Este trabajo fue apoyado por NIH AI099854 y AI126742 a la clave.

1. inducir PFV en expresión de e. coli
<ol><li>
Añadir 1 μL del plásmido de expresión en PFV (10 ng/μL) a 20 μL de e. coli BL21(DE3) pLysS (20 alícuota μL de las células disponibles comercialmente tiene > 2 x 106 UFC/μg plásmido) en un tubo de 1,5 mL. Mezclar suavemente con el dedo golpeando o sacudiendo el tubo. Incubar en hielo 5 minutos.
	<ol>
<li>Choque por exactamente 30 de calor s en a 42 ° c baño de agua y se vuelve inmediatamente hielo por 2 min.</li>
		<li>Añadir 80 μL de caldo super óptima temperatura ambiente con los medios de comunicación (SOC) de represión catabólica. Incubar durante 1 h a 37 ° c con 225 revoluciones por minuto (rpm) temblor.</li>
		<li>Placa de 25 μL de la mezcla en un 100 x 15 mm placa de Petri que contiene 25 mL de agar caldo (LB) de Luria (agar LB de 1 L: 10 g de bacto-triptona, 10 g de NaCl, extracto de levadura 5 g, agar 15 g) y 100 μg/mL ampicilina (100 mg/mL de solución stock).</li>
		<li>El restante 75 μL de las células transformadas en una segunda placa idéntica de la placa. Incubar las placas con las tapas hacia abajo durante la noche a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recuperar las placas de transformados e. coli. Utilice una sola Colonia para inocular 3 mL de LB (L 1 LB: 10 g de bacto-triptona, 10 g de NaCl, 5 g de levadura extracto) suplementado con ampicilina 100 de μg/mL en un tubo de cultivo de polipropileno de 14 mL de fondo redondo. Incubar durante 8 h a 37 ° c con agitación de 225 rpm.
	<ol>
<li>Añadir 3 mL del cultivo a 50 mL LB suplementado con 100 μg/mL ampicilina y cloranfenicol 34 μg/mL (solución stock de 34 mg/mL) en un erlenmeyer de 250 mL. Incubar el cultivo durante la noche a 37 ° C con agitación de 225 rpm.</li>
		<li>Transferir los 53 mL de cultura a L 1 LB ampicilina 100 de μg/mL y 34 cloranfenicol μg/mL en un erlenmeyer de 4 L. Incubar a 37 ° C con agitación de 225 rpm.</li>
		<li>Medir la densidad óptica a 600 nm (OD600) de la cultura periódicamente. Inicialmente, verifique la cultura OD600 cada h. Como la cultura alcanza el deseado OD600, compruebe cada 15 min que no cubran. Crecer la cultura a un OD600 entre 0.9 y 1.0. Transferir el matraz en un baño de hielo y agitar para reducir la temperatura de la cultura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transferir 1 mL del cultivo a un tubo de 1,5 mL para su posterior análisis por desnaturalización análisis de SDS-PAGE.
	<ol>
<li>Sedimenten las células en el tubo de 1,5 mL por centrifugación durante 1 minutos en una microcentrífuga a 14.000 x g a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 150 μL tampón fosfato salino (PBS) por pipeteo. El PBS puede ser con o sin CaCl2 y MgCl2.</li>
		<li>Añadir 150 μL de 2 x de tampón de SDS-PAGE (150 mM Tris-HCl, pH 6.8, 1.2% SDS, 30% glicerol, 15% β-mercaptoetanol (βME), 0.0018% azul de bromofenol) y homogeneizar por pipeta o vórtice. Hervir durante 3 minutos almacenar a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir a la cultura bacteriana: una concentración final de 0.25 mM isopropílico-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG, solución de 0,25 M) y 50 μM vivencias2 (solución 50 mM). IPTG induce la expresión del gen PFV IN desde el promotor de T7 y vivencias2 se agrega como un suplemento para el plegamiento correcto de un dominio de dedo de zinc terminal amino en PFV IN. Incubate el cultivo a 25 ° C con agitación a 225 rpm por 4 h. inmediatamente transferir el matraz en un baño de hielo. Guardar 1 mL de cultivo para el análisis de SDS-PAGE siguiendo el mismo protocolo que el anterior en 1.3.</li>
	<li>
Transferir el cultivo bacteriano para botellas de tamaño apropiado de la centrífuga. Por ejemplo, una cultura 1 L puede transferirse a cuatro botellas de polipropileno de fondo cónico desechable estéril de 250 mL. Girar las botellas en una centrífuga de mesa refrigerada a 3000 x g por 20 min a 4 ° c. Deseche el sobrenadante vertiendo.
	<ol>
<li>Vuelva a suspender todos los diabolos de un cultivo bacteriano de 1 L en un volumen total de 25 mL (6,25 mL por frasco) PBS frío (con o sin CaCl2 y MgCl2) mediante pipeteo. Combinar y transferir la suspensión bacteriana a un tubo cónico de 50 mL. Girar en una centrífuga refrigerada a 3.000 x g durante 20 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante vertiendo o pipeteando.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspender el precipitado bacteriano en 10 mL de tampón de resuspensión (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl e inhibidor de la proteasa de la phenylmethylsulfanoxide (PMSF) de 500 μM) mediante pipeteo. Snap freeze el pellet colocando el tubo en un frasco Dewar con nitrógeno líquido suficiente para sumergir el tubo de 50 mL. Cuidadosamente retire el tubo de nitrógeno líquido y almacenar a-80 ° C. Nota: Pellet bacteriano se puede almacenar por varios meses a-80 ° C. No hemos visto pérdida de la proteína activa después de almacenaje de-80 ° C durante dos años.</li>
	<li>
Analizar las muestras antes de la inducción y la inducción por 8,3 cm de ancho, 7,3 cm de alto, 0.75 m m gruesa de SDS-PAGE gel con poliacrilamida de 6% de 1,5 mL apilando capa (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, la acrilamida de 6%, 0.1% SDS, persulfato de amonio 0.1%, 0,001% TEMED) y 3,5 mL 10% poliacrilamida de resolución de capa (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, persulfato de amonio 10% acrilamida, 0.1% SDS, 0,1%, 0,001% TEMED)12.
	<ol>
<li>Después de verter el gel de apilamiento, coloque un peine bien 10. Cuando el gel ha polimerizado, montar el aparato de la página y añadir suficiente buffer correr de SDS-PAGE (25 mM Tris, glicina 192 mM, 0.1% SDS).</li>
		<li>Coloque 10 μL de cada muestra y 4 μL de estándares prestained proteína. Ejecutar a 16,5 V/cm hasta el frente del tinte llega a la parte inferior del gel, aproximadamente 60 minutos.</li>
		<li>Desmonte las placas de gel y transferir el gel a un recipiente de plástico. Añadir Coomassie azul brillante coloración solución (0,1% R-250 azul brillante de Coomassie, 40% metanol, ácido acético al 10%) para cubrir el gel generosamente y la mancha por 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Eliminar la solución de tinción vertiendo y reemplazar con desteñir solución (40% de metanol, ácido acético al 10%) hasta que las bandas son fácilmente visibles. Eliminar la solución de extracción vertiendo y reemplazar con agua desionizada. PFV en deben ser fácilmente identificado en la muestra después de la inducción. PFV en con una etiqueta de hexahistidine tiene un peso molecular de 47374 Da.</li>
		<li>Si no está visible en PFV, repetir la inducción a partir de una colonia diferente de una de las placas de la transformación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cromatografía de afinidad de níquel
<ol><li>Descongelar un pellet bacteriano en el hielo. Nota: Esto le llevará un tiempo considerable (aproximadamente 2-3 h). Cuando el diábolo descongelado a una mezcla de células, agregar un adicional de 500 μM PMSF (solución stock de 100 mM).</li>
	<li>Mantenga el tubo de 50 mL de bacterias en el hielo de la mezcla. Someter a ultrasonidos las bacterias en 30% amplitud de 30 s (1 s a 1 s off) por pellets derivados de cultura de 1 L, utilizando un sonicador con un cuerno de bio de 0,5 pulgadas de diámetro con un diámetro de 0,125 pulgadas cónico microtip, una frecuencia de 20 kHz y una potencia máxima de 400 w.</li>
	<li>Transferir la muestra de células a un tubo de ultracentrífuga frío. Uso de policarbonato botella asambleas (25 mm de diámetro, altura de 89 mm) compatibles con un rotor de ángulo fijo tipo 60 Ti. Rotores y tubos alternativos pueden usarse si se alcanza la misma fuerza de gravitación. Spin x 120.000 g durante 60 min a 4 ° C. Debe haber una pelotilla obvio. El sobrenadante puede tener un color amarillo.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante vertiendo o pipetear en un tubo cónico de 50 mL frío. Nota el volumen; Este volumen debe ser aproximadamente el volumen de buffer de resuspensión antes del snap de congelación. Si el sobrenadante es viscoso, pueden ser contaminada por ADN bacteriano que pueda obstruir la columna de cromatografía. En este caso, repita la ultracentrifugación para la pelotilla de la DNA bacteriana.</li>
	<li>
Preparar 500 mL tampón un (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) y 500 mL Buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, imidazol de 200 mM). Nota: En este protocolo, mantener el sistema de cromatografía líquida (FPLC) proteína rápida, todos los búferes y la muestra a 4 ° C en una cámara fría.<ol>
<li>Filtro estéril búferes A y B, con 0,2 μm filtro desechable. Dependiendo del sistema FPLC, lave la bomba un y bomba B con Buffer A Buffer B y, respectivamente. Del flujo 90% un Buffer y 10% de tampón B a través del sistema hasta que se estabilicen las lecturas de la UV y conductividad. El caudal máximo depende del instrumento; utilizar un flujo de 5 mL/min con un límite de presión máxima de 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar una 110 mm largo, 5 mm diámetro FPLC columna con resina de níquel cargado de 1,5 mL (capacidad máxima 50 mg/mL, máxima presión de 1 MPa). La columna puede preparada el día antes de la purificación y almacenada a 4 ° c.</li>
	<li>Conecte la columna del instrumento FPLC. Equilibrar la columna con 20 mL de 90% A Buffer y 10% Buffer B (imidazol 20 mM) con un caudal de 0,5 mL/min con un límite máximo de presión de 0,5 MPa. El instrumento debe recoger datos en tiempo real de la conductividad y la absorbancia UV a 280 nm (un280). La conductividad y las lecturas de la UV deben estabilizar. Si estas lecturas no se han estabilizado, continuar buffers de flujo a través de la columna hasta que sean estables.</li>
	<li>
La muestra de proteínas (~ 10 mL por pellets) de carga a la columna con un caudal de 0,15 mL/min con un límite máximo de presión de 0,5 MPa. La tasa y la columna de presión sigue siendo la misma a través de la purificación. Recoge el flujo a través de un tubo de 50 mL.
	<ol>
<li>Lavar la columna con 20 mL 90% un Buffer y 10% Buffer B. recoger el lavado en un tubo de 50 mL. Eluir las proteínas con un degradado lineal de 20 mL de 10% a 100% B Buffer (20 mM de imidazol de 200 mM).</li>
		<li>Por último, lavar la columna con 5 mL 100% Buffer B (imidazol de 200 mM). Recoger el lavado final y degradado en fracciones 0,27 mL.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
15 μL de tampón de muestra 2 x SDS-PAGE se combinan con 15 μL del flujo a través, de lavado y pico A280 fracciones. Hervir las muestras por 3 minutos.
	<ol>
<li>Preparar dos 10% SDS-PAGE gel como se describió anteriormente en el paso 1.6 excepto con peines bien 15. Coloque 10 μL de cada muestra a los geles y 4 μL de estándares prestained proteína. Correr, la mancha y analizar los geles como se describe en el paso 1.6.</li>
		<li>Combinar fracciones que parecen contener casi puro en PFV basado en inspección visual. Medir el volumen de pipeteo, por lo general 8-10 mL.</li>
		<li>Utilizando un espectrofotómetro, A280 de las fracciones combinadas de medir y calcular la cantidad total de proteína en PFV; nuestro rendimiento típico es ~ 10 mg por L de cultura inducida. El coeficiente de extinción de PFV en con la etiqueta hexahistidine es 59360 cm-1 M-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para quitar la etiqueta de hexahistidine, suplemento PFV en 10 mM Ditiotreitol (DTT, solución stock de 1 M) y 0.1 mM EDTA, pH 8.0 (solución stock de 0,5 M). Añadir 15 μg de la proteasa 3C de rinovirus humanos (HRV) por mg PFV IN. Incubate a 4 ° c durante la noche. Reduce el peso molecular de PFV en de 47374 Da a Da 44394 y puede ser verificado por análisis de SDS-PAGE 10%.</li>
</ol>3. cromatografía de afinidad heparina
<ol><li>
Preparar 250 mL Buffer C (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF) y 250 mL Buffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl). Nota: En el presente Protocolo, el sistema FPLC, buffers y muestra se mantienen en una cámara fría a 4 ° c.<ol>
<li>Filtro estéril Buffers C y D con las unidades de filtro desechable de 0,2 μm. Dependiendo del sistema FPLC, lave la bomba un y bomba B con amortiguamiento C y Buffer D, respectivamente. Flujo tampón C el 80% y 20% D Buffer a través del sistema hasta que se estabilicen las lecturas de la UV y conductividad. El caudal máximo depende del instrumento; Utilizamos sistemáticamente un flujo de 5 mL/min con un límite de presión máxima de 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar una 80 mm largo, 5 mm diámetro FPLC columna con 1 mL de resina de sepharose de heparina (máxima capacidad 2.0 mg de bovino resina de antitrombina III por mL; máximo presión 1,4 MPa). La columna puede ser preparada el día antes de la purificación y almacenada a 4 ° C. Conecte la columna del instrumento FPLC.
	<ol>
<li>Equilibrar la columna con 20 mL de tampón C el 80% y 20% Buffer D (200 mM NaCl) a una velocidad de flujo de 0,5 mL/min con un límite de presión máxima de 1 MPa. El instrumento debe recoger datos en tiempo real de la conductividad y la absorbancia UV a 280 nm (un280). La conductividad y las lecturas de la UV deben estabilizar. Si estas lecturas no se han estabilizado, continuar buffers de flujo a través de la columna hasta que sean estables.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reducir la concentración de NaCl de la muestra en PFV a 200 mM sumando 1,5 volúmenes de tampón C. Por ejemplo, añadir 15 mL de Buffer C 10 mL PFV pulg El volumen total es típicamente ~ 25 mL.</li>
	<li>
Carga de la muestra diluida del PFV en a la columna sepharose de heparina a velocidad de flujo de 0,5 mL/min y presión máxima límite 1,0 MPa. La tasa y la columna de presión sigue siendo la misma a través de la purificación. Recoge el flujo a través de un tubo cónico de 50 mL.
	<ol>
<li>Lavar la columna con 20 mL de tampón C el 80% y 20% Buffer D 200 mM (NaCl), que recoge el lavado en un tubo cónico de 50 mL. Eluir la columna con un gradiente lineal de 30 mL de 20% a 100% Buffer D (200 mM a 1 M de NaCl).</li>
		<li>Lavar la columna con 5 mL de 100% Buffer D. recoja el gradiente y lavado final en fracciones de 0,37 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis de la carga, flujo, lavado y fracciones por 8% SDS-PAGE como se describe en 2.9. PFV en tras la ruptura de la etiqueta de hexahistidine tiene un peso molecular de 44394 Da y el coeficiente de extinción sigue siendo 59360 cm-1 M-1 sin la etiqueta de hexahistidine. Guarde todas las fracciones en 4 ° c hasta la realización de una prueba de la nucleasa.</li>
</ol>4. ensayo nucleasa
<ol><li>
Identificar fracciones de sepharose de heparina que parecen contener casi puro PFV pulg. combinar 3 μL de la fracción de heparina y 50 ng de 3 kb DNA plasmídico superenrollado en reacción buffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM vivencias2 10 mM TDT) con un volumen final de 15 μL. Incubar a 37 ° c durante 90 minutos incluye un control negativo con no IN. PFV
	<ol>
<li>Detener la reacción con proteinasa K de 1 mg/mL (20 mg/mL de solución stock) y 0,5% SDS (solución stock al 10%). Incubar a 37 ° C por 1 h. muestras pueden ser almacenadas a-20 ° C para su posterior análisis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar un gel de 125 mL de 1% en peso por volumen (p/v) de agarosa en buffer de x TAE 1 (40 mM Tris acetato, EDTA 1 mM) con 0,1 μg/mL etidio bromuro (solución stock de 10 mg/mL)13. La solución de agarosa del derretimiento y vierta en una bandeja de fundición de gel de 15 cm x 10 cm. Inserte un peine bien 15 pozos de espesor 0,75 mm ancho, 5 mm. Delgado pozos rinden mejor resolución de banda en comparación con los pozos de espesor 1,5 mm. Permita que el gel se solidifique a temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Sumergir el gel en 1 x TAE con bromuro de etidio de 0.1 μg/mL. Añadir 3,5 μL de 6 x carga del tinte (50% glicerol, colorante de naranja G 0.15%) a las reacciones de prueba de la nucleasa. Carga todo el volumen del gel. Correr el gel a tensión constante, 10 voltios por cm (100 V) a temperatura ambiente durante 1 hora o hasta que el frente de tinte naranja G llega al final del gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inmediatamente la imagen del gel de agarosa con un analizador fluorescente para detectar bromuro de etidio. ADN lineal debe ejecutar tallaje a 3 kb, ADN superenrollado debe correr más rápido (~ 2 kb), y círculo relajado DNA debe ejecutar más lento (~3.5 kb).
	<ol>
<li>Usando software de análisis de imagen, calcular el volumen de píxeles del plásmido superenrollado, lineal y relajado círculo en cada carril. Llame a la suma del píxel volúmenes para estas tres formas de ADN "ADN total" valoran y usan para calcular el porcentaje de círculos lineales y relajados. Por ejemplo, el volumen de píxeles de círculos relajados se divide por el total valor de píxel de ADN en ese carril, multiplique este número por 100 para determinar un porcentaje. Fracciones que contienen contaminante nucleasa muestran un porcentaje más alto de círculos lineales y relajados en comparación con el control negativo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combinar fracciones de sepharose de heparina que no muestran actividad de nucleasas contaminantes. Dializarse en 10 mm tubo corte del diálisis de 6-8 kDa peso molecular (MWCO) a 4 ° C durante la noche contra 1 L 50 mm Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 50 μM vivencias2, 10 mM DTT, 20% de glicerol.</li>
	<li>Recuperar la muestra libre de nucleasa de PFV en tubo de diálisis. Mida A280 y calcular la concentración de la proteína final. Alícuota y complemento la congelación en nitrógeno líquido. Almacenar en alícuotas a-80 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases.">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li><li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus.">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration.">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li><li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+reaction+pathway+and+critical+intermediates.">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li><li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells.">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li><li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase.">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li><li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration.">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Proteínas recombinantes que interactúan con el ADN, tales como proteínas, depuradores de oxígeno para aplicaciones de microscopía sola molécula o integrases retroviral, de reparación del ADN deben estar libres de contaminantes nucleasas bacterianas2,3. Estos contaminantes pueden confundir la interpretación de los resultados durante los ensayos bioquímicos o de una sola molécula a granel.
Hemos encontrado que una nucleasa bacteriana con frecuencia Co purifica con PFV pulg. Sin embargo, PFV en muestra una afinidad por heparina sepharose que es fácilmente distinguible de las nucleasas bacterianas contaminantes1. La clave para preparación de libre de nucleasa PFV es la cuidadosa cuantificación de actividad nucleasa en cada fracción después de elución gradiente de sepharose de heparina. El gradiente debe ser suficientemente bajo para permitir la separación del PFV en el contaminante nucleasa; una fuerte pendiente no sería compatible con una separación eficiente. Además, el sustrato de DNA de plásmido debe tener un bajo porcentaje de círculos relajados para reducir el fondo de la prueba de la nucleasa. Si el sustrato de DNA de plásmido tiene un alto fondo de círculos relajados, debe realizarse una nueva purificación de ADN plásmido. El ensayo de actividad de nucleasa revela la presencia de las fracciones que deben ser desechados y nucleasas contaminantes.
En algunos casos, la cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) puede ser un método eficaz para la eliminación de un contaminante de la nucleasa2. Grupos anteriores han utilizado seg durante la purificación de PFV en4. SEC tiene un volumen de carga limitada y tiende a reducir la concentración de la proteína final. La ventaja principal a afinidad y cromatografía de intercambio iónico es la capacidad para cargar un volumen significativamente mayor de segundos
Pruebas de actividad de nucleasa puede adaptarse a diferentes proteínas que purifican conjuntamente con una nucleasa bacteriana. Aquí identificamos que en PFV y una nucleasa contaminante se puede separar por cromatografía de sepharose de heparina. Previamente hemos demostrado que en PFV tiene un perfil similar a la nucleasa con cationes Mono-S y cromatografía de intercambio de aniones Mono Q hacer estas resinas no aptos para esta proteína. Dependiendo de las características de afinidad de la proteína deseada en relación con la nucleasa, este protocolo puede usarse con resinas de afinidad o de intercambio iónico y la elución gradiente. La clave para quitar contaminación de nucleasa de una proteína de interés es una diferencia en la afinidad por una resina. Cada fracción debe ensayarse para actividad de nucleasa. Las resinas de cromatografía de este Protocolo no pueden ser directamente aplicadas en todas las proteínas que purifican conjuntamente con nucleasas bacterianas. Sin embargo, el concepto global de la utilización de una afinidad o resina de intercambio iónico para separar la nucleasa de una proteína de interés y detectar fracciones actividad nucleasa puede aplicarse ampliamente.

Estudios bioquímicos y una sola molécula de interacciones de proteínas con ADN requieren proteínas recombinantes excepcionalmente puras. Contaminando las nucleasas de bacterias puede ocultar los resultados de estos ensayos. Una nucleasa contaminante se ha encontrado en preparaciones de proteínas recombinantes oxígeno carroñero protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) y prototipo virus espumoso (PFV) integrasa (IN) aislados de Escherichia coli (e. coli)1 , 2 , 3.
Ensayos de integración retroviral se basan en la conversión de ADN superenrollado productos mellada o lineal como una medida de la actividad4. Durante la infección celular IN se une a los dos extremos de un cDNA viral al host cromatina5. Cada extremo a la reacción se denomina transferencia de cadena. Ensayos del recombinante en actividad puede unirse dos oligomeros DNA mímico el cDNA viral termina con un objetivo de ADN en una reacción de integración concertada de5,4,6,7,8. Alternativamente IN recombinante puede unirse solamente un extremo de ADN en un sitio medio no fisiológico relevante integración reacción9,10. Cuando DNA plasmídico superenrollado es el objetivo de integración, integración concertada son productos lineal ADN y medio productos de integración son círculos relajados. Estos productos de reacción son identificados por su movilidad relativa en gel de agarosa electroforesis1. Si la IN recombinante tiene una nucleasa contaminante, habrá falsos círculos relajados o un plásmido linearizado posiblemente confundir los resultados experimentales. Oligómeros de DNA virales pueden etiquetarse fluorescencia para identificar concluyente productos de integración, en comparación con productos de nucleasa. Sin embargo, en gran medida favorece objetivos de ADN superenrollados; cualquier pérdida del plásmido superenrollado círculos relajados o DNA linear por nucleasas contaminantes podría sesgar resultados e interpretación de datos11. Así es indispensable para quitar las nucleasas bacterianas de retrovirales en los preparativos.
PFV en tiene una afinidad diferente para sepharose heparina en comparación con la de nucleasas bacterianas1. PFV en y la nucleasa pueden estar separados por una elución gradiente lineal de sepharose de heparina. La nucleasa no se detecta fácilmente por una absorbancia (UV) ULTRAVIOLETA en pico nm 280 o por electroforesis en gel de poliacrilamida analítica sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE). En cambio, la nucleasa es detectado por un análisis de la actividad de nucleasa utilizando la conversión de un plásmido superenrollado en círculos relajados o productos lineales. Cada fracción siguiente cromatografía de sepharose de heparina se comprueba actividad nucleasa. PFV en y el contaminante de nucleasa no tienen ninguna diferencia en la afinidad de la resina de anión Mono-Q. Hay una pequeña diferencia en la afinidad de la resina de catión Mono-S. Sin embargo, la resolución Mono-S de nucleasas bacterianas y en PFV no permitiría la separación eficiente de las proteínas. En última instancia, heparina sepharose afinidad purificación ofrece la mejor separación de nucleasas bacterianas de PFV en y tiene la ventaja del volumen de carga ilimitado.
Pruebas de contaminación actividad nucleasa puede adaptarse a otras proteínas. La proteína de interés probablemente tendrá características de afinidad alternativos que PFV en; la diferencia de enlace características de la proteína de interés y el contaminante de nucleasa debe determinarse empíricamente. Esta metodología para identificar la contaminación de la nucleasa puede adaptarse a otras resinas como cationes Mono-S o resinas de intercambio de aniones Mono-Q. Resinas de afinidad e intercambio iónico pueden ofrecer un método confiable para aislar una proteína recombinante de interés contaminen las nucleasas sin límites en el volumen de proteína durante la cromatografía.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BL21/DE3 Rosetta E. coli</td>
			<td style="width:180px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70956-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB broth</td>
			<td style="width:180px;">EMD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloramphenicol&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CI8280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">208086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure</td>
			<td style="width:180px;">Gojira Fine Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PMSF&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imidazole&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT&#160;</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure EDTA</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CA3510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA Superflow</td>
			<td style="width:180px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Heparin Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td style="width:180px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0998-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HRV14 3C protease&#160;</td>
			<td style="width:180px;">EMD Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">71493-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase

La proteína integrasa (IN) de los virus espumoso del prototipo de retrovirus (PFV) es una enzima de modelo para estudiar el mecanismo de integración retroviral. Comparado con el IN de otros retrovirus, en PFV es más soluble y más susceptibles a la manipulación experimental. Además, es sensible a los inhibidores IN clínicamente relevantes virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1), sugiriendo que el mecanismo catalítico de PFV es similar a la que del VIH-1 in en cataliza la unión covalente de viral DNA complementaria (cDNA) al destino ADN en un proceso llamado transferencia de cadena. Esta reacción de transferencia de cadena presenta mellas el ADN diana. Análisis de productos de la reacción de integración puede ser confundido por la presencia de nucleasas que igualmente nick ADN. Una nucleasa bacteriana se ha demostrado para purificar conjuntamente con PFV recombinante expresado en Escherichia coli (e. coli). Aquí se describe un método para aislar en PFV de nucleasas contaminantes por cromatografía de afinidad de heparina. Fracciones son fácilmente evaluadas por contaminación de nucleasa con un plásmido superenrollado y electroforesis en gel de agarosa. EN PFV y nucleasas contaminantes muestran afinidades alternativas para heparina sepharose permitiendo una preparación libre de nucleasa de recombinantes en PFV adecuado para análisis bioquímicos o de una sola molécula de a granel de la integración.

Recombinante en PFV está a menudo contaminada con nucleasas bacterianas1. Análisis bioquímico de la integración dependen de la cuantificación de la conversión de ADN de plásmido superenrollado en círculos relajados y productos lineales. La presencia de una nucleasa contaminante podría conducir a falsa cuantificación de estos ensayos. Expresión de PFV en con una etiqueta de hexahistidine es inducida en e. coli (figura 1) y primero se purificó por cromatografía de afinidad níquel (figura 2). Las fracciones con casi puro en PFV se combinan y la etiqueta hexahistidine es dividida por una proteasa. Hemos determinado que en PFV y nucleasas contaminantes tienen diferentes afinidades para heparina sepharose cromatografía (figura 3)1. Fracciones en PFV tras cromatografía de sepharose de heparina se incuban con un plásmido superenrollado a ensayo para círculos relajados y plásmido linearizado, producto de la actividad de nucleasa (figura 4). Este ensayo permite la identificación de fracciones de proteína sin nucleasa (figura 5). Estas fracciones pueden combinar, dializaron y congeladas para futuros experimentos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig1.jpg"> Figura 1: Inducción de PFV en e. coli . Las células de las culturas antes (carril 2) y después de la inducción (carril 3) se analizan para detectar la presencia de PFV en, 47374 da. muestras fueron separadas por 10% SDS-PAGE y teñidas con azul brillante de Coomassie. Carril 1, marcadores de peso molecular (kDa). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig2.jpg"> Figura 2: Níquel fracciones de cromatografía de afinidad. Lisados bacterianos solubles fueron separados por cromatografía de afinidad de níquel. PFV en con una etiqueta hexahistidine eluyó con un degradado lineal de 20 mM de imidazol de 200 mM. Fracciones se evaluaron 10% SDS-PAGE y teñidas con azul brillante de Coomassie. PFV en, 47374 Da, es evidente en la muestra que se carga a la columna (carga), pero es menos evidente en el flujo a través o lavado. Fracciones que procederá a la elución en la gradiente de imidazol comúnmente muestran un contaminante de movilidad más lento cerca de 75 kDa, así como algunos contaminantes más rápidos de la movilidad en o por debajo de 25 kDa. A concentraciones más altas de imidazol no contaminantes evidentes ya en PFV parece ser relativamente puro. En este ejemplo, fracciones #33 a #84 fueron combinados y más purificadas. Marcadores de peso molecular (kDa) están a la izquierda de cada gel. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig3.jpg"> Figura 3 : Cromatografía de sepharose heparina de PFV en 1 . Después del retiro de afinidad y proteasa de níquel de la etiqueta hexahistidine, PFV en (Da 44394) fue fraccionado por heparina sefarosa. Las proteínas fueron eluidas con un degradado lineal desde 200 mM a 1 M de NaCl. Incluso fracciones #12 a #44 se evaluaron 8% SDS-PAGE teñido con Coomassie blue. Marcadores de peso molecular (kDa) están a la izquierda de cada gel. Estas fracciones fueron probadas para la actividad de nucleasa. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig4.jpg"> Figura 4: Ensayo de la nucleasa de sepharose fracciones de heparina 1 . Cada fracción de sepharose heparina fue añadido al ADN del plásmido superenrollado. Fracción números se correlacionan con los se muestra en la figura 3. Tras la incubación, las reacciones de nucleasa fueron deproteinated y separaron por 1% agarosa con bromuro de etidio. Controles negativos incluyen ADN de plásmido con ninguna proteína (sólo blanco) y una purificación previa de tipo salvaje en PFV conocido libre de nucleasas (PFV en peso). Control positivo para contaminantes actividad nucleasa es una purificación previa de catalítico inactivo en PFV que se sabe que tienen contaminante nucleasa (PFV en D128N). Marcadores del tamaño de ADN aparecen en kb. Plásmido superenrollado (SC), plásmido lineal (L) y círculos relajados (RC) se indican. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig5.jpg"> Figura 5 : Cuantificación de ensayos de nucleasas 1. se examinaron los geles de agarosa y valores de los píxeles se cuantificaron para superenrollado (SC), lineal (L) y bandas de círculo relajado (RC) en cada carril. Fracción números se correlacionan con los se muestra en las figuras 3 y 4. Se calcularon los porcentajes de círculos lineales y relajados utilizando los valores de píxel y la ecuación que se muestra. Por ejemplo, valores de píxel para las bandas de fracción #12 son: 817636 plásmido superenrollado, 50467 plásmido lineal y 112052 círculos relajados. El valor de píxel de ADN total de fracción #12 es la suma de estos valores, 980155. El porcentaje del ADN lineal es 50467 multiplicado por 100 el porcentaje y dividido por el total valor de ADN equivale a 5.1%. El porcentaje de círculos relajados es 112052 multiplicado por 100 y dividido por el total valor de ADN equivale a 11,4%. La suma de los porcentajes del círculo lineal y relajado es 16.5%. ADN del plásmido de control negativo con ninguna proteína (No en, el gráfico de abajo) indica que esta preparación de plásmido incluye 4.4% del ADN total como círculos relajados o lineales. Un segundo control negativo fue una purificación previa de tipo salvaje en PFV (WT) que muestra el 8,6% del ADN total como círculos relajados o lineales. Estos carriles dos indican el nivel de fondo de mellada o lineal del plásmido presente con el sustrato solo y con PFV pulg. Un control positivo es una purificación previa de catalítico inactivo en PFV (D128N) que tenía el 23% del ADN total como círculos lineales y relajados. El ADN expuesto a fracciones de heparina sepharose #12 al #22 resultó en > 10% de la DNA como círculos lineales y relajados. En este ejemplo, fracciones #24 y #42 aparecidos < 10% conversión lineal y relajado de los círculos. Estas fracciones fueron combinadas y se dializaron. Alícuotas fueron congeladas y almacenadas a-80 ° C para su uso futuro. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Proteína de integrasa prototipo recombinante virus espumoso está a menudo contaminada con una nucleasa bacteriana durante la purificación. Este método identifica la contaminación nucleasa y lo quita de la preparación final de la enzima.

Detección y eliminación de nucleasa contaminación durante la purificación de prototipo recombinante Virus Espumoso integrasa

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.0K vistas.  The Ohio State University College of Medicine. Proteína de integrasa prototipo recombinante virus espumoso está a menudo contaminada con una nucleasa bacteriana durante la purificación. Este método identifica la contaminación nucleasa y lo quita de la preparación final de la enzima.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Investigación

Inmunología e Infección

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Detección del virus infeccioso de campo recogidos por los mosquitos del ensayo cultivo celular Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purificación por afinidad de los complejos de ribonucleoproteína Influenza Virus de la cromatina de las células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

En Vivo Imaging Systems (IVIS) La detección de un virus invasor Neuro-encefálico

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Rescate del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante a partir de cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Rescate y Caracterización del Virus Recombinante de un Nuevo Mundo Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

Asamblea y purificación del prototipo Virus espumoso de los Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...