Questo lavoro è stato supportato da localizzativi per la ricerca scientifica (15K 07147, 17K 07419) da JSP (a Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), un Inamori Foundation Research Grant (a HI) e il programma del centro di utilizzo/ricerca congiunta per la medicina inerente allo sviluppo, in l'Istituto di embriologia molecolare e genetica, Università di Kumamoto (al HS). Ringraziamo il Dr. Azusa Kamikouchi e il signor Daichi Yamada per il loro aiuto nell'utilizzo del sistema di imaging.

1. preparazione del cervello larvale espianti
<ol><li>Prenotare una camera di imaging. Nota: La registrazione stabile richiede che i cervello espianti essere legati. Qui, una camera di imaging a basso costo, fatto a mano è usata nel Ca2 + sistema di imaging.<ol>
<li>Usando il forcipe, graffiare il basso al centro di un piatto di plastica cultura (35 x 10 mm) per creare un'ammaccatura per il ganglio ventrale del cervello larvale rendendo il montaggio più facile (passaggio 1.3, Figura 1).</li>
		<li>Con uno stuzzicadenti, mettere una piccola goccia di colla su entrambi i lati dell'ammaccatura e allegare un'asta di tungsteno (0,125 mm di diametro, 6-7 mm di lunghezza) per la colla.</li>
		<li>Con un piccolo pezzo di adesivo riutilizzabile pastoso, fare un muro circolare (10 mm di diametro e 3 mm di altezza) che circondano l'ammaccatura (Figura 1). Nota: Lo spazio all'interno della parete sarà successivamente riempito di tampone fosfato salino (PBS; 0,14 M NaCl, KCl, M 0,0027 0,01 M PO43 -, pH 7,4 ± 0.05 a 25 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione degli animali Nota: Per l'imaging del calcio, un indicatore del calcio, GCaMP6s, è espresso nel tipo cella di interesse, che è comunemente ottenuto utilizzando combinazioni di GAL4 UAS-GCaMP6se tessuto-specifici. Per garantire che il segnale è mediato attraverso il recettore di candidato, GCaMP6s si esprime anche in un mutante difettoso nel ricevitore.<ol>
<li>Quando sono richiesti confronti sperimentali per i diversi genotipi come wild-type e mutanti, età larve test match per evitare variazioni di livello di espressione GCaMP6 e differenze fisiologiche a causa di fasi inerenti allo sviluppo.</li>
		<li>Tenere mosche parentale (30 mosche per ciascun sesso) in un flacone di coltura contenenti cibo standard volo per 8 h consentire la deposizione delle uova sulla superficie del cibo. Larve di cultura in massa nell'ambito di un ciclo luce-buio di 12 h a 25 ° C e 60-70% di umidità relativa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissezione del cervello larvale<ol>
<li>A 90-120 h dopo (AEL) la deposizione delle uova, le larve di raccogliere e lavarli almeno 3 volte con acqua distillata per rimuovere i residui di cibo aderente.</li>
		<li>Posto una larva su un vetro da orologio quadrato 1,5 pollici riempito con PBS freddo ghiaccio. Nota: I due passaggi successivi sono effettuati in questo vetro d'orologio sotto il microscopio per dissezione.</li>
		<li>Utilizzare pinze per afferrare delicatamente la parte centrale della larva. Utilizzare un'altra pinza per afferrare i ganci di bocca e tirare i ganci di bocca delicatamente per separare la parte anteriore della larva contenente il cervello dal resto del corpo. Nota: In alternativa, possono essere utilizzate forbici chirurgiche.</li>
		<li>Tenere la punta anteriore dal forcipe e girare la larva dentro e fuori. Rimuovere il tessuto estraneo attaccato al cervello, come i dischi immaginali, corpi grassi e anello della ghiandola. Separare delicatamente il cervello dall'apparato boccale.</li>
		<li>Applicare 200 µ l di PBS all'interno dell'anello composto l'adesivo riutilizzabile e mastice-come nella camera di imaging. Succhiare delicatamente il cervello sezionato con PBS in una pipetta Pasteur e poi trasferirlo nella camera di imaging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostazione del cervello nella camera di imaging<ol>
<li>Utilizzare pinze per afferrare le fibre muscolari che si estende dai gangli ventrali. Inserire delicatamente il cervello l'ammaccatura sotto il filo di tungsteno.</li>
		<li>Utilizzando un altro forcipe, tirare il filo di tungsteno leggermente fino a posizionare il cervello alla posizione corretta per l'imaging (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. acquisizione di Ca2 + fluorescenza immagini
Nota: Espianti di cervello immersi in PBS sono Imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza equipaggiato con un 20x obiettivo di immersione in acqua (N.A. = 0.5). PBS non attiva le cellule del cervello. Se sono necessarie immagini asse z, l'obiettivo è montato con un motore piezoelettrico-attivata lente. Una testa confocal di filatura del disco viene utilizzata per migliorare la risoluzione di tempo. Per l'imaging di scarsa illuminazione, un elettrone moltiplicando charge coupled device fotocamera è montato sul microscopio. La formazione immagine di fluorescenza GCaMP6s (eccitazione/emissione: 488/509 nm) richiede un laser di 488 nm per l'eccitazione con un divisore di fascio dicroici e un filtro di emissione (ad es., 528 filtro passa-banda banda di ± 38 nm).
<ol><li>Posizionare la camera imaging contenente l'espianto di cervello al microscopio.</li>
	<li>Abbassare la lente dell'obiettivo fino a che tocca il PBS. Sotto illuminazione in campo chiaro, posizionare il cervello e portare a fuoco. Passare a luce fluorescente e regolare la messa a fuoco sulle cellule GCaMP6s-labeled. Nota: La fluorescenza verde basale il GCaMP6s dovrebbe essere visibile.</li>
	<li>Avvia acquisizione a 250 ms/frame con una risoluzione di 512 × 512 pixel in modalità raffreddato ad acqua, utilizzando il software di acquisizione appropriato (ad es., µManager). Regolare il tempo di esposizione per ottenere i valori di fluorescenza all'interno della gamma dinamica della fotocamera CCD, ma non inferiori a 1000 (unità arbitrarie), con immagini a 16 bit (gamma dinamica 0-65.535). Nota: Un tempo di esposizione basso dovrebbe essere utilizzato per ridurre al minimo i foto-candeggio della GCaMP6s. Tempo di esposizione dovrebbe essere ottimizzata in ogni esperimento dipende i livelli di espressione di GCaMP6 e la sensibilità del sistema di rilevamento. E ' stato 100 ms nel nostro esperimento utilizzando dilp2 > GCaMP6s. Quando z-sezioni sono necessari per una data profondità imaging, diverse immagini di z-sezione possono essere acquisite a seconda gli intervalli di tempo e cornice di esposizione. Se la fotocamera dispone di sufficiente risoluzione spaziale, la dimensione binning (numero di registri sul chip che verrà essere cestinate in un pixel digitale) dovrebbe essere aumentata per ridurre il tempo di esposizione.</li>
	<li>Una volta determinati parametri di imaging, prendere le immagini per 1 min prima della somministrazione del peptide per rilevare l'intensità del segnale di linea di base (F0).</li>
	<li>Applicare il peptide di prova; per questo, sciogliere 100 µ l di soluzione di peptide in PBS e pipettare esso direttamente nella vasca larvale per produrre una concentrazione ottimale. Nota: La soluzione di peptide deve essere iniettata lentamente (ad es., flusso tariffa 20 µ l/s) nella soluzione vasca utilizzando una pipetta. Peptide sintetico estranei disciolti in PBS viene utilizzato come controllo negativo.</li>
	<li>Registrare l'emissione di GCaMP6s per pochi minuti.</li>
</ol>3. analisi dei dati
Nota: Dati di Imaging sono analizzati non in linea con il ImageJ. Durante l'imaging time-lapse, pipettaggio induce il cervello larvale spostare. Di conseguenza, posizionali aberrazioni delle immagini seriale devono essere corretto prima dell'analisi. La correzione può essere eseguita utilizzando un plug-in, di ImageJ TurboReg come segue.
<ol><li>Aprire il software di analisi e utilizzare il primo fotogramma (prima dell'applicazione del peptide) come immagine di riferimento.</li>
	<li>Selezionare plug- | Registrazione | TurboReg.</li>
	<li>Scegliere il file di immagine seriale come l' origine e l'immagine di riferimento come destinazione.</li>
	<li>Verifica Corpo rigido (parallelo spostamento e rotazione delle immagini) e preciso ("Veloce" è grossa ma veloce analisi invece) per il metodo di lavorazione e qualità, rispettivamente.</li>
	<li>Fare clic su Batch per avviare l'elaborazione di immagini.</li>
	<li>Selezionare più aree di interesse (ROI) utilizzando Analyze | Strumenti | Manager di ROI in ImageJ.</li>
	<li>Misurare l'intensità di pixel cliccando più | Multi misura | OK nella finestra Gestione ROI.</li>
	<li>Calcolare ΔF/F0 = (F - F0) / f0, dove F è l'intensità ROI al momento dello stimolo, e F0 è l'intensità a una finestra di tempo immediatamente prima di un determinato evento sperimentale (ad esempio, 30 fotogrammi precedenti la insorgenza di stimolo).</li>
	<li>Ripetere l'esperimento utilizzando campioni multipli del cervello, lo svolgimento di elaborazioni statistiche per ottenere la media e l'errore standard della media (SEM) in ogni momento.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il Ca2 + imaging metodo qui descritto è un sistema utile per testare la funzione degli ormoni nel cervello. In vivo, il cervello riceve gli ormoni dai vari organi endocrini. Inoltre, il cervello percepisce costantemente crescente di informazioni sensoriali, che provoca l'attivazione neuronale spontanea. Questo sistema ex vivo elimina tale rumore e produce un migliore rapporto segnale/rumore rispetto all'imaging in vivo . In questo sistema, le molecole possono essere testati singolarmente o in combinazione. Oltre gli ormoni peptidici, tutte le molecole solubili in acqua, compresi i composti naturali o sintetici, possono essere applicate per l'espianto di cervello.
Per Ca2 + imaging, cervello espianti devono essere legati. Per questo scopo, una matrice di gel in agarosio di punto basso punto di fusione o fibrina è stato utilizzato in precedenza16,17. Queste matrici gel possono tenere il campione stabile, tuttavia, i tessuti sono riscaldati a sopra 30 ° C. Questa temperatura provoca una risposta di scossa di calore negli animali pecilotermi come gli insetti. Per evitare lo stress da calore, il cervello potrebbe essere legato fisicamente. Il cervello collegato la cuticola sono fissate con spilli entomologici18. Il nostro metodo utilizzando un filo di tungsteno fornisce semplice e stabile della holding del campione. Questo sistema è facile da preparare e riutilizzabili e permette stimolanti raggiungere le cellule bersaglio più facilmente rispetto al gel incorporamento metodo. Così, questo sarà utile per lo screening di ligando.
La scelta dell'indicatore fluorescente dipende dal tipo di neuroni di destinazione, il tipo di recettori espressi il neurone, e le questioni biologiche affrontate. Una serie di varianti di GCaMP6 ottimizzato per il rilevamento di vari Ca2 + dinamica temporale è stato generato13. In particolare, GCaMP6 varianti differiscono da nella loro cinetica di risposta: GCaMP6s (lento), GCaMP6m (medio) e GCaMP6f (veloce). I tempi di decadimento per GCaMP6s e 6m sono relativamente lenti (cioè., τ1/2 dopo 10 potenziali di azione in una preparazione di fettine di ippocampo) mentre che per GCaMP6f è veloce (τ1/2 dopo 1 potenziale d'azione). Altri tipi di indicatori fluorescenti disponibili per attività neurale includono EPAC-accampamento (accampamento), Synapto-pHluorin (rilascio sinaptico) e ArcLight (potenziale di membrana)19,20,21. Questi indicatori fluorescenti geneticamente codificati possono essere espressa in tipi cellulari specifici. Così, l' ex vivo sistema di imaging in grado di rilevare varie risposte nei neuroni desiderati.
Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo. Tessuti in primo luogo, estranei devono essere rimossi dal cervello per ottenere un'immagine chiara. L'uso di forcipe affilato e forbici chirurgiche facilita il delicato lavoro. In secondo luogo, il cervello dissecato dovrebbe essere fissato in posizione. Occasionalmente, il campione di cervello si muove leggermente pipettatura (il campo circa 5 µm). Per impedire che il cervello in movimento, deve essere regolata l'altezza del filo di tungsteno nella camera di formazione immagine per la dimensione del campione del cervello. In alternativa, potrebbe essere installato un sistema di perfusione di gravità per stimolazione delicata. In terzo luogo, i risultati di formazione immagine di cervello devono essere interpretati con cautela. Il ligando applicato al cervello potrebbe stimolare neuroni inaspettati, che a sua volta potrebbero attivare i neuroni bersaglio. Per rilevare l'effetto diretto di un ormone su neuroni specifici, il ricevitore deve essere abbattuto nella targetneurons. In questo caso, l'espressione dell'indicatore fluorescente può essere combinato con quello del recettore RNAi utilizzando il sistema Gal4/UAS.
Una limitazione minore del presente protocollo è che la durata di formazione immagine è limitata a causa dei danni eventuali del campione del cervello. Nelle nostre mani, il cervello di Drosophila possa essere imaged per fino a circa 60 min utilizzando questo protocollo. Soluzione di emolinfa-come, ad esempio HL3.1 Salina22e intensità laser potrebbe consentire la formazione immagine a lungo termine. Inoltre, l'installazione corrente di imaging non è adatto per lo stimolo ripetuto dello stesso campione. Per tali esperimenti, potrebbe essere utilizzato un bagno di aspersione.
Infine, questo protocollo ha varie applicazioni. Modificando la camera di formazione immagine, potrebbero essere imaged cervello adulto e altri tessuti della drosofila o i tessuti di altri animali. Negli organismi non-modello, la mancanza di strumenti genetici ha reso difficile introdurre indicatori fluorescenti nel genoma. Tuttavia, recentemente sviluppati tecniche di editing di genoma CRISPR/Cas9 hanno aperto la porta all'ingegneria genetica in questi animali. Così, questo protocollo potrebbe essere usato per studiare Inter-organo segnalazione in una vasta gamma di animali.

Comunicazione dell'organo--organo è una strategia evolutivamente conservata per il mantenimento dell'omeostasi per far fronte a cambiamenti ambientali. In esseri umani, una varietà di ormoni arereleased da ghiandole endocrine nella circolazione. Molti di questi ormoni come destinazione l'ipotalamo del cervello, che regola i processi metabolici e comportamenti fondamentali come l'alimentazione1,2. Molti ormoni sono stati scoperti utilizzando modelli mammiferi. Tuttavia, i meccanismi della loro azione, soprattutto le reti interorgan a cui essi partecipano, rimangono in gran parte poco chiari.
Drosophila melanogaster è emerso come un utile modello per lo studio della comunicazione dell'organo--organo. In insetti, molti processi fisiologici sono controllati dagli ormoni. I primi studi sulla crescita e metamorfosi di messa a fuoco utilizzato grossi insetti. In questi studi, la rimozione o il trapianto di organi specifici predisse l'esistenza Inter-dell'organo molecole di segnalazione; più tardi, ormone giovanile (JH), ormone protoracicotropo (PTTH) ed ecdisone erano biochimicamente purificata3,4,5. Una grande famiglia di peptidi segnalazione intercellulare è pensata per essere coinvolti in vari eventi fisiologici durante il ciclo di vita dell'insetto6,7. La maggior parte di questi peptidi agiscono su recettori accoppiati a proteine G (GPCR), anche se i GPCR specifici erano inizialmente difficili da identificare mediante approcci convenzionali. La pubblicazione dell'intero genoma della drosofila sequenza8 è stata la svolta che ha permesso l'identificazione di peptidi bioattivi di Drosophila basato su loro omologia a quelli trovati in altri insetti. Inoltre, i recettori per i peptidi diversi sono stati identificati da GPCR preveduto nel genoma usando analisi di associazione GPCR-ligando cell-cultura-based. Successivamente, analisi di espressione predetto le vie dell'organo--organo suscitate da questi peptidi e recettori. In particolare, molti dei ricevitori del peptide putativo sono espressi nel cervello, suggerendo che il cervello è un obiettivo importante di peptide ormoni9. Inoltre, gli strumenti genetici avanzati in Drosophila hanno contribuito all'identificazione di ruoli fisiologici di combinazioni peptide-GPCR. Ad esempio, i sistemi trascrizionale binari LexA e GAL4 abilitare gene atterramento o sovraespressione in maniera controllata spazialmente e temporalmente. Gal4, un fattore di trascrizione identificato in lievito, si lega a una specifica sequenza di cis-regolatori chiamata sequenza di attivazione a Monte (UAS). Nel sistema GAL4/UAS, la riga di driver fornisce tessuto-specifica o espressione GAL4 fase-specifici e la linea di risponditore trasporta UAS a Monte del gene di interesse o il costrutto all'espressione di shRNA in auto. LexA/LexAop sistema è basato su un meccanismo simile. Analisi fenotipiche di animali di GPCR-atterramento di peptide-atterramento e tessuto-specifico tessuto-specifici possono rivelare informazioni sulla modalità di segnalazione di peptide-GPCR e sito di azione. Tuttavia, le conclusioni che possono essere raggiunto esclusivamente da dati genetici sono limitate. D'altra parte, una volta che il bersaglio putativo di un ormone peptidico particolare viene ristretto a un tipo di tessuti o cellule, ex vivo calcio imaging in espianti di organo utilizzabile per delucidare la comunicazione dell'organo--organo mediata dalla segnalazione del peptide-GPCR. Al momento dell'attivazione di un GPCR accoppiati a Gq, concentrazione intracellulare di Ca2 + è aumentata a causa del rilascio di Ca2 + dal ER10. Nel cervello, attivazione neurale anche eleva i livelli di Ca2 + intracellulari. Tali aumenti di Ca2 + possono essere rilevati da un sensore di calcio, GCaMP, che subisce cambiamenti conformazionali in presenza di Ca2 + con conseguente emissione di fluorescenza11.
In questo articolo, viene descritto un metodo di imaging utilizzando il cervello di Drosophila espianti di calcio. Per testare la capacità di un peptide di attivare specifici neuroni, un peptide di prova viene applicato per l'espianto di cervello GCaMP-esprimendo, e cambiamenti di fluorescenza sono controllati mediante microscopia confocale. Il coinvolgimento dei GPCR viene confermato eseguendo la stessa analisi utilizzando un mutante cervello manca il GPCR. Questa combinazione di immagine e genetica fornisce informazioni precise sulla comunicazione dell'organo--organo di peptidi-GPCR. eventuali modifiche e applicazioni del presente protocollo inoltre sono discussi.

<table><tbody><tr><td>Tungsten rod</td><td>A-M systems, Sequim, WA, USA</td><td>717000</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik, Paris, France</td><td>3049100</td><td>putty-like reusable adhesives</td></tr><tr><td>Watch glass, square, 1 5/8 in</td><td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td><td>742300</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan</td><td>T900</td><td>Phosphated buffered salts</td></tr><tr><td>CCHa2</td><td>SCRUM Inc., Tokyo, Japan</td><td></td><td>Custum-synthesized peptide</td></tr><tr><td>Ghrerin</td><td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4372-s</td><td></td></tr><tr><td>Nociceptin</td><td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4313-v</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager A2</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>Axio Imager A2</td><td>fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>420957-9900-000</td><td>water-immersion objective lens</td></tr><tr><td>P-725 PIFOC objective scanner with long travel range</td><td>Physik Instrumente GmbH &amp;amp; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>N/A</td><td>piezoelectric-activated lens mover</td></tr><tr><td>Confocal Scanner Unit CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan</td><td>CSU-W1</td><td>spinning disc confocal head</td></tr><tr><td>ImagEM C9100-13</td><td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan</td><td>C9100-13</td><td>EM-CCD camera</td></tr><tr><td>OBIS 488 nm LS 60 mW</td><td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td><td>1178770</td><td>488-nm laser</td></tr><tr><td>488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td><td>dichroic beam splitter</td></tr><tr><td>528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>FF01-528/38-25</td><td>emission filter</td></tr><tr><td>&amp;micro;Manager</td><td>Open Imaging, Inc.</td><td>N/A</td><td>https://micro-manager.org</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>U. S. National Institutes of Health</td><td>N/A</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>TurboReg</td><td>Philippe Th&amp;eacute;venaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne</td><td>N/A</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td></tr></tbody></table>

ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila

Organo per organo comunicazione mediante la segnalazione endocrina, ad esempio, dalla periferia al cervello, è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi. Come un animale di modello per ricerca endocrina, Drosophila melanogaster, che dispone di sofisticati strumenti genetici e informazioni sul genoma, è sempre più utilizzato. Questo articolo viene descritto un metodo per l'imaging del calcio degli espianti del cervello di Drosophila . Questo metodo consente il rilevamento del segnale diretto di un ormone al cervello. È noto che molti ormoni peptidici agiscono attraverso i recettori accoppiati a proteine G (GPCR), cui attivazione provoca un aumento della concentrazione intracellulare di Ca2 +. Attivazione neurale anche eleva i livelli intracellulari di Ca2 + , da afflusso di Ca2 + e il rilascio di Ca2 + memorizzati nel reticolo endoplasmico (ER). Un sensore di calcio, GCaMP, può monitorare queste Ca2 + modifiche. In questo metodo, GCaMP è espresso nei neuroni di interesse, e il cervello larvale che esprimono GCaMP è dissecato e coltivato ex vivo. Il peptide di prova viene quindi applicato per l'espianto di cervello, e vengono rilevate le modifiche fluorescenti in GCaMP utilizzando un microscopio confocale di filatura disco equipaggiato con una camera CCD. Utilizzando questo metodo, qualsiasi molecola solubile in acqua possa essere testato, e vari eventi cellulari associati con attivazione neurale possono essere imaged utilizzando gli opportuni indicatori fluorescenti. Inoltre, modificando la camera imaging, questo metodo può essere utilizzato per l'immagine di altri organi di Drosophila o degli organi di altri animali.

Usando questo protocollo, l'attivazione delle cellule cerebrali che producono insulina (IPCs) dall'ormone peptide, CCHa2, è stato esaminato. IPC del selvaggio-tipo cervello sono stati etichettati con GCaMP6s usando una combinazione di dilp2 -GAL412 (un regalo da Dr. Rulifson) e UAS-GCaMP6s13 (un regalo da Dr. Kim). Cervello larvale espianti sono stati trattati con un peptide sintetico di CCHa2, e la fluorescenza da GCaMP6s è stata registrata in tempo reale. In questo esperimento, le immagini sono state ottenute da un unico piano focale. Ogni cluster IPC contiene circa 14 celle14, e sono stati rilevati segnali da 3 a 6 celle. L'intensità del segnale di GCaMP6s è stato drammaticamente aumentata dopo la somministrazione di CCHa2 (Figura 2A, film 1). I cervelli di selvaggio-tipo non hanno mostrato una risposta ovvia al Ghrelin o nocicettina (film 2 e 3, rispettivamente), che sono gli ormoni del peptide dei mammiferi senza un omologo di Drosophila . Questi risultati indicano che l'attivazione osservato dei IPC di CCHa2 è una risposta specifica a CCHa2. Per chiarire se CCHa2 agisce attraverso CCHa2-R, la stessa analisi è stata condotta usando il cervello mutante CCHa2-R. Senza tale aumento dell'intensità del segnale è stata osservata dopo la somministrazione di CCHa2 nei cervelli mutanti (4 film). L'analisi statistica ha mostrato che la differenza di intensità del segnale tra il wild-type e mutanti cervelli CCHa2-R è diventato significativa entro 2 min dopo l'applicazione di CCHa2 ed è stata mantenuta per almeno 7 min (Figura 2B). Questi risultati indicano che IPCs sono specificamente attivati da CCHa2 attraverso CCHa2-R. Tutti i peptidi utilizzati in questo studio sono stati diluiti dalla PBS per ottenere una concentrazione finale di 10-9 M.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57701/57701fig1.jpg"> Figura 1 . Camera di formazione immagine (A) della coltura piatto (35 x 10 mm) con una piccola ammaccatura e asta di tethering. (B) a forma di anello parete fatta di adesivi riutilizzabili pastosa. (C) A espianto larvale cervello inserito nella camera di imaging. <a href="/files/ftp_upload/57701/57701fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57701/57701fig2.jpg"> Figura 2 . Formazione immagine del calcio del explant larvale cervello Cervello di selvaggio-tipo (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) è stato esposto a CCHa2, grelina e nocicettina. CCHa2-R mutante (dilp2-Gal4, CCHa2-RTAL-34/UAS-GCaMP6s, CCHa2-RTAL-34) cervello è stato esposto a CCHa2. GCaMP6s segnali IPCS sono stati rilevati mediante microscopia confocale a 250 ms/telaio. Ancora immagini di intervalli di tempo selezionati sono mostrati in (A). Le immagini sono state pseudocolored per visualizzare meglio le intensità del segnale differenti. ΔF/F0 in ogni punto del tempo è stata tracciata in (B). ΔF/F0 è stato calcolato da 5 a 10 diverse preparazioni. ROIs sono stati regolati su corpi cellulari che sono stati rilevati in un stesso piano focale. Le linee continue indicano la media di 5-10 campioni, e le linee tratteggiate segnano i limiti superiore e inferiori dell'errore standard della media. Le aree ombreggiate indicano la variazione dei segnali negli esperimenti. Barra della scala indica 50 µm. La figura è adattata da Sano et al. 15. <a href="/files/ftp_upload/57701/57701fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie1.jpg"> Film 1. Selvaggio-tipo IPCs esposti a CCHa215 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S1_WT_CCHa2.avi" target="_blank">Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie2.jpg"> Film 2. Selvaggio-tipo IPCs esposti a Ghrelin15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S2_WT_Ghrelin.avi" target="_blank">Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie3.jpg"> Film 3. Selvaggio-tipo IPCs esposti a nocicettina15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S3_WT_Nociceptin.avi" target="_blank">Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie4.jpg"> Film 4. CCHa2-R mutante IPCs esposti a CCHa2 15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S4_CCHa2_mutant_CCHa2.avi" target="_blank">Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>

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Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcio Imaging per visualizzare le risposte del cervello alla segnalazione endocrina in Drosophila

Questo articolo descrive un protocollo per l'ex vivo imaging del calcio del cervello di Drosophila . In questo metodo, composti naturali o sintetiche possono essere applicati il buffer per testare la loro capacità di attivare particolari neuroni nel cervello.

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

ex-vivo-calcium-imaging-for-visualizing-brain-responses-to-endocrine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

9.2K Views.  Nagoya University. Questo articolo descrive un protocollo per l'ex vivo imaging del calcio del cervello di Drosophila . In questo metodo, composti naturali o sintetiche possono essere applicati il buffer per testare la loro capacità di attivare particolari neuroni nel cervello.

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

Calcio Imaging in<em&gt; Drosophila</em&gt; All&#39;attivazione Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neuroscienze

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

Misurare risposte fisiologiche di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni sensoriali a Lipid feromoni utilizza Live Calcio Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Immunologia e infezioni

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Monitoraggio degli eventi epilettiformi in Drosophila tramite imaging del calcio

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

Autore in primo piano: approfondimenti sulle tecniche e sui risultati dei recenti progressi nella ricerca sull'epilessia 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

In vivo Imaging del calcio delle risposte neurali indotte dal gusto nella Drosophila adulta

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

Ex Vivo Calcium Imaging to Study Drosophila Brain Responses to Neuropeptides

Source:&#160;<a style='text-decoration:none;' href='https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/57701/ex-vivo-calcium-imaging-for-visualizing-brain-responses-to-endocrine-signaling-in-drosophila'><span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Ishimoto, H.&#160;et. al.,<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila.&#160;J. Vis. Exp.<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> (2018)</a> &#160;This video demonstrates calcium imaging to study&#160;Drosophila brain responses to neuropeptides. Neurons expressing a fluorescent calcium indicator reveal intracellular calcium dynamics and functional responses to signaling molecules.

Source:&#160;Ishimoto, H.&#160;et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila.&#160;J. Vis. Exp. ...

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