이 작품은 지원 연구비에 의해 과학적 연구에 대 한 (15 K 07147, 17 K 07419) JSP에서 (히로시 종합, 히로코 사노), (하이), 이나 모리 재단 연구 그랜트와 공동 사용/연구 센터의 프로그램 발달 의학에 분자 발생 학, 유전학, (HS)에 쿠마 모토 대학 연구소. 우리 이미징 시스템을 사용 하 여 그들의 도움에 대 한 박사 아즈사 삿포로 야마다 다 이치 씨 감사 합니다.

1입니다. 애벌레 뇌 Explants의 준비
<ol><li>이미징 챔버를 확인 합니다. 참고: 안정적인 녹음 두뇌 explants 곁 수 있어야 합니다. 여기, 낮은-비용, 손으로 만든 이미징 챔버는 Ca2 + 이미징 시스템에 사용 됩니다.<ol>
<li>집게를 사용 하 여 쉽게 장착 (1.3, 그림 1단계)를 만드는 애벌레 두뇌의 복 부 신경 절에 대 한 덴트를 만드는 플라스틱 문화 접시 (35 m m x 10 m m)의 하단 중앙 스크래치.</li>
		<li>이쑤시개와 덴트의 양쪽에 superglue의 작은 방울을 놓고 접착제를 텅스텐 막대 (0.125 m m, 6 ~ 7 m m 길이)를 연결 합니다.</li>
		<li>퍼 티 같이 재사용할 수 있는 접착제의 작은 조각을 사용 하 여, 확인 (10 m m 직경에서 및 높이 3 m m) 원형 벽 주변 덴트 (그림 1). 참고: 벽 내부의 공간 나중으로 채워질 것 이다 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 0.14 M NaCl, KCl, 0.0027 M 0.01 M 포43-, 25 ℃에서 pH 7.4 ± 0.05).</li>
	</ol>
</li>
	<li>동물 준비 참고: 칼슘 이미징, 칼슘 표시기, GCaMP6s, 표현 된다 세포 유형의 관심, 일반적으로 조직의 특정 GAL4 UAS-GCaMP6s의 조합을 사용 하 여 이루어집니다. 신호 후보 수용 체를 통해 중재 된다 되도록 GCaMP6s 수용 체에 결함이 있는 돌연변이 또한 표현 된다.<ol>
<li>다른 genotypes 야생 타입 등 돌연변이 대 한 실험 비교 필요한 경우 GCaMP6 식 수준 변화와 발달 단계에 따른 생리 적 차이 피하기 위해 일치 시험 애벌레 나이.</li>
		<li>포함 하는 음식의 표면에 계란-누워 있도록 8 h에 대 한 표준 비행 거리 음식 문화 유리병에 부모의 파리 (30 파리 각 섹스에 대 한)을 유지. 25 ° C와 60-70% 상대 습도에서 12 h 빛 어두운 주기에서 질량에는 문화 애벌레</li>
	</ol>
</li>
	<li>애벌레는 두뇌의 해 부<ol>
<li>(AEL) 누워 계란 후 90-120 h, 애벌레를 수집 하 고 그들에 게 부착 식품 이물질 제거를 증류수와 적어도 3 번을 씻어.</li>
		<li>장소는 1.5 인치 사각 시계 유리에 유 충은 얼음 차가운 PBS 가득합니다. 참고: 다음 두 단계 해 현미경이 시계 유리에 수행 됩니다.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 부드럽게 유 충의 중간 부분을 잡아. 다른 집게를 사용 하 여 입 후크를 유 충을 포함 하는 시체의 나머지 부분에서 뇌의 앞쪽 부분을 부드럽게 입 고리를 당겨. 참고: 또는, 수술가 위 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>겸 자에 의해 앞쪽 끝을 누른 유 충을 안으로 밖으로 설정 합니다. 외부 조직 imaginal 디스크, 지방 기관, 링 선 등 뇌에 연결을 제거 합니다. 부드럽게는 mouthparts에서 뇌를 분리 합니다.</li>
		<li>PBS의 200 µ L 이미징 챔버에 퍼 티 같은 재사용 접착제의 링의 안쪽에 적용 됩니다. 부드럽게 파스퇴르 피 펫에 PBS 가진 해 부 뇌를 빨 아 하 고 이미징 챔버로 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두뇌 이미징 챔버로 설정<ol>
<li>집게를 사용 하 여 복 부 신경에서 연장 하는 근육 섬유를 잡아. 텅스텐 와이어 아래 덴트에 두뇌를 부드럽게 삽입 합니다.</li>
		<li>다른 집게를 사용 하 여, 풀 텅스텐 와이어를 약간 장소 두뇌 이미징 (그림 1)에 대 한 올바른 위치에.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ca2 + 형광 이미지 수집
참고: PBS에 몰입 하는 뇌 explants는 몇 군데 물 침수 렌즈 X 20을 갖춘 형광 현미경을 사용 하 여 (없음 = 0.5). PBS는 뇌에서 세포를 활성화 하지 않습니다. Z 축 이미지, 필요한 경우 활성화 압 전 렌즈 발동기로 대물 렌즈 마운트입니다. 회전 디스크 confocal 머리는 시간 분해능을 향상 하는 데 사용 됩니다. 낮은 조명 촬영에 대 한 전 하 결합 소자 카메라 멀티 전자 현미경에 장착 됩니다. GCaMP6s 형광 이미징 (여기/방출: 488/509 nm) 여기 dichroic 빔 스플리터와 방출 필터 488 nm 레이저를 요구 한다 (예., 528 ± 38 nm 대역 대역 통과 필터).
<ol><li>포함 하는 현미경 뇌 explant 이미징 챔버를 놓습니다.</li>
	<li>그것은 PBS를 건드리면 때까지 대물 렌즈를 낮춥니다. 필드 밝은 조명 아래 뇌 놓고 초점으로 그것을. 형광 빛을 전환 하 고 GCaMP6s 라는 세포에 초점을 조정 합니다. 참고:는 GCaMP6s의 기저 녹색 형광 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>250 ms에서 수집을 시작/냉각 모드 적절 한 수집 소프트웨어를 사용 하 여 512 × 512 픽셀의 해상도에서 프레임 (예., µManager). 16 비트 이미지 (동적 범위 0-65535) CCD 카메라의 동적 범위에서 형광 값을 1000 (임의의 단위) 보다 낮게 하지 노출 시간을 조정 합니다. 참고: 낮은 노출 시간에 GCaMP6s의 사진-표백을 최소화 하기 위해 사용 해야 합니다. 그것은 GCaMP6의 식 수준 및 탐지 시스템의 감도에 따라 노출 시간 각 실험에 최적화 되어야 합니다. 그것은 사용 하 여 우리의 실험에서 100 ms dilp2 > GCaMP6s. Z-섹션 주어진된 이미징 깊이 대 한 필요한 경우, 여러 z 섹션 이미지 노출 시간과 프레임 간격에 따라 취득 수 있습니다. 카메라 공간 해상도 충분 한 경우, 노출 시간을 줄이기 위해 범주화 크기 (하나의 디지털 픽셀으로 범주화 하는 칩에 레지스터의 수)를 증가 한다.</li>
	<li>이미지 매개 변수를 확인 하는 펩 티 드 관리 기준 신호 강도 (F0)를 검색 하기 전에 1 분 동안 이미지 걸릴.</li>
	<li>적용 테스트 펩 티 드. 이 위해, PBS에서 펩 티 드 솔루션의 100 µ L를 녹이 고 직접 최적 농도를 애벌레 욕조에 플라스틱. 참고: 펩 티 드 솔루션 천천히 주입 되어야 한다 (예를 들어, 흐름 속도 20 µ L/s)는 피 펫을 사용 하 여 목욕 솔루션으로. 없는 합성 펩 티 드 PBS에 녹아 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.</li>
	<li>몇 분 동안 GCaMP6s 방출을 기록 합니다.</li>
</ol>3. 데이터 분석
참고: 영상 데이터는 오프 라인으로 ImageJ로 분석 된다. 시간 경과 화상 진 찰 동안 pipetting 이동 애벌레 뇌를 발생 합니다. 따라서, 직렬 이미지의 위치 착오 분석 하기 전에 수정 해야 합니다. 수정 된 ImageJ 플러그인, TurboReg를 사용 하 여 다음과 같이 수행할 수 있습니다.
<ol><li>분석 소프트웨어를 열고 (펩 티 드 응용 프로그램) 전에 첫 번째 프레임 참조 이미지를 사용 합니다.</li>
	<li>플러그인을 선택 | 등록 | TurboReg.</li>
	<li>원본 으로 직렬 이미지 파일 및 대상으로 참조 이미지를 선택 합니다.</li>
	<li>체크 리 짓 바디 (병렬 변위 및 이미지의 회전)와 정확한 ("빠른"는 빠른 분석 하지만 거친 대신) 처리 방법 및 품질, 각각.</li>
	<li>일괄 이미지 처리 시작을 클릭 합니다.</li>
	<li>분석을 사용 하 여 관심사 (ROIs)의 여러 영역을 선택 | 도구 | 투자 수익 관리자 ImageJ에.</li>
	<li>더 많은 를 클릭 하 여 픽셀 강도 측정 | 다중 측정 | 확인 ROI 관리자 창에서.</li>
	<li>Δ/F0 를 계산 = (F-F0) /F0, 어디 F 투자 수익 강도, 자극의 시간에서 이며 F0 특정 실험 이벤트 직전 시간대에 강도 (예를 들어, 30 프레임 앞에 자극 증상)입니다.</li>
	<li>반복 실험 여러 뇌 샘플을 사용 하 여, 평균 및 각 시간 지점에서 평균 (SEM)의 표준 오차를 통계 처리를 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Morton, G. J., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+central+nervous+system+control+of+glucose+metabolism.">Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).</li><li>Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+regulation+of+food+intake.">Hormonal regulation of food intake.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).</li><li>Goodman, W. G., Cusson, M., Gilbert, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+juvenile+hormones.">The juvenile hormones.</a> Insect Endocrinology. , 310-365 (2012).</li><li>Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H., Gilbert, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysteroid+chemistry+and+biochemistry.">Ecdysteroid chemistry and biochemistry.</a> Insect Endocrinology. , 106-176 (2012).</li><li>Smith, W., Rybczynski, R., Gilbert, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protothoracicotropic+hormone.">Protothoracicotropic hormone.</a> Insect Endocrinology. , 1-62 (2012).</li><li>Claeys, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+neuropeptide+and+peptide+hormone+receptors:+current+knowledge+and+future+directions.">Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions.</a> Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).</li><li>Gade, G., Goldsworthy, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+peptide+hormones:+a+selective+review+of+their+physiology+and+potential+application+for+pest+control.">Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control.</a> Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).</li><li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster.">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).</li><li>Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+peptidergic+cells+in+Drosophila:+where+DIMM+fits+in.">Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in.</a> PLoS One. 3 (3), 1896 (2008).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies:+growth+and+diabetic+phenotypes.">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+regulate+insulin+producing+cells+and+their+output+in+Drosophila.">Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila.</a> Frontiers in Physiology. 4, 252 (2013).</li><li>Sano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nutrient-Responsive+Hormone+CCHamide-2+Controls+Growth+by+Regulating+Insulin-like+Peptides+in+the+Brain+of+Drosophila+melanogaster.">The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genetics. 11 (5), 1005209 (2015).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs.">Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), 0163744 (2016).</li><li>Sabado, V. a. N., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Resolution+Fluorescence+Live+Imaging+of+Drosophila+Circadian+Clocks+in+Larval+Brain+Culture.">Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 131, e57015 (2018).</li><li>Apostolopoulou, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+Taste+Signaling+in+Drosophila+Larvae.">Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).</li><li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits.">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).</li><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li></ol>

저자는 공개 없다.

캘리포니아2 + 이미징 방법을 여기에 설명 된 뇌에서 호르몬의 기능을 테스트 하기 위한 유용한 시스템입니다. Vivo에서 두뇌 다양 일 분 비 장기에서 호르몬을 받습니다. 더하여, 두뇌는 끊임없이 자연 신경 활성화를 일으키는 원인이 되는 감각 정보를 오름차순 인식. 이 비보 전 시스템 같은 노이즈를 제거 하 고 vivo에서 영상 보다 더 나은 신호/잡음 비율을 생성 합니다. 이 시스템에 단독으로 또는 조합에서 분자를 테스트할 수 있습니다. 펩 티 드 호르몬 이외에 천연 또는 합성 화합물을 포함 하 여 모든 수용 성 분자는 두뇌 explant에 적용할 수 있습니다.
캘리포니아2 + 이미징, 뇌 explants 곁에 있이 필요가 있다. 이 위해 젤 매트릭스 낮은 녹는 포인트 agarose 또는 섬유 소 되었습니다 사용 이전16,17. 그러나이 젤 매트릭스 샘플을 안정적으로 저장할 수 있습니다, 그리고, 조직은 이상가 열에서 30 ° c. 이 온도 poikilothermic 동물 곤충 등에서 열 충격 응답을 발생합니다. 열 스트레스를 방지 하려면 두뇌 육체적으로 곁 수 있습니다. 표 피에 부착 된 뇌 곤충 핀18로 걸린다. 텅스텐 와이어를 사용 하 여 우리의 방법을 간단 하 고 안정적인 샘플의 개최를 제공 합니다. 이 시스템 준비 하기 쉽고 재사용, 이며 메서드를 포함 하는 젤에 비해 더 쉽게 대상 세포에 도달 하는 자극 수 있습니다. 따라서,이 ligand 심사에 유용할 것 이다.
형광 표시기의 선택 대상 뉴런, 신경, 그리고 생물 학적 질문 해결 되 고 표현 된 수용 체의 종류의 종류에 따라 달라 집니다. 일련의 GCaMP6 이체 다양 한 임시 캘리포니아2 + 역학을 탐지 하기 위한 최적화 된 생성 된13되었습니다. 특히, GCaMP6 이체 다 그들의 반응 속도 론: GCaMP6s (느린), GCaMP6m (중간), 그리고 GCaMP6f (빠른). GCaMP6s와 6 분에 대 한 부패 시절은 비교적 느린 (즉., 10 활동 전위 hippocampal 슬라이스 준비에서 후 τ1/2 ) GCaMP6f는 빨리 그 동안 (τ1/2 1 활동 전위 후). 다른 유형의 신경 활동에 대 한 사용 가능한 형광 표시기 등 EPAC 캠프 (캠프), Synapto-pHluorin (시 냅 스 자료), 아크 라이트 (막 잠재력)19,,2021. 이러한 유전자 인코딩된 형광 표시기 특정 셀에 표현할 수 있습니다. 따라서,는 ex vivo 이미징 시스템에서에서 검색할 수 다양 한 응답 원하는 신경.
이 프로토콜에서 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 외부 조직 깨끗 한 이미지를 뇌에서 제거 되어야 합니다. 날카롭게 집게와 수술가 위를 사용 하 여 섬세 한 작업 용이. 둘째, 해 부 두뇌 위치에 고정 되어야 한다. 때때로, 뇌 샘플 pipetting (범위 약 5 µ m)에서 약간 이동 합니다. 두뇌가 이동 하지 않도록 하려면 두뇌 샘플의 크기에 이미징 챔버에 텅스텐 와이어의 높이 조정 한다. 또는, 중력-피드 관류 시스템 부드러운 자극에 대 한 설치 될 수 있습니다. 셋째, 뇌 이미징의 결과 주의로 해석 해야 합니다. Ligand 두뇌에 적용 차례로 대상 뉴런을 활성화 수 예기치 않은 뉴런 자극 수 있습니다. 특정 신경 세포에 호르몬의 직접적인 영향을 감지 하는 수용 체 해야 될 절 다운은 targetneurons에. 이 경우에, 형광 표시기의 식 RNAi Gal4/UAS 시스템을 사용 하 여 수용 체의 결합 수 있습니다.
이 프로토콜의 사소한 제한 이미징의 기간 제한 뇌 샘플의 최종 피해 때문입니다. 우리의 손에서 초파리 뇌 수 수 몇 군데에 대 한이 프로토콜을 사용 하 여 약 60 분까지. Hemolymph 같은 솔루션 HL3.1 염 분22및 레이저 강도 같은 장기 이미징을 사용 수 있습니다. 또한, 현재 이미징 설치 동일한 샘플의 반복적인 자극을 위해 적당 하다. 이러한 실험에 대 한 관류 목욕을 사용 수 있습니다.
마지막으로,이 프로토콜에는 다양 한 응용 프로그램 있다. 이미징 챔버를 수정 하 여 성인 두뇌 및 다른 초파리 조직 또는 다른 동물의 조직 수 수 몇 군데. 비 모형 유기 체에서 유전 도구의 부족은 어려웠습니다 게놈에 형광 지표를 소개 하. 그러나, 최근에 개발 된 CRISPR/Cas9 게놈 편집 기술을이 동물에 유전 공학에 문을 열었습니다. 따라서,이 프로토콜 간 기관 동물의 넓은 범위에서 신호를 공부 사용 될 수 있습니다.

기관 대 기관 통신 환경 변화에 대처 하기 위해 항상성 유지 하기 위한 진화론 보존된 전략 이다. 인간, 순환으로 내 분 비 동맥에서 호르몬 arereleased의 다양 한. 이러한 호르몬의 많은 신진 대사 과정 및1,2먹이 등 기본적인 동작을 조절 하는 두뇌의 시상 하 부 대상. 많은 호르몬 포유류 모델을 사용 하 여 발견 되었습니다. 그러나, 그들의 행동, 특히 있는 그들이 참여, interorgan 네트워크의 메커니즘 크게 불분명 남아 있습니다.
초파리 melanogaster 기관 대 기관 통신 공부에 대 한 유용한 모델로 떠오르고 있다. 곤충, 많은 생리 적인 과정은 호르몬에 의해 제어 됩니다. 초기 연구 성장과 변형에 초점을 맞추고 큰 곤충을 사용. 이 연구에서 제거 또는 특정 장기의 이식 예측 간 장기 신호 분자;의 존재 나중에, 젊은 호르몬 (JH), Prothoracicotropic 호르몬 (PTTH), 및 Ecdysone 화학적 정화3,,45했다. 세포 신호 펩 티 드의 큰 가족 곤충 라이프 사이클6,7동안 다양 한 생리 적 행사에 참여 하 생각 된다. 이러한 펩 티이 드의 대부분 비록 특정 GPCRs 처음 전통적인 방법을 사용 하 여 식별 하기 어려운 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)에서 작동 합니다. 초파리 전체 게놈 순서8 의 간행물이 이었다 초파리 생리 활성 펩 티 드는 다른 곤충에서 발견 된에 그들의 상 동에 따라 식별을 사용 하는 획기적인. 또한, 여러 가지 펩 티 드에 대 한 수용 체는 GPCRs GPCR 리간드 바인딩 분석 셀-문화-기반을 사용 하 여 게놈에 예측에서 확인 되었다. 다음, 식 분석 예측 기관 대 기관 경로 이러한 펩 티 드와 수용 체에 의해 elicited. 특히, 상 상속 펩 티 드 수용 체의 많은 두뇌, 두뇌 펩 티 드 호르몬9의 주요 목표는 제안 표현 됩니다. 또한, 초파리 에서 유전자 고급 도구 펩 티 드 GPCR 조합의 생리 적 역할의 id에 공헌 했다. 예를 들어, GAL4 및 LexA 기반 이진 transcriptional 시스템 활성화 유전자 최저 또는 overexpression 공간 및 일시적으로 제어 방식. GAL4, 효 모에서 확인 된 녹음 방송 요인 특정 cis 규제 시퀀스 라는 상류 활성화 순서 (UAS)에 바인딩합니다. GAL4/UAS 시스템에서 드라이버 라인 제공 조직 관련 또는 단계 특정 GAL4 표현과 응답자 선 관심 또는 드라이브 shRNA 식 구조 유전자의 상류 UAS 운반. LexA/LexAop 시스템 비슷한 메커니즘을 기반으로 합니다. 조직의 특정 펩 티 드-최저와 조직 특정 GPCR 최저 동물의 phenotypic 분석 펩 티 드 GPCR 신호 모드와 행동의 사이트에 대 한 정보를 알아낼 수 있습니다. 그러나, 유전자 데이터에 의해서만 도달 될 수 있는 결론 제한 됩니다. 다른 한편으로, 특정 펩 티 드 호르몬의 상 상속 대상 조직 또는 세포 유형으로 좁혀입니다, 일단 비보 전 칼슘 기관 explants 이미징 펩 티 드 GPCR 신호에 의해 중재 기관 대 기관 통신 명료 하 사용할 수 있습니다. Gq 결합 GPCR의 활성화, 세포내 캘리포니아2 + 농도10응급실 캘리포니아2 + 의 출시로 인해 증가 된다. 뇌, 신경 활성화는 또한 세포내 캘리포니아2 + 레벨을 올린다. 이러한 Ca2 + 증가 칼슘 센서, GCaMP, 캘리포니아2 + 형광 방출11결과의 구조적 변화를 겪 습에 의해 감지할 수 있습니다.
이 문서에서는, 초파리 뇌를 사용 하 여 이미징 방법 explants 칼슘 설명 되어 있습니다. 특정 뉴런을 활성화 하는 펩 티 드의 능력을 테스트 하기 위해 테스트 펩 티 드 GCaMP 표현 뇌 explant에 적용 되 고 형광 변화 confocal 현미경 검사 법에 의해 모니터링 됩니다. GPCR의 참여는 GPCR 부족 돌연변이 두뇌를 사용 하 여 동일한 분석 결과 수행 하 여 다음 확인 된다. 이미징 및 유전학의이 조합은 펩 티 드에 의해 기관 대 기관 통신에 대 한 정확한 정보를 제공 합니다-GPCRs. 가능 수정 및이 프로토콜의 응용 프로그램 또한 토론 된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1033px;" width="1032">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:295px;">Tungsten rod</td>
			<td style="width:327px;">A-M systems, Sequim, WA, USA</td>
			<td style="width:165px;">717000</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blu Tack</td>
			<td>Bostik, Paris, France</td>
			<td>3049100</td>
			<td>putty-like reusable adhesives</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Watch glass, square, 1 5/8 in</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan</td>
			<td>T900</td>
			<td>Phosphated buffered salts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCHa2</td>
			<td>SCRUM Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Custum-synthesized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ghrerin</td>
			<td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td>
			<td>4372-s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nociceptin</td>
			<td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td>
			<td>4313-v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Axio Imager A2</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Axio Imager A2</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>420957-9900-000</td>
			<td>water-immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P-725 PIFOC objective scanner with long travel range</td>
			<td>Physik Instrumente GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>piezoelectric-activated lens mover</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Confocal Scanner Unit CSU-W1</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-W1</td>
			<td>spinning disc confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImagEM C9100-13</td>
			<td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td>EM-CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">OBIS 488 nm LS 60 mW</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>1178770</td>
			<td>488-nm laser</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock, Rochester, NY, USA</td>
			<td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock, Rochester, NY, USA</td>
			<td>FF01-528/38-25</td>
			<td>emission filter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#181;Manager</td>
			<td>Open Imaging, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://micro-manager.org</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImageJ</td>
			<td>U. S. National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TurboReg</td>
			<td>Philippe Th&#233;venaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne</td>
			<td>N/A</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila

내 분 비 신호에 의해 기관 대 기관 통신 예를 들어 뇌에 주변에서은 항상성 유지 하기 위한 필수. 내 분 비 연구 모델 동물로, 초파리 melanogaster, 어떤은 정교한 유전자 도구 및 게놈 정보, 점점 사용 되고있다. 이 문서에는 초파리 뇌 explants의 칼슘 이미징 하는 방법을 설명합니다. 이 메서드는 직접 뇌에 호르몬의 신호 감지 수 있습니다. 그것은 잘 알려진 많은 펩 티 드 호르몬 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs), 누구의 활성화 세포내 캘리포니아2 +농도 있는 증가 일으키는 통해 행동. 신경 활성화는 또한 세포내 캘리포니아2 + 레벨을, 캘리포니아2 + 유입 및 캘리포니아2 + 바인딩과 그물 (ER)에 저장 된 자료를 올린다. 칼슘 센서, GCaMP, 이러한 Ca2 + 변화를 모니터링할 수 있습니다. 이 방법에서는, GCaMP의, 신경에 표현 하 고 GCaMP을 표현 하는 애벌레 뇌를 해 부하 고 교양 비보 전. 테스트 펩 티 드 다음 뇌 explant에 적용 되 고 형광 변화 GCaMP에 장착 된 CCD 카메라 회전 디스크 confocal 현미경을 사용 하 여 검색. 이 메서드를 사용 하 여 모든 수용 성 분자는 시험 될 수 있다, 그리고 신경 활성화와 관련 된 다양 한 셀룰러 이벤트 적절 한 형광 표시기를 사용 하 여 이미지 수 있습니다. 또한, 이미징 챔버를 수정 하 여 이미지 다른 초파리 장기 나 다른 동물의 장기를이 메서드를 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용 하는 펩 티 드 호르몬, CCHa2에 의해 뇌 인슐린 생산 세포 (IPCs)의 정품 인증 시험 되었다. 야생-타입 두뇌의 IPCs GCaMP6s로 표시 했다 dilp2-GAL412 (박사 Rulifson 선물), UAS-GCaMP6s13 (김 박사 선물)의 조합을 사용 하 여. 애벌레 두뇌 explants 합성 CCHa2 펩 티 드로 치료 했다 그리고 GCaMP6s에서 형광 실시간으로 기록 했다. 이 실험에서 이미지는 단일 초점 평면에서 얻은 했다. 각 IPC 클러스터 포함 약 14 셀14, 그리고 6 셀에 3에서 신호 감지 했다. GCaMP6s 신호 강도 CCHa2 행정 (그림 2영화 1) 극적으로 증가 되었다. 야생-타입 두뇌 렐 또는 Nociceptin에 대 한 확실 한 응답을 표시 하지 않았습니다 (영화 2 및 3, 각각), 초파리 homologue 없이 포유류 펩 티 드 호르몬입니다. 이 결과 CCHa2에 의해 IPCs의 관찰된 활성화 CCHa2에 대 한 특정 응답 임을 나타냅니다. CCHa2 CCHa2-R을 통해 작동 하는 여부를 명확 하 게 동일한 분석 CCHa2-R 돌연변이 두뇌를 사용 하 여 실시 했다. 신호 강도에 이러한 증가 돌연변이 두뇌 (동영상 4)에서 CCHa2 관리 후 관찰 되었다. 통계 분석 보여주 야생-타입 및 CCHa2-R 돌연변이 두뇌 신호 강도 차이 CCHa2 신청 후 2 분 이내 중요 한 되었다 적어도 7 분 (그림 2B) 유지 되었다. 이 결과 나타냅니다 IPCs 특별히 CCHa2 r.를 통해 CCHa2에 의해 활성화 된다 이 연구에 사용 된 모든 펩 티 드를 10-9 M의 최종 농도 산출 하는 PBS에 의해 희석 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57701/57701fig1.jpg"> 그림 1 . 이미징 챔버 (A) 작은 덴트와 tethering 막대 접시 (35 x 10 mm) 문화. (B) 고리 모양의 벽 퍼 티 같이 재사용할 수 있는 접착제의 만든. (C) 애벌레 두뇌 explant 이미징 챔버에 삽입. <a href="/files/ftp_upload/57701/57701fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57701/57701fig2.jpg"> 그림 2 . 칼슘 이미징 애벌레 두뇌 explant의 야생-타입 (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) 뇌 CCHa2, Ghrelin, 및 Nociceptin에 노출 되었다. CCHa2-R 돌연변이 (dilp2-Gal4, CCHa2-R탈-34/UAS-GCaMP6s, CCHa2-R탈-34) 뇌 CCHa2에 노출 되었다. IPCs에 GCaMP6s 신호 250 ms/프레임에 confocal 현미경 검사 법에 의해 감지 되었다. 여전히 선택한 시간 포인트의 이미지 (A)에 표시 됩니다. 이미지 pseudocolored 더 나은 다른 신호 강렬을 시각화 했다. 각 시간 지점에서 δ/F0 (B)에 그릴 했다. Δ/F0 는 10 다른 준비에 5에서 계산 했다. ROIs 같은 초점면에서 검색 된 셀 시체에 설정 했다. 단단한 라인 5 ~ 10 샘플의 평균 나타내고 점선의 평균 표준 오차의 위와 더 낮은 한계를 표시 합니다. 음영된 지역에서 실험 신호 변화를 나타냅니다. 눈금 막대는 50 µ m을 나타냅니다. 그림은 사노 외. 에서 적응 15. <a href="/files/ftp_upload/57701/57701fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie1.jpg"> 영화 1입니다. 야생-타입 IPCs CCHa2에 노출15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S1_WT_CCHa2.avi" target="_blank">여기를 클릭 하십시오이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie2.jpg"> 영화 2입니다. 야생-타입 IPCs Ghrelin에 노출15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S2_WT_Ghrelin.avi" target="_blank">여기를 클릭 하십시오이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie3.jpg"> 영화 3입니다. 야생-타입 IPCs Nociceptin에 노출15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S3_WT_Nociceptin.avi" target="_blank">여기를 클릭 하십시오이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/57701/57701movie4.jpg"> 영화 4. CCHa2-R 돌연변이 IPCs CCHa2에 노출 15 <a href="/files/ftp_upload/57701/Movie_S4_CCHa2_mutant_CCHa2.avi" target="_blank">여기 클릭 하십시오이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila at JoVE.com

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

이 종이 초파리 뇌의 칼슘 이미징 비보 전 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 천연 또는 합성 화합물은 뇌의 특정 신경 세포를 활성화 하는 능력을 테스트 하는 버퍼에 적용할 수 있습니다.

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

ex-vivo-calcium-imaging-for-visualizing-brain-responses-to-endocrine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

9.1K 조회수.  Nagoya University. 이 종이 초파리 뇌의 칼슘 이미징 비보 전 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 천연 또는 합성 화합물은 뇌의 특정 신경 세포를 활성화 하는 능력을 테스트 하는 버퍼에 적용할 수 있습니다.

비디오: Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

연구

신경과학

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

행동과 자극 반응 도중 전체 두뇌 화상 진찰을 위한 성인 Drosophila melanogaster를 준비합니다

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

마우스 의 생체 칼슘 이미징에서 맛 자극에 신경절 신경 반응

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

생체 내 트랜스제닉 마우스의 뇌 성 구체 칼슘 및 혈역학 이미징

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...