עבודה זו היה נתמך על ידי Grants-in-Aid למחקר מדעי (15K 07147, 17K 07419) מ- JSPS (כדי הירושי Ishimoto, סנו לובה פריז), על Inamori קרן המחקר מענק (איץ ' אי), ואת התוכנית של המרכז השימוש/מחקר משותף ללימודי רפואה התפתחותית, ב המכון אמבריולוגיה מולקולרית, גנטיקה, קאמאמוטו אוניברסיטת (HS). אנו מודים ד ר אזוסה Kamikouchi, מר דאיצ'י יאמאדה לעזרה שלהם באמצעות מערכת הדמיה.

1. הכנת המוח זחל Explants
<ol><li>להפוך חדר הדמיה. הערה: הקלטה יציבה מחייבת explants המוח להיות קשורה. . הנה, תא הדמיה נמוכים, בעבודת יד משמש את Ca2 + מערכת הדמיה.<ol>
<li>באמצעות מלקחיים, לגרד במרכז תחתית לצלחת פלסטיק תרבות (35 מ"מ x 10 מ"מ) כדי ליצור גומה עבור גנגליון הגחוני של המוח זחל שהופך הרכבה קלה יותר (שלב 1.3, איור 1).</li>
		<li>עם קיסם, במקום טיפה קטנה של דבק מגע על צדי השקע וחבר מוט טונגסטן (0.125 מ"מ קוטר, 6-7 מ מ אורך) הדבק.</li>
		<li>באמצעות פיסה קטנה של דבק לשימוש חוזר, כמו מרק, יצירת קיר עגול (10 מ מ בקוטר של 3 מ מ) סביב השקע שנוצר (איור 1). הערה: החלל בתוך הקיר אחר כך יתמלא buffered פוספט תמיסת מלח (PBS; 0.14 M NaCl, 0.0027 M אשלגן כלורי, פו40.01 M3 -, pH 7.4 ± 0.05 25 ° c).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת בעלי חיים הערה: עבור הדמיה סידן, מחוון סידן, GCaMP6s, מתבטאת בסוג התא של עניין, אשר בדרך כלל מושגת באמצעות שילובים של רקמות ספציפיות GAL4 ו UAS-GCaMP6s. כדי להבטיח כי האות מתווך באמצעות הקולטן המועמד, GCaMP6s מתבטאת גם מוטציה פגומה של הקולטן.<ol>
<li>כאשר השוואות ניסיוני עבור אחרים שונים כגון סוג הפרוע מוטציות נדרשים, הזחלים מבחן התאמה גיל כדי להימנע GCaMP6 ביטוי ברמה וריאציות, הבדלים פיזיולוגיים עקב שלבים התפתחותיים.</li>
		<li>שמור הורים זבובים (30 זבובים לסקס כל) מבחנה אחת תרבות המכיל מזון לטוס סטנדרטי עבור 8 שעות לאפשר הטלת ביצים על פני השטח של המזון. הזחלים תרבות המונית תחת מחזור בהירה-כהה 12-h ב- 25 ° C ו- 60-70% לחות יחסית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דיסקציה של המוח זחל<ol>
<li>90-120 h לאחר ביצה הנחת (AEL), לאסוף את הזחלים, לשטוף אותם לפחות 3 פעמים עם מים מזוקקים להסרת פסולת מזון חסיד.</li>
		<li>המקום זחל על זכוכית השעון סקוור 1.5 אינץ מלא PBS קר קרח. הערה: השלבים שני הבא מתבצעות בכוס הזו לצפות במיקרוסקופ ויבתר.</li>
		<li>להשתמש מלקחיים לאחוז בעדינות את החלק האמצעי של הזחל. להשתמש מלקחיים אחר כדי לתפוס את הווים הפה ומשוך את הווים הפה בעדינות כדי להפריד בין החלק הקדמי של הזחל המכיל את המוח משאר חלקי הגוף. הערה: לחלופין, מספריים כירורגיים יכול לשמש.</li>
		<li>להחזיק את הקצה הקדמי על ידי מלקחיים ופנו הזחל מבפנים החוצה. הסרת רקמת חיצוני המחובר אל המוח, כגון דיסקים דמותי, שומן הגוף ובלוטת טבעת. בעדינות להפריד בין המוח לבין mouthparts.</li>
		<li>µL 200 ל- PBS חלות על החלק הפנימי של הטבעת עשוי דבק לשימוש חוזר דבק שפכטל דמוי בבית הבליעה הדמיה. למצוץ בעדינות את המוח ביתור עם PBS לתוך פיפטה פסטר, ולאחר מכן להעביר אותו לחדר ההדמיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדרת המוח לחדר ההדמיה<ol>
<li>להשתמש מלקחיים לתפוס סיבי השריר המשתרעת הגרעינים הגחון. הכנס המוח בעדינות לתוך השקע שנוצר מתחת לגדר טונגסטן.</li>
		<li>באמצעות מלקחיים אחר, משוך החוט טונגסטן מעט עד מקום המוח במיקום הנכון הדמיה (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. רכישת Ca2 + זריחה תמונות
הערה: המוח explants שקוע PBS הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד 20 X עדשה המטרה טבילה במי (נ. א = 0.5). PBS אינו מפעיל תאים במוח. אם ציר z תמונות נדרשים, העדשה המטרה נטענה עם mover עדשה פיזואלקטריים מופעל. ראש ספינינג דיסק קונאפוקלית משמש כדי לשפר את הרזולוציה זמן. עבור תאורה הדמיה, אלקטרון הכפלת תשלום מצמידים מכשיר המצלמה נטענה על המיקרוסקופ. ההדמיה של זריחה GCaMP6s (עירור/פליטה: 488/509 ננומטר) דורש 488 ננומטר לייזר עבור עירור עם מפצל קרן ודיקרואיק זוהר, מסנן פליטה (למשל., 528 ± 38 nm הלהקה bandpass מסנן).
<ol><li>המקום תא הדמיה המכיל את explant המוח מתחת למיקרוסקופ.</li>
	<li>. תוריד את העדשה המטרה עד שייגע מגניב. תחת תאורה בהירים-שדה, מקם את המוח ולהביא אותה לידי המוקד. לעבור אור ניאון והתאימו את המוקד על תאים התווית על-ידי GCaMP6s. הערה: קרינה פלואורסצנטית ירוק הבזליים של GCaMP6s צריכים להיות גלויים.</li>
	<li>התחלה רכישה ב 250 ms/מסגרת ברזולוציה של 512 × 512 פיקסלים במצב water-cooled באמצעות התוכנה רכישת המתאים (למשל., µManager). להתאים את זמן החשיפה להשיג ערכי פלורסצנטיות בתוך הטווח הדינמי של מצלמה CCD, אבל לא נמוכה יותר 1000 (יחידות שרירותיות), עם תמונות 16 סיביות (טווח דינמי 0-65,535). הערה: זמן חשיפה נמוכה אמור לשמש כדי למזער את הלבנת לצילום של GCaMP6s. זמן החשיפה צריך להיות מוטבת ניסוי זה תלוי רמות הביטוי של GCaMP6 ואת הרגישות של מערכת זיהוי. . זה היה 100 ms שלנו באמצעות ניסוי dilp2 > GCaMP6s. כאשר z-סעיפים הנדרשים עבור עומק הדמיה נתון, ניתן לרכוש מספר תמונות z-סעיף בהתאם מרווחי הזמן ומסגרת של חשיפה. אם המצלמה יש מספיק רזולוציה מרחבית, גודל binning (מספר הקופות על השבב זה להיות מנופה לתוך פיקסל דיגיטלית אחד) צריך להיות מוגברת כדי לצמצם את זמן החשיפה.</li>
	<li>ברגע דימות פרמטרים נקבעים, לקחת את תמונות עבור 1 דקות לפני פפטיד המינהל כדי לזהות עוצמות האות הבסיסית (F0).</li>
	<li>להחיל את מבחן פפטיד; בשביל זה, להמיס 100 µL של פתרון פפטיד PBS, pipette זה ישירות לתוך האמבט זחל להניב תשואה של ריכוז אופטימלי. הערה: הפתרון פפטיד צריך להיות מוזרק לאט (למשל, תזרים שיעור 20 µL/s) בתוך תמיסת אמבט באמצעות פיפטה של. לא קשורים פפטיד סינתטי מומס PBS משמש פקד שלילי.</li>
	<li>להקליט את פליטת GCaMP6s לכמה דקות.</li>
</ol>3. ניתוח נתונים
הערה: הדמיה הנתונים מנותחים במצב לא מקוון עם ImageJ. במהלך ההדמיה זמן לשגות, pipetting גורמת למוח זחל להזיז. לכן, יש לתקן סטיות לפי מיקום של תמונות טורי לפני ניתוח. התיקון יכול להתבצע באמצעות ImageJ של התוספת, TurboReg כפי שמוצג להלן.
<ol><li>פתח את תוכנת ניתוח ועושים שימוש המסגרת הראשונה (לפני יישום פפטיד) תמונת ייחוס.</li>
	<li>בחר תוספים | רישום | TurboReg.</li>
	<li>לבחור את קובץ התמונה טורי מקור התמונה התייחסות היעד.</li>
	<li>בדוק אם גוף קשיח (מקביל הזחה וסיבוב של תמונות), מדויקות ("מהיר" הוא גס אבל ניתוח מהיר במקום) שיטת העיבוד ואת איכות, בהתאמה.</li>
	<li>לחץ על אצווה כדי להפעיל את העיבוד תמונה.</li>
	<li>בחר אזורים מרובים עניין (ROIs) באמצעות נתח | כלים | רועי מנהל ב ImageJ.</li>
	<li>למדוד את עוצמת פיקסל על ידי לחיצה על יותר | ריבוי אמצעי | טוב בחלון מנהל רועי.</li>
	<li>חישוב ΔF/F0 = (F - F0) /F0, כאשר F הוא עוצמת ROI בזמן הגירוי ו- F0 היא עוצמת-חלון זמן מיד לפני אירוע מסוים ניסיוני (למשל, 30 מסגרות מקדים תחילת גירוי).</li>
	<li>חזור על הניסוי באמצעות דגימות מוח מרובים, בניהול עיבוד סטטיסטי של הנתונים כדי לקבל ממוצע של שגיאת התקן של הממוצע (SEM) בכל נקודה בזמן.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Morton, G. J., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+central+nervous+system+control+of+glucose+metabolism.">Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).</li><li>Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+regulation+of+food+intake.">Hormonal regulation of food intake.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).</li><li>Goodman, W. G., Cusson, M., Gilbert, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+juvenile+hormones.">The juvenile hormones.</a> Insect Endocrinology. , 310-365 (2012).</li><li>Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H., Gilbert, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysteroid+chemistry+and+biochemistry.">Ecdysteroid chemistry and biochemistry.</a> Insect Endocrinology. , 106-176 (2012).</li><li>Smith, W., Rybczynski, R., Gilbert, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protothoracicotropic+hormone.">Protothoracicotropic hormone.</a> Insect Endocrinology. , 1-62 (2012).</li><li>Claeys, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+neuropeptide+and+peptide+hormone+receptors:+current+knowledge+and+future+directions.">Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions.</a> Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).</li><li>Gade, G., Goldsworthy, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+peptide+hormones:+a+selective+review+of+their+physiology+and+potential+application+for+pest+control.">Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control.</a> Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).</li><li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster.">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).</li><li>Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+peptidergic+cells+in+Drosophila:+where+DIMM+fits+in.">Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in.</a> PLoS One. 3 (3), 1896 (2008).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies:+growth+and+diabetic+phenotypes.">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+regulate+insulin+producing+cells+and+their+output+in+Drosophila.">Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila.</a> Frontiers in Physiology. 4, 252 (2013).</li><li>Sano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nutrient-Responsive+Hormone+CCHamide-2+Controls+Growth+by+Regulating+Insulin-like+Peptides+in+the+Brain+of+Drosophila+melanogaster.">The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genetics. 11 (5), 1005209 (2015).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs.">Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), 0163744 (2016).</li><li>Sabado, V. a. N., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Resolution+Fluorescence+Live+Imaging+of+Drosophila+Circadian+Clocks+in+Larval+Brain+Culture.">Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 131, e57015 (2018).</li><li>Apostolopoulou, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+Taste+Signaling+in+Drosophila+Larvae.">Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).</li><li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits.">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).</li><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

Ca2 + הדמיה בשיטה המתוארת כאן היא מערכת שימושית לבדיקה את הפונקציה של הורמונים במוח. אין ויוו, המוח מקבל הורמונים של האורגנים האנדוקרינית. בנוסף, המוח רואה כל הזמן עולה המידע החושי, הגורמת הפעלה עצביים ספונטנית. מערכת זו שמחוץ מבטל רעש נורא ותשואות יחס אות/רעש טוב יותר מאשר ויוו הדמיה. במערכת זו, ניתן לבדוק מולקולות ביחידים או במשולב. בנוסף פפטיד ההורמונים, כל מולקולות מסיסים במים, כולל תרכובות טבעיים או סינתטיים, ניתן ליישם את explant במוח.
עבור Ca2 + הדמיה, המוח explants צריך להיות קשור. למטרה זו, מטריצה ג'ל העשוי agarose נקודת התכה נמוכה או פיברין היה בשימוש בעבר16,17. מטריצות אלה ג'ל יכול להחזיק את הדגימה stably, עם זאת, רקמות מחוממים מעל 30 ° C. את החום גורם לתגובה חום-הלם ב poikilothermic בעלי חיים כגון חרקים. כדי למנוע עומס חום, המוח יכול להיות קשור פיזית. המוח המצורפת את הקוטיקולה מהודקים עם סיכות חרקים18. השיטה שלנו באמצעות חוט טונגסטן מספק פשוטה, יציבה מחזיק המדגם. מערכת זו היא קלה להכנה ולשימוש ומאפשרת ממריצים להגיע תאי היעד בקלות רבה יותר בהשוואה הג'ל הטמעת השיטה. לכן, זה יהיה שימושי להקרנה ליגנד.
הבחירה של מחוון פלורסנט תלוי בסוג של היעד נוירונים, הסוג של קולטנים לידי ביטוי הנוירון, והשאלות ביולוגי נותרים ללא מענה. סדרה של משתנים GCaMP6 אופטימיזציה עבור זיהוי שונים טמפורלית Ca2 + דינמיקה כבר שנוצר13. בפרט, GCaMP6 גרסאות נבדלים קינטיקה התגובה שלהם: GCaMP6s (איטי), GCaMP6m (בינוני), ו- GCaMP6f (מהיר). הטיימס דעיכה עבור GCaMP6s ו- 6m איטיים יחסית (כלומר., τ1/2 אחרי 10 פוטנציאל פעולה בהכנה פרוסה בהיפוקמפוס) בזמן זה GCaMP6f הוא מהיר (τ1/2 לאחר פוטנציאל הפעולה 1). סוגים אחרים של מחוונים פלורסנט זמינים עבור פעילות עצבית כוללים במחנה EPAC (מחנה), Synapto-pHluorin (שחרור סינפטית), תאטרון ארקלייט (פוטנציאל ממברנה)19,20,21. בשעונים פלורסנט מקודדים גנטית יכול להתבטא סוגי תאים ספציפיים. לפיכך, ex-vivo מערכת הדמיה לזהות שונים התגובות בנוירונים הרצוי.
ישנם מספר שלבים קריטיים פרוטוקול זה. ראשית, שאינם שייכים לרקמות יש להסיר מן המוח כדי לקבל תמונה ברורה. השימוש מחודדים מלקחיים ומספריים כירורגי מקלה על העבודה עדין. שנית, והטרף המוח להיות קבועה למקומן. לעיתים, המדגם המוח עוברת מעט pipetting (טווח כ 5 מיקרומטר). כדי למנוע את המוח זז, הגובה של חוט טונגסטן בבית הבליעה הדימות צריך להיות מותאם בהתאם לגודל המדגם המוח. לחלופין, יכול להתקין מערכת הכבידה-feed זלוף לגירוי עדין. שלישית, התוצאות של הדמיה מוחית יש לפרש בזהירות. ליגנד חלה על המוח עלול לעורר נוירונים בלתי צפויים, אשר בתורו יכול להפעיל את הנוירונים היעד. כדי לזהות את ההשפעה הישירה של הורמון על נוירונים ספציפיים, הקולטן צריך להיות הפילו-מטה targetneurons. במקרה זה, הביטוי של מחוון פלורסנט יכול להיות משולב עם זה של הקולטן RNAi באמצעות מערכת Gal4/UAS.
מגבלה מינור של פרוטוקול זה הוא המשך של הדמיה הוא מוגבל בשל הנזק בסופו של דבר המדגם המוח. בידיים שלנו, המוח דרוזופילה יכול לדימות עבור עד כ 60 דקות שימוש בפרוטוקול זה. פתרון כמו hemolymph, כגון מלוחים HL3.122, ואת עוצמות לייזר עלול לאפשר הדמיה לטווח ארוך. בנוסף, הדמיה הכיוונון הנוכחי אינו מתאים גירוי חוזרות באותה דגימת זרע. לניסויים כאלה, אמבט זלוף יוכל לשמש.
לבסוף, פרוטוקול זה יש יישומים שונים. על-ידי שינוי התא הדמיה, המוח למבוגרים ו רקמות דרוזופילה אחרים או ברקמות של בעלי חיים אחרים יכול לדימות. אורגניזמים שאינם-דגם, העדר כלים גנטיים הפכה אותו קשה להציג מחוונים פלורסנט לתוך הגנום. עם זאת, טכניקות עריכה הגנום CRISPR/Cas9 פיתחה לאחרונה פתחת את הדלת כדי הנדסה גנטית בבעלי חיים אלה. לפיכך, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד הבין-עוגב איתות במגוון רחב של החיות.

עוגב-כדי-איבר תקשורת היא אסטרטגיית אבולוציונית שנשמרת על שמירה על הומאוסטזיס להתמודד עם שינויים סביבתיים. בבני אדם, מגוון רחב של הורמונים arereleased של בלוטות אנדוקריניות למחזור. רבים של הורמונים אלה יעד ההיפותלמוס במוח, אשר מווסת תהליכים מטבוליים והתנהגויות יסוד כגון האכלה1,2. הורמונים רבים כבר גילו באמצעות מודלים בתרבית. עם זאת, מנגנוני הפעולה שלהם, במיוחד הרשתות interorgan בהם הם משתתפים, נותרו בלתי ברורים במידה רבה.
דרוזופילה melanogaster התפתחה מודל שימושי עבור לימוד אורגן-כדי-איבר תקשורת. בחרקים, תהליכים פיזיולוגיים רבים נשלטים על ידי הורמונים. לימודי התמקדות צמיחה ושינוי צורה להשתמש חרקים גדולים. במחקרים אלה, הסרה או השתלת איברים ספציפיים ניבא את קיומו של מולקולות איתות בין איברים; מאוחר יותר, הורמון נעורים (JH), הורמון Prothoracicotropic (PTTH) Ecdysone היו מבחינה ביוכימית מטוהרים3,4,5. משפחה גדולה של פפטידים איתות המערכת נחשב להיות מעורבים באירועים פיזיולוגיים שונים במהלך מחזור חיי חרק6,7. רוב פפטידים אלה פועלים על G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), למרות GPCRs ספציפי היו בתחילה קשה לזהות באמצעות גישות קונבנציונליות. הפרסום של רצף הגנום כולו דרוזופילה 8 היה פריצת הדרך שאיפשר את הזיהוי של פפטידים ביו דרוזופילה בהתבסס על שלהם הומולוגיה לאלה שנמצאו ושאר חרקים. בנוסף, קולטני עבור מספר פפטידים אותרו מ GPCRs חזה הגנום באמצעות מבחני הכריכה GPCR-ליגנד המבוססות על התא-תרבות. בשלב הבא, ביטוי ניתוח חזה המסלולים איברים-כדי-איבר שהפיק אלה פפטידים, קולטנים. ראוי לציין, רבים של קולטני פפטיד בשם באים לידי ביטוי במוח, רומז המוח הוא יעד מרכזי של פפטיד ההורמונים9. יתר על כן, כלים גנטיים מתקדמים בדרוזופילה תרמו זיהוי תפקידים פיזיולוגיים של שילובים פפטיד-GPCR. למשל, GAL4 ואת לקסה בינארי תעתיק מערכות מבוססות להפעיל גנים או ביטוי בצורה מבוקרת במרחב של חנותם. GAL4, גורם שעתוק שזוהתה שמרים, נקשר לרצף cis-רגולציה ספציפי שנקרא רצף ההפעלה נגד הזרם (UAS). במערכת GAL4/UAS, הקו מנהל התקן מספק רקמות ספציפיות או ביטוי GAL4 שלב ספציפי לבין הקו המשיב נושא UAS במעלה הזרם של הגן מעניינים או הבונה לביטוי shRNA נסיעה. לקסה/LexAop מערכת מבוססת על מנגנון דומה. ניתוחים פנוטיפי של פפטיד-נוקאאוט רקמות ספציפיות ובעלי GPCR-נוקאאוט רקמות ספציפיות יכול לחשוף מידע אודות מצב של פפטיד-GPCR באיתות האתר של פעילות. אולם, המסקנות כי ניתן להגיע אך ורק על ידי מידע גנטי מוגבלים. מצד שני, ברגע בשם היעד של הורמון מסוים הוא צימצמת לסוג הרקמה או תא, שמחוץ סידן דימות in איברים explants ניתן להבהיר את התקשורת איברים-כדי-איבר מתווכת על-ידי איתות פפטיד-GPCR. בעת ההפעלה של GPCR מצמידים Gq, הריכוז2 + Ca תאיים גדל בשל שחרורו של Ca2 + מ ה ER10. במוח, הפעלה עצבית גם מעלה רמות2 + Ca תאיים. Ca2 + עליות כאלה ניתן להבחין באמצעות חיישן סידן, GCaMP, אשר עובר שינויים הסתגלותי בנוכחות Ca2 + וכתוצאה מכך פליטת קרינה פלואורסצנטית11.
במאמר זה מתואר של סידן שיטת הדמיה באמצעות המוח דרוזופילה explants. כדי לבדוק את היכולת של פפטיד להפעלת נוירונים ספציפיים, פפטיד המבחן חל את explant המוח לבטא GCaMP, שינויים פלורסצנטיות המפוקחים על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. המעורבות של GPCR אז אושר על ידי ביצוע וזמינותו אותו באמצעות מוח מוטציה חסר את GPCR. שילוב זה של הדמיה וגנטיקה מספק מידע מדויק על איבר-כדי-איבר תקשורת על-ידי פפטידים-GPCRs. האפשר שינויים ויישומים של פרוטוקול זה נדונות גם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1033px;" width="1032">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">Tungsten rod</td>
			<td style="width:327px;">A-M systems, Sequim, WA, USA</td>
			<td style="width:165px;">717000</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blu Tack</td>
			<td>Bostik, Paris, France</td>
			<td>3049100</td>
			<td>putty-like reusable adhesives</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Watch glass, square, 1 5/8 in</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan</td>
			<td>T900</td>
			<td>Phosphated buffered salts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCHa2</td>
			<td>SCRUM Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Custum-synthesized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ghrerin</td>
			<td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td>
			<td>4372-s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nociceptin</td>
			<td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td>
			<td>4313-v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Axio Imager A2</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Axio Imager A2</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>420957-9900-000</td>
			<td>water-immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P-725 PIFOC objective scanner with long travel range</td>
			<td>Physik Instrumente GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>piezoelectric-activated lens mover</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal Scanner Unit CSU-W1</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-W1</td>
			<td>spinning disc confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImagEM C9100-13</td>
			<td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td>EM-CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">OBIS 488 nm LS 60 mW</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>1178770</td>
			<td>488-nm laser</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock, Rochester, NY, USA</td>
			<td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock, Rochester, NY, USA</td>
			<td>FF01-528/38-25</td>
			<td>emission filter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;Manager</td>
			<td>Open Imaging, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImageJ</td>
			<td>U. S. National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TurboReg</td>
			<td>Philippe Th&#233;venaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne</td>
			<td>N/A</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila

עוגב-כדי-איבר תקשורת על-ידי איתות האנדוקרינית, לדוגמה, מהפריפריה למוח חיונית על שמירה על הומאוסטזיס. כחיה דגם למחקר האנדוקרינית, דרוזופילה melanogaster, אשר מורכבת גנטי כלים ומידע הגנום, משמשת יותר ויותר. מאמר זה מתאר שיטת ההדמיה סידן של explants המוח דרוזופילה . שיטה זו מאפשרת זיהוי ישיר באיתות של הורמון במוח. זה ידוע כי רבים פפטיד ההורמונים לפעול דרך G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), הפעלת אשר גורמת לעלייה בריכוז2 +Ca תאיים. הפעלה עצבית גם מגביה תאיים Ca2 + רמות, Ca2 + זרם והן על שחרורו של Ca2 + המאוחסן תוך-פלזמית (ER). חיישן סידן, GCaMP, באפשרותך לפקח על Ca2 + שינויים אלה. בשיטה זו, GCaMP מתבטאת הנוירונים עניין, וה -המוח זחל GCaMP-לבטא ביתר תרבותי ex-vivo. מבחן פפטיד מחילה על explant המוח, שינויים פלורסנט GCaMP מזוהים באמצעות ספינינג דיסק מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד with a מצלמה CCD. באמצעות שיטה זו, ניתן לבחון את כל מולקולה מסיסים במים, הסלולר אירועים שונים הקשורים עם הפעלה עצבית יכולה לדימות באמצעות האינדיקטורים פלורסנט המתאים. יתר על כן, על-ידי שינוי התא הדמיה, ניתן בשיטה זו לשיקוף איברים דרוזופילה אחרים או האברים של בעלי חיים אחרים.

באמצעות פרוטוקול זה, נבחן את ההפעלה של מייצרי אינסולין תאי המוח (IPCs) על ידי הורמון פפטידי, CCHa2. IPCs של המוח פראי-סוג הודבקו תוויות עם GCaMP6s באמצעות שילוב של dilp2 -GAL412 (מתנה רוליפסון ד ר), UAS-GCaMP6s13 (מתנה ד ר קים). Explants המוח זחל שטופלו פפטיד CCHa2 סינתטי, הוקלט על ידי קרינה פלואורסצנטית מ- GCaMP6s בזמן אמת. בניסוי זה, תמונות, התקבלו מוקד מטוס בודד. כל אשכול IPC מכילה תאים בסביבות 1414, אותות 3 אל 6 תאים אותרו. עוצמת האות GCaMP6s היה גדל באופן דרמטי על המינהל CCHa2 (איור 2א, סרט 1). המוח פראי-סוג לא הראה מענה ברור גרלין או Nociceptin (הסרט 2 ו- 3, בהתאמה), אשר הם יונקים פפטיד ההורמונים ללא homologue דרוזופילה . תוצאות אלה מציינים כי הפעלת שנצפה IPCs על ידי CCHa2 היא תגובה ספציפית CCHa2. כדי לברר אם CCHa2 פועלת באמצעות CCHa2-R, הניתוח באותו נערך באמצעות המוח מוטציה CCHa2-R. אין עלייה כזו בעוצמת האות נצפתה לאחר CCHa2 המינהל במוחם מוטציה (4 סרטים). ניתוח סטטיסטי הראה כי ההבדל בעוצמת האות בין פראי-סוג CCHa2-R שכל מוטציה הפכה משמעותית בתוך 2 דקות לאחר יישום CCHa2, נשמר לפחות 7 דקות (איור 2B). תוצאות אלו מצביעות על IPCs במיוחד מופעלים על-ידי CCHa2 דרך CCHa2-R. כל פפטידים השתמשו במחקר זה היו מדולל על ידי PBS להניב ריכוז סופי של 10-9 מ'.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57701/57701fig1.jpg"> איור 1 . הדמיה תא (א) תרבות מאכל (35 מ"מ x 10 מ"מ) עם שקע קטן, רוד tethering. (B) בצורת טבעת קיר עשוי דבק שפכטל דמוי דבקים לשימוש חוזר. (ג) A explant המוח זחל הוכנס לחדר ההדמיה. <a href="/files/ftp_upload/57701/57701fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57701/57701fig2.jpg"> איור 2 . סידן הדמיה של explant המוח זחל המוח פראי-סוג (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) נחשף CCHa2 גרלין, Nociceptin. מוטציה CCHa2-R (dilp2-Gal4, CCHa2-Rטל-34/UAS-GCaMP6s, CCHa2-Rטל-34) המוח נחשף CCHa2. אותות GCaMP6s ב IPCs אותרו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית-ms 250/מסגרת. עדיין תמונות של נקודות זמן נבחר מוצגות באותיות (A). התמונות היו pseudocolored משופרת של עוצמות האות שונה. ΔF/F0 בכל נקודה בזמן הייתה להתוות ב (B). ΔF/F0 מחושב מ 5 כדי 10 תכשירים שונים. ROIs נקבעו על הגופות תא שזוהו על מטוס מוקד זהה. הקווים מוצק מציינים הממוצע של 5-10 דוגמאות, ולסמן הקווים המקווקווים הגבולות העליונים והתחתונים של שגיאת התקן של הממוצע. אזורים מוצללים מציינים את הווריאציה של האותות בניסויים. סולם בר מציין 50 מיקרומטר. הדמות היא ממאמרו של סנו. et al. 15. <a href="/files/ftp_upload/57701/57701fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie1.jpg"> סרט 1. IPCs פראי-סוג נחשפים CCHa215 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S1_WT_CCHa2.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie2.jpg"> הסרט 2. IPCs פראי-סוג נחשפים גרלין15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S2_WT_Ghrelin.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie3.jpg"> הסרט 3. IPCs פראי-סוג נחשפים Nociceptin15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S3_WT_Nociceptin.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie4.jpg"> סרט 4. CCHa2-R מוטציה IPCs נחשפים CCHa2 15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S4_CCHa2_mutant_CCHa2.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila at JoVE.com

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ex-vivo סידן הדמיה של המוח דרוזופילה . בשיטה זו, תרכובות טבעי או סינתטי ניתן להחיל את המאגר כדי לבחון את היכולת שלהם להפעיל את המסוים הנוירונים במוח.

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

ex-vivo-calcium-imaging-for-visualizing-brain-responses-to-endocrine

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

9.1K Views.  Nagoya University. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ex-vivo סידן הדמיה של המוח דרוזופילה . בשיטה זו, תרכובות טבעי או סינתטי ניתן להחיל את המאגר כדי לבחון את היכולת שלהם להפעיל את המסוים הנוירונים במוח.

Video: Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

הכנת מלנוגאסטר דרוזופילה למבוגרים להדמיית מוח שלמה במהלך תגובות התנהגות וגירויים

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

In vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...