gelişim dönemleri nedeniyle önlemek için yaş.</li>
		<li>Ebeveyn sinekler (30 sinekler her seks için) standart sinek gıda gıda yüzeyinde yumurta döşeme izin vermek 8 h için içeren bir kültür şişe bulundurun. 25 ° C ve 60-%70 bağıl nem bir 12-h koyu döngüsü altında kitle kültürü larvaları.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Larva beyin diseksiyon<ol>
<li>90-120 h (AEL) döşeme yumurta sonra larva toplamak ve en az 3 kez yapisan gıda enkaz kaldırmak için distile su ile yıkayın.</li>
		<li>Yer bir larva bir kare 1.5-inç izle cam buz soğuk PBS ile dolu. Not: Sonraki iki adımı bu seyretmek cam diseksiyon mikroskop altında devam etmektedir.</li>
		<li>Forseps yavaşça larva orta parçası kapmak için kullanın. Başka bir forseps ağız kanca al ve yavaşça beyin vücudun geri kalanından içeren larva ön bölümünü ayırmak için ağız kanca çekmek için kullanın. Not: Alternatif olarak, cerrahi makas kullanılabilir.</li>
		<li>Ön uç forseps tarafından tutun ve larva mahvedecekler. Imaginal diskler, yağ organları ve yüzük bezi gibi beyin bağlı yabancı dokuyu. Yavaşça beyin ağız ayırın.</li>
		<li>PBS 200 µL macun gibi yeniden kullanılabilir yapıştırıcı görüntüleme odasında yapılan halka içine uygulanır. Yavaşça Pasteur pipet disseke beynine PBS ile emmek ve ardından görüntüleme odanın içine aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beyin görüntüleme odasına ayarlama<ol>
<li>Forseps kas lifleri ventral gangliyon uzanan kapmak için kullanın. Beyin yavaşça göçük altında tungsten kabloyu takın.</li>
		<li>Başka bir forseps kullanarak, çekme tungsten tel biraz ilâ yer beyin (Şekil 1) görüntüleme için doğru konumda.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ca2 + floresans görüntüleri edinimi
Not: PBS içinde dalmış beyin explants 20 X su-daldırma objektif lens ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanarak yansıma (N.A. 0,5 =). PBS beyin hücrelerinde etkinleştirmez. Z ekseni görüntüleri gerekiyorsa, objektif lens piezoelektrik aktif lens nakliyeci ile monte edilir. Bir iplik disk confocal kafa zaman çözünürlüğü arttırmak için kullanılır. Düşük ışık görüntüleme için şarj kuplajlı cihaz kamera çarparak bir elektron mikroskobunun monte edilir. GCaMP6s floresan görüntüleme (uyarma/emisyon: 488/509 nm) uyarma bir dikroik ışın ayırıcı ve bir emisyon filtre ile 488-nm lazer gerektirir (Örn., 528 ± 38 nm bant bant filtre).
<ol><li>Beyin explant mikroskop altında içeren görüntüleme odası yerleştirin.</li>
	<li>PBS dokunana dek objektif lens indirin. Alan parlak aydınlatma altında beyin getirin ve odak haline getirmek. Floresan ışık geçiş ve GCaMP6s etiketli hücreleri üzerinde odak noktası ayarlayın. Not: GCaMP6s bazal yeşil floresans görünür olmalıdır.</li>
	<li>Edinme, 250 ms başlatmak/çerçeve uygun satın alma yazılımı kullanılarak su soğutmalı modunda 512 × 512 piksel çözünürlükte (Örn., µManager). CCD kamera dinamik alanı değerlerinin floresans elde, ama (rasgele adet), 1000'den daha düşük değil için pozlama süresi 16-bit görüntüleri (dinamik aralığı 0-65. 535 ') ile ayarlayın. Not: Düşük çekim hızı fotoğraf-GCaMP6s ağartma en aza indirmek için kullanılır. GCaMP6 ifade düzeyleri ve algılama sistemi duyarlılığını bağlıdır gibi çekim hızı her deneyde optimize edilmelidir. Bizim deneme kullanarak 100 ms olduğunu dilp2 > GCaMP6s. Z-bölümler için belirli bir görüntüleme derinliği gerekli olduğunda, birkaç z-bölümü görüntü pozlama zaman ve çerçeve aralıkları bağlı olarak elde edilebilir. Kamera yeterli Uzaysal Çözünürlük varsa, çekim hızı azaltmak için binning büyüklüğü (kasalar bir dijital piksel binned yonga üzerinde sayısı) artırılmalıdır.</li>
	<li>Bir kez görüntü parametreleri belirlenir, peptid yönetim temel sinyal yoğunluklarda (F0) tespit etmek için önce 1 dk. için görüntüleri almak.</li>
	<li>Test peptid uygulanır; Bunun için 100 µL PBS peptid çözümün dağıtılması ve en iyi bir konsantrasyon vermeye larva banyo hemen içine pipette. Not: Yavaş yavaş peptid çözüm enjekte (Örneğin, akış hızı 20 µL/s) içine bir pipet kullanarak banyo çözüm. PBS içinde çözünmüş ilgisiz sentetik peptid bir negatif kontrol kullanılır.</li>
	<li>Kayıt GCaMP6s emisyon birkaç dakika için.</li>
</ol>3. veri analizi
Not: Görüntüleme verileri çevrimdışı ImageJ ile analiz edilir. Hızlandırılmış görüntüleme sırasında taşımak larva beyin pipetting neden olur. Bu nedenle, seri görüntülerin pozisyonel aberasyonları analiz daha önce düzeltilmelidir. Düzeltme gibi bir ImageJ eklenti, TurboReg kullanarak gerçekleştirilebilir.
<ol><li>Analiz yazılımı açın ve ilk kare (peptid uygulamadan önce) referans görüntü olarak kullanın.</li>
	<li>Eklentileri seçin | Kayıt | TurboReg.</li>
	<li>Seri resim dosyasının kaynak ve hedefolarak başvuru yansıması seçin.</li>
	<li>Katı vücut (paralel deplasman ve görüntülerin rotasyon) ve ("Hızlı" Bunun yerine hızlı analiz kaba) doğru işleme yöntemi ve kalite için sırasıyla kontrol edin.</li>
	<li>Toplu görüntü işleme başlamak için tıklatın.</li>
	<li>Analiz kullanarak ilgi (ROIs) birden fazla bölgesini seçin | Araçlar | ROI Yöneticisi ImageJ içinde.</li>
	<li>Piksel yoğunluğu daha tıklatarak ölçmek | Multi ölçü | Tamam ROI Yöneticisi penceresinde.</li>
	<li>ΔF/F0 hesaplamak = (F - F0) nereye F yatırım getirisi şiddeti uyarıcı anda ise F0 belirli bir deneysel olayından hemen önce bir zaman penceresi yoğunlukta /F0, (Örneğin, 30 kare önceki uyarıcı başlangıçlı).</li>
	<li>Birden fazla beyin örnekleri kullanarak, ortalama ve standart hata, her zaman bir noktada ortalamaya (SEM) elde etmek için istatistiksel işleme iletken denemeyi tekrarlamak.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Morton, G. J., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+central+nervous+system+control+of+glucose+metabolism.">Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).</li><li>Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+regulation+of+food+intake.">Hormonal regulation of food intake.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).</li><li>Goodman, W. G., Cusson, M., Gilbert, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+juvenile+hormones.">The juvenile hormones.</a> Insect Endocrinology. , 310-365 (2012).</li><li>Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H., Gilbert, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysteroid+chemistry+and+biochemistry.">Ecdysteroid chemistry and biochemistry.</a> Insect Endocrinology. , 106-176 (2012).</li><li>Smith, W., Rybczynski, R., Gilbert, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protothoracicotropic+hormone.">Protothoracicotropic hormone.</a> Insect Endocrinology. , 1-62 (2012).</li><li>Claeys, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+neuropeptide+and+peptide+hormone+receptors:+current+knowledge+and+future+directions.">Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions.</a> Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).</li><li>Gade, G., Goldsworthy, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+peptide+hormones:+a+selective+review+of+their+physiology+and+potential+application+for+pest+control.">Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control.</a> Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).</li><li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster.">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).</li><li>Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+peptidergic+cells+in+Drosophila:+where+DIMM+fits+in.">Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in.</a> PLoS One. 3 (3), 1896 (2008).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies:+growth+and+diabetic+phenotypes.">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+regulate+insulin+producing+cells+and+their+output+in+Drosophila.">Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila.</a> Frontiers in Physiology. 4, 252 (2013).</li><li>Sano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nutrient-Responsive+Hormone+CCHamide-2+Controls+Growth+by+Regulating+Insulin-like+Peptides+in+the+Brain+of+Drosophila+melanogaster.">The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genetics. 11 (5), 1005209 (2015).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs.">Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), 0163744 (2016).</li><li>Sabado, V. a. N., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Resolution+Fluorescence+Live+Imaging+of+Drosophila+Circadian+Clocks+in+Larval+Brain+Culture.">Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 131, e57015 (2018).</li><li>Apostolopoulou, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+Taste+Signaling+in+Drosophila+Larvae.">Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).</li><li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits.">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).</li><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan yöntemi Imaging Ca2 + işlev hormonların beyinde sınamak için kullanışlı bir sistem olduğunu. İçinde vivo, beyin hormon çeşitli endokrin organ alır. Buna ek olarak, beyin sürekli artan spontan nöronal etkinleştirme Nedenleri duyusal bilgileri algılar. Bu ex vivo sistem böyle gürültü ortadan kaldırır ve in vivo görüntüleme daha daha iyi bir sinyal/noise oranı verir. Bu sistemde moleküllerin tek başına veya birlikte test edilebilir. Peptid hormonlar yanı sıra, doğal veya sentetik bileşikler, dahil olmak üzere herhangi bir suda çözünen molekülleri beyin explant uygulanabilir.
CA2 + görüntüleme için beyin explants gergin gerekiyor. Bu amaçla, bir jel matris düşük erime noktası özel yapılan veya fibrin oldu daha önce kullanılan16,17. Bu jel matrisleri örnek stabil tutabilir, ancak, dokular, 30 ° c üzerinde ısıtılır Bu sıcaklık ısı şok yanıt böcekler gibi poikilothermic hayvanlarda neden olur. Isı stres önlemek için beynin fiziksel olarak gergin. Manikür için bağlı beyin böcek pimleri18ile bağlanır. Tungsten tel kullanarak bizim yöntem basit ve istikrarlı örneğini tutarak sağlar. Bu sistem hazırlamak kolay ve yeniden kullanılabilir ve uyarıcılar daha kolay yöntem katıştırma jel göre hedef hücreleri ulaşmak sağlar. Böylece, bu ligand tarama için faydalı olacaktır.
Floresan göstergesi seçim hedef nöronlar, nöron ve biyolojik sorular ele alınıyor ifade reseptörleri tür türüne bağlıdır. GCaMP6 türevleri çeşitli zamansal Ca2 + dynamics algılamak için en iyi duruma getirilmiş bir dizi oluşturulan13oldu. Özellikle, onların yanıt kinetik GCaMP6 türevleri farklı: GCaMP6s (yavaş), GCaMP6m (orta) ve GCaMP6f (hızlı). Çürüme kez GCaMP6s ve 6m için nispeten yavaş (i.e., τ1/2 ' den sonra 10 Aksiyon potansiyelleri hipokampal dilim hazırlık) iken bu GCaMP6f hızlı için (τ1/2 1 Aksiyon potansiyeli sonra). Sinirsel aktivite için kullanılabilir floresan göstergelerin diğer türleri EPAC-Kampı (kampı), Synapto-pHluorin (sinaptik yayın) ve ArcLight (membran potansiyeli)19,20,21içerir. Bu genetik olarak kodlanmış floresan göstergeleri belirli hücre türleri ifade edilebilir. Böylece, görüntüleme sistemi ex vivo çeşitli yanıt istenen nöronlarda algılayabilir.
Bu protokol için birkaç önemli adım vardır. İlk, yabancı dokular net bir görüntü elde etmek için beyinden kaldırılması gerekir. Bilenmiş forseps ve cerrahi makas kullanımı hassas çalışma kolaylaştırır. İkinci olarak, disseke beyin pozisyona sabit olmalıdır. Zaman zaman, beyin örnek biraz (aralığı yaklaşık 5 µm) pipetting taşır. Beyin hareket etmesini engellemek için görüntüleme odasında tungsten tel yüksekliğini beyin örnek boyutu için ayarlanmalıdır. Alternatif olarak, bir yerçekimi-besleme perfüzyon sistemi için nazik stimülasyon yüklü. Üçüncü olarak, beyin görüntüleme sonuçlarını dikkatle yorumlanmalıdır. Beyne uygulanan ligand sırayla-ebil harekete geçirmek hedef nöronlar beklenmeyen nöronlar teşvik. Bir hormon belirli nöronlar üzerinde doğrudan etkisi algılamak için reseptör çaldı targetneurons içinde aşağı. Bu durumda, floresan göstergesi ifade bu reseptör Gal4/UAS sistemini kullanarak RNAi ile kombine edilebilir.
Bu protokol küçük bir sınırlama görüntüleme süresi beyin örnek nihai hasar nedeniyle sınırlı olmasıdır. Elimizde, Drosophila beyin için yaklaşık 60 dk kadar bu iletişim kuralını kullanan yansıması. HL3.1 tuzlu22ve lazer yoğunluklarda gibi hemolymph gibi çözümü, uzun vadeli görüntüleme olanak verebilir. Buna ek olarak, geçerli görüntüleme kurulumu aynı örnek tekrarlayan uyarılması için uygun değildir. Bu tür deneyler için bir perfüzyon banyo kullanılabilir.
Son olarak, bu iletişim kuralının çeşitli uygulamalar vardır. Görüntüleme odası değiştirerek, yetişkin beyin ve diğer Drosophila doku veya diğer hayvanların doku görüntüsü. Sigara model organizmalarda genetik araçları eksikliği genom floresan göstergeleri tanıtmak zor yaptı. Ancak, son zamanlarda geliştirilen CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknikleri bu hayvanlarda genetik mühendisliği için kapıyı açtı. Böylece, bu iletişim kuralını arası organ hayvanlar geniş bir sinyal çalışma için kullanılabilir.

Organ organ iletişim çevresel değişiklikler ile başa çıkmak için homeostazı korumak için evrimsel korunmuş bir stratejidir. İnsanlarda, endokrin bezleri hormon arereleased çeşitli kan dolaşımı içine. Bu hormonların birçoğunu metabolik süreçleri ve1,2besleme gibi temel davranışları düzenleyen beynin hipotalamus hedef. Birçok hormon memeli modelleri kullanarak tespit edilmiştir. Ancak, kendi eylem, özellikle içinde onlar katılmak, interorgan ağlar mekanizmaları büyük ölçüde belirsiz kalır.
Drosophila melanogaster organ organ iletişim eğitim için yararlı bir model olarak ortaya çıkmıştır. Böcekler, birçok fizyolojik süreçleri hormonlar tarafından kontrol edilir. Büyüme ve metamorfoz odaklanarak erken çalışmaları büyük böcekler kullanılır. Bu çalışmalarda, kaldırma veya belirli organ nakli arası organ sinyal molekülleri varlığını tahmin; daha sonra Juvenil hormon (JH), Prothoracicotropic hormon (PTTH) ve Ecdysone biyokimyasal olarak saflaştırılmış3,4,5idi. Hücreler arası sinyal peptidler büyük bir ailenin böcek ömrü6,7sırasında çeşitli fizyolojik olaylara karışmış olduğu düşünülmektedir. Belirli GPCRs geleneksel yaklaşımları kullanarak tanımlamak başlangıçta zor olmasına rağmen bu peptidler çoğunu G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs), hareket. Drosophila tüm genom dizisi8 yayın Drosophila biyoaktif peptidler onların Homoloji diğer böcekler içinde bulunanlara göre tanımlaması etkin atılım oldu. Ayrıca, birkaç peptidler reseptörleri hücre kültür esaslı GPCR-ligand bağlayıcı deneyleri kullanarak genom tahmin GPCRs üzerinden tespit edilmiştir. Daha sonra ifade analizleri Bu peptidler ve reseptörler tarafından elde edildi organ organ yolları öngördü. Özellikle, birçok sözde peptid reseptörlerinin beyin peptid hormonlar9uğrak bir olduğunu düşündüren beyindeki ifade edilir. Ayrıca, Drosophila gelişmiş genetik araçlarında peptid GPCR kombinasyon fizyolojik rolleri tanımlama için katkıda bulunmuştur. Örneğin, GAL4 ve LexA tabanlı ikili transkripsiyon sistemler gen nakavt veya overexpression dağınık şekilde ve geçici denetimli bir biçimde etkinleştirin. GAL4, Maya, tanımlanan bir transkripsiyon faktörü ters yönde harekete geçirmek sıra (UAS) adı verilen belirli bir CIS düzenleyici dizisine bağlanır. GAL4/UAS sisteminde doku özel sürücü hattı oluşturur veya Yanıtlayıcı satır ve sahne-özel GAL4 ifade taşır UAS akıntıya karşı gen faiz veya sürücü shRNA ifade için yapı. LexA/LexAop sistem benzer bir mekanizma dayanmaktadır. Doku özgü peptid-nakavt ve doku özgü GPCR nakavt hayvanların fenotipik analizleri peptid GPCR'ın sinyal modu ve site eylem hakkında bilgi ortaya çıkarabilir. Ancak, sadece genetik veri tarafından ulaşılabilir sonuçları sınırlıdır. Öte yandan, bir kez bir belirli peptit hormon sözde hedef bir doku veya hücre türüne aşağı daralmış, organ explants Imaging ex vivo kalsiyum peptid GPCR sinyal tarafından aracılı organ organ iletişim aydınlatmak için kullanılabilir. Gq birleştiğinde GPCR harekete geçirmek, açıklaması, Ca2 + ER10nedeniyle intrasellüler Ca2 + konsantrasyonu artar. Beyinde, sinir harekete geçirmek de intrasellüler Ca2 + düzeyleri yükseltir. Böyle Ca2 + artar bir kalsiyum sensör, huzurunda floresans emisyon11' kaynaklanan Ca2 + konformasyon değişiklikler geçer GCaMP tarafından tespit edilebilir.
Bu makalede, Drosophila beyin kullanarak görüntüleme yöntemi explants bir kalsiyum açıklanmıştır. Belirli nöronların harekete geçirmek bir peptid yeteneğini test etmek için bir test peptid GCaMP ifade beyin explant için uygulanır ve floresan değişiklikler confocal mikroskobu tarafından izlenir. GPCR katılımı sonra GPCR eksik bir mutant beyin kullanarak aynı tahlil gerçekleştirerek doğruladı. Bu görüntüleme ve genetik organ organ iletişim hakkında kesin bilgi peptidler tarafından sağlar-GPCRs. olası değişiklikler ve uygulamaları bu protokolün de ele alınmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1033px;" width="1032">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">Tungsten rod</td>
			<td style="width:327px;">A-M systems, Sequim, WA, USA</td>
			<td style="width:165px;">717000</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blu Tack</td>
			<td>Bostik, Paris, France</td>
			<td>3049100</td>
			<td>putty-like reusable adhesives</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Watch glass, square, 1 5/8 in</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan</td>
			<td>T900</td>
			<td>Phosphated buffered salts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCHa2</td>
			<td>SCRUM Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Custum-synthesized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ghrerin</td>
			<td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td>
			<td>4372-s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nociceptin</td>
			<td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td>
			<td>4313-v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Axio Imager A2</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Axio Imager A2</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>420957-9900-000</td>
			<td>water-immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P-725 PIFOC objective scanner with long travel range</td>
			<td>Physik Instrumente GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>piezoelectric-activated lens mover</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal Scanner Unit CSU-W1</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-W1</td>
			<td>spinning disc confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImagEM C9100-13</td>
			<td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td>EM-CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">OBIS 488 nm LS 60 mW</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>1178770</td>
			<td>488-nm laser</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock, Rochester, NY, USA</td>
			<td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock, Rochester, NY, USA</td>
			<td>FF01-528/38-25</td>
			<td>emission filter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;Manager</td>
			<td>Open Imaging, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImageJ</td>
			<td>U. S. National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TurboReg</td>
			<td>Philippe Th&#233;venaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne</td>
			<td>N/A</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila

Endokrin sinyal tarafından organ organ iletişim Örneğin, çevre beyne homeostazı korumak için çok önemlidir. Endokrin araştırma modeli hayvan, hangi genetik araçları ve genom bilgileri gelişmiş sahiptir, Drosophila melanogaster, giderek kullanılıyor. Bu makalede Drosophila beyin explants kalsiyum görüntüleme için bir yöntem. Bu yöntem, bir hormon beyne doğrudan sinyal algılama sağlar. İyi birçok peptid hormonlar G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs), kimin harekete geçirmek artışa neden olmaktadır intrasellüler Ca2 +toplama yoluyla hareket bilinmektedir. Sinirsel harekete geçirmek de intrasellüler Ca2 + düzeyleri, Ca2 + akını ve endoplazmik retikulum (ER) depolanan Ca2 + sürümü yükseltir. Bir kalsiyum sensör, GCaMP, bu Ca2 + değişiklikleri izleyebilirsiniz. Bu yöntemde, GCaMP faiz nöronlarda ifade edilir ve GCaMP ifade larva beyin disseke ve kültürlü ex vivo. Test peptid sonra beyin explant için uygulanır ve GCaMP floresan değişiklikler CCD fotoğraf makinesi ile donatılmış dönen disk confocal mikroskop kullanarak algılanır. Bu yöntemi kullanarak, suda çözünen herhangi bir molekül test edilebilir ve sinirsel harekete geçirmek ile ilişkili çeşitli hücresel olaylar uygun floresan göstergeler kullanarak yansıma. Ayrıca, görüntüleme odası değiştirerek, bu yöntem diğer Drosophila organ veya diğer hayvanların organlarını görüntü için kullanılabilir.

Bu iletişim kuralını kullanan, beyin insülin üreten hücreleri (IPCs) tarafından peptid hormon, CCHa2, aktivasyonu incelenmiştir. IPCs vahşi-türü beyin GCaMP6s ile etiketli dilp2 -GAL412 (Dr. Rulifson hediyesi) ve UAS-GCaMP6s13 (Dr. Kim hediyesi) bir birleşimini kullanarak. Larva beyin explants sentetik bir CCHa2 peptid ile tedavi edildi ve floresan GCaMP6s üzerinden gerçek zamanlı olarak kaydedildi. Bu deneyde, bir tek odak düzlem görüntüleri elde edilmiştir. Her IPC küme yaklaşık 14 hücreleri14içerir ve 6 hücrelere 3 sinyalleri tespit edildi. GCaMP6s sinyal yoğunluğu büyük ölçüde CCHa2 Yönetim (Şekil 2A, film 1) yükseltilmiştir. Vahşi-türü beyin açık bir tepki Grelin ya da Nociceptin belli etmedi (Film 2 ve 3, sırasıyla), Drosophila homologue olmaksızın memeli peptid hormonlar vardır. Bu sonuçlar IPCs CCHa2 tarafından gözlenen aktivasyonu CCHa2 belirli bir tepki gösteriyor. CCHa2 CCHa2-R ile davranır olup olmadığını açıklığa kavuşturmak için aynı analiz CCHa2-R mutant beyin kullanılarak yapılmıştır. Sinyal yoğunluğu içinde bir artış yok sonra mutant beyin (Movie 4) yönetiminde CCHa2 gözlendi. İstatistiksel sinyal şiddeti vahşi tipi ve CCHa2-R mutant beyin arasındaki farkı CCHa2 uygulamadan sonra 2 dk içinde önemli oldu ve en az 7 dk. (Şekil 2B) devam edildi gösterdi. Bu sonuçlar IPCs özellikle CCHa2 CCHa2-r ile etkinleştirilir gösterir Bu çalışmada kullanılan tüm peptidler PBS tarafından 10-9 M son bir konsantrasyon vermeye seyreltilmiş.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57701/57701fig1.jpg"> Resim 1 . Görüntüleme odası (A) çanak (35 mm x 10 mm) küçük dent ve hayvan zinciri çubuk ile kültür. (B) halka şeklinde duvar macun gibi yeniden kullanılabilir yapıştırıcılar yaptı. (C) A larva beyin explant görüntüleme odasında takılı. <a href="/files/ftp_upload/57701/57701fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57701/57701fig2.jpg"> Resim 2 . Larva beyin explant kalsiyum görüntüleme Vahşi-türü (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) beyin CCHa2, Ghrelin ve Nociceptin maruz kalmış. CCHa2-R mutant (dilp2-Gal4, CCHa2-RTAL-34/UAS-GCaMP6s, CCHa2-RTAL-34) beyin CCHa2 için maruz oldu. IPCs GCaMP6s sinyalleri confocal mikroskobu 250 ms/karede tarafından tespit edildi. Hala seçili zaman puan görüntülerini (A) gösterilir. Görüntüleri daha iyi farklı sinyal yoğunluklarda görmek için pseudocolored. ΔF/F0 , her zaman bir noktada (B) çizildi. ΔF/F0 5 ila 10 farklı hazırlıkları için hesaplanır. ROIs hücre cesetlerdeki aynı odak düzlemi içinde tespit edildi kuruldu. Düz çizgiler 5-10 örnekleri ortalamasını gösterir ve ortalama, standart hata alt ve üst sınırlarını noktalı çizgiler işaretleyebilirsiniz. Gölgeli alanlar deneylerde sinyalleri varyasyonu gösterilir. Ölçek çubuğu 50 µm gösterir. Sano vd. adapte rakamdır 15. <a href="/files/ftp_upload/57701/57701fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie1.jpg"> Film 1. Vahşi tipi IPCs için CCHa2 maruz15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S1_WT_CCHa2.avi" target="_blank">lütfen bu videoyu izlemek için tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie2.jpg"> Film 2. Vahşi tipli IPCs Grelin için maruz15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S2_WT_Ghrelin.avi" target="_blank">lütfen bu videoyu izlemek için tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie3.jpg"> Film 3. Vahşi tipi IPCs için Nociceptin maruz15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S3_WT_Nociceptin.avi" target="_blank">lütfen bu videoyu izlemek için tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie4.jpg"> Film 4. CCHa2-R mutant IPCs için CCHa2 maruz 15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S4_CCHa2_mutant_CCHa2.avi" target="_blank">lütfen bu videoyu izlemek için tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila at JoVE.com

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Bu kağıt için ex vivo kalsiyum düşsel Drosophila beyin protokolünü açıklar. Bu yöntemde, doğal veya sentetik bileşikler beyindeki belli nöronlar etkinleştirmek için yeteneklerini test için tampon uygulanabilir.

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

ex-vivo-calcium-imaging-for-visualizing-brain-responses-to-endocrine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

9.1K Görüntüleme.  Nagoya University. Bu kağıt için ex vivo kalsiyum düşsel Drosophila beyin protokolünü açıklar. Bu yöntemde, doğal veya sentetik bileşikler beyindeki belli nöronlar etkinleştirmek için yeteneklerini test için tampon uygulanabilir.

Video: Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Nörobilim

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Davranış ve Uyaran Yanıtları Sırasında Yetişkin Drosophila melanogaster'ı Tüm Beyin Görüntülemeye Hazırlama

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

Tadı Uyaranlara Fare Genikül Ganglion Nöron Yanıtlarının In vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...