Este trabajo fue apoyado por subvenciones para la investigación científica (15 07147 K, 17K 07419) de JSP (a Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), una beca de investigación Fundación de Inamori (para HI) y el programa del centro de investigación uso común para la medicina del desarrollo, en el Instituto de embriología Molecular y genética, Universidad de Kumamoto (en HS). Agradecemos Dr. Azusa Kamikouchi y Sr. Daichi Yamada su ayuda para usar el sistema de proyección de imagen.

1. preparación de los explantes de cerebro larvas
<ol><li>Hacer una cámara de proyección de imagen. Nota: Grabación estable requiere que los explantes de cerebro ser atado. Aquí, se utiliza una cámara de bajo costo, hechas a mano en el Ca2 + sistema de imagen.<ol>
<li>Con unas pinzas, rayar el centro inferior de una placa de cultivo de plástico (35 x 10 mm) para crear un hueco para el ganglio ventral del cerebro larvas que hace más fácil montaje (paso 1.3, figura 1).</li>
		<li>Con un palillo de dientes, coloque una pequeña gota de pegamento en cada lado de la abolladura y coloque una varilla de tungsteno (0,125 mm de diámetro, 6 a 7 mm de longitud) en el pegamento.</li>
		<li>Usando un pequeño pedazo de adhesivo reutilizable como masilla, hacer una pared circular (10 mm de diámetro y 3 mm de alto) alrededor de la abolladura (figura 1). Nota: El espacio dentro de la pared se posteriormente llenará con tampón fosfato salino (PBS; 0,14 M de NaCl, KCl, de 0,0027 M 0.01 M PO43 -, pH 7,4 ± 0.05 a 25 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de animales Nota: Imagen de calcio, un indicador de calcio, GCaMP6s, se expresa en el tipo de la célula de interés, que normalmente se consigue mediante combinaciones de tejidos específicos GAL4 y UAS-GCaMP6s. Para asegurar que la señal está mediada por el receptor del candidato, GCaMP6s también se expresa en un mutante defectuoso en el receptor.<ol>
<li>Cuando se requieren comparaciones experimentales para diferentes genotipos de tipo salvaje y mutantes, edad partido prueba de larvas para evitar variaciones de nivel de expresión GCaMP6 y diferencias fisiológicas debido a etapas de desarrollo.</li>
		<li>Mantener los padres moscas (30 moscas para cada sexo) en un frasco de cultivo que contienen alimentos mosca de 8 h permitir la puesta de huevos en la superficie de los alimentos. Larvas de cultura en masa bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h a 25 ° C y 60-70% de humedad relativa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disección del cerebro larvas<ol>
<li>En 90-120 h después de la postura (AEL), recoger las larvas y lavar por lo menos 3 veces con agua destilada para eliminar restos de alimentos adherentes.</li>
		<li>Lugar una larva en un vidrio de reloj de 1,5 pulgadas cuadrado lleno de PBS frío hielo. Nota: Los dos pasos siguientes se realizan en este vidrio de reloj con el microscopio de disección.</li>
		<li>Utilice pinzas para agarrar suavemente la parte media de la larva. Utilice otra pinza para agarrar los ganchos de la boca y tirar de los ganchos de la boca suavemente para separar la parte anterior de la larva que contiene el cerebro del resto del cuerpo. Nota: Alternativamente, tijeras quirúrgicas pueden ser utilizados.</li>
		<li>Sostenga la punta anterior por pinzas y vuelva la larva. Remover el tejido extraño conectado al cerebro, como los discos imaginales, cuerpos grasos y glándula del anillo. Separe suavemente el cerebro de las piezas bucales.</li>
		<li>Aplique 200 μL de PBS en el interior del anillo del masilla-como adhesivo reutilizable en la sala de proyección de imagen. Chupar suavemente el cerebro disecado con PBS en una pipeta Pasteur y transferirlo luego a la cámara de proyección de imagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configuración del cerebro en la cámara de imágenes<ol>
<li>Utilice pinzas para agarrar las fibras musculares que se extienden desde los ganglios ventrales. Inserte suavemente el cerebro en la abolladura debajo del alambre de tungsteno.</li>
		<li>Con otro fórceps, tire el alambre de tungsteno ligeramente hasta colocar el cerebro en la posición correcta para la proyección de imagen (figura 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. adquisición de imágenes de fluorescencia de Ca2 +
Nota: Explantes cerebro inmersos en PBS son imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con 20 X objetivo de inmersión en agua (N.A. = 0,5). PBS no activa las células en el cerebro. Si se necesitan imágenes de eje z, el objetivo está montado con un motor piezoeléctrico activado lente. Una cabeza confocal de disco giratorio se utiliza para mejorar el tiempo de resolución. Para la proyección de imagen con poca luz, un electrón multiplicando dispositivo acoplado de carga cámara se monta en el microscopio. La proyección de imagen de GCaMP6s fluorescencia (excitación/emisión: 488/509 nm) requiere un láser de 488 nm para la excitación con un divisor de haz dicroicos y un filtro de emisión (e.g., 528 filtro de paso de banda en banda ± 38 nm).
<ol><li>Coloque la cámara imágenes que contiene el explante del cerebro bajo el microscopio.</li>
	<li>Bajar el objetivo hasta que toque el PBS. Bajo iluminación de campo claro, coloque el cerebro y ponerlo en foco. Interruptor para la luz fluorescente y ajuste el enfoque en las células GCaMP6s-labeled. Nota: La fluorescencia verde basal de la GCaMP6s debe ser visible.</li>
	<li>Iniciar adquisición en 250 ms/marco con una resolución de 512 × 512 píxeles en modo refrigerado por agua, utilizando el software de adquisición apropiados (por ej., µManager). Ajustar el tiempo de exposición para obtener los valores de fluorescencia dentro de la gama dinámica de la cámara, pero no inferior a 1000 (unidades arbitrarias), con imágenes de 16 bits (rango dinámico de 0-65.535). Nota: Puede usarse un tiempo de exposición bajo para minimizar la foto-blanqueo de la GCaMP6s. Tiempo de exposición debe ser optimizado en cada experimento ya que depende de los niveles de expresión de GCaMP6 y la sensibilidad del sistema detector. Fue de 100 ms en nuestro experimento usando dilp2 > GCaMP6s. Cuando se requieren para una determinada profundidad imágenes z-secciones, varias imágenes de la sección de z pueden ser adquiridos según los intervalos de tiempo y el marco de la exposición. Si la cámara tiene suficiente resolución espacial, debe aumentarse el tamaño de binning (número de registros en el chip que se clasifica en un píxel digital) para reducir el tiempo de exposición.</li>
	<li>Una vez que se determinan los parámetros de proyección de imagen, tomar imágenes durante 1 min antes de la administración del péptido para detectar intensidades de la señal de referencia (F0).</li>
	<li>Aplicar el prueba de péptido; para ello, disolver 100 μl de solución de péptido en PBS y pipetear directamente en el baño de larvas para dar una concentración óptima. Nota: La solución del péptido debe inyectarse lentamente (p. ej., flujo tasa 20 μl/s) en la solución de baño mediante una pipeta. Péptido sintético sin relación disuelta en PBS se utiliza como control negativo.</li>
	<li>Registro de la emisión de GCaMP6s por unos minutos.</li>
</ol>3. Análisis de los datos
Nota: Proyección de imagen de datos es analizada sin conexión con el ImageJ. Durante la proyección de imagen de Time-lapse, pipeteo hace que el cerebro larvas para moverse. Por lo tanto, se deben corregir aberraciones posicionales de las serie imágenes antes del análisis. La corrección se puede realizar utilizando un plug-in, ImageJ TurboReg como sigue.
<ol><li>Abra el software de análisis y utilizar el primer fotograma (antes de la aplicación de péptidos) como una imagen de referencia.</li>
	<li>Seleccione Plugins | Registro | TurboReg.</li>
	<li>Elija el archivo de imagen serial como la fuente y la imagen de referencia como destino.</li>
	<li>Compruebe, Cuerpo rígido (paralelo desplazamiento y rotación de imágenes) y precisa ("Rápido" es grueso pero un análisis rápido en lugar de otro) para el método de proceso y calidad, respectivamente.</li>
	<li>Haga clic en lote para iniciar el proceso de imagen.</li>
	<li>Seleccionar varias regiones de interés (ROIs) mediante analizar | Herramientas | ROI Manager en ImageJ.</li>
	<li>Medir la intensidad de los píxeles haciendo clic más | Multi medida | OK en la ventana Administrador de ROI.</li>
	<li>Calcular ΔF/F0 = (F - F0) / f0, donde F es la intensidad de retorno de la inversión en el momento del estímulo, y F0 es la intensidad en una ventana del tiempo inmediatamente antes de un evento experimental en particular (por ejemplo, 30 marcos anteriores a la Inicio del estímulo).</li>
	<li>Repetir el experimento utilizando múltiples muestras de cerebro, realizando procesamiento estadístico para obtener la media y error estándar de la media (SEM) en cada momento.</li>
</ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+Taste+Signaling+in+Drosophila+Larvae.">Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).</li><li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits.">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).</li><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El Ca2 + imagen método descrito aquí es un sistema útil para probar la función de las hormonas en el cerebro. En vivo, el cerebro recibe las hormonas de diferentes órganos endocrinos. Además, el cerebro percibe constantemente ascendente la información sensorial, que provoca la activación neuronal espontánea. Este sistema ex vivo elimina dichos sonidos y produce una mejor relación señal/ruido que en vivo la proyección de imagen. En este sistema, las moléculas pueden analizarse por separado o en combinación. Además de las hormonas peptídicas, cualquier moléculas solubles en agua, incluyendo compuestos naturales o sintéticos, se pueden aplicar al explante del cerebro.
De Ca2 + proyección de imagen, explantes cerebro deban estar atado. Para ello, una matriz de gel de agarosa de punto de bajo punto de fusión o de fibrina ha sido utilizado previamente16,17. Estas matrices de gel pueden contener la muestra estable, sin embargo, los tejidos se calientan en encima de 30 ° C. Esta temperatura provoca una respuesta de shock térmico en poiquilotérmicas animales como insectos. Para evitar el estrés por calor, el cerebro podría ser atado físicamente. El cerebro a la cutícula se sujetan con pernos insectos18. Nuestro método usando un alambre de tungsteno ofrece simple y estable de la muestra. Este sistema es reutilizable y fácil de preparar y permite estimulantes llegar a las células blanco más fácilmente en comparación con el gel de incrustación método. Por lo tanto, esto será útil para la detección del ligando.
La elección del indicador fluorescente depende del tipo de neuronas de destino, el tipo de receptores en la neurona y las preguntas biológicas están abordadas. Una serie de variantes de GCaMP6 optimizado para la detección de varios temporal Ca2 + dinámica ha sido generado13. En particular, GCaMP6 las variantes difieren en su cinética de la respuesta: GCaMP6s (lento), GCaMP6m (medio) y GCaMP6f (rápido). Los tiempos de decaimiento de GCaMP6s y 6m son relativamente lentos (es decir., τ1/2 después de 10 potenciales de acción en una preparación de hippocampal rebanada) mientras que para GCaMP6f es rápido (τ1/2 después de 1 potencial de acción). Otros tipos de indicadores fluorescentes disponibles para la actividad de los nervios son EPAC-campamento (cAMP), Synapto-pHluorin (liberación sináptica) y ArcLight (potencial de membrana)19,20,21. Estos indicadores fluorescentes genéticamente codificados se pueden expresar en tipos celulares específicos. Por lo tanto, el ex vivo sistema de imagen puede detectar varias respuestas en las neuronas deseadas.
Hay varios pasos críticos en este protocolo. Primeros, extraños tejidos deben quitarse el cerebro para obtener una imagen clara. El uso de pinzas afiladas y tijeras quirúrgicas facilita el trabajo delicado. En segundo lugar, el cerebro disecado se fijarán en su posición. En ocasiones, la muestra de cerebro se mueve ligeramente de pipeteo (la gama aproximadamente 5 μm). Para evitar que el cerebro se mueva, debe ajustarse la altura del alambre de tungsteno en la sala de proyección de imagen para el tamaño de la muestra de cerebro. Alternativamente, se podría instalar un sistema de perfusión de gravedad para la estimulación suave. En tercer lugar, los resultados de la proyección de imagen del cerebro deben ser interpretados con precaución. El ligando aplicado al cerebro podría estimular neuronas inesperadas, que a su vez pueden activar las neuronas de destino. Para detectar el efecto directo de una hormona en neuronas específicas, el receptor debe ser derribado en el targetneurons. En este caso, la expresión del indicador fluorescente puede combinarse con la del receptor de la RNAi usando el sistema de Gal4/UAS.
Una limitación menor de este protocolo es que la duración de la proyección de imagen es limitada debido a los daños de la muestra de cerebro. En nuestras manos, el cerebro de Drosophila puede ser reflejado para hasta aproximadamente 60 min utilizando este protocolo. Hemolinfa-como solución, como HL3.1 salina22intensidades láser podría permitir la proyección de imagen a largo plazo. Además, la configuración actual de la proyección de imagen no es adecuada para la estimulación repetitiva de la misma muestra. Para tales experimentos, podría utilizarse un baño de perfusión.
Por último, este protocolo tiene varios usos. Mediante la modificación de la cámara de proyección de imagen, el cerebro adulto y otros tejidos de Drosophila o los tejidos de otros animales podrían ser reflejados. En organismos no-modelo, la carencia de herramientas genéticas ha hecho difícil introducir indicadores fluorescentes en el genoma. Sin embargo, recientemente desarrollado CRISPR/Cas9 genoma edición técnicas han abierto la puerta a la ingeniería genética en estos animales. Así, este protocolo podría ser utilizado para estudiar entre órganos de señalización en una amplia gama de animales.

Órgano de órgano de comunicación es una estrategia evolutivamente conservada para mantener la homeostasis para hacer frente a cambios ambientales. En los seres humanos, una variedad de arereleased de las hormonas de las glándulas endocrinas en la circulación. Muchas de estas hormonas objetivo el hipotálamo del cerebro, que regula los procesos metabólicos y conductas fundamentales como alimentación1,2. Se han descubierto muchas hormonas utilizando modelos de mamíferos. Sin embargo, los mecanismos de su acción, especialmente las redes interorgan en el que participan, siendo en gran parte confusos.
Drosophila melanogaster ha emergido como un modelo útil para estudiar la comunicación de órgano a órgano. En insectos, muchos procesos fisiológicos son controlados por hormonas. Los primeros estudios centrándose en el crecimiento y metamorfosis utilizan grandes insectos. En estos estudios, la extirpación o trasplante de órganos específicos predijo la existencia de moléculas de señalización entre órganos; más tarde, la ecdisona, la hormona juvenil (JH) y Prothoracicotropic hormona (PTTH) fueron purificada bioquímicamente3,4,5. Una gran familia de péptidos de señalización intercelulares se piensa para estar implicado en varios eventos fisiológicos durante el ciclo de vida de insectos6,7. La mayoría de estos péptidos actúa sobre G-proteína-juntó los receptores (GPCRs), aunque los GPCRs específicos fueron inicialmente difíciles de identificar utilizando métodos convencionales. La publicación de la Drosophila genoma secuencia8 fue el gran avance que permitió la identificación de péptidos bioactivos de Drosophila basado en su homología a las encontradas en otros insectos. Además, se identificaron los receptores para varios péptidos de GPCRs previstos en el genoma usando análisis de unión de ligando GPCR basada en cultivo celular. A continuación, análisis de expresión predijeron las vías de órgano a órgano sacadas por estos péptidos y receptores. En particular, muchos de los receptores de péptido putativo se expresan en el cerebro, lo que sugiere que el cerebro es un blanco importante de péptidos hormonas9. Por otra parte, las herramientas avanzadas de genéticas en Drosophila han contribuido a la identificación de roles fisiológicos de combinaciones de péptido GPCR. Por ejemplo, el GAL4 y sistemas binarios transcripcionales de LexA permiten knockdown de genes o sobreexpresión de forma espacial y temporal controlada. GAL4, un factor de la transcripción en levadura, se une a una secuencia específica de cis-regulador llamada secuencia de activación ascendente (UAS). En el sistema de GAL4/UAS, la línea del controlador proporciona tejidos específicos o expresión de GAL4 etapa-específica y la línea de respuesta lleva UAS corriente arriba del gen de interés o de la construcción en expresión de shRNAs en coche. LexA/LexAop sistema se basa en un mecanismo similar. Análisis fenotípicos de los animales de tejidos específicos péptido-caída y tejidos específicos GPCR-caída pueden revelar información sobre modo del GPCR péptido de señalización y sitio de acción. Sin embargo, las conclusiones que se pueden llegar únicamente por datos genéticos son limitadas. Por otra parte, una vez que el supuesto objetivo de una hormona peptídica particular es limitado a un tipo de tejido o célula, puede utilizarse para aclarar la comunicación de órgano a órgano mediada por péptidos GPCR signaling ex vivo calcio en explantes de órgano. La activación de un GPCR acoplado a Gq, se incrementa la concentración de Ca2 + intracelular debido a la liberación de Ca2 + de la ER10. En el cerebro, la activación neural también eleva los niveles de Ca2 + intracelulares. Tal Ca2 + aumenta puede detectarse mediante un sensor de calcio, GCaMP, que sufre cambios conformacionales en presencia de Ca2 + en fluorescencia emisión11.
En este artículo, se describe un calcio explantes método proyección de imagen del cerebro de Drosophila . Para probar la capacidad de un péptido para activar las neuronas específicas, un péptido de prueba se aplica al explante expresando su GCaMP cerebro, y cambios de fluorescencia son monitoreados mediante microscopía confocal. La participación de lo GPCR es confirmada luego por realizar el mismo análisis utilizando un cerebro mutante que carece el GPCR. Esta combinación de imágenes y genética proporciona información precisa acerca de órgano a órgano comunicación por péptidos-GPCRs. posibles modificaciones y aplicaciones de este protocolo también se discuten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1033px;" width="1032">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">Tungsten rod</td>
			<td style="width:327px;">A-M systems, Sequim, WA, USA</td>
			<td style="width:165px;">717000</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blu Tack</td>
			<td>Bostik, Paris, France</td>
			<td>3049100</td>
			<td>putty-like reusable adhesives</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Watch glass, square, 1 5/8 in</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan</td>
			<td>T900</td>
			<td>Phosphated buffered salts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCHa2</td>
			<td>SCRUM Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Custum-synthesized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ghrerin</td>
			<td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td>
			<td>4372-s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nociceptin</td>
			<td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td>
			<td>4313-v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Axio Imager A2</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Axio Imager A2</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>420957-9900-000</td>
			<td>water-immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P-725 PIFOC objective scanner with long travel range</td>
			<td>Physik Instrumente GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>piezoelectric-activated lens mover</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal Scanner Unit CSU-W1</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-W1</td>
			<td>spinning disc confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImagEM C9100-13</td>
			<td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td>EM-CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">OBIS 488 nm LS 60 mW</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>1178770</td>
			<td>488-nm laser</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock, Rochester, NY, USA</td>
			<td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock, Rochester, NY, USA</td>
			<td>FF01-528/38-25</td>
			<td>emission filter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;Manager</td>
			<td>Open Imaging, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImageJ</td>
			<td>U. S. National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TurboReg</td>
			<td>Philippe Th&#233;venaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne</td>
			<td>N/A</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila

Comunicación de órgano a órgano por la señalización endocrina, por ejemplo, de la periferia al cerebro, es esencial para mantener la homeostasis. Como un animal modelo para la investigación endocrina, Drosophila melanogaster, que cuenta con sofisticadas herramientas de genéticas y genoma información, se está utilizando cada vez más. Este artículo describe un método para la proyección de imagen de calcio de los explantes del cerebro de Drosophila . Este método permite la detección de la señalización directa de una hormona en el cerebro. Es bien sabido que muchas de las hormonas peptídicas actúan a través de G proteína-juntó los receptores (GPCRs), cuya activación provoca un aumento en la concentración de Ca2 +intracelular. Activación neural también eleva el Ca2 + los niveles intracelulares, de Ca2 + afluencia y la liberación de Ca2 + en el retículo endoplásmico (ER). Un sensor de calcio, GCaMP, puede controlar estos cambios de Ca2 + . En este método, GCaMP se expresa en las neuronas de interés, y el cerebro larvas GCaMP expresando es disecado y cultivado ex vivo. El péptido de la prueba se aplica a la explantación de cerebro, y los cambios fluorescentes en GCaMP se detectan utilizando un microscopio confocal de disco giratorio equipado con una cámara CCD. Usando este método, cualquier molécula soluble en agua puede ser probada, y varios eventos celulares asociados con la activación neural pueden ser reflejados mediante los indicadores fluorescentes apropiados. Por otra parte, mediante la modificación de la cámara de proyección de imagen, este método puede utilizarse para otros órganos de Drosophila o los órganos de otros animales de la imagen.

Mediante este protocolo, la activación de la insulina produciendo las células del cerebro (IPCs) de la hormona del peptide, CCHa2, fue examinada. IPCs del cerebro de tipo salvaje fueron etiquetadas con GCaMP6s usando una combinación de dilp2 -GAL412 (un regalo del Dr. Rulifson) y UAS-GCaMP6s13 (un regalo del Dr. Kim). Explantes de cerebro larvas fueron tratados con un péptido sintético de CCHa2, y la fluorescencia de GCaMP6s fue grabada en tiempo real. En este experimento, se obtuvieron imágenes de un solo plano focal. Cada grupo IPC contiene alrededor de 14 células14, y se detectaron señales de 3 a 6 células. La intensidad de la señal de GCaMP6s fue aumentada con la administración de CCHa2 (figura 2A, 1 película). El cerebro de tipo salvaje no mostraron una respuesta obvia a la ghrelina o Nociceptin (películas 2 y 3, respectivamente), que son las hormonas peptídicas mamíferos sin un homólogo de Drosophila . Estos resultados indican que la activación observada del IPCs por CCHa2 es una respuesta específica a CCHa2. Para aclarar si CCHa2 actúa a través de CCHa2-R, el mismo análisis se realizó con cerebros mutantes CCHa2-R. No hay tal incremento en la intensidad de la señal fue observada después de la administración de CCHa2 en el cerebro mutante (Movie 4). El análisis estadístico demostró que la diferencia en intensidad de la señal entre el tipo salvaje y cerebros mutantes CCHa2-R se convirtió en significativa dentro de 2 minutos después de la aplicación de CCHa2 y se mantuvo por al menos 7 min (figura 2B). Estos resultados indican que IPCs son activados específicamente por CCHa2 por CCHa2-R. Todos los péptidos utilizados en este estudio se diluyeron por PBS para obtener una concentración final de 10-9 M.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57701/57701fig1.jpg"> Figura 1 . Proyección de imagen de cámara (A) la cultura plato (35 x 10 mm) con una pequeña abolladura y barra de tethering. (B) en forma de anillo pared hecha de masilla-como adhesivos reutilizables. (C) A explante de cerebro larvas insertada en la cámara de proyección de imagen. <a href="/files/ftp_upload/57701/57701fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57701/57701fig2.jpg"> Figura 2 . Proyección de imagen de calcio de explante cerebro larvas Cerebro de tipo salvaje (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) fue expuesto a Nociceptin, CCHa2 y ghrelina. CCHa2-R mutante (dilp2-Gal4, CCHa2-RTAL-34/UAS-GCaMP6s, CCHa2-RTAL-34) cerebro fue expuesto a CCHa2. GCaMP6s señales en IPCs fueron detectadas mediante microscopía confocal en el marco de ms de 250. Todavía imágenes de puntos de tiempo seleccionado se muestran en (A). Las imágenes fueron pseudocolored para visualizar mejor la intensidad de la señal. ΔF/F0 en cada momento fue trazada en (B). ΔF/F0 se calculó a partir 5 a 10 preparaciones diferentes. ROIs fueron fijados en los cuerpos celulares que fueron detectados en un mismo plano focal. Las líneas sólidas indican la media de 5 a 10 muestras, y las líneas punteadas marcan los límites superior e inferior del error estándar de la media. Las áreas sombreadas indican la variación de las señales en los experimentos. Barra de escala indica 50 μm. La figura es una adaptación de Sano et al. 15. <a href="/files/ftp_upload/57701/57701fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie1.jpg"> Película de 1. Tipo salvaje IPCs expuestos a CCHa215 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S1_WT_CCHa2.avi" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie2.jpg"> Película de 2. Tipo salvaje IPCs expuestos a ghrelina15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S2_WT_Ghrelin.avi" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie3.jpg"> Pelicula de 3. Tipo salvaje IPCs expuestos a Nociceptin15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S3_WT_Nociceptin.avi" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie4.jpg"> Movie 4. CCHa2-R mutante IPCs expuestos a CCHa2 15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S4_CCHa2_mutant_CCHa2.avi" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>

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Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila

Este papel describe un protocolo para ex vivo calcio la proyección de imagen del cerebro de Drosophila . En este método, compuestos naturales o sintéticos pueden aplicarse en el búfer para poner a prueba su capacidad para activar las neuronas particular en el cerebro.

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

ex-vivo-calcium-imaging-for-visualizing-brain-responses-to-endocrine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

9.1K vistas.  Nagoya University. Este papel describe un protocolo para ex vivo calcio la proyección de imagen del cerebro de Drosophila . En este método, compuestos naturales o sintéticos pueden aplicarse en el búfer para poner a prueba su capacidad para activar las neuronas particular en el cerebro.

Video: Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Investigación

Neurociencias

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Proyección de imagen del calcio celular específicos de señalización en la sinapsis tripartita del diafragma del ratón

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Preparación de Drosophila melanogaster adulto para imágenes cerebrales completas durante las respuestas de comportamiento y estímulos

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

Imágenes de calcio in vivo de las respuestas de las neuronas ganglionares geniculadas de ratón a los estímulos del gusto

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

Calcio de pericitos cerebrales e imágenes hemodinámicas en ratones transgénicos in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...