Este trabalho foi financiado pelo NIH AI099854 e AI126742 a chave.

1. induzir PFV em expressão em e. coli
<ol><li>
Adicionar 1 μL do plasmídeo de expressão IN PFV (10 ng/μL) de 20 μL de Escherichia coli BL21(DE3) pLysS (20 alíquota μL de células disponíveis comercialmente tem > 2 x 106 UFC/μg plasmídeo) em um tubo de 1,5 mL. Misture suavemente pelo dedo tocar ou passar rapidamente o tubo. Incubar em gelo 5 min.
	<ol>
<li>Aqueça o choque por exatamente 30 s em um 42 ˚ c banho de água e em seguida, retornar imediatamente para gelo por 2 min.</li>
		<li>Adicione 80 µ l de caldo super ideal de temperatura com meios de repressão (SOC) catabolite. Incube durante 1 h a 37 ˚ c com 225 rotações por minuto (rpm) a tremer.</li>
		<li>Placa 25 μL da mistura em uma 100 x 15 mm placa de Petri contendo 25 mL de ágar de caldo (LB) de Luria (ágar-ágar LB 1L: 10 g NaCl, extrato de levedura 5 g, 10 g bacto-triptona, ágar 15 g) e 100 μg/mL ampicilina (100 mg/mL de solução).</li>
		<li>Os restantes 75 μL das células transformadas em uma segunda placa idêntica da placa. Incubar as placas com as tampas para baixo durante a noite a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recuperar as placas de transformada Escherichia coli. Usar uma única colônia para inocular 3 mL de LB (L 1 LB: 10g de bacto-triptona, 10 g de NaCl, 5 g de fermento extrato) suplementado com 100 ampicilina μg/mL em um tubo de polipropileno cultura 14 mL de fundo redondo. Encube por ~ 8 h em 37 ˚ c com 225 rpm a tremer.
	<ol>
<li>Adicione a 3 mL de cultura a 50 mL LB suplementado com 100 μg/mL ampicilina e cloranfenicol 34 μg/mL (34 mg/mL de solução) em um Erlenmeyer de 250 mL. Incube a cultura durante a noite a 37 ° C, com 225 rpm a tremer.</li>
		<li>Transferi o 53 mL da cultura para L 1 LB, 100 μg/mL ampicilina e 34 cloranfenicol μg/mL em um frasco de Erlenmeyer de 4 L. Incube a 37 ° C, com 225 rpm a tremer.</li>
		<li>Medir a densidade óptica em 600 nm (OD600) da cultura periodicamente. Inicialmente, verifica a cultura OD600 cada h. Como a cultura atinge o desejado OD600, verificar a cada 15 min para não overgrow. Cresce a cultura para uma OD600 entre 0,9 e 1,0. Transferir o balão para um banho de gelo e agite para reduzir a temperatura da cultura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transferi 1 mL da cultura para um tubo de 1,5 mL para análise posterior por desnaturação análise de SDS-PAGE.
	<ol>
<li>Granule as células no tubo de 1,5 mL por centrifugação por 1 min em uma microcentrífuga a 14.000 x g, à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante. Resuspenda o pellet em 150 μL tampão fosfato soro fisiológico (PBS), pipetando. O PBS pode ser com ou sem CaCl2 e MgCl2.</li>
		<li>Adicionar 150 μL de tampão de amostra SDS-PAGE de 2x (150 mM Tris-HCl, pH 6,8, SDS de 1,2%, 30% de glicerol, 15% de β-mercaptoetanol (βME), 0,0018% bromofenol) e misture bem por pipeta ou vórtice. Ferva por 3 min. loja a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar a cultura bacteriana: uma concentração final de 0,25 mM isopropil-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, solução estoque de 0,25 M) e 50 μM ZnCl2 (solução de 50 milímetros). IPTG induz a expressão do gene PFV IN o promotor T7 e ZnCl2 é adicionado como um suplemento para o dobramento correto de um domínio do dedo de zinco terminal amino em PFV IN. Incubate a cultura, a 25 ° C com agitação imediatamente a 225 rpm para 4 h. transferi o balão para um banho de gelo. Salve 1 mL da cultura para análise de SDS-PAGE, seguindo o mesmo protocolo como acima no ponto 1.3.</li>
	<li>
Transferi a cultura bacteriana para garrafas de centrífuga de tamanho apropriado. Por exemplo, uma cultura de 1L pode ser transferida para quatro garrafas de polipropileno parte inferior cónica estéril descartável 250 mL. Gire as garrafas em uma centrífuga de mesa refrigerada a 3000 x g durante 20 minutos a 4 ˚ c. Descarte os sobrenadantes derramando.
	<ol>
<li>Todas as pelotas de uma cultura bacteriana de 1 L, em um volume total de 25 mL (6,25 mL / frasco) PBS frio (com ou sem CaCl2 e MgCl2) Ressuspender pipetando. Combinar e transferir as suspensões bacterianas para um tubo cónico de 50 mL. Girar numa centrifugadora refrigerada a 3.000 x g por 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante por derramar ou pipetagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspenda o pellet bacteriano em 10 mL de tampão de ressuspensão (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl e 500 inibidor da protease phenylmethylsulfanoxide (PMSF) μM) por pipetagem. Snap congelar a pelota, colocando o tubo em um frasco de Dewar com nitrogênio líquido suficiente para submergir o tubo de 50 mL. Cuidadosamente Retire o tubo do nitrogênio líquido e armazene a-80 ° C. Nota: Pelotas bacterianas podem ser armazenadas por vários meses a-80 ° C. Temos visto sem perda de proteína ativa após armazenamento-80 ° C durante dois anos.</li>
	<li>
Análise das amostras de pré- indução e pós-indução por 8,3 cm de largura, 7,3 cm de altura, 0,75 mm espessura SDS-PAGE géis com poliacrilamida 6% de 1,5 mL camada de empilhamento (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, persulfato de amónio do acrilamido 6%, 0,1% SDS, 0,1%, 0.001% TEMED) e 3,5 mL 10% poliacrilamida resolvendo camada (375 mM Tris-HCl, pH 8.8, 10% do acrilamido, 0,1% SDS, 0,1% persulfato de amónio, 0,001% TEMED)12.
	<ol>
<li>Depois de derramar o gel de empilhamento, inserir um pente bem 10. Quando o gel tem polimerizado, montar o aparato da página e adicionar suficiente buffer corrente de SDS-PAGE (25 mM Tris, glicina 192mm, 0,1% SDS).</li>
		<li>Carrega 10 μL de cada amostra e 4 μL de padrões da proteína de prestained. Execute a 16.5 V/cm até a frente do corante atinge a parte inferior do gel, aproximadamente 60 min.</li>
		<li>Desmontar as placas de gel e gel de transferência para uma banheira de plástico. Adicione Coomassie brilhante azul coloração solução (0,1% R-250 azul brilhante de Coomassie, 40% de metanol, ácido acético a 10%) generosamente cobrir o gel e mancha por 20 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Remover a solução de coloração derramando e substituir com destain solução (40% de metanol, ácido acético a 10%) até bandas são facilmente visíveis. Remover a solução de descoloração derramando e substituir com água desionizada. PFV IN devem ser facilmente identificado na amostra pós-indução. PFV em com um tag de hexahistidine tem um peso molecular de 47374 Da.</li>
		<li>Se em PFV não estiver visível, repita a indução, começando com uma colônia diferente de uma das placas de transformação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. níquel cromatografia de afinidade
<ol><li>Descongele uma pelota bacteriana no gelo. Nota: Isso levará um tempo significativo (aproximadamente 2-3h). Quando a pelota descongelou para uma suspensão de células, adicione um adicional de 500 μM PMSF (solução estoque de 100 mM).</li>
	<li>Mantenha o tubo de 50 mL de bactérias chorume no gelo. Proceda à sonicação as bactérias em amplitude de 30% para 30 s (1 s na, 1 s fora) por pelota derivada da cultura de 1 L, usando um sonicador com um chifre de bio 0,5 polegada de diâmetro com um diâmetro de 0,125 polegada afilado microtip, uma frequência de 20 kHz e potência máxima de 400 w.</li>
	<li>Transferi a amostra de células para um tubo frio se. Use o policarbonato garrafa assemblies (25 mm de diâmetro, altura de 89 mm) compatíveis com um rotor de ângulo fixo tipo 60 de Ti. Rotores e tubos alternativos podem ser utilizados se a mesma força de gravitação é alcançada. Girar a 120.000 x g, durante 60 min a 4 ° C. Deve haver um pellet óbvio. O sobrenadante pode ter uma cor amarela.</li>
	<li>Transferi o sobrenadante por derramar ou Pipetar para um tubo cônico de frio 50 mL. Nota o volume; Este volume deve ser aproximadamente o volume de ressuspensão buffer usado antes da congelação de snap. Se o sobrenadante é viscoso, podem estar contaminado por ADN bacteriano que pode obstruir a coluna de cromatografia. Neste caso, repita a ultracentrifugação para o DNA bacteriano de Pelotas.</li>
	<li>
Preparar 500 mL Buffer uma (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 500 μM PMSF) e 500 mL Buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 500 μM PMSF, imidazol 200 mM). Nota: No presente protocolo, manter o sistema de cromatografia líquida (FPLC) proteína rápida, todos os buffers e a amostra a 4 ° C, em uma sala fria.<ol>
<li>Buffers de filtro estéril A e B com 0,2 μm unidades de filtro descartável. Dependendo do sistema FPLC, lave bomba A e B de bomba com tampão A e B do Buffer, respectivamente. B de Buffer de fluxo 90% A de Buffer e 10% através do sistema até estabilizar a condutividade e leituras de UV. A taxa de fluxo máxima vai depender do instrumento; Use uma taxa de fluxo de 5 mL/min com um limite de pressão máxima de 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar uma 110 mm, 5 mm diâmetro FPLC coluna com resina de níquel-cobrado 1,5 mL (capacidade de ligação máxima 50 mg/mL, máximo 1 MPa de pressão). A coluna pode ser preparada no dia antes da purificação e armazenada a 4 ˚ c.</li>
	<li>A coluna Conecte o instrumento FPLC. Equilibrar a coluna com 20 mL de 90% A de Buffer e 10% B Buffer (imidazol 20mm) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, com um limite de pressão máxima de 0,5 MPa. O instrumento deve estar coletando dados em tempo real de condutividade e absorção UV em 280 nm (280). A condutividade e leituras de UV devem estabilizar. Se estas leituras não tem estabilizado, continue a buffers de fluxo através da coluna até que estejam estáveis.</li>
	<li>
Carrega a amostra de proteínas (~ 10 mL por pelota) para a coluna em uma taxa de fluxo de 0,15 mL/min, com um limite de pressão máxima de 0,5 MPa. A pressão de coluna e a taxa de fluxo permanece a mesma em toda a purificação. Colete o fluxo através de um tubo de 50 mL.
	<ol>
<li>Lavar a coluna com 20 mL de 90% A de Buffer e 10% Buffer B. coletar a lavagem em um tubo de 50 mL. Eluir as proteínas com um gradiente linear de 20 mL de 10% a 100% B Buffer (20 mM para imidazole 200 mM).</li>
		<li>Finalmente, lave a coluna com 5 mL 100% B Buffer (imidazol 200 mM). Recolher a lavagem final e gradiente em frações de 0,27 mL.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aliam 15 μL de tampão de amostra SDS-PAGE 2 x 15 μL do fluxo através de lavagem e pico A280 fracções. Ferva as amostras por 3 min.
	<ol>
<li>Prepare dois 10% gel de SDS-PAGE, conforme descrito anteriormente na etapa 1.6 exceto com 15 pentes bem. Carrega 10 μL de cada amostra para os géis e 4 μL de padrões da proteína de prestained. Executar, manchar e analisar os geles, conforme descrito na etapa 1.6.</li>
		<li>Fracções de combinar que parecem conter quase puro PFV IN baseiam na inspeção visual. Medir o volume de pipetagem, normalmente de 8 a 10 mL.</li>
		<li>Usando um spectrophotometer, medir a um280 das frações combinadas e calcular a quantidade total de proteínas em PFV; nosso rendimento típico é ~ 10 mg / L de cultura induzida. O coeficiente de extinção da PFV IN com a tag hexahistidine é 59360 cm-1 M-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para remover a marca de hexahistidine, suplemento PFV IN com 10 mM ditiotreitol (DTT, solução estoque de 1 M) e 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (solução 0,5 M). Adicione 15 μg de protease de 3C rinovírus humano (VFC) por mg PFV IN. Incubate no 4 ˚ c durante a noite. Clivagem reduz o peso molecular PFV IN de 47374 para Da 44394 e pode ser verificada pela análise de SDS-PAGE 10%.</li>
</ol>3. cromatografia de afinidade heparina
<ol><li>
Preparar 250 mL Buffer C (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM de EDTA e 500 μM PMSF) e 250 mL de tampão D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl). Nota: Este protocolo, o sistema FPLC, buffers e amostra são mantidos em uma sala fria no 4 ˚ c.<ol>
<li>Filtro estéril Buffers C e D com 0,2 μm unidades de filtro descartável. Dependendo do sistema FPLC, lave bomba A e B de bomba com Buffer C e D do Buffer, respectivamente. Fluxo de Buffer C 80% e 20% D reserva através do sistema até estabilizar a condutividade e leituras de UV. A taxa de fluxo máxima vai depender do instrumento; rotineiramente usamos uma taxa de fluxo de 5 mL/min, com um limite de pressão máxima de 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare uma 80 mm, 5 mm diâmetro FPLC de coluna com 1 mL de resina sepharose de heparina (máxima capacidade de ligação 2,0 mg de bovinos antitrombina III / mL da resina; 1,4 MPa de pressão máxima). A coluna pode ser preparada no dia antes da purificação e armazenada a 4 ° C. A coluna Conecte o instrumento FPLC.
	<ol>
<li>Equilibrar a coluna com 20 mL de tampão C de 80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, com um limite de pressão máxima de 1 MPa. O instrumento deve estar coletando dados em tempo real de condutividade e absorção UV em 280 nm (280). A condutividade e leituras de UV devem estabilizar. Se estas leituras não tem estabilizado, continue a buffers de fluxo através da coluna até que estejam estáveis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reduzir a concentração de NaCl de amostra PFV em 200mm adicionando 1,5 volumes Buffer C. Por exemplo, adicionar 15 mL de tampão C para 10 mL PFV IN. Nosso volume total é tipicamente ~ 25 mL.</li>
	<li>
A amostra em PFV diluída à coluna de sepharose heparina em taxa de fluxo de 0,5 mL/min com pressão máxima de carga limite 1,0 MPa. A pressão de coluna e a taxa de fluxo permanece a mesma em toda a purificação. Colete o fluxo através de um tubo cónico de 50 mL.
	<ol>
<li>Lavar a coluna com 20 mL de tampão C de 80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl), coletando a lavagem em um tubo cónico de 50 mL. Eluir a coluna com um gradiente linear de 30 mL de 20% a 100% D Buffer (200 mM a 1 M NaCl).</li>
		<li>Lave a coluna com 5 mL de 100% Buffer D. coletar o gradiente e lavagem final em frações de 0,37 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisar o fluxo através de carga, lavagem e frações em 8% SDS-PAGE, conforme descrito em 2.9. PFV em clivagem da hexahistidine marca a seguir tem um peso molecular de 44394 Da e o coeficiente de extinção permanece 59360 cm-1 M-1 sem a marca de hexahistidine. Armazene todas as frações no 4 ˚ c até a conclusão de um ensaio de nuclease.</li>
</ol>4. ensaio de nuclease
<ol><li>
Identificar frações de sepharose heparina que parecem conter quase puro PFV pol. combinar 3 μL de fração de heparina e 50 ng de 3KB supercoiled Plasmídeo em reação buffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 110 mM de NaCl, 5 mM de MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM DTT) com um volume final de 15 µ l. Incubar a 37 ˚ c por 90 min. incluir um controle negativo com nenhum PFV IN.
	<ol>
<li>Parar a reação com 1 mg/mL da protease K (20 mg/mL de solução) e 0,5% SDS (solução a 10% das ações). Incube a 37 ° C por 1 h. amostras podem ser armazenadas a-20 ° C para posterior análise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare um gel de 125 mL de 1% peso por volume (p/v) de agarose em 1 x TAE buffer (40 mM Tris-Acetato, 1 mM EDTA) com 0,1 µ g/mL ethidium bromide (10 mg/mL de solução)13. Derreter a solução de agarose e despeje para uma bandeja de fundição de gel 15 cm x 10 cm. Inserir um pente bem 15 com ampla, poços de espessura 0,75 mm 5 mm. Poços finos rendem melhor resolução de banda, em comparação com poços de espessura de 1,5 mm. Permitir que o gel solidificar à temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Imergir o gel em 1 x TAE com brometo de etídio 0,1 µ g/mL. Adicione 3,5 μL de 6 x Tintura (50% de glicerol, tintura de laranja G 0,15%) de carregamento para as reações de ensaio de nuclease. Carrega todo o volume para o gel. Funcione o gel em constante tensão, 10 volts por centímetro (100 V) à temperatura ambiente durante 1 h ou até a frente de corante laranja G chega ao fim do gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
O gel de agarose imediatamente da imagem com um scanner fluorescente definido para detectar o brometo de etídio. DNA linear deve ser executado fiel tamanho em kb 3, DNA supercoiled deve correr mais rápido (~ 2 kb) e círculo relaxado DNA deve executar mais lento (~3.5 kb).
	<ol>
<li>Usando o software de análise de imagem, calcule o volume de pixel do plasmídeo círculo supercoiled, linear e relaxado em cada raia. Chame a soma do pixel volumes para estas três formas de DNA, o DNA"total" de valor e usá-lo para calcular a percentagem de círculos lineares e relaxados. Por exemplo, o volume de pixel de círculos relaxados é dividido pelo valor de pixel de DNA total na lane, multiplique esse número por 100, para determinar uma porcentagem. Frações que contêm contaminante nuclease exibem um percentual maior de círculos lineares e descontraídos, em comparação com o controle negativo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combine a frações de sepharose heparina que não exibem atividade de nuclease contaminante. Urinar em 10 mm, 6-8 kDa peso molecular corte (MWCO) tubulação da diálise em 4 ° C durante a noite contra 1 L de 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20% de glicerol.</li>
	<li>Recupere a amostra PFV IN livre de nuclease da tubulação da diálise. Medir a um280 e calcular a concentração de proteína final. Alíquota e snap freeze em nitrogênio líquido. Alíquotas de loja a-80 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases.">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li><li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus.">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration.">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li><li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+reaction+pathway+and+critical+intermediates.">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li><li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells.">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li><li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase.">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li><li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration.">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Proteínas recombinantes que interagem com o DNA, tais como proteínas, catadores de oxigênio para aplicações de microscopia única molécula ou integrases retroviral, de reparação do DNA devem ser livres de contaminação bacteriana nucleases2,3. Estes contaminantes podem confundir a interpretação dos resultados durante os ensaios bioquímicos ou única molécula de granel.
Achamos que uma nuclease bacteriana frequentemente co purifica com PFV pol. No entanto, PFV IN exibe uma afinidade para sepharose heparina que é facilmente distinguível do contaminante nuclease bacteriana1. A chave para a preparação da nuclease livre PFV IN é a quantificação cuidadosa de actividade nuclease em cada fração após eluição gradiente de heparina-sepharose. O gradiente deve ser suficientemente raso para permitir a separação do PFV IN do contaminante nuclease; um gradiente íngreme não seria compatível com uma separação eficiente. Além disso, o substrato de DNA de plasmídeo deve ter uma baixa percentagem de círculos descontraídos para reduzir o plano de fundo do ensaio da nuclease. Se o substrato de DNA de plasmídeo tem um fundo elevado de círculos relaxados, deve ser realizada uma nova purificação de plasmídeo. O ensaio da atividade nuclease revela a presença do contaminante nuclease e fracções que devem ser descartadas.
Em alguns casos, a cromatografia de exclusão (SEC) pode ser um método eficaz para a remoção de um contaminante nuclease2. Grupos anteriores usaram SEC durante a purificação de PFV em4. SEC tem um volume de carga limitada e tende a reduzir a concentração de proteína final. A grande vantagem de afinidade e cromatografia de troca iónica é a capacidade de carregar um volume significativamente maior do que a SEC.
Testes para a atividade de nuclease podem ser adaptada para diferentes proteínas que purificam co com uma nuclease bacteriana. Aqui podemos identificar ao PFV e uma nuclease contaminante pode ser separado por cromatografia de sepharose heparina. Anteriormente mostramos que PFV em tem um perfil semelhante a nuclease com Mono-S cação e cromatografia de troca de ânion Mono-Q tornando Estas resinas inadequada para esta proteína. Dependendo das características de afinidade da proteína desejada em relação a nuclease, este protocolo pode ser usado com afinidade ou troca iônica resinas e eluição gradiente. A chave para uma eficaz remoção de contaminação de nuclease de uma proteína de interesse é uma diferença na afinidade por uma resina. Cada fração deve ser analisada para a atividade de nuclease. As resinas de cromatografia do presente protocolo não podem ser aplicadas diretamente para todas as proteínas que purificam co com nucleases bacterianas. No entanto, o conceito global do uso de uma afinidade ou resina de troca iônica para separar a nuclease de uma proteína de interesse e frações analisar para a atividade de nuclease pode ser amplamente aplicável.

Estudos bioquímicos e única molécula de interações da proteína com DNA requerem proteínas recombinantes excepcionalmente puras. Contaminar as nucleases de bactérias pode obscurecer os resultados desses ensaios. Um contaminante nuclease foi encontrado em preparações à base de proteínas recombinantes oxigênio ao tesouro protocatechuate-3,4-dioxigenase (PCD) e protótipo vírus espumoso (PFV) integrase (IN) isolados de Escherichia coli (e. coli)1 , 2 , 3.
Ensaios de integração retroviral dependem a conversão de DNA supercoiled produtos entalhadas ou lineares como uma medida da atividade4. Durante a infecção celular IN junta-se as duas extremidades do cDNA viral para o anfitrião cromatina5. Cada participante se juntar a reação é denominado transferência de vertente. Ensaios de recombinação na atividade posso juntar dois oligómeros de DNA imitar o cDNA viral termina para um destino de DNA em uma integração concertada reação4,5,6,7,8. Alternativamente IN recombinante pode aderir apenas um final de DNA em um site não-fisiologicamente relevante metade integração reação9,10. Quando supercoiled Plasmídeo é alvo de integração, integração concertada produtos são linearizadas DNA e produtos de integração local metade são círculos relaxados. Estes produtos de reação são identificados por sua mobilidade relativa durante de eletroforese de gel de agarose1. Se o recombinante em tem uma contaminante nuclease, haverá círculos relaxados espúrios ou um plasmídeo linear possivelmente confundir os resultados experimentais. Oligómeros de DNA virais podem ser rotulados fluorescente para identificar conclusivamente produtos de integração, ao contrário de produtos da nuclease. No entanto, em muito favorece supercoiled alvos do DNA; qualquer perda do plasmídeo supercoiled círculos relaxados ou DNA linear por nucleases contaminantes poderia distorcer os resultados e interpretação de dados11. Assim, é imperativo para remover bacterianas nucleases de retroviral em preparações.
PFV em tem uma diferente afinidade para heparina sepharose comparado ao de nuclease bacteriana1. PFV IN e a nuclease podem estar separadas por uma eluição gradiente linear de heparina-sepharose. A nuclease não é facilmente detectado por uma absorvância (UV) ultravioleta no pico de nm 280 ou por eletroforese em gel de poliacrilamida analítica de sódio Dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Em vez disso, a nuclease é detectado por um ensaio de atividade nuclease empregando a conversão de um plasmídeo supercoiled círculos relaxados ou produtos lineares. Cada fração após cromatografia de sepharose heparina é testada para a atividade de nuclease. PFV IN e a contaminação de nuclease não tem nenhuma diferença na afinidade para resina de ânion Mono-Q. Há uma pequena diferença na afinidade para resina de cátion Mono-S. No entanto, a resolução de Mono-S de nuclease bacteriana e em PFV não permitiria eficiente separação das proteínas. Em última análise, purificação da afinidade de sepharose heparina oferece a melhor separação de nuclease bacteriana de PFV IN... e tem a vantagem do volume de carga ilimitada.
Teste para contaminar a atividade de nuclease pode ser adaptada a outras proteínas. A proteína de interesse provavelmente terá características de afinidade alternativos que PFV IN; a diferença de vinculação características da proteína de interesse e a contaminação de nuclease deve ser determinada empiricamente. Esta metodologia para identificar contaminação nuclease pode ser adaptada para outras resinas incluindo cátion Mono-S ou resinas de troca de ânion Mono-Q. Afinidade e troca iônica resinas podem oferecer um método confiável para isolar uma proteína recombinante do interesse de contaminar nucleases sem limites no volume de proteína durante a cromatografia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BL21/DE3 Rosetta E. coli</td>
			<td style="width:180px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70956-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB broth</td>
			<td style="width:180px;">EMD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloramphenicol&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CI8280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">208086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure</td>
			<td style="width:180px;">Gojira Fine Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PMSF&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imidazole&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT&#160;</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure EDTA</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CA3510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA Superflow</td>
			<td style="width:180px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Heparin Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td style="width:180px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0998-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HRV14 3C protease&#160;</td>
			<td style="width:180px;">EMD Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">71493-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase

A proteína integrase (IN) do vírus espumoso da retrovírus protótipo (PFV) é uma enzima de modelo para o estudo do mecanismo de integração retroviral. Comparado a pol de outros retrovírus, PFV IN é mais solúvel e mais receptivos a manipulação experimental. Além disso, é sensível a inibidores de IN clinicamente relevantes vírus de imunodeficiência humana (HIV-1), sugerindo que o mecanismo catalítico da PFV IN é semelhante do HIV-1 IN. IN catalisa juntarem covalente viral DNA complementar (cDNA) para o alvo DNA em um processo chamado transferência de vertente. Esta reação de transferência de vertente apresenta cortes de ADN do alvo. Análise dos produtos de reacção de integração pode ser confundida pela presença de nucleases que nick da mesma forma o DNA. Uma nuclease bacteriana foi mostrado para purificar co com PFV recombinante expressa em Escherichia coli (e. coli). Aqui nós descrevemos um método para isolar PFV IN das nucleases contaminantes por cromatografia de afinidade de heparina. Frações são facilmente rastreadas por contaminação de nuclease com um plasmídeo supercoiled e eletroforese em gel de agarose. PFV IN e o contaminante nuclease exibem afinidades alternativas para heparina sepharose permitindo uma preparação livre de nuclease da recombinação PFV IN adequado para análise de bioquímica ou única molécula em massa de integração.

Recombinante PFV em muitas vezes está contaminado com uma nuclease bacteriana1. Ensaios bioquímicos integração dependem a quantificação da conversão do plasmídeo supercoiled DNA para círculos relaxados e produtos lineares. A presença de uma contaminante nuclease poderia levar a quantificação espúria destes ensaios. Expressão da PFV IN com um tag de hexahistidine é induzida em e. coli (Figura 1) e primeiro purificado por cromatografia de afinidade de níquel (Figura 2). As frações com quase puro PFV IN são combinadas e a tag hexahistidine é clivada por uma protease. Nós determinamos que PFV IN e as nucleases contaminantes têm afinidades diferentes para heparina sepharose cromatografia (Figura 3)1. Frações em PFV após cromatografia de sepharose heparina são incubadas com um plasmídeo supercoiled a ensaiar para círculos relaxados e plasmídeo linear, os produtos da atividade da nuclease (Figura 4). Este ensaio permite a identificação de frações de proteína sem a nuclease (Figura 5). Estas frações podem ser combinadas, diálise e congeladas para experiências futuras.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig1.jpg"> Figura 1: Indução de PFV em e. coli . Células de culturas antes (pista 2) e depois de indução (faixa 3) são analisadas para a presença de PFV IN, 47374 promotor. amostras foram separados por 10% SDS-PAGE e corados com azul de Coomassie brilhante. Pista 1, marcadores de peso molecular (kDa). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig2.jpg"> Figura 2: Níquel fracções de cromatografia de afinidade. Lisado bacteriano solúvel foram separado por cromatografia de afinidade de níquel. PFV IN com um tag de hexahistidine foi eluída com um gradiente linear de 20 mM para imidazole de 200 mM. Frações foram avaliadas em 10% SDS-PAGE e corados com azul de Coomassie brilhante. PFV IN, 47374 Da, é facilmente perceptível na amostra carregada para a coluna (carga), mas é menos aparente no fluxo através de ou lavar. Frações que eluir cedo no gradiente de imidazol comumente exibem um contaminante de mobilidade mais lento perto de 75 kDa, bem como alguns contaminantes de mobilidade mais rápidos em ou abaixo de 25 kDa. Em altas concentrações de imidazol existem contaminantes não aparentes e PFV IN parece ser relativamente puro. Neste exemplo, frações #33 através de #84 foram combinadas e mais purificadas. Marcadores de peso molecular (kDa) são à esquerda de cada gel. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig3.jpg"> Figura 3 : Cromatografia de sepharose heparina de PFV em 1 . Após a remoção de afinidade e protease níquel da marca hexahistidine, PFV em (Da 44394) foi fracionado por heparina-sepharose. As proteínas foram eluídas com um gradiente linear de 200 mM a 1 M de NaCl. Mesmo frações #12 #44 foram avaliadas em 8% SDS-PAGE corado com Coomassie azul. Marcadores de peso molecular (kDa) são à esquerda de cada gel. Estas frações foram testadas para a atividade de nuclease. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig4.jpg"> Figura 4: Ensaio de nuclease de frações de heparina sepharose 1 . Cada fração de sepharose heparina foi adicionada ao plasmídeo supercoiled DNA. Números de fração correlacionam àqueles mostrados na Figura 3. Após incubação, as reações de nuclease foram desproteínado e separaram por 1% de agarose com brometo de etídio. Controles negativos incluem Plasmídeo com nenhuma proteína (alvo somente) e uma purificação anterior do tipo selvagem em PFV conhecido para ser livre de nuclease (PFV em WT). Um controle positivo para contaminar a atividade de nuclease é uma purificação anterior de cataliticamente inactiva PFV em que é conhecida por ter contaminante nuclease (PFV em D128N). Marcadores de tamanho de DNA são mostrados em kb. Supercoiled plasmídeo (SC), plasmídeo linear (L) e círculos relaxados (RC) são indicados. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig5.jpg"> Figura 5 : Quantificação dos ensaios de nuclease 1. Agarose géis foram escaneados e valores de pixel foram quantificados para supercoiled (SC), linear (L) e bandas de círculo relaxado (RC) em cada raia. Números de fração correlacionam àqueles mostrados nas figuras 3 e 4. As percentagens de lineares e descontraídos círculos foram calculadas usando os valores de pixel e a equação mostrada. Por exemplo, o pixel valores para as bandas da fração #12 são: 817636 do plasmídeo supercoiled, 50467 plasmídeo linear e 112052 círculos relaxados. O valor de pixel de DNA total para fração #12 é a soma desses valores, 980155. A porcentagem de DNA linear é 50467 multiplicado por 100 para a porcentagem e dividido pelo valor de DNA total igual a 5,1%. A percentagem de círculos relaxados é 112052 multiplicado por 100 e dividido pelo valor de DNA total igualando 11,4%. A soma das percentagens de círculo linear e relaxado é 16,5%. Controlo negativo plasmídeo com nenhuma proteína (não IN, gráfico inferior) indica que esta preparação do plasmídeo incluído 4,4% do DNA total como círculos lineares ou relaxados. Um segundo controle negativo era uma purificação anterior do tipo selvagem PFV IN (WT) exibido 8,6% do DNA total como círculos lineares ou relaxados. Estas faixas de controle de dois indicam o nível de fundo do plasmídeo entalhado ou linear presente com o substrato sozinho e com PFV pol. Um controle positivo é uma purificação anterior de cataliticamente inactiva em PFV (D128N), que tinha 23% do DNA total como círculos lineares e relaxados. O DNA exposto a frações de sepharose heparina #12 a 22 # resultou em > 10% do DNA linear e relaxado em círculos. Neste exemplo, frações #24 a #42 exibidas < conversão de 10% aos círculos lineares e relaxados. Estas frações foram combinadas e diálise. Alíquotas foram congeladas e armazenadas a-80 ° C para uso futuro. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56605/56605fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase at JoVE.com

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Proteína de integrase espumosa vírus recombinante protótipo é frequentemente contaminada com uma nuclease bacteriana durante a purificação. Este método identifica a contaminação da nuclease e remove-lo a preparação final da enzima.

Deteção e remoção de contaminação de Nuclease durante a purificação do protótipo recombinante vírus espumoso Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.0K visualizações.  The Ohio State University College of Medicine. Proteína de integrase espumosa vírus recombinante protótipo é frequentemente contaminada com uma nuclease bacteriana durante a purificação. Este método identifica a contaminação da nuclease e remove-lo a preparação final da enzima.

Vídeo: Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Imunologia e Infecção

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

In Vivo Imaging Systems Detecção (IVIS) de um vírus de Neuro-invasiva encefalítico

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Resgate de Vírus da Doença de Newcastle recombinante de cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Triagem rápida de HIV transcriptase reversa e integrase Inibidores

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

Montagem e purificação do protótipo vírus espumoso Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...