Questo lavoro è stato supportato da NIH AI099854 e AI126742 a chiave.

1. indurre PFV nell'espressione in e. coli
<ol><li>
Aggiungere 1 μL di plasmide di espressione IN PFV (10 ng / µ l) a 20 μL di e. coli BL21 (DE3) pLysS (aliquota da 20 μL di celle disponibili in commercio è > 2 x 106 CFU/μg plasmide) in una provetta da 1,5 mL. Mescolare delicatamente dal dito toccando o sfogliando il tubo. Incubare in ghiaccio 5 min.
	<ol>
<li>Calore shock per esattamente 30 s in un 42 ˚ c bagno d'acqua e quindi tornare immediatamente in ghiaccio per 2 min.</li>
		<li>Aggiungere 80 µ l di brodo super ottimale di temperatura ambiente con media di repressione (SOC) dei cataboliti. Incubare per 1 h a 37 ° c con 225 giri al minuto (rpm) agitazione.</li>
		<li>Piastra 25 µ l della miscela su un 100 mm x 15 mm di Petri contenente 25 mL di agar di brodo (LB) di Luria (L 1 LB agar: bacto-tryptone di 10 g, 10 g NaCl, 5 g Estratto di lievito, 15 g di agar) e 100 μg/mL ampicillina (100 mg/mL di soluzione madre).</li>
		<li>Il restante 75 μL di cellule trasformate in un secondo piatto identico della piastra. Incubare le piastre con i coperchi giù durante la notte a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recuperare le piastre di trasformato Escherichia coli. Utilizzare una singola Colonia per inoculare 3 mL di LB (1 L LB: 10 g di bacto-tryptone, 10 g di NaCl, 5 g di lievito estratto) completati con 100 ampicillina μg/mL in una provetta di polipropilene cultura fondo tondo 14-mL. Incubare per ~ 8 h a 37 ° c con agitazione 225 giri/min.
	<ol>
<li>Aggiungere 3 mL di cultura a 50 mL LB completati con 100 μg/mL ampicillina e cloramfenicolo 34 μg/mL (34 mg/mL di soluzione madre) in una beuta da 250 mL. Incubare la coltura durante la notte a 37 ° C con agitazione 225 giri/min.</li>
		<li>Trasferire i 53 mL di coltura LB 1 L, 100 µ g/mL ampicillina e 34 cloramfenicolo μg/mL in un matraccio di Erlenmeyer 4L. Incubare a 37 ° C con agitazione 225 giri/min.</li>
		<li>Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) della cultura periodicamente. Inizialmente, controllare la cultura OD600 ogni h. Come la cultura raggiunge il desiderato OD600, controllare ogni 15 min per non invadere. Far crescere la cultura a un OD600 tra 0,9 e 1.0. Trasferire il pallone in un bagno di ghiaccio e agitare per ridurre la temperatura della cultura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trasferire 1 mL della coltura in una provetta da 1,5 mL per un'analisi successiva denaturando analisi SDS-PAGE.
	<ol>
<li>Agglomerare le cellule nel tubo da 1,5 mL mediante centrifugazione per 1 minuto in un microfuge a 14.000 x g a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 150 μL Tampone fosfato salino (PBS) di pipettaggio. Il PBS può essere con o senza CaCl2 e MgCl2.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l di tampone di SDS-PAGE: 2x (150 mM Tris-HCl, pH 6.8, SDS 1,2%, 30% glicerolo, 15% β-mercaptoetanolo (βME), blu di bromofenolo 0,0018%) e mescolare accuratamente da dispensare o vortice. Far bollire per 3 min. Conservare a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere la coltura batterica: una concentrazione finale di 0,25 mM isopropilico-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, soluzione di riserva di 0,25 M) e 50 μM ZnCl2 (soluzione 50 mM). IPTG induce l'espressione del gene PFV IN dal promotore T7 e ZnCl2 viene aggiunto come un supplemento per il corretto ripiegamento di un dominio del dito di zinco terminale amminico in PFV IN. Incubate la cultura a 25 ° C con agitazione immediatamente a 225 giri/min per 4 h. trasferire il pallone in un bagno di ghiaccio. Salvare 1 mL di coltura per analisi SDS-PAGE, seguendo lo stesso protocollo come sopra al punto 1.3.</li>
	<li>
Trasferire la coltura batterica bottiglie di dimensioni appropriate della centrifuga. Ad esempio, una cultura di 1 L può essere trasferita a quattro bottiglie di polipropilene fondo conico sterile monouso da mL 250. Girare le bottiglie in una centrifuga refrigerata da tavolo a 3000 x g per 20 min a 4 ° c. Scartare i surnatanti versando.
	<ol>
<li>Tutti i pellet da una coltura batterica 1 L in un volume totale di 25 mL (6,25 mL per flacone) PBS freddo (con o senza CaCl2 e MgCl2) Risospendere pipettando. Combinare e trasferire le sospensioni batteriche in una provetta conica da 50 mL. Girare in una centrifuga refrigerata a 3.000 x g per 20 min a 4 ° C. Scartare il surnatante di versamento o di pipettaggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risospendere il pellet batterico in 10 mL di tampone di risospensione (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl e l'inibitore della proteasi phenylmethylsulfanoxide (PMSF) 500 μM) di pipettaggio. Snap congelare il pellet inserendo il tubo in un pallone Dewar con azoto liquido sufficiente per immergere il tubo da 50 mL. Rimuovere il tubo da azoto liquido con cautela e conservare a-80 ° C. Nota: Pellet batteriche possono essere conservati per diversi mesi a-80 ° C. Non abbiamo visto nessuna perdita di proteina attiva dopo stoccaggio di-80 ° C per due anni.</li>
	<li>
Analizzare i campioni di pre- induzione e post-induzione di 8,3 cm di larghezza, 7,3 cm di altezza, 0,75 mm spessore SDS-PAGE gel con poliacrilammide 6% 1,5 mL accatastamento strato (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 6% di acrilammide, 0.1% SDS, 0,1% ammonio persolfato, 0.001% TEMED) e 3,5 mL 10% poliacrilammide risoluzione strato (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10% di acrilammide, 0.1% SDS, 0,1% ammonio persolfato, 0.001% TEMED)12.
	<ol>
<li>Dopo aver versato il gel d'impilamento, inserire un pettine di ben 10. Quando il gel è polimerizzato, montare l'apparecchiatura di pagina e aggiungere sufficienti buffer in esecuzione di SDS-PAGE (25 mM Tris, glicina 192 mM, 0,1% SDS).</li>
		<li>Caricare 10 µ l di ogni campione e 4 μL di standard di proteina precolorati. Eseguire a 16,5 V/cm fino a quando la parte anteriore della tintura raggiunge il fondo del gel, circa 60 min.</li>
		<li>Smontare le lastre di gel e trasferire il gel in una vasca di plastica. Aggiungi Coomassie Brilliant Blue macchiatura soluzione (0,1% R-250 di blu brillante Coomassie, 40% metanolo, acido acetico 10%) per generosamente coprire il gel e macchiare per 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione colorante versando e Sostituisci con decolorare soluzione (40% metanolo, 10% acido acetico) fino a quando le bande sono facilmente visibili. Rimuovere la soluzione decolorante versando e sostituire con acqua deionizzata. PFV IN dovrebbe essere facilmente identificati nel campione post-induzione. PFV IN con un tag di hexahistidine ha un peso molecolare di 47374 Da.</li>
		<li>Se non è visibile IN PFV, ripetere l'induzione a partire con una colonia di diversa da una delle piastre trasformazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. nickel cromatografia di affinità
<ol><li>Scongelare una batterica precipitato sul ghiaccio. Nota: Questo richiederà molto tempo (circa 2-3 h). Quando la pallina si è sciolto per liquami una cella, aggiungere un ulteriore 500 μM PMSF (soluzione 100 mM).</li>
	<li>Tenere il tubo da 50 mL di batteri dei residui sul ghiaccio. Sottoporre ad ultrasuoni i batteri ad ampiezza di 30% per 30 s (1 s on, 1 s off) a pellet derivato dalla cultura 1L utilizzando un sonicatore con un corno di bio del diametro di 0,5 pollici con un diametro di 0,125 pollici conica microtip, una frequenza di 20 kHz e potenza massima di 400 w.</li>
	<li>Trasferire il campione di cellule in una provetta di freddo ultracentrifuga. Utilizzare in policarbonato bottiglia assembly (diametro 25 mm, 89 mm altezza) compatibile con un rotore ad angolo fisso tipo 60 Ti. Rotori e tubi alternativi possono essere utilizzati se non si ottiene la stessa forza di gravitazione. Spin di 120.000 x g per 60 min a 4 ° C. Ci dovrebbe essere una pallina di ovvia. Il supernatante può avere un colore giallo.</li>
	<li>Trasferire il surnatante da versarsi o pipettare in una provetta conica freddo 50 mL. Nota il volume; Questo volume dovrebbe essere circa il volume di tampone di risospensione utilizzato prima del congelamento di snap. Se il supernatante è viscoso, può essere contaminato da DNA batterico che poteva intasare la colonna di cromatografia. In questo caso, ripetere l'ultracentrifugazione per pellet il DNA batterico.</li>
	<li>
Preparare 500 mL Tampone un (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) e 500 mL Tampone B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, imidazolo 200 mM). Nota: In questo protocollo, mantenere il sistema di cromatografia in fase liquida (FPLC) proteine veloci, tutti i buffer e il campione a 4 ° C in una camera fredda.<ol>
<li>Filtro sterile buffer A e B, con 0,2 μm filtro monouso. A seconda del sistema FPLC, lavare pompa A e pompa B con tampone A e B di Buffer, rispettivamente. Flusso di tampone al 90% e 10% tampone B attraverso il sistema fino a stabilizzano la conducibilità e letture di UV. La portata massima dipenderà sullo strumento; utilizzare una portata di 5 mL/min con un limite di pressione massima di 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare una colonna FPLC 110mm Diametro 5 mm long, con 1,5 mL di resina carica di nichel (capacità di legame massimo 50 mg/mL, massima pressione di 1 MPa). La colonna può essere preparata il giorno prima purificazione e conservata a 4 ° c.</li>
	<li>Collegare la colonna allo strumento FPLC. Equilibrare la colonna con 20 mL di tampone al 90% e 10% tampone B (imidazolo 20 mM) con una portata di 0,5 mL/min con un limite di pressione di 0,5 MPa. Lo strumento dovrebbe essere raccolta dati in tempo reale di conducibilità e di capacità di assorbimento UV a 280 nm (A280). Si dovrebbero stabilizzare la conducibilità e letture di UV. Se queste letture non sono stabilizzati, continuare a buffer del flusso attraverso la colonna fino a quando non sono stabili.</li>
	<li>
Caricare il campione della proteina (~ 10 mL / pellet) alla colonna ad un flusso di 0,15 mL/min con un limite di pressione di 0,5 MPa. La portata e colonna la pressione rimane la stessa durante la purificazione. Raccogliere il flusso attraverso in una provetta da 50 mL.
	<ol>
<li>Lavare la colonna con 20 mL di tampone al 90% e 10% Buffer B. raccogliere il lavaggio in un tubo da 50 mL. Eluire le proteine con una sfumatura lineare di 20 mL di 10% a 100% tampone B (20mm-imidazolo 200 mM).</li>
		<li>Infine, lavare la colonna con 5 mL 100% tampone B (imidazolo 200 mM). Raccogliere il lavaggio gradiente e finale in frazioni 0,27 mL.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Combinare 15 μL di tampone del campione SDS-PAGE 2 x con 15 μL del flusso attraverso, lavare e le frazioni di picco A280 . Bollire i campioni per 3 min.
	<ol>
<li>Preparare due 10% SDS-PAGE gel come descritto in precedenza nel passaggio 1.6 tranne con ben 15 pettini. Caricare 10 µ l di ogni campione per il gel e 4 μL di standard di proteina precolorati. Eseguire, macchia e analizzare i gel come descritto al punto 1.6.</li>
		<li>Combinare le frazioni che sembrano contenere quasi puro IN PFV basato su ispezione visiva. Misurare il volume di pipettaggio, solitamente 8-10 mL.</li>
		<li>Misurare A280 delle frazioni combinate con uno spettrofotometro e calcolare la quantità totale di PFV di proteine; il nostro rendimento tipico è ~ 10 mg / L di cultura indotta. Il coefficiente di estinzione di PFV IN con il tag hexahistidine è 59360 cm-1 M-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per rimuovere il tag hexahistidine, supplemento al PFV IN con 10 mM dithiothreitol (DTT, soluzione madre 1 M) e 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (soluzione 0,5 M). Aggiungere 15 μg di proteasi 3C rhinovirus umano (HRV) per mg PFV IN. Incubate a 4 ˚ c durante la notte. Clivaggio riduce il peso molecolare IN PFV da 47374 Da a Da 44394 e può essere verificato dall'analisi di 10% SDS-PAGE.</li>
</ol>3. cromatografia di affinità eparina
<ol><li>
Preparare 250 mL C Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF) e 250 mL Tampone D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, NaCl di 1m). Nota: In questo protocollo, il sistema FPLC, buffer e campione sono tenuti in una cella frigorifera a 4 ˚ c.<ol>
<li>Filtro sterile buffer C e D con 0,2 unità di filtrazione monouso μm. A seconda del sistema FPLC, lavare pompa A e pompa B con Buffer C e D del Buffer, rispettivamente. Flusso di Buffer C l'80% e 20% Buffer D attraverso il sistema fino a stabilizzano la conducibilità e letture di UV. La portata massima dipenderà sullo strumento; Utilizziamo abitualmente una portata di 5 mL/min con un limite di pressione massima di 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare una colonna FPLC lunga, 5 mm diametro 80 mm con 1 mL di resina di sepharose eparina (massima capacità legante 2,0 mg di bovino in resina di antitrombina III / mL; pressione massima 1,4 MPa). La colonna può essere preparata il giorno prima purificazione e conservata a 4 ° C. Collegare la colonna allo strumento FPLC.
	<ol>
<li>Equilibrare la colonna con 20 mL di Buffer C l'80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl) ad una portata di 0,5 mL/min con un limite di pressione di 1 MPa. Lo strumento dovrebbe essere raccolta dati in tempo reale di conducibilità e di capacità di assorbimento UV a 280 nm (A280). Si dovrebbero stabilizzare la conducibilità e letture di UV. Se queste letture non sono stabilizzati, continuare a buffer del flusso attraverso la colonna fino a quando non sono stabili.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ridurre la concentrazione di NaCl del campione PFV IN a 200 mM con l'aggiunta di 1,5 volumi C. Buffer Ad esempio, aggiungere 15 mL di Buffer C 10ml PFV in. Il nostro volume totale è in genere ~ 25 mL.</li>
	<li>
Il campione diluito IN PFV alla colonna di sepharose eparina a 0,5 mL/min di portata con pressione massima di carico limite 1,0 MPa. La portata e colonna la pressione rimane la stessa durante la purificazione. Raccogliere il flusso attraverso in una provetta conica da 50 mL.
	<ol>
<li>Lavare la colonna con 20 mL di Buffer C l'80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl), raccogliendo il lavaggio in una provetta conica da 50 mL. Eluire la colonna con una sfumatura lineare di 30 mL di 20% a 100% D Buffer (200 mM a 1 M NaCl).</li>
		<li>Lavare la colonna con 5 mL di 100% Buffer D. raccogliere il gradiente e lavaggio finale in frazioni di 0,37 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare il carico, il flusso attraverso, lavare e frazioni dell'8% SDS-PAGE come descritto in 2.9. PFV IN seguito clivaggio del tag hexahistidine ha un peso molecolare di 44394 Da e il coefficiente di estinzione rimane 59360 cm-1 M-1 senza il tag hexahistidine. Memorizzare tutte le frazioni a 4 ˚ c fino al completamento di un'analisi di nucleasi.</li>
</ol>4. analisi di nucleasi
<ol><li>
Identificare le frazioni di sepharose eparina che sembrano contenere quasi puro PFV poll. combinare 3 μL di frazione di eparina e 50 ng di 3 kb plasmide supercoiled DNA nella reazione del buffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM DTT) con un volume finale di 15 μL. Incubare a 37 ° c per 90 min Include un controllo negativo con nessun PFV IN.
	<ol>
<li>Fermare la reazione con proteinasi K di 1 mg/mL (20 mg/mL di soluzione madre) e 0,5% SDS (10% soluzione di riserva). Incubare a 37 ° C per 1 h. campioni possono essere conservati a-20 ° C per un'analisi successiva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare un gel 125 mL di 1% in peso per volume (p/v) agarose in tampone di x TAE 1 (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) con 0.1 µ g/mL etidio bromuro (10 mg/mL di soluzione madre)13. Sciogliere la soluzione di agarosio e versate ad un vassoio di colata di gel 15 x 10 cm. Inserire un pettine di ben 15 con ampia, pozzi di spessore 0,75 mm 5 mm. Pozzi sottile resa migliore risoluzione di banda rispetto ai pozzi spessore 1,5 mm. Lasciare che il gel a solidificare a temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Immergere il gel in 1 x TAE con 0,1 µ g/mL di bromuro di etidio. Aggiungere 3,5 μL di 6x loading dye (50% glicerolo, 0,15% Orange G tintura) per le reazioni di dosaggio di nucleasi. Caricare l'intero volume al gel. Esegua il gel a tensione costante, 10 volt per centimetro (100 V) a temperatura ambiente per 1 ora o fino a quando la parte anteriore della tintura di Orange G raggiunge la fine del gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immediatamente l'immagine del gel dell'agarosi con uno scanner fluorescente impostato per rilevare il bromuro di etidio. DNA lineare deve essere eseguito con taglia indicata 3 kb, DNA supercoiled dovrebbe più veloce (~ 2 kb), e rilassato cerchio DNA va più lento (~3.5 kb).
	<ol>
<li>Utilizzando software di analisi di immagine, calcolare il volume di pixel del plasmide supercoiled, lineare e rilassante cerchio in ogni corsia. Chiamare la somma del pixel volumi per queste tre forme di DNA "DNA totale" valore e utilizzano per calcolare la percentuale dei cerchi lineare e rilassati. Ad esempio, il volume di pixel dei cerchi rilassati è diviso per il valore del pixel del DNA totale in quanto Vicolo, moltiplicare questo numero per 100 per determinare una percentuale. Le frazioni che contengono contaminante nucleasi visualizzano una percentuale più elevata dei cerchi lineare e rilassati rispetto al controllo negativo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combinare le frazioni di sepharose eparina che non vengono visualizzati attività della nucleasi contaminanti. Dializzare in 10 mm 6-8 kDa peso molecolare in taglio tubi dialisi (MWCO) a 4 ° C durante la notte contro 1 L di 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20% glicerolo.</li>
	<li>Recuperare il campione di PFV IN nucleasi-free da tubi di dialisi. A280 di misurare e calcolare la concentrazione finale di proteine. Aliquotare e snap congelamento in azoto liquido. Conservare le aliquote a-80 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases.">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li><li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus.">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration.">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li><li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+reaction+pathway+and+critical+intermediates.">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li><li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells.">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li><li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase.">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li><li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration.">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Proteine ricombinanti che interagiscono con il DNA, come proteine, spazzini di ossigeno per le applicazioni di microscopia di singola molecola, o retrovirali integrases, di riparazione del DNA dovrebbero essere liberi di contaminanti batterici nucleasi2,3. Questi contaminanti possono confondere l'interpretazione dei risultati durante saggi biochimici o singola molecola alla rinfusa.
Abbiamo trovato che una nucleasi batterica frequentemente co-purifica con PFV poll. Tuttavia, PFV IN Visualizza un'affinità per l'eparina sepharose che è facilmente distinguibile dalla nucleasi batterica contaminante1. La chiave per preparazione di nucleasi-free IN PFV è l'attenta quantificazione di attività di nucleasi in ogni frazione seguendo eluizione di pendenza da eparina sepharose. La pendenza deve essere sufficientemente bassa per consentire la separazione di PFV IN dal contaminante nucleasi; una pendenza non sarebbe compatibile con una separazione efficace. Inoltre, il substrato di DNA del plasmide dovrebbe avere una bassa percentuale di cerchi rilassate per ridurre lo sfondo del dosaggio della nucleasi. Se il substrato di DNA del plasmide ha un'alta priorità bassa dei cerchi rilassate, dovrebbe essere effettuata una nuova purificazione di DNA plasmidico. L'analisi di attività della nucleasi rivela la presenza dei contaminanti nucleasi e frazioni che devono essere eliminate.
In alcuni casi, cromatografia di esclusione di formato (SEC) può essere un metodo efficace per la rimozione di un contaminante nucleasi2. Gruppi precedenti hanno usato SEC durante la purificazione di PFV IN4. SEC ha un volume di carico limitata e tende a ridurre la concentrazione finale di proteine. Il vantaggio principale di affinità e cromatografia a scambio ionico è la possibilità di caricare una quantità significativamente maggiore rispetto SEC.
Test per l'attività della nucleasi possono essere adattati a diverse proteine che co-purificano con una nucleasi batterica. Qui ci identifichiamo IN PFV e una nucleasi contaminante possono essere separata mediante cromatografia a sepharose eparina. Precedentemente abbiamo indicato che PFV IN ha un profilo simile a nucleasi con Mono-S catione e cromatografia a scambio anionico Mono-Q che rende queste resine inadatto per questa proteina. A seconda delle caratteristiche di affinità della proteina voluta in relazione alla nucleasi, questo protocollo può essere usato con resine di affinità o scambio ionico ed eluizione di pendenza. La chiave efficace rimozione di contaminazione della nucleasi da una proteina di interesse è una differenza di affinità per una resina. Ogni frazione deve essere analizzati per attività della nucleasi. Le resine di cromatografia del presente protocollo non possono essere applicate direttamente a tutte le proteine che co-purificano con nucleasi batteriche. Tuttavia, il concetto generale dell'utilizzo di un'affinità o resina a scambio ionico per separare le nucleasi da una proteina di interesse e testando le frazioni per attività della nucleasi può essere ampiamente applicabile.

Gli studi biochimici e singola molecola delle interazioni della proteina con DNA richiedono proteine ricombinanti eccezionalmente pure. Contaminando nucleasi da batteri possa oscurare i risultati di queste analisi. Una nucleasi contaminante è stata trovata in preparazioni a base di proteine ricombinanti ossigeno scavenger protocatecuato-3,4-diossigenasi (PCD) e prototipo virus schiumoso (PFV) integrasi (IN) isolato da Escherichia coli (Escherichia coli)1 , 2 , 3.
Integrazione retrovirale saggi si basano sulla conversione del DNA supercoiled ai prodotti intaccati o lineare come una misura di attività4. Durante l'infezione cellulare IN unisce le due estremità di un cDNA virale per l'host della cromatina5. Ogni estremità unendo la reazione è chiamato filo trasferimento. Saggi di ricombinante IN attività possono aderire due oligomeri del DNA che imita il cDNA virale termina ad un target di DNA in un'integrazione concertata reazione4,5,6,7,8. In alternativa IN ricombinante possono aderire solo un'estremità del DNA in un non-fisiologicamente rilevanti metà sito integrazione reazione9,10. Quando il DNA del plasmide supercoiled è la destinazione di integrazione, i prodotti sono concordate linearizzato DNA e mezza sito integrazione prodotti sono cerchi rilassati. Questi prodotti di reazione sono individuati dalla loro mobilità relativa nel corso di elettroforesi su gel di agarosio1. Se il ricombinante IN ha una nucleasi contaminante, ci saranno spurie cerchi rilassati o un plasmide linearizzato possibilmente confondendo i risultati sperimentali. Oligomeri del DNA virali possono essere etichettati fluorescente per identificare i prodotti di integrazione, al contrario di prodotti nuclease conclusivamente. Tuttavia, IN notevolmente favorisce target DNA supercoiled; qualsiasi perdita del plasmide supercoiled a cerchi rilassati o DNA lineare di contaminante nucleasi potrebbe inclinare risultati e interpretazione di dati11. Quindi è assolutamente necessario rimuovere nucleasi batteriche da retrovirali nelle preparazioni.
PFV IN ha una diversa affinità per l'eparina sepharose rispetto alla nucleasi batterica1. PFV IN e le nucleasi possono essere separati da un'eluizione di pendenza lineare da eparina sepharose. Le nucleasi non è rilevata prontamente da un'assorbanza di ultravioletti (UV) a 280 nm picco o di elettroforesi di analitica sodio dodecil solfato del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). Invece, la nucleasi viene rilevata da un'analisi di attività della nucleasi che impiegano la conversione di un plasmide supercoiled a cerchi rilassati o prodotti lineari. Ogni frazione seguendo cromatografia sepharose eparina è testato per attività della nucleasi. PFV IN e il contaminante nucleasi non hanno alcuna differenza nell'affinità per resina anionica Mono-Q. C'è una piccola differenza di affinità per resina del catione Mono-S. Tuttavia, la risoluzione di Mono-S di nucleasi batterica e PFV IN non consentirebbe efficiente separazione delle proteine. In definitiva, la purificazione di affinità di eparina sepharose offre la migliore separazione di nucleasi batterica da PFV IN e ha il vantaggio di volume di carico illimitato.
Test per attività della nucleasi di contaminanti possono essere adattati ad altre proteine. La proteina di interesse probabilmente avrà caratteristiche di affinità alternativi rispetto IN PFV; la differenza nelle caratteristiche della proteina di interesse e il contaminante di nucleasi di associazione deve essere determinata empiricamente. Questa metodologia per l'identificazione di contaminazione nucleasi può essere adattata a altre resine tra cui Mono-S catione o resine a scambio anionico Mono-Q. Affinità e scambio ionico resine possono offrire un metodo affidabile per isolare una proteina ricombinante di interesse da parte di contaminanti nucleasi senza limiti sul volume della proteina durante la cromatografia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BL21/DE3 Rosetta E. coli</td>
			<td style="width:180px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70956-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB broth</td>
			<td style="width:180px;">EMD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloramphenicol&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CI8280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">208086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure</td>
			<td style="width:180px;">Gojira Fine Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PMSF&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imidazole&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT&#160;</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure EDTA</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CA3510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA Superflow</td>
			<td style="width:180px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Heparin Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td style="width:180px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0998-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HRV14 3C protease&#160;</td>
			<td style="width:180px;">EMD Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">71493-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase

La proteina di integrasi (IN) del virus schiumoso del prototipo di retrovirus (PFV) è un enzima di modello per studiare il meccanismo di integrazione retrovirale. Rispetto IN da altri retrovirus, PFV IN è più solubile e più suscettibili di manipolazione sperimentale. Inoltre, è sensibile a inibitori dell'IN clinicamente rilevanti virus di immunodeficenza umana (HIV-1), suggerendo che il meccanismo catalitico di PFV IN è simile a che di HIV-1 pollici pollici catalizza l'Unione covalente di virale DNA complementare (cDNA) per destinazione DNA in un processo chiamato trasferimento strand. Questa reazione di trasferimento del filo introduce Nick al DNA dell'obiettivo. Analisi dei prodotti di reazione di integrazione possono essere confuso dalla presenza di nucleasi quel nick allo stesso modo del DNA. Una nucleasi batterica è stata indicata per co-purificare con ricombinante IN PFV espressa in Escherichia coli (Escherichia coli). Qui descriviamo un metodo per isolare PFV IN dalla nucleasi contaminante dalla cromatografia di affinità di eparina. Le frazioni sono facilmente schermate per contaminazione di nucleasi con un plasmide supercoiled e l'elettroforesi del gel dell'agarosi. PFV IN e i contaminante nucleasi display alternativo affinità per eparina sepharose permettendo una preparazione nucleasi-free of recombinant PFV IN adatto per analisi biochimiche o singola molecola di massa di integrazione.

Ricombinante IN PFV è spesso contaminato con una nucleasi batterica1. Le analisi biochimiche integrazione dipendono la quantificazione della conversione del DNA del plasmide supercoiled cerchi rilassati e prodotti lineari. La presenza di una contaminante nucleasi potrebbe portare a spuria quantificazione di queste analisi. Espressione di PFV IN con un tag hexahistidine è indotta in e. coli (Figura 1) e prima purificati mediante cromatografia di affinità di nichel (Figura 2). Le frazioni con quasi puro PFV IN sono combinate e il tag hexahistidine è clivato da una proteasi. Abbiamo determinato che PFV IN e le nucleasi contaminante hanno diverse affinità per l'eparina sepharose cromatografia (Figura 3)1. Frazioni di PFV IN seguito cromatografia sepharose eparina sono incubate con un plasmide supercoiled analizzare per cerchi rilassati e plasmide linearizzato, i prodotti dell'attività della nucleasi (Figura 4). Questo test consente l'identificazione delle frazioni proteiche senza nucleasi (Figura 5). Queste frazioni possono essere combinate, dializzate e congelate per futuri esperimenti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig1.jpg"> Figura 1: Induzione di PFV IN e. coli . Cellule da culture prima (lane 2) e dopo induzione (corsia 3) sono analizzati per la presenza di campioni da. PFV IN, 47374 erano separate da 10% SDS-PAGE e macchiato con l'azzurro brillante di Coomassie. Lane 1, marcatori di peso molecolare (kDa). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig2.jpg"> Figura 2: Le frazioni di cromatografia di affinità del nichel. Lisati batterici solubili sono stati separati mediante cromatografia di affinità di nichel. PFV IN con un tag di hexahistidine è stato eluito con una sfumatura lineare di 20mm-imidazolo di 200 mM. Le frazioni sono state valutate di 10% SDS-PAGE e macchiato con l'azzurro brillante di Coomassie. Da PFV IN, 47374, è prontamente apparente nel campione caricato alla colonna (carico), ma è meno evidente nel flusso attraverso o lavare. Le frazioni che eluire presto nella sfumatura imidazolo comunemente visualizzare un contaminante di mobilità più lento vicino 75 kDa, nonché alcuni contaminanti di mobilità più veloce pari o inferiore a 25 kDa. Alle più alte concentrazioni di imidazolo non ci sono nessun contaminanti prontamente apparente e PFV IN sembra essere relativamente puro. In questo esempio, frazioni #33 e #84 sono state combinate e ulteriormente purificate. Marcatori di peso molecolare (kDa) sono a sinistra di ogni gel. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig3.jpg"> Figura 3 : Cromatografia di sepharose eparina of PFV IN 1 . A seguito di rimozione di affinità e proteasi di nichel del tag hexahistidine, PFV IN (44394 Da) è stato frazionato da eparina sepharose. Proteine sono state eluite con una sfumatura lineare da 200 mM a 1 M di NaCl. Anche frazioni #12 e #44 sono state valutate 8% SDS-PAGE macchiato con Coomassie blu. Marcatori di peso molecolare (kDa) sono a sinistra di ogni gel. Queste frazioni sono state testate per l'attività della nucleasi. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig4.jpg"> Figura 4: Dosaggio di nucleasi di frazioni di sepharose eparina 1 . Ogni frazione di sepharose eparina è stato aggiunto al DNA del plasmide supercoiled. Frazione numeri correlano a quelli mostrati nella Figura 3. A seguito di incubazione, le reazioni di nucleasi erano deproteinato e separati da 1% di agarosio con etidio bromuro. Controlli negativi includono il DNA del plasmide con nessuna proteina (solo destinazione) e una purificazione precedente di tipo selvaggio IN PFV privi di nucleasi (PFV IN WT). Un controllo positivo per contaminare l'attività della nucleasi è una purificazione precedente of cataliticamente inattivo IN PFV che è noto per avere contaminante nucleasi (PFV IN D128N). Indicatori di dimensione del DNA sono mostrati in kb. Plasmide supercoiled (SC), plasmide lineare (L) e rilassate cerchi (RC) sono indicati. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig5.jpg"> Figura 5 : Quantificazione dell'analisi della nucleasi 1. dell'agarosi gel sono stati scannerizzati e i valori dei pixel sono stati quantificati per supercoiled (SC), lineare (L) e bande di cerchio rilassato (RC) in ogni corsia. Frazione numeri correlano a quelli mostrati nelle figure 3 e 4. Le percentuali dei cerchi lineare e rilassati sono state calcolate utilizzando i valori dei pixel e l'equazione indicata. Ad esempio, il pixel valori per le bande della frazione #12 sono: plasmide supercoiled 817636, 50467 lineare plasmide e 112052 cerchi rilassati. Il valore del pixel del DNA totale per frazione #12 è la somma di questi valori, 980155. La percentuale di DNA lineare è 50467 moltiplicato per 100 per la percentuale e diviso per il valore di DNA totale pari al 5,1%. La percentuale di cerchi rilassati è 112052 moltiplicato per 100 e diviso per il valore di DNA totale pari al 11,4%. La somma delle percentuali di cerchio lineare e rilassato è 16,5%. DNA plasmidico di controllo negativo con nessuna proteina (non IN, grafico in basso) indica che questa preparazione del plasmide incluso 4,4% del DNA totale come cerchi lineare o rilassati. Un secondo controllo negativo era una purificazione precedente di tipo selvaggio PFV IN (WT) che visualizzato 8,6% del DNA totale come cerchi lineare o rilassati. Queste corsie di due controllo indicano il livello di sfondo del plasmide linearizzato o intaccato presente con il substrato da solo e con PFV poll. Un controllo positivo è una purificazione precedente of cataliticamente inattivo IN PFV (D128N) che aveva il 23% del DNA totale come cerchi lineare e rilassati. Il DNA esposto alle frazioni di eparina sepharose #12 e #22 ha provocato > 10% del DNA come cerchi lineare e rilassati. In questo esempio, frazioni 24 # a #42 visualizzate < 10% conversione ai cerchi lineare e rilassati. Queste frazioni sono state combinate e dializzate. Le aliquote sono state congelate e conservate a-80 ° C per un uso futuro. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Proteina di integrasi del virus schiumoso prototipo ricombinante è spesso contaminata con una nucleasi batterica durante la purificazione. Questo metodo identifica contaminazione nucleasi e lo rimuove dalla preparazione finale dell'enzima.

Rilevamento e rimozione di nucleasi contaminazione durante la purificazione del prototipo ricombinanti Virus schiumoso integrasi

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.0K Views.  The Ohio State University College of Medicine. Proteina di integrasi del virus schiumoso prototipo ricombinante è spesso contaminata con una nucleasi batterica durante la purificazione. Questo metodo identifica contaminazione nucleasi e lo rimuove dalla preparazione finale dell'enzima.

Video: Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Generazione di influenza da virus ricombinante del DNA plasmidi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Il rilevamento del virus infettivo da Campo-zanzare raccolte mediante test coltura cellulare Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) il rilevamento di un neuro-invasiva Virus encephalitic

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Salvataggio di virus ricombinante malattia di Newcastle da cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

Assemblaggio e purificazione del prototipo Virus schiumoso Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...