Kavramsallaştırma, HC ve Z. s. F.; Soruşturma, H. C., J. C ve Z. s. F; Kaynaklar, Z. s. F.; Yazma - orijinal taslak, ı. A. s.; Yazma-İnceleme ve düzenleme, ı. A. s., J. C., H. C., S. L. T. ve Z. s. F.; Görselleştirme, H. C.; Gözetim, Z. s. F.; Satın alma, Z. s. F ve F. s. L. finansman
Bir South Carolina iyileştirilmesi öğretmen kalitesi yüksek öğrenim durumu başlıklı Grant tarafından desteklenen proje, artırılması orta sınıflarda Bilim Öğretmenler bilgi bitki işlemleri, yapıları ve işlevleri ile nişan bitki Bilimleri Araştırma (bitki Bilim)
Birleşik Sates Department of Education tarafından (CFDA numarası 84.367B) ödül fonları
Yazarlar Dr Nian Wang Florida Üniversitesi genomik DNA örnekleri sunan için teşekkür etmek istiyorum Citrus sinensis Valencia bulaşmış.

1. bitki doku genomik ekstraksiyon kiti kullanarak genomik DNA izole
<ol><li>Bütün taze temiz makas kullanarak bir narenciye ağaçtan yaprak ve yaprak temiz plastik sandviç torbaya koyun kesme narenciye yaprak dokusu elde. Not: yaprak dokusu içeren torba 4 ° C buzdolabı veya buz izole edilmiş bir kap içinde bozulma önlemek için en kısa zamanda toplandıktan sonra yerleştirilmelidir.</li>
	<li>Bir harç ve havaneli chill için sıvı azot az miktarda ekleyin. Onlar soğutma, yaprak dokusu, yaklaşık 1 kare inç boyutunda küçük bir parça kesmek için makas kullanın. Kesme doku anında dondurmak için havanda yerleştirin. Daha fazla sıvı azot, gerekirse ekleyin. Not: İzoleli eldiven her zaman sıvı azot taşıma sırasında giyilmelidir.</li>
	<li>Hızlı bitki doku harçla ince bir toz eziyet. Tamamen sıvı azot buharlaşır ve ince yeşil toz kalır kadar taşlama devam edin.</li>
	<li>Kısa bir süre için 10-15 s sıvı azot metal bir spatula chill sonra zemin dokusu içinde harç spatula kullanarak 1.5 mL microcentrifuge tüp kepçe.</li>
	<li>600 µL çekirdeği lizis çözüm Ekle 1000 µL pipet (bakınız Tablo reçetesi) kullanarak ve girdap örnek için 1-3 s, daha sonra kuluçkaya 15dk için 65 ° C su banyosunda.</li>
	<li>10µL pipet lysate kullanmaya RNase çözüm 3 µL ekleyin, tüp 2 - 5 kez karıştırın ve bir kabine kuluçka 15dk için 37 ° C'de kuluçkaya için ters çevir. Not: devam etmeden önce oda sıcaklığında soğumaya karışım izin verin.</li>
	<li>200 µL Protein yağış çözüm, girdap 20 s için yüksek hızlı, sonra 3 dk santrifüj adlı bir firma Pelet oluşturmak için 13.000 x g de ekleyin. Örnek centrifuged iken, oda sıcaklığında isopropanol 600 µL taze 1.5 mL microcentrifuge tüp ekleyin.</li>
	<li>1000 µL pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde süpernatant isopropanol içeren taze 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarma centrifuged örnekten çıkarın. Pelet şimdi atılabilir. Not: süpernatant protein ile Pelet yukarıda süpernatant minik bir miktar terk ederek bulaşıcı kaçının.</li>
	<li>DNA iplik benzeri lifler bir kitle görünür hale gelinceye kadar tüpü ters çevir, sonra oda sıcaklığında 1 dk. için 13.000 x g, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant dikkatle boşaltmak, 600 µL % 70 etanol için Pelet eklemek, tüp birkaç kez DNA yıkama ve 13.000 x g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi için ters çevir.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde gevşek DNA Pelet bırakarak etanol, Aspire edin sonra açın ve emici kağıt üzerine istirahat Tüp, tersine çevirin. Hava kuru 15 dakika oda sıcaklığında.</li>
	<li>DNA rehidrasyon çözeltinin 100 µL kurutulmuş DNA Pelet ekleyin, sonra düzenli olarak tüp dokunarak karıştırma sırasında bir 65 ° C su banyosu için 1 h, DNA'da kuluçkaya.</li>
	<li>Arıtılmış su 1 µL bir microcuvette ve boş kullanılmak üzere bir spektrofotometre içine yerleştirin. Örnek 1 µL microcuvette koyup spektrofotometre ekleme DNA mevcut konsantrasyonu hesaplayın. DNA toplama (ng/µL) (bir260-320) olarak hesaplanan × seyreltme faktörü × 50 ng/µL olabilir. Not: Protokol burada duraklatılmış. Örnek 4 ° C'de depolanan</li>
</ol>2. PCR genomik DNA örnekleri üzerinde gerçekleştirin
<ol><li>Birleştirmek 10 µL 2 x PCR Master Mix ( malzemelerin tabloyabakın), 1 µL ileri astar (10 pM/µL), 1 µL ters astar (10 pM/µL) (bkz Tablo 2 . astar dizileri için) 100 ng genomik DNA örneğinden ayıklanmış ve arıtılmış su (ilâ 20 µL son hacim) bir 50 µL PCR Tüp, flick karıştırın ve kısaca santrifüj.</li>
	<li>PCR tüp thermocycler eklediğinizde ve buna göre (bkz. Tablo 1). Not: Protokol burada duraklatılmış. Reaksiyon tamamlandıktan sonra gerekirse, örnek 4 ° C'de depolayın.</li>
</ol>3. bir özel jel güçlendirilmiş DNA'da electrophorese
<ol><li>0.4 g özel toz tartmak ve temiz 200 mL Erlenmeyer flask, ilâ 50 mL dolum için 1 x TAE arabellek ile birlikte ekleyin.</li>
	<li>Mikrodalga 1,5 dk her 30 sallayarak, yüksek s, özel tamamen eriyene kadar. Not: Yanık önlemek için sıvı özel taşıma sırasında İzoleli eldiven giyilmelidir.</li>
	<li>10 mg/mL arasında etidyum bromür 2.5 µL sıvı özel ve shake karıştırın ekleyin, sonra bir seviye jel kalıp içine sıvı özel jel dökmek. Hızlı bir şekilde standart 12-diş jeli tarak dökme sonra ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 20 dakika serin, daha sonra jel tarak kaldırmak jel izin ve jel ile 1 x TAE tampon dolu bir düzey jel kutusu içine yerleştirin.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak, toplam güçlendirilmiş DNA örnekleri kuyu yükleyin. 5 µL DNA örneklerini ayrı bir kuyudan içinde merdiven ( Tablo malzemelerigörmek) ekleyin.</li>
	<li>Örnekleri için bir sabit 90 V, 35 dk. electrophorese sonra jel çıkarın ve bir UV transilluminator yerleştirin.</li>
	<li>Fotoğrafını çekip 302 UV transillumination kullanırken deseni bantlama jel analiz nm.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Field Office, F. l. o. r. i. d. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).</li><li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+citrus+greening+on+citrus+operations+in+Florida.">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).</li><li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).</li><li>UICEP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology. , (2013).</li><li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria.">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li><li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+(huanglongbing)+bacterium+&amp;#34;Candidatus+Liberibacter+asiaticus&amp;#34;+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers.">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &amp;#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&amp;#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li><li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultivation+of+'Candidatus+Liberibacter+asiaticus'+with+actinobacteria+from+citrus+with+huanglongbing.">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li><li>Department of Agriculture &amp; National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).</li><li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bov&#233;, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+&#946;+operon.">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the &#946; operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li><li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions.">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).</li><li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing.">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li></ol>

Huan Chen, Ian Arthur Palmer, Jian Chen, Ming Chang, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu ve Zheng Qing Fu hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Tüm adımları tam olarak en iyi deneysel koşullar elde etmek için takip çok önemlidir. Bütün yaprak dokusu bu gösteri sırasında kullanılan; Ancak, protokol teorik olarak her türlü bitki doku eklemek için değiştirilebilir. Daha önce araştırmacılar, bütün yaprak doku yerine yaprak damar dokusu, genomik DNA elde ve benzer sonuçlar11elde. Narenciye FBOX gene ile karşılık gelen grup görünmesini başarısız olursa, sonuç geçersiz olur ve bir veya daha fazla çalışma yordamdaki bazı teknik hatalar olabilir. Yaygın hataları şunlardır: kontamine veya uygun olmayan şekilde steril su, micropipette ipuçları veya microcentrifuge tüpler; PCR karışımında veya genomik DNA ekstraksiyon sırasında gerekli bir veya daha fazla bileşen eklemek başarısız; uygun thermocycler koşulları korumak başarısız; reaktifler veya onların son kullanma tarihi diğer maddeler kullanarak; zayıflık-e doğru eklemek etidyum bromür ya da başka bir DNA leke özel jel; güçlendirilmiş DNA çok yüksek bir gerilim veya çok uzun süre electrophoresing; ve eski veya hatalı karma TAE arabellek ya da sadece su TAE tampon yerine jel kutusunu doldurmak için kullanarak.
Astar LAA2_F ve LAJ5_R olan Liberibacter asiaticum ve africanum belirlemekte onların başarısı nedeniyle önceki araştırmadan seçilmiştir. Bu astar ribozomal altbirimde genler rplA ve güçlendirilmiş bir 669 bp parçası C. verimli rplJ, yükseltmek l. africanum veya C. bir 703 bp parçası l. asiaticum9. Astar LSS_F ve LSS_R bu tahlil için kurulan yanlış negatif oranı düşük, doğruluk ve özgüllüğü nedeniyle önceki araştırmadan C. için seçilmiştir l. asiaticum. LSS astar küme tüm üç 16S rDNA genler C. içinde mevcut bir 500 bp sırayla güçlendirir l. asiaticum6. FBOX astar bir iç amplifikasyon kontrolü olarak kullanılmak üzere inşa edildi ve narenciye bitkilerde bulunan 400 bp sırası yükseltmek. Önceki araştırma FBOX stabil narenciye bitkilerde ifade edilir ve bu tahlil RT-qPCR10için adapte bir referans gen olarak kullanmak için mükemmel bir aday yapmak gösterir.
Bu tahlil narenciye doku herhangi bir türü için kullanılacak adapte edilebilir ve RT-qPCR gibi ek PCR tabanlı deneyleri kullanılmak üzere değiştirilebilir. Bu tahlil sınırlamaları az, ve en geleneksel PCR doğasında vardır. Bu sınırlayıcı faktörler şunlardır: etanol veya inhibitör diğer kimyasalların PCR karışımı, daha gelişmiş bir tahlil, bir thermocycler daha küçük laboratuvarlarında ve DNA kirlenme varlığı için ihtiyaç gerçekleştirmeden Nefelometri eksikliği varlığı.
Bu testin özgüllüğü doğrudan daha özel RT-qPCR Yöntemler göre yapılmış değil, bu tahlil bilim adamları olan liberibacter üzerinde araştırma yapmak için yararlıdır ve potansiyel olarak teşhis etmek isteyen çiftçiler narenciye enfekte ağaçlar kendi alanlarında, özellikle daha belirgin yöntemler kullanılabilir veya maliyet-etkin değilse. Gerçekten de, bu bir tek narenciye üretici veya araştırmacı hızlı ve ucuz birkaç yüz örnekleri birkaç gün içinde çok kanallı pipetler pahalı bir RT-qPCR thermocycler satın almadan birkaç 96-şey plakaları ile kombine kullanarak tahlil ki akla yatkın.

Narenciye greening, olarak da bilinen huanglongbing, narenciye ağaçları önemli bir kaybına neden oldu. Florida, bir % 70 azalma Florida portakal kutu üretiminde 244 milyon kutularından 1997-1998 sezonunda 70 milyon kutularına aynı derecede-in 2016-2017 sezon1neden olduğu hastalık nerede tahmini bir temsilcisi durumdur. Florida narenciye ağaçları % 90'ı enfekte2var ve bu Florida narenciye sanayi neyin narenciye greening3önemli rol oynar, narenciye hastalıklar nedeniyle her yıl yaklaşık bir milyar dolar kaybeder tahmin edilmektedir. Narenciye greening öncelikle invaziv Asya narenciye psyllid tarafından Diaphorina citri, yaymak ama da virüslü dokusunun. aşılama tarafından yayılır Damarlar, asimetrik sarı yaprak distrofileri, erken yapraksızlaşma, dal dieback, kök çürümesi ve ölüm bitki sarılık hastalığı neden olur. Önemlisi, hastalık nadiren meyve üreten çiçek Sezon dışında üretmek için narenciye bitki neden olur. Virüslü narenciye bitkiler tarafından üretilen meyve olgunlaşmamış, yeşil ve acı4tatma.
Bu yöntemin amacı doğru olduğunu ve tam olarak hareketli bakteri olan liberibacter spp., narenciye greening virüslü narenciye ağaçları5phloem içinde yaşayan, hastalığının tanımlar. Genomik DNA canlı bakteri içeren bütün yaprak dokudan elde edilir. Bu ayıklanan genomik DNA'yı nerede oligonucleotides bakteri'nın 16S rDNA dizisine tamamlayıcı bu dizi yükseltmek için kullanılan geleneksel PCR için şablon olarak kullanılır. Oligonucleotides bir narenciye FBOX gen için tamamlayıcı bir iç amplifikasyon denetimi olarak kullanılır. Bu yöntemi kullanmak seçtik çünkü önceki araştırma6' başarılı olmak için kanıtlanmış oldu.
Bu yöntem basit, nispeten ucuz ve herhangi bir normal donanımlı Biyokimya Laboratuarı'nda gerçekleştirilen mümkün olmanın avantaj vardır. Buna ek olarak, PCR Bu patojen7ve patojen'ın yeteneği hayatta kalmak ve yıl için asemptomatik ana bilgisayar8içinde yeniden zorluğu nedeniyle bu patojen tespit için en doğru ve kesin yöntem kalır. Birçok farklı uzmanlık PCR deneyleri başarılı bir şekilde bu patojen tespit etmek için kullanılmıştır; Ancak, geleneksel PCR basit tahlil için doğru ve belirli algılama, özellikle asemptomatik ana bilgisayarlar8içinde kalır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">A1120</td>
			<td style="width:111px;">Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid nitrogen</td>
			<td>Air Products</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mastercycler pro with control panel</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6321000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1250 W Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5424 table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-403-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isotemp 215 digital water bath</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15-462-15Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metal spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z283274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mortar and pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LSE Vortex Mixer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 10 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1161-3730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 200 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1163-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 1250 &#956;L tips</td>
			<td>TipOne</td>
			<td>1161-1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Variable Volume Pipettor Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75788-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;cuvette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6138000018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stackable casting tray and combs</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>213655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-Sub Cell GT System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biospectrometer basic</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2X Taq Green PCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forward Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reverse Primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water, PCR grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3315953001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel Doc XR+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 KB+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specific and accurate detection of the citrus greening pathogen candidatus liberibacter spp. using conventional pcr on citrus leaf tissue samples

Narenciye greening, olarak da bilinen huanglongbing, narenciye çiftlikleri küresel ravaging yıkıcı bir narenciye hastalıktır. Bu hastalık asimetrik sarı yaprak distrofileri, damar sararma, yapraksızlaşma, kök çürümesi ve sonuçta, narenciye bitkinin ölümüne neden olur. Ne zaman bulaştırmak, narenciye bitki büyüme bodur ve çiçek sezon dışı üretmek. Bu çiçekler, nadiren meyve verim ve bu da küçük, sert, düzensiz şekilli Narenciye meyve bu verim tercih edilmez. Bu hastalık Asya narenciye psyllid, Diaphorina citri ve virüslü narenciye dokusunun aşılama tarafından yayılır. Patojen narenciye bitki içinde bir uzun ve değişken kuluçka dönemi vardır — bazen belirtiler ortaya çıkmadan önce yıl. Bu patojen vitro kültür girişimlerini muhtemelen düşük nedeniyle başarısız oldu ve düzensiz konsantrasyon patojenin içinde narenciye doku enfekte veya çevre çoğaltmak zor olduğundan büyümesine elverişli koşullar patojen. Bu, onun uzun bir kuluçka dönemi ve araştırmacıların patojen kültür yetersizlik nedeniyle yayıldı önce hastalık tespit etmek çok zordur. Sonuç olarak, hastalık sadece aniden bir narenciye çiftçinin tüm verim yok sonra ortaya çıkıyor. Burada sunulan narenciye greening patojen olan liberibacter spp. genomik DNA ekstraksiyon kiti ve PCR kullanarak doğru ve belirli algılanması için bir yöntemdir. Bu yöntem basit, verimli, uygun maliyetli ve kantitatif analiz için uyarlanabilir. Bu yöntem narenciye herhangi bir doku kullanmak için adapte edilebilir; Ancak, bu potansiyel olarak patojen dokuda mevcut miktarı ile sınırlıdır. Yine de, bu yöntem daha önce virüslü narenciye bitki tanımlamak narenciye çiftçilerin izin ve daha da yayılabilir önce yıkıcı bu hastalığın yayılmasını engellemek.

500'e karşılık gelen ayrı bir grup olumlu bir sonuç üretir olan Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, ve/veya 700 için karşılık gelen ayrı bir grup için bp bp Laa2/Laj5, 16S ribozomal β bir INSERT için operon9. İç amplifikasyon kontrol grubu da 400 görünmelidir bp. Bu grup narenciye FBOX gene10amplifikasyon için karşılık gelen ve bir sonuç geçerli kabul edilmesi görünmesi gerekir (resim 1 ve Şekil 2). Her iki 500 eksikliği bp ve 700 400 bp Wataha mevcut iken bp bantları negatif bir sonuç temsil eder. PCR sağlıklı örnekleri üzerinde performans yaklaşık 700 bazı non-spesifik bantlama desenler verim bp ve 400 bp; Ancak, yalnızca tek bir kalın bant Bu moleküler ağırlık karşılık gelen olumlu sonuç (Şekil 1) gösterir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>İşlemi</td>
			<td>Temp.</td>
			<td>Zaman</td>
			<td>Döngüleri</td>
		</tr>
<tr>
<td>İlk denatürasyon</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>3 - 5 dk</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denatürasyon</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>30 sn</td>
			<td rowspan="3">35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tavlama</td>
			<td>55 ° C</td>
			<td>30 sn</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kopma uzaması</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>40 sn</td>
		</tr>
<tr>
<td>Son uzama</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>10 dk</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Hedef 16S rDNA genler ve narenciye FBOX yükseltmek için kullanılan Thermocycler ayarlar.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adı astar</td>
			<td colspan="2">Sıra</td>
			<td>Başvuru</td>
		</tr>
<tr>
<td>LAA2_F</td>
			<td colspan="2">5'-TAT AAA GGT TGA SKK TTC GAG TTT-3'</td>
			<td>Hocquellet, ve ark., 1999</td>
		</tr>
<tr>
<td>LAJ5_R</td>
			<td colspan="2">5'-ACA AAA GCA GAA ATA GCA CGA ACA A-3'</td>
			<td>Hocquellet, ve ark., 1999</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBOX_F</td>
			<td colspan="2">5'-TTG GAA YASASI CTT TCG CCA CT-3'</td>
			<td>Bu tahlil</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBOX_R</td>
			<td colspan="2">5'-AGC AGA SKK GGC TAT TAT ACG YASASI G-3'</td>
			<td>Bu tahlil</td>
		</tr>
<tr>
<td>LSS_F</td>
			<td colspan="2">5'-GGA GAG GTG AGT GGA ATT MOLDOVA'DA A-3'</td>
			<td>Fujikawa, ve ark., 2012</td>
		</tr>
<tr>
<td>LSS_R</td>
			<td colspan="2">5'-ACC CAA KEDİ CTA GGT AAA AAC C-3'</td>
			<td>Fujikawa, ve ark., 2012</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2. Astarlar, DNA dizisi ve başvuru adını.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57240/57240fig1.jpg"> Şekil 1. Geleneksel PCR analizini dört virüslü narenciye yaprak doku örnekleri ve iki heathy örnek negatif denetimleri kullanılan kaynaklanır. 'gDNA' genomik DNA örneği çıkarılan narenciye yaprak dokudan gösterir. Örnekleri gDNA 1 ve gDNA 4 olan bulaşmamış narenciye yaprak örnekleri; gDNA 2, 3, 5 ve 6 olan liberibacter asiaticum (Clas) enfekte örnekleri vardır. DNA iletişim kuralında yazılı olarak ayıklandı. PCR Protokolü (bakınız Tablo 1) başına bir şablon olarak ayıklanan genomik DNA'yı kullanarak gerçekleştirildi. LAA2/LAJ5, LAS606/LSS ve FBOX kullanılan astar kümeleri (bkz: Tablo 2) bakın. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57240/57240fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57240/57240fig2.jpg"> Şekil 2. Üç güçlendirilmiş gDNA örnek tam jel fotoğrafı. 1 sağlıklı narenciye doku örneğidir; 2 ve 3 enfekte Clas doku örnekleri örneklerindendir. Bu örnekler gDNA 1, 2 ve 3, Şekil 1' de görüldüğü gibi karşılık gelir. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57240/57240fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples at JoVE.com

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Narenciye Greening narenciye bitkileri genel olarak etkileyen özellikle yıkıcı bir hastalıktır. Burada sunulan basit bir yöntem PCR ve narenciye yaprak doku genomik DNA ekstraksiyon narenciye greening patojen olan liberibacter spp. doğru ve kesin tanımlaması için kullanıyor

Belirli ve narenciye Greening patojen olan liberibacter spp. kullanma geleneksel PCR narenciye yaprak doku örnekleri üzerinde doğru tespiti

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

specific-accurate-detection-citrus-greening-pathogen-candidatus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

7.6K Görüntüleme.  University of South Carolina. Narenciye Greening narenciye bitkileri genel olarak etkileyen özellikle yıkıcı bir hastalıktır. Burada sunulan basit bir yöntem PCR ve narenciye yaprak doku genomik DNA ekstraksiyon narenciye greening patojen olan liberibacter spp. doğru ve kesin tanımlaması için kullanıyor

Video: Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of agricultural waters. Here, water is filtered through sterile Modified Moore Swabs (MMS), which consist&#160;of a simple gauze filter enclosed in a plastic cartridge, to concentrate bacteria. Following filtration, non-selective or selective enrichments for the target bacteria are performed in the MMS. For colorimetric detection of the target bacteria, the enrichments are then assayed using paper-based analytical devices (&#181;PADs) embedded with bacteria-indicative substrates. Each substrate reacts with target-indicative bacterial enzymes, generating colored products that can be detected visually (qualitative detection) on the &#181;PAD. Alternatively, digital images of the reacted &#181;PADs can be generated with common scanning or photographic devices and analyzed using ImageJ software, allowing for more objective and standardized interpretation of results. Although the biochemical screening procedures are designed to identify the aforementioned bacterial pathogens, in some cases enzymes produced by background microbiota or the degradation of the colorimetric substrates may produce a false positive. Therefore, confirmation using a more discriminatory diagnostic is needed. Nonetheless, this bacterial concentration and detection platform is inexpensive, sensitive (0.1 CFU/ml detection limit), easy to perform, and rapid (concentration, enrichment, and detection are performed within approximately 24&#160;hr), justifying its use as an initial screening method for the microbiological quality of agricultural water.

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (&#181;PAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

Kolorimetrik Algılama Paper-based<em&gt; Escherichia coli</em&gt;<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. Ve<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Tarım Su geniş hacimli

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Çevre

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

Eşzamanlı Niceleme için Dubleks Dijital PCR Testi<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ve Waters İnsan Fekal ilişkili HF183 Marker

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic pathway of dimethylarsinic acid (DMAV) thiolation, have been recently found in the environment as well as human organs. DMMTAV and DMDTAV can be quantified to determine the ecological effects of dimethylated thioarsenicals and their stability in environmental media. The synthesis method for these compounds is unstandardized, making replicating previous studies challenging. Furthermore, there is a lack of information about storage techniques, including storage of compounds without species transformation. Moreover, because only limited information about synthesis methods is available, there may be experimental difficulties in synthesizing standard chemicals and performing quantitative analysis. The protocol presented herein provides a practically modified synthesis method for the dimethylated thioarsenicals, DMMTAV and DMDTAV, and will help in the quantification of species separation analysis using high performance liquid chromatography in conjunction with inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP-MS). The experimental steps of this procedure were modified by focusing on the preparation of chemical reagents, filtration methods, and storage.

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

This article presents modified experimental protocols for dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV) synthesis, inducing dimethylarsinic acid (DMAV) thiolation through mixing of DMAV, Na2S, and H2SO4. The modified protocol provides an experimental guideline, thereby overcoming limitations of the synthesis steps that could have caused experimental failures in quantitative analysis.

DMMTAV ve çevresel uygulamaları için DMAV kullanarak DMDTAV hazırlanması: sentez, arıtma ve onay

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management strategies that reduce the impact of the disease. Presently in many diagnostic laboratories, the polymerase chain reaction (PCR), particularly real-time PCR, is considered the most sensitive and accurate method for plant pathogen detection. However, laboratory-based PCRs typically require expensive laboratory equipment and skilled personnel. In this study, soil-borne pathogens of potato are used to demonstrate the potential for on-site molecular detection. This was achieved using a rapid and simple protocol comprising of magnetic bead-based nucleic acid extraction, portable real-time PCR (fluorogenic probe-based assay). The portable real-time PCR approach compared favorably with a laboratory-based system, detecting as few as 100 copies of DNA from Spongospora subterranea. The portable real-time PCR method developed here can serve as an alternative to laboratory-based approaches and a useful on-site tool for pathogen diagnosis.

Rapid and accurate detection of plant pathogens on-site, especially soil-borne pathogens, is crucial to prevent further inoculum production and proliferation of plant diseases in the field. The method developed here using a portable real-time PCR detection system enables on-site diagnosis under field conditions.

Toprak kaynaklı Phytopathogens bir taşınabilir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak yerinde moleküler tespiti

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

Bitki enfeksiyon Test: Sprey ve bitki patojeni Magnaporthe Grisea ile aşı yara-aracılı

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid impingement-based air sampling devices for efficacious concentration of negatively-charged viruses from bioaerosols. Thus, the resin serves as an additional concentration step in the bioaerosol sampling workflow. Nucleic acid extraction of the viral particles is then performed directly from the anion exchange resin, with the resulting sample suitable for molecular analyses. Further, this protocol describes a custom-built bioaerosol chamber capable of generating virus-laden bioaerosols under a variety of environmental conditions and allowing for continuous monitoring of environmental variables such as temperature, humidity, wind speed, and aerosol mass concentration. The main advantage of using this protocol is increased sensitivity of viral detection, as assessed via direct comparison to an unmodified conventional liquid impinger. Other advantages include the potential to concentrate diverse negatively-charged viruses, the low cost of anion exchange resin (~$0.14 per sample), and ease of use. Disadvantages include the inability of this protocol to assess infectivity of resin-adsorbed viral particles, and potentially the need for the optimization of the liquid sampling buffer used within the impinger.

An anion exchange resin-based method, adapted to liquid impingement-based bioaerosol sampling of viruses is demonstrated. When coupled with downstream molecular detection, the method allows for facile and sensitive detection of viruses from bioaerosols.

Anyon Exchange reçine kullanma Bioaerosols--dan virüs tespiti

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular substrates offer key advantages over cell-based aAPC, including precise control of signal presentation parameters and physical properties of the aAPC surface to modulate its interactions with T cells. aAPC constructed from anisotropic particles, particularly ellipsoidal particles, have been shown to be more effective than their spherical counterparts at stimulating T cells due to increased binding and larger surface area available for T cell contact, as well as reduced nonspecific uptake and enhanced pharmacokinetic properties. Despite increased interest in anisotropic particles, even widely accepted methods of generating anisotropic particles such as thin-film stretching can be challenging to implement and use reproducibly.
To this end, we describe a protocol for the rapid, standardized fabrication of biodegradable anisotropic particle-based aAPC with tunable size, shape, and signal presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo, along with methods to characterize their size, morphology, and surface protein content, and to assess their functionality. This approach to fabricating anisotropic aAPC is scalable and reproducible, making it ideal for generating aAPC for &#34;off-the-shelf&#34; immunotherapies.

Here, we present a protocol to quickly and reproducibly generate biologically inspired, biodegradable articifical antigen presenting cells (aAPC) with tunable size, shape, and surface protein presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo.

Yönbağımlı polimer yapay antijen hücreleri CD8 + T Hücre aktivasyonu için sunma imalatı

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Tilapia Gölü virüs kullanarak geleneksel RT-PCR ve SYBR yeşil RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Saf Yaprak Döken Standlarda Üç Farklı Yöntem Kullanılarak Yaprak Alan İndeksi Tahmini

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples

Clostridium perfringens (C. perfringens) is a prolific toxin producer and causes a wide range of diseases in various hosts. C. perfringens is categorized into five different toxinotypes, A through E, based on the carriage of four major toxin genes. The prevalence and distribution of these various toxinotypes is understudied, especially their pervasiveness in American retail food. Of particular interest to us are the type B and D strains, which produce epsilon toxin, an extremely lethal toxin suggested to be the environmental trigger of multiple sclerosis in humans. To evaluate the presence of different C. perfringens toxinotypes in various food samples, we developed an easy method to selectively culture these bacteria without the use of an anaerobic container system only involving three culturing steps. Food is purchased from local grocery stores and transported to the laboratory under ambient conditions. Samples are minced and inoculated into modified rapid perfringens media (RPM) and incubated overnight at 37 &#176;C in a sealed, airtight conical tube. Overnight cultures are inoculated onto a bottom layer of solid Tryptose Sulfite Cycloserine (TSC) agar, and then overlaid with a top layer of molten TSC agar, creating a &#34;sandwiched&#34;, anaerobic environment. Agar plates are incubated overnight at 37 &#176;C and then evaluated for appearance of black, sulfite-reducing colonies. C. perfringens-suspected colonies are removed from the TSC agar using sterile eye droppers, and inoculated into RPM and sub-cultured overnight at 37 &#176;C in an airtight conical tube. DNA is extracted from the RPM subculture, and then analyzed for the presence of C. perfringens toxin genes via polymerase chain reaction (PCR). Depending on the type of food sampled, typically 15&#8211;20% of samples test positive for C. perfringens.

Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples

The objective of this protocol is to detect different Clostridium perfringens toxinotypes in locally purchased foods, particularly epsilon toxin producing strain types B and D, without the use of anaerobic chambers.

Perakende Gıda Numunelerinde Clostridium Perfringens Toxinotypes Zenginleştirme ve Algılama

Clostridium perfringens (C. perfringens) is a prolific toxin producer and causes a wide range of diseases in various hosts. C. perfringens is categorized ...