Bu eser NIH AI099854 ve AI126742 için anahtar tarafından desteklenmiştir.

1. PFV neden E. coli ifadede
<ol><li>
PFV inç ifade plazmid (10 ng/μL) 1 μL E. coli BL21(DE3) pLysS 20 μL için Ekle (20 μL aliquot piyasada bulunan hücre vardır > 2 x 106 CFU/μg plazmid) 1,5 mL tüp içinde. Hafifçe dokunarak veya tüp flicking finger ile karıştırın. Kuluçkaya on Ice 5 dak.
	<ol>
<li>Isı şok tam olarak 30 42 ˚C s su banyosu ve 2 min için buz hemen dönün.</li>
		<li>Süper en uygun oda sıcaklığında suyu catabolite baskı (SOC) medya ile 80 μL ekleyin. 37 ˚C sallayarak dakikada (devir/dakika) 225 devrimler ile 1 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Bir 100 mm x 15 mm Petri kabına 25 mL Luria suyu (LB) agar içeren tarih karışımı 25 μL plaka (1 L LB agar: 10 g bacto-tryptone, 10 g NaCl, 5 g maya ekstresi, 15 g agar) ve 100 μg/mL Ampisilin (100 mg/mL stok çözelti).</li>
		<li>İkinci aynı tabakta dönüştürülmüş hücrelerin kalan 75 μL plaka. Gecede 37 ° C'de aşağı kapakları ile plakalar kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plakaları almak dönüştürülmüş E. coli. 3 mL LB aşılamak için bir koloni kullanın (1 L LB: 10 g bacto-tryptone, 10 gram NaCl, 5 g maya özü) bir 14-mL yuvarlak alt polipropilen kültür tüp 100 μg/mL Ampisilin ile desteklenmiştir. 225 rpm sallayarak ile 37 ˚C ~ 8 h için kuluçkaya.
	<ol>
<li>Kültür 3 mL 50 mL LB 100 μg/mL Ampisilin ve 34 μg/mL kloramfenikol (34 mg/mL stok çözelti) 250 ml Erlenmeyer şişesi ile takıma ekleyin. Gecede 37 ° C'de 225 rpm sallayarak ile Kültür kuluçkaya.</li>
		<li>Kültür 53 mL 1 L LB, 100 μg/mL Ampisilin ve 34 μg/mL kloramfenikol içinde 4 L Erlenmeyer flask aktarın. 37 ° C'de 225 rpm sallayarak ile kuluçkaya.</li>
		<li>600 optik yoğunluk ölçmek nm (OD600) kültürünün düzenli olarak. Başlangıçta, kültür OD600 her saat kontrol edin. Kültür istenen OD600ulaştığı gibi her 15 dakikada değil sarmak için kontrol edin. Kültür bir OD600 arasında 0,9 ve 1.0 için büyür. Şişeye bir buz banyosu aktarmak ve kültür sıcaklığını azaltmak için girdap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 mL kültür daha sonraki analizler için 1,5 mL tüp SDS-sayfa analizi denaturing tarafından aktarın.
	<ol>
<li>14.000 x g oda sıcaklığında, microfuge içinde 1 dk aralıklarla tarafından 1.5 mL tüp hücrelerde cips. Süpernatant atmak. Pelet 150 μL fosfat tamponlu tuz (PBS) pipetting tarafından resuspend. PBS ile veya olmadan CaCl2 ve MgCl2olabilir.</li>
		<li>2 SDS-sayfa örnek arabellek x 150 μL ekleyin (150 mM Tris-HCl, pH 6.8, % 1,2 SDS, % 30 gliserol, % 15 β-mercaptoethanol (βME), %0.0018 bromophenol mavi) ve damlalıklı veya girdap tarafından iyice karıştırın. -20 ° C'de 3 dk. deposu için kaynatın</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bakteri kültürü ekleyin: 0,25 mM izopropil-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, 0.25 M hisse senedi çözüm) ve 50 mikron ZnCl2 (50 mM stok çözelti) son bir konsantrasyon. IPTG üzerinden T7 organizatörü PFV inç gen ifadesi indükler ve ZnCl2 PFV inç Incubate 4 h için 225 rpm'de hemen sallayarak ile Kültür 25 ° C'de bir amino terminal çinko parmak etki alanının doğru katlanır için ek olarak eklendi şişeye bir buz banyosu aktarın. 1 mL kültür SDS-sayfa analizi 1.3 içinde yukarıdaki gibi aynı protokol sonrası için sakla.</li>
	<li>
Bakteri kültürü uygun ölçekli santrifüj şişe aktarın. Örneğin, bir 1 L kültür dört steril tek kullanımlık 250 mL konik alt polipropilen Şişeler için transfer edilebilir. 20 dk 4 ˚C az için 3000 x g de buzdolabında bir masa üstü santrifüj şişelerde spin. Supernatants dökerek atmak.
	<ol>
<li>Tüm 25 mL (6.25 mL şişe başına) soğuk PBS (ile ya da ezelî CaCl2 ve MgCl2) toplam hacmi 1 L bakteriyel kültüründe çökeltilerini pipetting tarafından resuspend. Birleştirmek ve bakteriyel süspansiyonlar bir 50 mL konik tüp için transfer. 3000 x g de soğutmalı santrifüj 4 ° C'de 20 dk içinde spin Süpernatant dökme veya pipetting atın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bakteriyel Pelet 10 mL resuspension arabellekte (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl ve 500 mikron phenylmethylsulfanoxide (PMSF) proteaz inhibitörü) pipetting tarafından resuspend. Ek bir Dewar şişesi ile sıvı azot 50 mL tüp daldırın için yeterli tüp yerleştirerek Pelet dondur. Dikkatle sıvı azot tüpü çıkarması ve-80 ° C'de depolayın Not: Bakteriyel granül birkaç ay-80 ° C'de depolanmış olabilir -80 ° C depolama iki yıldır takip aktif protein kaybı olmadan gördük.</li>
	<li>
İndüksiyon öncesi ve sonrası indüksiyon örnekleri 8.3 cm genişliğinde, 7,3 cm yüksek, 0,75 mm kalın SDS-sayfa jelleri katman yığınlama 1,5 mL % 6 polyacrylamide ile analiz (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, % 6 Akrilamid, % 0,1 SDS, % 0,1 amonyum persülfat, %0,001 TEMED) ve 3,5 mL % 10 Katman çözme polyacrylamide (375 mM Tris-HCl, pH 8.8, % 10 Akrilamid, % 0,1 SDS, % 0,1 amonyum persülfat, % 0.001 TEMED)12.
	<ol>
<li>Yığın jel dökme sonra 10 iyi tarak yerleştirin. Jel polimerli ne zaman sayfa aparatı monte ve yeterli SDS-sayfa çalışan arabellek (25 mM Tris, 192 mM glisin, % 0,1 SDS) ekleyin.</li>
		<li>Her örneğinin 10 μL ve prestained protein standartların 4 μL yük. Boya açık alt jel, yaklaşık 60 dk ulaşıncaya kadar 16,5 V/cm çalıştırın.</li>
		<li>Jel levha sökmeye ve jel için plastik bir küvet aktarın. Coomassie parlak mavi çözüm (%0.1 Coomassie parlak mavi R-250, % 40 metanol, % 10 Asetik asit) cömertçe jel kapak ve ortam sıcaklığı, 20 dk için leke için boyama ekleyin.</li>
		<li>Boyama çözüm dökerek kaldırın ve eski yerine koymak ile çözüm (% 40 metanol, % 10 Asetik asit) destain bantları kolayca görünür hale gelene kadar. Destaining çözüm dökerek kaldırın ve deiyonize su ile değiştirin. PFV inç sonrası indüksiyon örnekte kolaylıkla tanımlanmalıdır. PFV inç hexahistidine etiketi ile 47374 Da bir moleküler ağırlık vardır.</li>
		<li>PFV inç görünür değilse, bir dönüşüm plakaların farklı bir koloni ile başlayan indüksiyon yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. nikel benzeşme Kromatografi
<ol><li>Bir bakteriyel Pelet buz çözme. Not: Bu önemli zaman (yaklaşık 2-3 h) alacak. Pelet hücre Bulamaç çözdürülen, ek bir 500 mikron PMSF (100 mM stok çözelti) ekleyin.</li>
	<li>50 mL tüp bakteri Bulamaç buz üzerinde tutun. Bakteri için %30 30 genlik adlı solüsyon içeren temizleyicide s (1 s, 1 kapalı s) 1 L kültür 0,125 inç çapında 0,5 inç çapında biyolojik boynuzlu bir sonicator kullanarak elde Pelet başına konik microtip, 20 kHz frekans ve 400 W. maksimum güç</li>
	<li>Hücre örnek bir soğuk ultracentrifuge tüp aktarın. Polikarbonat şişe (25 mm çapında, 89 mm yükseklik) bir türü 60 Ti sabit açılı rotor ile uyumlu kullanabileceksiniz. Eğer aynı yerçekimi kuvveti elde alternatif tüpler ve rotorlar kullanılabilir. Spin 120.000 x g 4 ° C'de 60 dk Bariz bir Pelet olmalıdır. Süpernatant sarı bir renk olabilir.</li>
	<li>Süpernatant dökme veya soğuk 50 mL konik tüp pipetting aktarın. Not Ses; Bu birim yaklaşık buz gibi ek önce kullanılan resuspension arabellek hacmi olmalıdır. Süpernatant viskoz ise, Kromatografi sütun yapışmasına neden bakteriyel DNA tarafından kirlenmiş. Bu durumda, bakteriyel DNA cips ultrasantrifüj yineleyin.</li>
	<li>
500 mL hazırlamak bir (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 mikron PMSF) tampon ve 500 mL arabellek B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 mikron PMSF, 200 mM imidazole). Not: Bu protokol için hızlı protein sıvı Kromatografi (FPLC) sistemi, tüm tamponları ve örnek 4 ° C soğuk bir odada tutun.<ol>
<li>Steril filtre arabelleği A ve B 0,2 mikron tek kullanımlık filtre cihazları ile. FPLC sistemine bağlı olarak, yıkama pompası A ve pompa B arabellek A ve arabellek B, sırasıyla. Akış Arabellek A % 90 ve % 10 arabellek B iletkenlik ve UV okuma stabilize kadar sistemi aracılığıyla. Maksimum akış hızı araç üzerinde bağlıdır; bir akış hızı 5 mL/dk 1.0 MPa maksimum basınç limit ile kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>110 mm uzunluğunda, 5 mm çap FPLC sütun 1,5 mL nikel-ücret reçine ile hazırlamak (en fazla bağlama kapasitesi 50 mg/mL, maksimum basınç 1 MPa). Sütun bir gün arıtma önce hazırlanan ve 4 ˚C depolanır.</li>
	<li>Sütun FPLC araç olarak bağlayın. Sütun ile tampon A % 90 ve % 10 arabellek B (20 mM imidazole) bir akış hızı 0.5 mL/dk 20 mL 0.5 MPa maksimum basınç sınırı ile equilibrate. Araç iletkenlik ve 280 Absorbans UV gerçek zamanlı veri toplama nm (bir280). İletkenlik ve UV okuma stabilize. Bu ölçümler stabilize değil, akışı arabelleği üzerinden sütun için kararlı oldukları kadar devam.</li>
	<li>
0,15 mL/dk Debi maksimum basınç sınırı 0.5 MPa olan adresindeki sütun için protein örnek (~ 10 mL başına pelet) yükleyin. Debisi ve sütun basıncı arıtma boyunca aynı kalır. 50 mL tüp aracılığıyla akış toplamak.
	<ol>
<li>Sütun yıkama 20 mL arabellek A % 90 ve % 10 ile arabellek B. toplamak bir 50 mL tüp yıkama. Proteinler 20 mL doğrusal gradyan, %10 100 arabellek B (20 mM 200 mM imidazole için) ile elute.</li>
		<li>Son olarak, sütun 5 mL %100 arabellek B (200 mM imidazole) ile yıkayın. Degrade ve son yıkama toplamak 0,27 mL kesirler.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 x SDS-sayfa örnek arabelleği 15 μL 15 μL akışı aracılığıyla, yıkama ve tepe A280 kesirler ile birleştirir. Örnekleri 3 dakika kaynatın.
	<ol>
<li>İki %10 15 iyi tarak adımla 1.6 dışında daha önce açıklandığı gibi SDS-sayfa jelleri hazırlayın. Her örneği için jeller 10 μL ve prestained protein standartların 4 μL yük. Koşmak, leke ve jelleri 1.6 adımda anlatıldığı gibi analiz.</li>
		<li>Neredeyse saf PFV inç görsel inceleme üzerine dayalı içerecek şekilde görünür kesirler birleştirin. Pipetting tarafından genellikle 8-10 mL birimin tedbir.</li>
		<li>Bir Spektrofotometre kullanarak, birleştirilmiş kesirler A280 ölçmek ve PFV inç protein, toplam miktarı; ~ 10 mg-L indüklenen kültür bizim tipik verimidir. PFV inç yok olma katsayısı hexahistidine etiketiyle 59360 cm-1 M-1olduğunu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hexahistidine etiketi kaldırmak için PFV inç ile 10 mM dithiothreitol (DTT, 1 M hisse senedi çözüm) ve 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (0,5 M stok çözelti) ek. İnsan rhinovirus (HRV) 3 C proteaz mg PFV inç Incubate başına 15 μg gecede 4 ˚C ekleyin. Bölünme PFV inç molekül ağırlığı 47374 Da 44394 Da azaltır ve % 10 SDS-sayfa analizi tarafından doğrulanmadı.</li>
</ol>3. heparin benzeşme Kromatografi
<ol><li>
250 mL hazırlamak arabellek C (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 mikron PMSF) ve 250 mL arabellek D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 mikron PMSF, 1 M NaCl). Not: Bu protokol için FPLC sistem, tamponlar ve örnek 4 ˚C, soğuk bir odada tutulur.<ol>
<li>Steril filtre arabelleği C ve D 0,2 mikron tek kullanımlık filtre cihazları ile. FPLC sistemine bağlı olarak, yıkama pompası A ve pompa B arabellek C ve arabellek D, sırasıyla. Akış Arabellek C % 80 ve % 20 arabellek D iletkenlik ve UV okuma stabilize kadar sistemi aracılığıyla. Maksimum akış hızı araç üzerinde bağlıdır; Biz rutin 1.0 MPa maksimum basınç limit ile bir akış hızı 5 mL/dk kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bir 80 mm uzunluğunda, 5 mm çap FPLC sütun 1 mL heparin sepharose reçine (bağlama kapasitesi sığır 2.0 mg mL başına Antitrombin III reçine; maksimum basınç 1.4 MPa maksimum) ile hazırlayın. Sütun bir gün arıtma önce hazırlanan ve 4 ° C'de depolanan Sütun FPLC araç olarak bağlayın.
	<ol>
<li>Maksimum basınç sınırı 1 MPa olan arabellek C % 80 ve % 20 arabellek D (200 mM NaCl) bir akış hızı 0.5 mL/dk 20 mL ile sütun equilibrate. Araç iletkenlik ve 280 Absorbans UV gerçek zamanlı veri toplama nm (bir280). İletkenlik ve UV okuma stabilize. Bu ölçümler stabilize değil, akışı arabelleği üzerinden sütun için kararlı oldukları kadar devam.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PFV inç örnek 200 mm NaCl konsantrasyon 1,5 birimleri arabellek C. ekleyerek azaltmak Örneğin, 10 mL PFV inç için arabellek C 15 mL ekleyin Bizim toplam genellikle ~ 25 mL birimdir.</li>
	<li>
Yük heparin sepharose sütun, 0.5 mL/dk akış hızı maksimum basınç ile seyreltilmiş PFV inç örneğe 1.0 MPa sınırlayın. Debisi ve sütun basıncı arıtma boyunca aynı kalır. 50 mL konik tüp aracılığıyla akış toplamak.
	<ol>
<li>Yıkama sütun 20 mL % 80'i arabellek C ve arabellek D (200 mM NaCl), % 20 ile 50 mL konik tüp makinaya toplama. Sütun (200 mM 1 M NaCl ile) 30 mL doğrusal gradyan, %20 100 arabellek D ile elute.</li>
		<li>Yıkama sütun 5 mL % 100 arabellek d. ile 0.37 mL kesirler degrade ve son makinaya toplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yük, akış, yıkama ve kesirler 8 oranında analiz SDS-sayfa 2.9 içinde açıklandığı gibi. 44394 Da bir molekül ağırlığı PFV bölünme hexahistidine etiketinin aşağıdaki inç var ve yok olma katsayısı 59360 cm-1 M-1 hexahistidine etiketi olmadan kalır. 4 ˚C, tüm kesirler nükleaz tahlil tamamlanması kadar saklayın.</li>
</ol>4. nükleaz tahlil
<ol><li>
Neredeyse saf PFV inç birleştirmek 3 μL heparin kesir ve 50 içerecek şekilde görünür heparin sepharose kesirler tanımlamak ng 3 KB supercoiled plazmid DNA tepki tampon (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 mikron ZnCl2 10 mM DTT) 15 μL son hacmi ile. 90 dk. Ekle bir negatif kontrol için 37 ˚C ile hiçbir PFV inç, kuluçkaya
	<ol>
<li>1 mg/mL İndinavir K ile Reaksiyonu (20 mg/mL stok çözelti) DurdurveÇoğaltma % 0.5 SDS (% 10 hisse senedi çözüm). 1 h. örnekleri daha sonraki analizler için-20 ° C'de depolanmış olabilir için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
125 mL jel % 1 kilo başına birim (w/v) özel 1 x TAE tampon (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) 0.1 µg/mL arasında etidyum bromür (10 mg/mL stok çözelti)13ile hazırlayın. Özel çözüm eritin ve bir 15 cm x 10 cm jel döküm tepsiye dökün. 15 iyi tarak 5 mm genişliğinde, 0,75 mm kalın kuyu ile ekleyin. İnce wells 1.5 mm kalınlığında wells için karşılaştırıldığında daha iyi grup çözünürlük verim. Ortam sıcaklığında katılaşmaya jel izin.
	<ol>
<li>1 jel bırakın 0.1 µg/mL arasında etidyum bromür ile x TAE. Boya (% 50 gliserol, % 0.15 Orange G boya) yükleme x 6 3.5 μL nükleaz tahlil reaksiyonlar için ekleyin. Birimin tümü jel için yükleyin. Jel sabit voltaj, cm (100 V), ortam sıcaklığında 1 h için veya Orange G boya açık jel sonuna ulaşana kadar başına 10 volt çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hemen özel jel etidyum bromür algılamak için ayarla floresan bir tarayıcı ile resim. Doğrusal DNA 3 kb boyutu sadık çalıştırmalısınız, supercoiled DNA daha hızlı (~ 2 kb) çalıştırmalısınız ve rahat daire DNA yavaş (~3.5 kb) çalıştırmalısınız.
	<ol>
<li>Görüntü analiz yazılımı kullanarak, her şeritte supercoiled, doğrusal ve rahat daire plazmid piksel hacmi hesaplama. Birimler bu üç DNA formu "Toplam DNA" için değer ve doğrusal ve rahat daireler yüzdesini hesaplamak için kullanabilirsiniz piksel toplamı ara. Örneğin, rahat daireler piksel hacmi toplam DNA piksel değeri bu şeritte bölünür, bu numarayı bir yüzde belirlemek için 100 ile çarpmak. Bulaşıcı nükleaz içeren kesirleri doğrusal ve rahat daireler negatif denetimine göre daha yüksek bir yüzdesi görüntüler.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bulaşıcı nükleaz faaliyet gösterme heparin sepharose kesirler birleştirin. 10 mm 6-8 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO) diyaliz boru 1 L 50 mm Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 mikron ZnCl2, 10 mM DTT, % 20 gliserol karşı gecede 4 ° C'de diyaliz.</li>
	<li>Nükleaz serbest PFV inç örnek gelen diyaliz boru kurtarmak. A280 ölçmek ve son protein konsantrasyonu hesaplayın. Aliquot ve ek sıvı azot dondur. Aliquots-80 ° C'de depolayın</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases.">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li><li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus.">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration.">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li><li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+reaction+pathway+and+critical+intermediates.">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li><li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells.">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li><li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase.">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li><li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration.">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

DNA onarım proteinler, tek molekül mikroskobu uygulamalar veya retroviral integrases, oksijen gidericiler gibi DNA ile etkileşim rekombinant proteinler bakteriyel nükleaz2,3bulaşıcı özgür olmalıdır. Bu kirleticiler sonuçları yorumlama toplu biyokimyasal veya tek molekül deneyleri sırasında karışabilir.
Biz bir bakteriyel nükleaz sık PFV inç ile birlikte arındırır olduğunu bulduk Ancak, PFV inç bakteriyel nükleaz geçen madde1ile kolayca ayırt edilebilir heparin sepharose bir ilgi gösterir. Degrade elüsyon heparin sepharose takip her kesir faaliyete nükleaz dikkatli Nefelometri nükleaz ücretsiz PFV inç hazırlanması için anahtardır. Geçişin PFV inç ayrılması nükleaz kirletici izin vermek için yeterince sığ olması gerekir; dik bir degrade etkin ayırma ile uyumlu olmayabilir. Ayrıca, plazmid DNA substrat rahat daireler nükleaz tahlil arka plan azaltmak için düşük bir yüzde olması gerekir. Plazmid DNA substrat rahat daireler yüksek bir arka plan varsa, plazmid DNA yeni bir arınma yapılmalıdır. Nükleaz etkinliği tahlil bulaşıcı nükleaz ve atılmalıdır kesirler varlığı ortaya koymaktadır.
Bazı durumlarda, boyutu dışlama Kromatografi (sn) bulaşıcı nükleaz2kaldırılması için etkili bir yöntem olabilir. Önceki gruplar sn PFV inç4saflaştırılması sırasında kullandık. SN sınırlı yük hacme sahip ve en son protein konsantrasyonu azaltmak eğilimindedir. En büyük avantajı benzeşme ve iyon Kromatografi sn daha önemli ölçüde daha büyük bir hacim yük yeteneğidir
Nükleaz etkinlik için test bir bakteriyel nükleaz ile birlikte arındırmak farklı proteinler adapte olabilir. Burada bu PFV inç tanımlamak ve bulaşıcı nükleaz heparin sepharose Kromatografi tarafından ayrılmış. Biz daha önce PFV inç nükleaz Mono-S katyon ve bu reçineler bu protein için uygun olmayan hale Mono-Q anyon Satım Kromatografi ile benzer bir profile sahip olduğunu göstermektedir. Nükleaz ile ilgili olarak istenen protein benzeşimi özelliklerini bağlı olarak, bu iletişim kuralını benzeşme veya iyon değiştirme reçineler ve degrade elüsyon ile kullanılabilir. Etkili nükleaz kontaminasyon kaldırılması için anahtar--dan bir protein ilgi bir reçine için ilgi içinde bir fark vardır. Her kesir nükleaz etkinlik için denetlesinler gerekir. Bu protokol Kromatografi reçineler ile bakteri enzimler işbirliği arındırmak tüm proteinler için doğrudan uygulanmayabilir. Ancak, faiz ve raporlaması kesirler nükleaz etkinliği için bir protein nükleaz ayırmak için bir benzeşme veya iyon değiştirme reçine kullanarak genel kavram genel olarak uygulanabilir olabilir.

Protein etkileşimler DNA ile biyokimyasal ve tek molekül çalışmaları son derece saf rekombinant proteinler gerektirir. Enzimler bakterilerden bulaşıcı bu deneyleri sonuçları belirsiz. Bulaşıcı bir nükleaz müstahzarları rekombinant proteinlerin oksijen leş protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) ve Escherichia coli (e.coli)1 ' den izole prototip köpüklü virüs (PFV) integrase (IN) bulundu , 2 , 3.
Retroviral Tümleştirme deneyleri dönüşüm supercoiled DNA çentik ya da doğrusal ürünler için etkinlik4bir ölçüsü olarak güveniyor. Hücresel enfeksiyon sırasında inç bir viral cDNA iki ucu ana bilgisayar Kromatin5' e katıldı. Her iki ucu tepki katılmadan strand transferi olarak adlandırılır. Deneyleri rekombinant IN etkinliği iki DNA reaksiyonlar katılabilir miyim viral cDNA taklit biter bir hedefe DNA'sı uyumlu entegrasyon tepki4,5,6,7,8. Alternatif olarak rekombinant inç bir fizyolojik olarak sigara ilgili yarım sitesini Tümleştirme tepki9,10' tek bir DNA son üye olabilirler. Supercoiled plazmid DNA hedef olduğunda Tümleştirme, uyumlu entegrasyon ürünlerdir DNA doğrusallaştırılmış ve rahat daireler yarım sitesi Tümleştirme ürünlerdir. Bu reaksiyon ürünleri özel Jel Elektroforez1sırasında onların göreceli hareketlilik tarafından tanımlanır. Rekombinant inç bulaşıcı nükleaz varsa, sahte rahat daire veya muhtemelen doğrusallaştırılmış plazmid deneysel sonuçlar kafa karıştırıcı olacak. Viral DNA reaksiyonlar fluorescently kesin nükleaz ürünleri aksine entegrasyon ürünleri tanımlayan olarak etiketlenmiş olabilir. Ancak, içinde büyük ölçüde supercoiled DNA hedefleri iyilik; rahat daireler veya doğrusal DNA bulaşıcı nükleaz tarafından supercoiled plazmid kaybı sonuçları ve veri11yorumlanması çarpık. Böylece bakteriyel nükleaz MÜSTAHZARLARI retroviral kaldırmak için zorunludur.
PFV inç için heparin sepharose bakteriyel nükleaz1' e göre farklı bir ilgi vardır. PFV inç ve nükleaz heparin sepharose üzerinden doğrusal bir degrade elüsyon tarafından ayrılmış. Nükleaz kolayca 280 nm pik ultraviyole (UV) Absorbans veya analitik Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) tarafından algılanmaz. Bunun yerine, nükleaz supercoiled plazmid dönüşüm rahat daire veya doğrusal ürünler için istihdam nükleaz etkinliği tahlil tarafından algılanır. Heparin sepharose Kromatografi takip her kesir nükleaz etkinlik için test edilmiştir. PFV inç ve nükleaz kirletici Mono-Q anyon reçine için ilgi hiçbir fark var. Mono-S katyon reçine için ilgi küçük bir fark vardır. Ancak, Mono-S çözünürlüğe bakteriyel nükleaz ve PFV inç proteinlerin verimli ayrılık izin vermez. Sonuçta, heparin sepharose benzeşme arıtma PFV inç sunar bakteriyel nükleaz en iyi ayrılması ve sınırsız yük hacmi bir avantaja sahiptir.
Nükleaz etkinlik kirletici için test diğer proteinler için adapte olabilir. Faiz protein alternatif benzeşimi özelliklerini PFV inç daha büyük olasılıkla olacak; protein faiz ve nükleaz kirletici özelliklerini bağlama fark ampirik olarak belirlenmelidir. Nükleaz kirlenme tanımlamak için bu yöntem Mono-S katyon veya Mono-Q anyon Satım reçineler de dahil olmak üzere diğer reçineler adapte olabilir. Benzeşme ve iyon değiştirme reçineler enzimler protein birimdeki sınırsız Kromatografi sırasında bulaşıcı üzerinden ilgi rekombinant protein izole etmek için güvenilir bir yöntem sunabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BL21/DE3 Rosetta E. coli</td>
			<td style="width:180px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70956-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB broth</td>
			<td style="width:180px;">EMD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloramphenicol&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CI8280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">208086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure</td>
			<td style="width:180px;">Gojira Fine Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PMSF&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imidazole&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT&#160;</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure EDTA</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CA3510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA Superflow</td>
			<td style="width:180px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Heparin Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td style="width:180px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0998-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HRV14 3C protease&#160;</td>
			<td style="width:180px;">EMD Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">71493-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase

Retrovirüs prototip köpüklü virüs (PFV) integrase (IN) protein retroviral Tümleştirme mekanizmasının okuyan bir model enzimdir. IN diğer Retrovirüsler, PFV inç daha çözünür ve daha deneysel manipülasyon için mükellef karşılaştırılır. Ayrıca, klinik insan immün yetmezlik virüsü (HIV-1) inç inhibitörleri, PFV inç katalitik mekanizması HIV-1 inç inç viral Tamamlayıcı DNA (cDNA) hedef kovalent katılmadan tromboksan benzer olduğunu ima için duyarlıdır Bir işlemde DNA strand transfer aradı. Bu strand transfer reaksiyon nickler hedef DNA tanıtır. Entegrasyon reaksiyon ürünleri analizini benzer şekilde DNA nick nükleaz varlığı ile şaşırmış. Bakteriyel nükleaz rekombinant PFV inç Escherichia coli içinde (E. coli) ifade ile birlikte arındırmak için gösterilmiştir. Burada PFV inç bulaşıcı nükleaz heparin benzeşme Kromatografi tarafından izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Kesirler kolayca nükleaz kirlenme bir supercoiled Plazmid ve özel Jel Elektroforez için tarandı. PFV inç ve bulaşıcı nükleaz heparin sepharose rekombinant PFV inç nükleaz ücretsiz hazırlanması toplu biyokimyasal veya tek molekül analiz entegrasyon için uygun izin için alternatif benzeşim görüntüler.

Rekombinant PFV inç genellikle bakteriyel nükleaz1ile kirlenmiş. Biyokimyasal Tümleştirme deneyleri supercoiled plazmid DNA dönüşüm rahat daireler ve doğrusal ürünlerini Nefelometri bağlıdır. Bulaşıcı bir nükleaz varlığı bu deneyleri sahte Nefelometri için neden olabilir. PFV inç ifade hexahistidine etiketi ile E. coli (şekil 1) indüklenen ve ilk saf nikel benzeşme Kromatografi (Şekil 2). Kesirler neredeyse saf PFV inç ile birleştirilir ve hexahistidine etiket bir proteaz tarafından i ciddi. PFV inç ve bulaşıcı nükleaz heparin sepharose Kromatografi (şekil 3)1için farklı benzeşim olduğunu belirlediler. Heparin sepharose Kromatografi takip PFV inç kesirler için rahat daireler tahlil için supercoiled bir Plazmid ve doğrusallaştırılmış plazmid ile ürünler nükleaz faaliyet (şekil 4) inkübe. Bu tahlil protein kesirler nükleaz (şekil 5) olmadan tanımlamasını sağlar. Bu kesirler kombine, diyaliz ve gelecekteki deneyler için dondurulmuş.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig1.jpg"> Şekil 1: İndüksiyon E. coli olarak içinde PFV . Hücreleri (lane 2) önce kültürlerden ve (lane 3) indüksiyon analiz sonra PFV inç, 47374 da örnekleri varlığı için % 10 oranında ayrı kaldık SDS-sayfa ve Coomassie ile parlak mavi lekeli. 1 yolu, molekül ağırlığı işaretleri (kDa). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig2.jpg"> Resim 2: Nikel benzeşme Kromatografi kesirler. Çözünür bakteriyel lysates nikel benzeşme Kromatografi tarafından ayrı kaldık. PFV inç hexahistidine etiketi ile 20 mm 200 mM imidazole için doğrusal gradyan ile eluted. Kesirler % 10 oranında değerlendirilmiştir SDS-sayfa ve Coomassie ile parlak mavi lekeli. PFV inç, 47374 Da, sütun (yük) yüklü örnek kolayca açıkça görülür, ancak daha az belirgin akışı veya yıkama. Erken imidazole degradede yaygın olarak elute kesirler 75 kDa yanı sıra bazı daha hızlı hareket eden kirletici yakınındaki bir daha yavaş hareket eden geçen madde veya 25 kDa altında görüntüler. İmidazole daha yüksek konsantrasyonları orada kolayca belirgin hiçbir kirletici ve PFV inç nispeten saf gibi görünüyor. Bu örnekte, kesirler #33 #84 ile kombine ve daha fazla saf. Moleküler ağırlık işaretleri (kDa) her jel sol tarafta vardır. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig3.jpg"> Şekil 3 : Heparin sepharose Kromatografi PFV ın 1 . Nikel benzeşme ve proteaz kaldırılması hexahistidine etiketi, heparin sepharose tarafından PFV (44394 Da) içinde şeker. Proteinler 200 mm'den doğrusal gradyan için 1 M NaCl ile eluted. Hatta kesirler #12 #44 8 SDS-sayfa Coomassie ile mavi lekeli oranında değerlendirildi. Moleküler ağırlık işaretleri (kDa) her jel sol tarafta vardır. Bu kesirler nükleaz etkinlik için test edildi. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig4.jpg"> Şekil 4: Nükleaz tahlil heparin sepharose kesirler 1 . Her heparin sepharose kesir supercoiled plazmid DNA eklendi. Kesir sayıları bu şekil 3' te gösterilen aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Kuluçka, nükleaz tepkiler deproteinated vardı ve % 1'özel etidyum bromür ile ayrılmış. Hiç protein (hedef sadece) ve vahşi türü PFV inç (PFV inç WT) nükleaz ücretsiz olarak bilinen önceki bir arınma plazmid DNA negatif denetimler içerir. Nükleaz etkinlik kirletici için olumlu bulaşıcı nükleaz (PFV inç D128N) sahip olduğu bilinmektedir catalytically etkin olmayan PFV inç önceki bir arınma denetimdir. DNA boyutu işaretlerine kb cinsinden gösterilir. Supercoiled plazmid (SC), doğrusal plazmid (L) ve rahat daireler (RC) gösterilir. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig5.jpg"> Şekil 5 : Nükleaz deneyleri Nefelometri 1. özel jelleri inceden inceye gözden geçirmek ve piksel değerlerini supercoiled (SC), doğrusal (L) ve her lane bantlarında rahat daire (RC) için sayısal. Kesir sayıları bu rakamlar 3 ve 4 gösterildiği aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Doğrusal ve rahat daireler oranlarda piksel değerlerini ve gösterilen Denklem kullanılarak hesaplanır. Kesir #12 bantları vardır örneğin, piksel değerleri: 817636 supercoiled plazmid, 50467 doğrusal Plazmid ve 112052 rahat daireler. Toplam DNA piksel değeri kesir #12 için bu değerleri, 980155 toplamıdır. Doğrusal DNA yüzde 100 ile çarpılır ve toplam DNA değerine göre % 5.1 eşit bölünmüş 50467 yüzdesidir. 100 ile çarpılmış ve % 11.4 eşit toplam DNA değerine göre bölünmüş 112052 rahat daireler yüzdesidir. Doğrusal ve rahat daire yüzde %16,5 toplamıdır. Hiç protein (inç, alt grafik) ile negatif kontrol plazmid DNA plazmid bu hazırlanması doğrusal veya rahat daireler olarak toplam DNA'ın % 4.4 dahil gösterir. İkinci bir negatif kontrol vahşi türü PFV inç (WT) toplam DNA'ın % 8,6 doğrusal veya rahat daireler olarak görüntülenen önceki bir arınma yapıldı. Bu iki denetim yolları parçalanmış veya doğrusallaştırılmış plazmid substrat yalnız ve PFV inç ile mevcut arka plan düzeyini gösteren Catalytically etkin olmayan PFV toplam DNA'ın % 23 doğrusal ve rahat daireler vardı inç (D128N) önceki bir arınma olumlu bir denetimdir. Heparin sepharose kesirler #12 #22 aracılığıyla maruz DNA sonuçlandı > doğrusal ve rahat daireler olarak DNA'ın % 10. Bu örnekte, görüntülenen kesirler #24-#42 < % 10 dönüşüm için doğrusal ve rahat daireler. Bu kesirler kombine ve diyaliz. Aliquots donmuş ve ileride kullanmak üzere-80 ° C'de depolanan. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase at JoVE.com

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Rekombinant prototip köpüklü virüs integrase protein genellikle arıtma sırasında bakteriyel nükleaz ile kirlenmiş. Bu yöntem nükleaz kirlenme belirler ve enzim son hazırlık kaldırır.

Algılama ve kaldırma nükleaz kirlenme rekombinant prototip köpüklü virüs Integrase saflaştırılması sırasında

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.0K Görüntüleme.  The Ohio State University College of Medicine. Rekombinant prototip köpüklü virüs integrase protein genellikle arıtma sırasında bakteriyel nükleaz ile kirlenmiş. Bu yöntem nükleaz kirlenme belirler ve enzim son hazırlık kaldırır.

Video: Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

Bir Nöro-İnvazif encephalitic Virüs Vivo Görüntüleme Sistemleri (IVIS) Algılama

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Yeni Bir Dünyadan Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve Karakterizasyonu Zika Virüsü Bulaşıcı Klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

Derleme ve prototip köpüklü virüs Intasomes arıtma

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...