This work was supported by the Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664).

Primer lösemik hücreler ile 1. Nötrofil İzolasyon ve Co-kültür NOT: Prosedürler bilgilendirilmiş onam imzalanması tüm hastalarda Lyon Hastane Etik kurul onayı altında gerçekleştirilmiştir. <ol><li> Birincil lösemik hücreler ve nötrofillerin izolasyonu <ol><li> Kronik lenfositik lösemi (KLL) tanısı hastaların EDTA (kan mililitrede 1.8 mg EDTA) periferik kan tüpleri toplamak. </li><li> Bir steril 50 ml tüp kan her biri 15 ml ilave edilir ve 15 ml RPMI seyreltin (seyreltme 1: 1), daha sonra dikkatli bir şekilde yavaş yavaş fazlar karıştırılmadan tüpün dibine yoğunluk gradyan çözeltisi 15 ml ilave ediniz. yoğunluk gradyan çözeltisi hazırlanması için oda sıcaklığında olduğundan emin olun. </li><li> Oda sıcaklığında ve frensiz 35 dakika boyunca 300 xg&#39;de santrifüj. Şekil 1A, yukarıdan aşağıya doğru gösterildiği gibi kan dört farklı aşamadan ayırmak gerekir: trombosit ve plazma, mononükleer hücreleri (white halkası), yoğunluk gradyan çözümü, granülositler ve eritrositler. </li><li> Yeni 50 ml tüp plastik Pasteur pipeti ve transferi ile birincil lösemik hücreleri temsil beyaz halka toplayın. <ol><li> PBS ile tüp içinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g toplam ve santrifüj 50 ml&#39;ye kadar (kalsiyum ve magnezyum içerir) doldurun. </li><li> 5 PBS daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g toplam ve santrifüj 50 ml&#39;ye kadar PBS ilave mL pelletini. </li><li> tam RPMI ortamı ile pelletini (RPMI 1640,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM glutamin, 100 U ile takviye / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin), hücre canlılığı sayacını kullanarak sayım için. </li></ol></li><li> Aspire Üst fazlar granülosit eritrosit faz ayrılıp 25 ml&#39;ye kadar PBS ekleyin toplam 50 ml% 0.9 NaClup içinde% 3 dekstran ekleyin. boruları 10 kez karıştırın ve karıştırma olmadan oda sıcaklığında 30 dakika boyunca muhafaza edin. </li><li> Üst RBC-fakir nötrofil katman toplayıntemiz ve steril bir 50 ml tüp içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüj tüpleri d. PBS sonra toplam 50 ml kadar kırmızı hücre parçalama tampon ekleyin ml 5 ile her pelletini. </li><li> RT daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g&#39;de santrifüj 15 dakika süreyle karanlıkta tüpler tutun. PBS ile pelet (toplam 50 ml&#39;ye kadar PBS ekleyin), daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g&#39;de santrifüj yıkayın. </li><li> hücre canlılığı, sayılmadan için tam RPMI ortamı ile pelet yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi kullanılarak izolasyon saflığını belirlemek için 5 ml&#39;lik plastik tüplere 50 ul PBS-FBS (% 4), her hücre türü için 3 x 10 5 tutun. </li></ol></li><li> İzole hücre popülasyonlarının Morfolojik Görüntüle&#39;ye analiz <ol><li> Bunu yapmak için, her biri 3 x 10 4 Nötrofiller ve 150 ul tam RPMI ortamında 3 x 10 4 mononükleer hücreleri yeniden süspanse edin. Bu t sağlanması, sitospin santrifüj cam slaytlar, filtre kartları ve örnek odaları birleştirinO santrifüj iyi dengelenmiş. </li><li> santrifüj slaytlar, filtre kartları ve örnek odalarında çıkarın oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 750 x g&#39;de numune odasına ve hücre-santrifüje her bir hücre türü yer. slaytta hücrelere zarar vermemek için dikkatli sökün. Filtre kartları ve örnek odaları atın. </li><li> Giemsa boyama kiti kullanılarak hücreleri leke ve 1 saat kuruması için slaytlar tutun. 100X büyütme ile mikroskop hücreleri tarafından inceleyin. </li></ol></li><li> FACS İzole Hücrelerin Saflık test <ol><li> APC konjüge anti-insan CD19 antikoru (5 ul / 10 6 hücre) ile izole edilmiş, birincil lösemi hücreleri etiketlemek. Tablo 1 (5 ul / 10 6 hücre) listelenen anti-insan antikorlarının karışımı ile saflaştırılmış nötrofilleri etiketleyin. 4 O ° C&#39;de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe hücreleri </li><li> 500 ul PBS-FBS (% 4), oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüj tüpleri hücreleri yıkayın. </li><li>200 ul PBS-FBS (% 4), her pelletini. </li><li> , SSC-A (488 / 10BP), FITC (BP 530/30), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP FSC-A (488 nM): 488 nm lazer: Aşağıdaki optik yapılandırmayı kullanarak bir akış sitometresinde analiz ), PE (BP 575/26); 633 nm lazer: APC (BP 660/20), APC-Cy7 (BP 780/60). Renk karşılanmasını sağlamak. </li></ol></li><li> Otolog Nötrofiller ile İlköğretim lösemik hücrelerinin Coculture <ol><li> Tohum, birincil lösemi hücrelerinin tek başına ya da tam RPMI ortamı içinde oranı 1:10 otolog nötrofiller 2 x 10 5 hücre / ml olmuştur. Bunu yapmak için, seyreltilmesi hücre süspansiyonları, hücre sayıları ayarlayın ve 2 x 10 6 hücre / mL nötrofil birincil lösemi hücre 2 x 10 5 hücre / ml ekleyin. dikkatlice karıştırın. </li><li> hücrelere Bruton tirozin kinaz (Btk) inhibitörü (İbrutinib) 25 uM ekleyin. % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 24 saat süreyle inkübe edilir. </li></ol></li><li> Hücre Hasat ve FACS analizi <ol><li> collECT, FACS analizi ve santrifüj oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g&#39;da tüpler 5 ml&#39;lik plastik tüplere hücreleri. daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüj 1 ml PBS-FBS (% 4) ile granül yıkayın. </li><li> ticari kit kullanılarak ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karanlıkta inkübe hücreleri süspanse Annexin V ve PI peletler. (FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (BP 530/30), PI 610: 488 nm lazer: Şekil 2A yolluk stratejisi kullanarak bir akış sitometresinde ve aşağıdaki optik yapılandırmasına analiz / 20 BP). Renk karşılanmasını sağlamak. </li></ol></li></ol> Granulositik Pathway ve 3D Model RL Lenfoma B Hücreleri ile Bunların kokültürü boyunca HL60 Hücre 2. Farklılaşma <ol><li> Nötrofil benzeri Hücreleri içine insan promiyelositik (HL60) Hücre Farklılaşma <ol><li> / Ml daha sonra değişimi etkilemek için 1 uM retinoik asit (RA) ve% 1.25 DMSO ilave 3 x 10 5 hücre HL60 hücre sayısını ayarlar. Her 3 x 10 5 Tohum </skadar&gt; de 48 oyuklu plaka başına HL60 hücreleri daha sonra% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 48 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g hücreleri ve santrifüj toplar. hücre canlılığı, sayılmadan için tam RPMI ortamı ile tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Sonra bu çözeltiye, 3 x 10 5 hücre / HL60 hücre sayısını ayarlamak ve 1 uM retinoik asit (RA) ve% 1.25 DMSO ilave edilerek kendi değişimini etkileme tam RPMI ortamı içinde hücre süspansiyonu seyreltin. Oyuk başına 48 oyuklu plaka içerisinde her biri 3 x 10 5 HL60 hücreleri, tohum ve% 5 CO2 ile 37 ° C sıcaklıkta bir 48 saat daha inkübe edilir. </li></ol></li><li> HL60 farklılaşma Analizi (HL60 fark) <ol><li> hücreleri toplamak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüj tüpleri. hücre canlılığı, sayılmadan için tam RPMI ortamı ile pelet yeniden süspanse edin. </li><li> flow sitometri ile hücre-yüzey belirteçleri ifade değişikliklerini analiz etmek. Her 3 x 10 5 koyun </sup&gt; ayrışmamış (hücre kültüründen) HL60 hücrelerinin ve FACS analizi ve santrifüj oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g&#39;da tüpler 5 ml&#39;lik plastik tüplere, 3 x 10 5 HL60 fark hücreleri. </li><li> 50 ul PBS-FBS (% 4) pelet yeniden süspanse edin. AF700 veya APC konjüge anti-insan CD38 (5 ul / 10 6 hücre) konjüge edilmiş bir anti-insan CD11b hücreleri etiketleyin. 4 O ° C&#39;de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe hücreleri </li><li> daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüj 500 ul PBS-FBS (% 4) ile yıkayınız. 200 ul PBS-FBS (% 4) pelet yeniden süspanse edin. </li><li> 488 nm lazer: Şekil 3A yolluk stratejisi ve aşağıdaki optik yapılandırma kullanarak akış sitometresinde analiz FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm lazer: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (BP 730/45). </li><li> HL60 fark morfolojik değişiklikleri test etmek için, mikroskobik inceleme için cam slaytlar üzerine hücreleri hareketsiz. <ol><li> Bunu yapmak için, her biri 3 x 10 tekrar süspansiyon <su(hücre kültüründen) p&gt; 4 farklılaşmamış HL60 hücrelerinin 150 ul komple RPMI ortamı içinde 3 x 10 4 HL60 fark. santrifüj dengeli olmasını sağlamak, sitospin santrifüj cam slaytlar, filtre kartları ve örnek odaları birleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1500 rpm&#39;de numune odasına ve hücre-santrifüje her bir hücre türü yer. santrifüj slaytlar, filtre kartları ve örnek odaları çıkarın. slaytta hücrelere zarar vermemek için dikkatli sökün. Filtre kartları ve örnek odaları atın. </li><li> Giemsa boyama kiti kullanılarak hücreleri leke ve 1 saat kuruması için slaytlar tutun. 100X büyütme ile mikroskop hücreleri tarafından inceleyin. </li></ol></li></ol></li><li> 3 boyutlu (3D) Kültür NOT: Bu deneyde kullanılan malzemeler soğuk ve deney buz üzerinde gerçekleşiyor emin olun. <ol><li> Tek başına veya HL60 fark ile karıştırılır ya her 5 x 10 4 RL hücreleri tekrar süspansiyon </em&gt; Oranı RL: HL60 fark 1:10 yaklaşık 2 ila 3 mm açıklığı genişletmek amacıyla steril makasla kesme, 1 ml bir pipet kullanarak 300 ul bazal membran matris ile karıştırılması. Bu adım sırasında kabarcıkları kaçının. </li><li> 24 oyuklu bir plaka içerisinde de / hücre süspansiyonu her biri 300 ul tohumu. Bu adım sırasında kabarcıkları kaçının. Daha sonra her bir RPMI ortamı doldurun ve% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 7 gün süre ile inkübe ml 1 ekleyin% 5 CO2 ile 37 ° C&#39; de 30 dakika boyunca inkübasyona bırakılır. iki günde orta değiştirin. günde 5 10 nM vinkristin ekleyin. </li></ol></li><li> FACS analizi <ol><li> 7 günlük bir kültürden sonra ortam aspire ve iki kez 1 ml buz gibi soğuk PBS ile her bir yıkama. 3 ml / buz gibi soğuk PBS-EDTA (5 mM) da ekleyin. 200 ul pipet ucu alt kullanılarak kazıyarak Kuyunun dibinden jel ayırın. 30 dakika boyunca buz üzerinde hafifçe plakayı sallayın. </li><li> steril 15 ml tüp içine hücre süspansiyonu aktarın ve ic yavaşça tüpler sallayın30 dakika daha örn. homojen hücre süspansiyonu görünüm için kontrol edin. (Bu durumda değilse, o zaman daha uzun süre hücreleri sallamak ya da daha fazla PBS-EDTA ekleyin). </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin tüpler. PBS ile peletler daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj yıkayın. </li><li> PBS-FBS (% 4) ile yeniden süspanse edin ve PE-Cy7 ve APC konjüge anti-insan CD38 antikoru (5 ul / 10 6 hücre) bağlı anti-insan CD19 antikoru ile etiket. 4 O ° C&#39;de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g sonra 500 ul PBS-FBS (% 4) santrifüj tüplerine ile yıkayınız. ticari kit kullanılarak Annexin V ve PI ile hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Şekil 4A yolluk strateji kullanarak akış sitometresinde analiz ve aşağıdaki optik yapılandırma: 488 nm lazer: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm lazer: APC (BP 660/20). Renk karşılanmasını sağlamak. </li></ol></li&gt; </ol>

<ol>
	<li>Gocheva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+induces+cathepsin+protease+activity+in+tumor-associated+macrophages+to+promote+cancer+growth+and+invasion.">IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion.</a> Genes Dev. 24, 241-255 (2010).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+Inflammation,+and+Cancer.">Immunity, Inflammation, and Cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li><li>Mitchem, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+decreases+tumor-initiating+cells,+relieves+immunosuppression,+and+improves+chemotherapeutic+responses.">Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses.</a> Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Complexity+Predicts+Breast+Cancer+Survival+and+Functionally+Regulates+Response+to+Chemotherapy.">Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li><li>Di Carlo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+role+of+polymorphonuclear+neutrophils+in+antitumor+reactions.">The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions.</a> Blood. 97, 339-345 (2001).</li><li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+Cinderella+of+innate+immune+system.">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).</li><li>Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+activation+and+regulation+of+innate+and+adaptive+immunity.">Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).</li><li>Kelbaek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+isolation+of+polymorphonuclear+leukocytes+from+large+blood+volumes.">Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes.</a> J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. F&#252;rKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).</li><li>Aynaud, M. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Tribbles+3+protects+nuclear+DNA+from+cytidine+deamination+by+APOBEC3A.">Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A.</a> J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).</li><li>Zi&#242;&#322;kowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+three-dimensional+cell+culture+and+anticancer+drug+activity+evaluation+in+a+microfluidic+chip.">Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip.</a> Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).</li><li>Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+method+for+the+isolation+of+neutrophils+in+high+yield+without+the+use+of+dextran+or+density+gradient+polymers.">Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers.</a> J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).</li><li>Behnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+immune+complexes+induce+neutrophil+extracellular+trap+release+by+human+neutrophil+granulocytes+via+Fc&#947;RIIIB+and+Mac-1.">Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via Fc&#947;RIIIB and Mac-1.</a> J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).</li><li>Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+are+not+less+sensitive+than+other+blood+leukocytes+to+the+genomic+effects+of+glucocorticoids.">Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids.</a> PloS One. 7, 44606 (2012).</li><li>Dorward, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+advance:+autofluorescence-based+sorting:+rapid+and+nonperturbing+isolation+of+ultrapure+neutrophils+to+determine+cytokine+production.">Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production.</a> J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments.">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. , e50586 (2013).</li><li>Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaplasmaphagocytophilum+reduces+neutrophil+apoptosis+in+vivo.">Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo.</a> Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).</li><li>Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+neutrophils.">Apoptosis of neutrophils.</a> ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).</li><li>Dalton, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HL-60+cell+line+was+derived+from+a+patient+with+FAB-M2+and+not+FAB-M3.">HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3.</a> Blood. 71, 242-247 (1988).</li><li>Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+normal+and+transformed+epithelial+cells:+Their+contributions+to+tumourigenesis.">Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).</li><li>Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+cultures:+current+trends+and+beyond.">Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond.</a> Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).</li><li>Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+Neutrophils,+and+Cancer:+A+Double+Edged+Sword.">Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword.</a> New J. Sci. , 271940 (2014).</li><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).</li><li>Shojaei, F., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+to+antivascular+endothelial+growth+factor+treatment:+role+of+myeloid+cells.">Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells.</a> Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).</li><li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+promote+the+malignant+glioma+phenotype+through+S100A4.">Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4.</a> Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).</li><li>Teramukai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+neutrophil+count+as+an+independent+prognostic+factor+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer:+an+analysis+of+Japan+Multinational+Trial+Organisation+LC00-03.">Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03.</a> Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).</li><li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IL-6-STAT3+axis+mediates+a+reciprocal+crosstalk+between+cancer-derived+mesenchymal+stem+cells+and+neutrophils+to+synergistically+prompt+gastric+cancer+progression.">The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression.</a> Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

yoğunluk gradyanlı santrifüj yaklaşımı kullanarak yüksek saflıkta insan kanından nötrofıller izolasyonu için ve aynı kademe tek çekirdekli hücreler içinde, burada etkili, basit, hızlı ve ucuz bir protokol açıklanan, aynı zamanda ayrılmakta ve geri kazanılmaktadır. izole edilmiş hücre popülasyonları ≥90% saftır. Çeşitli yöntemler insan kanından nötrofil izolasyonu için kullanılabilir. Bu süreksiz gradyanlar 11,12 kullanarak veya nötrofiller immüno-manyetik bu daha sonra CD16- bağlanması ile zenginleştirilmiş nötrofiller insan karşıtı CD16 gibi belirli bir antikor ile işaretlenmişlerdir olan sırasında pozitif immüno-manyetik seçim nötrofil izolasyonu için, ticari kitler kullanılarak benzer yöntemler bulunmaktadır manyetik bir sütun 13 pozitif hücreleri. Negatif immüno-manyetik seçim ile ticari kitler tam kan ya da granülosit süspansiyon hücreleri Tha üzerine bağlanan antikorun bir kokteyli ile etiketlenir sırasında da mevcutturn, nötrofiller 9 (yani, eritrosit, trombosit ve CD2, CD3, CD9, CD 19, CD36, CD56, glikoforin A ve dekstran-kaplı manyetik parçacıklar gibi istenmeyen hücreleri etiketlemek antikor komplekslerinin), daha sonra nötrofiller antibodinin olarak elüsyon ile zenginleştirilmiş manyetik kolonu üzerinde bağlanmayan hücreleri negatif fraksiyon. Buna ek olarak, nötrofiller flöresanla aktive edilen hücre 14 sıralama ile izole edilebilir. Bazı teknikler pozitif immüno-manyetik seçim olarak saf nötrofil, yüksek verimler sağladığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, nötrofillerin yüzeyi üzerinde bağlanan ve bu potansiyel olarak, bunların aktivasyonunu veya farklılaşmasını indükleyerek işlevini değiştirebilir markalama maddeleri nedeniyle yoğunluk gradyan santrifüj yöntemlerine göre dezavantajları vardır. Ayrıca pozitif immuno-manyetik seçim yöntemi, ayrılması için bir manyetik sütun üzerinde antikor etiketli nötrofil bağlama kullanarak ve bu da onların fonksiyonlarını etkileyebilir.Bu yöntem olumsuz nötrofil yaşamını etkileyebileceğini göstermiştir hücreleri toplamak için uzun zaman gerektirir Floresan Aktif Hücre Sıralama nedeniyle kısa yarı ömrü ölçüde başka sınırlama vardır. Yoğunluk gradyanı santrifüjü yöntem çok karşılaştırılabilir ve nötrofil saflığı hem prosedürler kullanılarak% 90&#39;ından fazla, ancak önceki 40,% 60 ve% 80,% hacim oluşur katman gradyan çözeltisi ile karşılaştırıldığında teknik olarak daha az zor olan bir iki tabakalı bir gradyanı / PBS Vol. Nedeniyle üç tabakadan arasındaki küçük yoğunluk farklılıkları Swamydas ve ark. Gradyan çözüm arayüzleri karışması sık yer aldığını 15 tarafından dile getirilmiştir. Negatif immüno-manyetik seçim yaklaşımlar ile ilgili olarak, aynı zamanda, yüksek saflık ve canlılığı 9 nötrofil izolasyonu için etkili olduğu bildirilmiştir. Pozitif bağışıklık manyetik seçimi ve Floresan Aktif Hücre Sorting üzerindeki avantajı nötrofiller olduğunuHerhangi bir markalama maddeleri ile etiketlenmemiş ve böylece hücre aktivasyonunun önlenmesi, manyetik kolona bağlanmaz ancak bu yöntem çok daha pahalı ve daha fazla zaman, yoğunluk gradyanı yöntemi ile karşılaştırıldığında alıcıdır. Nötrofiller, normal olarak in vitro ve in vivo 16,17 hem de hızlı bir kendiliğinden bile apoptoza uğrarlar. HL60promyelocyticcells nötrofiller 18 içine farklılaşma geçmesi potansiyel olarak insan lökosit atalarıdır birçok özelliklerini korurlar. Nötrofil aksine, HL60 fark hücreler hızla yok apoptoz geçmesi ve bu hücreleri kullanarak, farklı donörlerden kendi izolasyon nötrofillerin farklı tepkiler sahip sorun çözer. Son zamanlarda, 3D kültürleri, insan ve hayvan fizyolojisi ve özellikle kanser alanında farklı biyolojik araştırmaları için bir modele daha olgun ve uygun hale gelir. 3D kültür 2D desen kayması hızla si ilerliyorİkincisi nce kanser 19 gibi çeşitli patolojik durumların inceleyerek sırasında daha göze çarpıyor. Bir hücrenin ortamına üçüncü bir boyut ekleyerek hücresel etkileşimleri 20 önemine yakından bakmak ve hücresel davranış ve özellikleri farklılıkları araştırmak için önemli olan 2B kültür sakıncaları artan bir farkındalık var. 3D kültür daha ilgili araştırma yol açan canlı bir organizmada koşullarına benzer bir ortam (örneğin., Insan) oluşturur. Ancak, 3D kültür gibi hücreler, hücre dışı matrisler ve 2D kültüründe mevcut değil interstisyel sıvılar gibi farklı iş ortakları arasındaki karmaşık etkileşimi içerir. Böylece, çabalar sipariş yöntemi kalibrasyonu kurmak ve özellikle iyi laboratuar uygulamaları yanı sıra etkili malzemeleri kapsamlı test ve izlenmektedir ticari markalar saymak gerekecektir. tümör mikrokatılmak ve antikanser ajanları 21,22 için tümör oluşumu, metastaz ve tepki düzenleyen birçok immün hücre popülasyonlarının da dahil olmak üzere çok sayıda hücre türleri oluşur. Çeşitli çalışmalar, tümör nötrofil infiltrasyonu artış önemli ölçüde anti-VEGF tedavisinin 23,24 gibi çeşitli anti-kanser ajanlarına karşı direnç kazanmış olan korelasyon göstermiştir. Ayrıca, ön-muamele nötrofil yükselme metastatik renal hücre karsinomu 25, hem de farklı katı tümörleri olan hastalarda intra-tümöral nötrofil yüksek düzeyde mevcudiyetinde hastalarda sayısı, 26 düşük hayatta kalma prognostik faktör olarak önerilmiştir. Çalışmamız nötrofiller antikanser ajan apoptosisden lenfoma B hücreleri korumada rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Özetle, burada açıklanan güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem hum gelen nötrofillerin ve mononükleer hücreleri toplamak için herhangi bir laboratuar tarafından istihdam edilebilirBir kan. Buna ek olarak, granülositik yolu boyunca HL60 hücrelerinin farklılaşma bu hızlı kendiliğinden apoptoz gibi neurophil sorunları önlemek amacıyla sunulmuştur. nötrofiller 2D ve 3D kültür sistemleri kullanılarak bu ajanlara karşı lenfoma hücreleri üzerinde koruyucu bir etki gösteren burada Bu yaklaşımlar bir anti-lenfoma ajanlara lenfoma hücrelerinin duyarlılığına nötrofillerin rolünü araştırmak için kullanıldı. Bu yaklaşımlar, kanser biyolojisinde nötrofil rolü anlayışımızı derinleştirmek gerektiğini nötrofil fonksiyonel çalışmalar çeşitli için kullanılabilir. Özellikle, bu yöntem, daha nötrofiller ve tümör hücreleri arasında veya nötrofil ve mikro diğer bileşenleri arasında çapraz-anlamak için kullanılabilir.

Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, tümör mikro içindeki hücrelerin önemli bir kısmını oluşturmaktadır ve hastalar ve kanser 1 hayvan modellerinde tümör kanser ile ilişkilidir. Son zamanlarda, daha yaygın kronik immün yanıtları kemoterapiler 2 tümör ilerlemesi, metastaz ve direnç teşvik kritik bir rol oynayan takdir haline gelmiştir. Makrofajlar ile doğrudan kemoterapi 3,4 tümör hücresi yanıtı düzenleyen gösterilmiştir önemli doğuştan gelen bağışıklık hücrelerdir. Bununla birlikte, anti-kanser tedavisine, tümör yanıtı düzenleyen nötrofillerin, doğuştan gelen bağışıklık sisteminde anahtar oyuncular rolü bilinmemektedir. Bu protokollerin amacı KLL hastanın kan örneklerinden nötrofil ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yöntem kullanmak ve anti-lenfoma ajanlara lenfoma hücrelerinin duyarlılığını düzenleyen rollerini araştırmak için granülositik yol boyunca HL60 hücreleri ayırt etmek vardır. 6 işgalci karşı ilk savunma hattı olarak kan 5 ve hareket doğuştan gelen bağışıklık sisteminin en bol hücresel bileşenidir. Nötrofiller, çeşitli patolojik şartlarda 7 değişken efektör fonksiyonlara ek olarak etkili bir doğuştan gelen bağışıklık yanıtları artan önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, yoğunluk gradyan ayırma yöntemi gibi diğer kan hücreleri, nötrofillerin izole etmek için, hızlı ve güvenilir bir yöntem olup, in vitro çalışmalar için gereklidir. Nötrofil izolasyonu için, bu yöntem kullanılarak, in vivo ve ex vivo nötrofil aracılığıyla oluşturulan imünolojik fonksiyonları üzerinde daha fazla araştırma kolaylaştıracaktır. Nötrofillerin saf popülasyonlarının elde etme yeteneği immünolojik hastalıkların 8 hastaların araştırılması için önemli bir ilk adımdır. Yoğunluk gradyan ayırma yöntemi hücrelerin yüksek verim elde edildiği bir yere bir tekniktir. methoD ara vermeden 35 dakika boyunca 300 g&#39;de santrifüje edilerek ve ardından seyreltilmiş insan kanı ihtiva eden bir tüpün alt yoğunluk gradyan çözeltisi ilave edilmesini kapsar. mononükleer hücrelerin halka arayüzü görünür ve nötrofiller eski aşağıda bulunur. Bu yöntem, çok daha 9 pahalı nötrofil izolasyon kiti gibi diğer mevcut yöntemlere göre önemli avantajlara sahip. Buna ek olarak, insan nötrofillerinden için spesifik bir yüzey işaretleyici yönelik antikorlar kullanılarak ticari kitler insan kanından nötrofilleri izole hücre aktivasyonunun veya farklılaşmasının riskini arttırır. Yoğunluk gradyan ayırma yöntemi kısa bir süre içinde, nötrofillerin izolasyonu sağlar. Aynı aşamada içinde, tek çekirdekli hücreler, ayrılmış ve geri kazanılır. Saf hücrelerin yüksek verimi fonksiyonel bütünlüğü elde etmek için elde edildiği bir temel teknik. Tümör microenv taklit etmek içinironment 3D deneyler gerçekleştirilmiştir. In vitro nötrofil kısa yarı ömürlü göz önüne alındığında, yeni insan nötrofil 3D deneyler kesin değildir. Bu nedenle, promiyelositik (HL60) hücreleri farklılaşma uyarıcılar dimetil sülfoksit (DMSO) ve retinoik asit (RA) kullanılarak, nötrofil benzeri hücrelere farklılaşmaları için indüklenir. Farklılaşmış HL60 hücreleri (HL60 fark) kullanarak, farklı donörlerden izolasyon nötrofillerin farklı tepkiler sahip önleyecektir. In vitro 3D kültür modelleri, in vitro 2D modelleri arasında ve in vivo modellerde bir ara evresini temsil eder. 2B kültüründe hücreler bu sentetik yüzey üzerinde denatüre edilir biriken proteinlere doğal olmayan hücre ekleri oluşturan plastik yüzeye yayılır. Bunun aksine, hücre ve hücre dışı matrisin sentezlenmesi için 3D kültürü da doğal hücre-hücre ek hücreler, bağlı oldukları doğal malzeme vardır.Bu nedenle, özellikle de, kanser hücreleri ve diğer hücre tipleri arasında 3D ko-kültür modelleri, tümör büyümesi, anjiyogenez ve metastazın katkıları gösteren için yararlı olmuştur. Bunun bir sonucu olarak, 3D kültürleri, hücre kültürü, in vivo 10 mevcut fizyolojik koşulları taklit etmek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1161">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:156px;">21875-034</td>
			<td style="width:535px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium)</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:156px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bruton&#39;s tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">CliniSciences</td>
			<td style="width:156px;">A3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vincristine&#160;</td>
			<td style="width:157px;">EG labo</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">BD Matrigel basement membrane matrix&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td>Put at 4 oC overnight before the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Red cell lysis buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:156px;">555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll (Pancoll)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td style="width:156px;">P04-60500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td style="width:535px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Annexing V-FLOUS staining kit&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Roche</td>
			<td>11&#160;988&#160;549&#160;001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit</td>
			<td style="width:157px;">Cosmos Biomedical</td>
			<td style="width:156px;">CB361550-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometry</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica DMR-XA microscope</td>
			<td style="width:157px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter</td>
			<td style="width:157px;">Nexcelom&#160; Bioscience</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutrophil isolation and analysis to determine their role in lymphoma cell sensitivity to therapeutic agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

, Beyaz bir halka tek-çekirdekli hücreleri temsil eder, trombositler ve plazma. Burada tarif edilen yoğunluk gradyan ayırma yöntemi CLL hasta kanından izole primer lösemik hücreler ve uyarılmamış nötrofiller Şekil 1A, yukarıdan aşağıya doğru (yoğunluk gradyanlı santrifüj işlemi sonrasında elde edilen farklı kan katmanları temsil içerir yoğunluk gradyan çözeltisi, granülositler ve eritrositler). Şekil 1B ve 1C, sırasıyla nötrofil (çok loblu çekirdek hücreleri) ve mononükleer hücreler arasında morfolojik görünümlere bakımından farklılıklar gösterir. Şekil 1 D&#39;deki sonuçlar, birincil lösemi hücrelerinde (mononükleer) yan dağılım (SSC) arsa vs ileri dağılım (FSC) temsil eder. Tek olan histogram (Şekil 1E) tam bir sağ shift APC konjuge anti-insan CD19 ile bu nüfusu gösterir EtiketlemeBu nüfus CD19 ve saf pozitif olduğunu gösterir zirve. Sitometrisi Tablo 1&#39;de listelenen florokrom-eşlenik monoklonal antikorların bir karışımı ile izole edilmiş nötrofiller etiketleme sonra akış tarafından doğrulanan şekilde nötrofiller de ≥90% saflıktadır. Şekil 1F CD45 için pozitif Yalıtılmış nötrofiller SSC dağılım çizim vs. FSC (Şekil temsil 1G), CD14 (Şekil 1H için CD15 için pozitif ve negatif), CD56 (Şekil 1J için, CD15 ve CD16 (Şekil 1I) hem de pozitif pozitif CD16 ve negatif). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53846/53846fig1.jpg" /> Hasta Kan İzole Morfolojik golcüler ve İlköğretim lösemik Hücre Saflık ve Nötrofiller Şekil 1. analizi. (A) şematik görünümü yoğunluğu Gradi sonra farklı kan katmanları temsilent santrifüj. (BC) Giemsa lekeleme (B) nötrofillerin ve (C) birinci lösemi hücrelerinde (mononükleer) arasındaki morfolojik farklılıklar gösterir. Fotoğraflar. 100X büyütme ile mikroskop tarafından alınan (D) İleri-saçılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) arsa izole primer lösemi hücre popülasyonunu temsil edildi. (E) İzole primer lösemi hücreleri, anti-CD19-APC ile etiketlendi CD19 ekspresyonu için analiz edildi. Kırmızı çizgi etiketlenmemiş hücreleri belirtir ve mavi çizgi anti-CD19-APC ile etiketlenmiş hücreler olduğunu gösterir. (E) FSC SSC dağılım çizim vs. izole nötrofil popülasyonu temsil etmektedir. (GJ) Yalıtılmış nötrofiller Tablo l&#39;de listelenen antikorların bir karışımı ile etiketlenmiş 1 ve (G), CD45 (H) CD14 ve CD15, (I) &#39;CD15 ve CD16, (J) CD16 bir ifadesi için analizd CD56. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53846/53846fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> antijenler </td><td> florokrom </td><td> Klon </td></tr><tr><td> CD14 </td><td> APC-Vio770 (Cy-7) </td><td> TÜK4 </td></tr><tr><td> CD15 </td><td> APC </td><td> VIMC6 </td></tr><tr><td> CD16 </td><td> FITC </td><td> VEP13 </td></tr><tr><td> CD45 </td><td> PerCP-Vio700 (Cy5.5) </td><td> 5B1 </td></tr><tr><td> CD56 </td><td> PE </td><td> AF12-7H3 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. florokrom-eşlenik Saflastırılmıs Monoklonal antikorlar izole nötrofillerin saflık testi için kullanılır. Tüm antikorlar Miltenyi Biotech elde edilmiştir. <p class="jove_content"fo: keep-together.within sayfa = &quot;1&quot;&gt; birincil lösemik hücrelerin (KLL) İbrutinib için hassasiyetine nötrofil etkisini araştırmak için, ikincisi tek başına veya oran N 24 saat otolog nötrofil (N) ile kültüre edildi : 25 uM&#39;de varlığında veya İbrutinib yokluğunda: 1, CLL 10. canlı birincil lösemi hücrelerinin (negatif Annexin V / olumsuz PI) yüzdesi akım sitometri analizi takiben anneksin V-FITC ve PI ile çift boyanması ile ölçüldü. Şekil 2A SSC ScatterPlot vs FSC nötrofiller ve primer lösemi hücrelerinin kapılarını temsil eder. Nötrofiller daha ayrıntılı birincil lösemik hücreler, böylece daha yüksek SSC ile görünür daha vardır. İbrutinib mevcudiyetinde nötrofil ile birlikte kültürlenmiş primer lösemik hücreler üzerinde geçiş sağlandıktan sonuçlar canlı hücrelerin daha yüksek oranda, tek başına kültürlenen hücreler ile karşılaştırıldığında (Şekil 2C,% 84.8) (Şekil 2B,% 53.1) göstermektedir. Şekil 2B kutu grafiği olduğunu azaltmaktadır gösteriyorİbrutinib tarafından uyarılan hücre canlılığı e anlamlı nötrofillerin varlığı (40.1 ± 3.1 vs 60.1 ± 3.5, p &lt;0.001, 19 hasta) tarafından engellenmiştir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53846/53846fig2.jpg" /> 2. Otolog Nötrofiller İbrutinib. Kan karşı primer lösemik hücreler koruyun Şekil kronik lenfositik lösemi (KLL) tanısı almış hastalarda toplanmıştır. Birincil lösemik hücreler izole ve primer lösemi hücreleri otolog nötrofiller (N) tek başına veya birlikte kültüre edildi: 24 saat Nratio 1:10 varlığında ya da 25 uM İbrutinib yokluğunda. Canlı birincil lösemi hücrelerinin yüzdesi (Annexiv V negatif / PI negatif) akım sitometri analizi takiben anneksin V-FITC ve PI ile çift boyanması ile ölçüldü. (A) İleri-saçılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) arsa nötrofiller ve birincil lösemi hücrelerinin kapılarını temsil. (B) Bi-boyutlu nokta-leke canlı ve apoptotik birincil lösemik hücrelerin tek başına kültüre ve 25 mcM İbrutinib ile tedavi yüzdelerini gösterir. (C) Bi-boyutlu nokta-leke canlı ve apoptotik birincil lösemik hücrelerin yüzdelerini ko-göstermektedir nötrofiller ile kültüre ve 25 mcM İbrutinib ile işlendi. (D) Kutu arsa 19 hastanın hayatta birincil lösemik hücrelerin yüzdesini temsil eder. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edilir. *** p &lt;0.001 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53846/53846fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> In vitro nötrofil kısa yarı ömürlü 3D kültür kullanımı etkisiz hale getirir. granülositik yolu boyunca HL60 hücrelerinin farklılaşma farklılaşma indükleyicileri ile oluşturuldu. İki farklı parametreler (hücre yüzey belirteçleri ifade ve morfolojik changes) HL60 farklılaşmasını ölçmek için kullanılmıştır. Şekil 3A&#39;da SSC dağılım çizim vs FSC HL60 hücrelerinin daha yüksek FSC ile HL60 fark hücreleri ile karşılaştırıldığında boyutu daha büyük olduğunu göstermektedir. Granülositik diferansiyasyon bir göstergesidir farklılaşması üzerine bir CD11b artış ve CD38 ekspresyonu (Şekil 3B) AF700 APC konjüge anti-insan CD38antibody konjüge anti-insan CD11b antikoru ile hücrelerin (HL60 ve HL60 fark) gösterir etiketleme. HL60 fark hücreleri, çok-loblu çekirdekleri (Şekil 3C) ortaya çıkması ile tespit morfolojik değişiklikler gösterir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53846/53846fig3.jpg" /> Şekil 3. Farklılaştırılmış HL60 Hücrelerinin Yapısal Parametreleri. (A) İleri-saçılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) araziler HL60 ve farklılaşmış HL60 hücreleri (HL60 fark) temsil etmektedir. (B) HL60 ve HL60 fark hücreleri akış sitometri analizi ve ardından bir anti-CD11b-AF700 ya da anti-CD38-APC ile etiketlenmiştir. SSC-A dağılım çizim (A) vs FSC-A her hücre popülasyonu üzerinde yolluk sonra, hücreler CD11b veya CD38 ifadeleri analiz edildi. (C) HL60 hücrelerinin granülosit doğru farklılaşma ile tutarlı morfolojik değişiklikleri gösterir. Resimler 100X büyütme ile mikroskop ile alınmıştır. Kalın siyah ok çok loblu çekirdeği etmektedir. Grafikler beş bağımsız deneyler temsilcisi vardır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53846/53846fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 3D modeli vinkristin RL hücresi tepkisi düzenleyen HL60 fark hücrelerinin etkisini test etmek için, RL hücreleri tek başına ya da 10 n, en vinkristin varlığında veya yokluğunda bazal membran matrisi içinde HL60 fark ile kültürlenmiştirŞekil 4A&#39;da gösterilen Ayırıcı stratejisi kullanılarak M., her iki popülasyonu, CD19 ve CD38 ekspresyonu göre ayırt edilir; CD38 pozitif CD19 ve HL60 fark hücre bulunan RL hücreleri. Vinkristin mevcudiyetinde HL60 fark hücreleri ile birlikte-kültür RL hücreler üzerinde geçiş sağlandıktan sonuçlar canlı hücrelerin daha yüksek oranda, tek başına kültür RL hücreleri ile karşılaştırıldığında (Şekil 4C,% 35.9) (Şekil 4B,% 19.7) göstermektedir. Şekil 4D çubuk grafiği HL60 fark hücreleri (19.5 ± 0.2 vs 33.1 ± 1.0, p &lt;0.001) varlığında hayatta RL hücrelerin yüzdesinde önemli bir artış (negatif CD19 pozitif Annexin V / PI negatif) gösterir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53846/53846fig4.jpg" /> Şekil 4. Nötrofil benzeri HL60 fark Hücreler 3D Kültür Vinkristin karşı RL Lenfoma Hücreleri koruyun. RL hücreleri<html> bazal membran matris içinde 7 gün HL60 fark oranı 1:10: RL HL60 fark hücreleri ile tek başına veya birlikte kültürlenmiştir. 5. günde, vinkristin (VCR), 10 nM lik bir konsantrasyonda ilave edilmiştir. Sferoidler 7. günde ayrıştırılmış ve hücreler daha sonra akış sitometrik analizi ile takip anneksin V-FITC ve PI ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş bir anti-CD 19-PECy7 ve anti-CD38-APC ile etiketlenmiştir. (A) ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) arsa RL hücreleri ve HL60 fark hücrelerin kapıları temsil eder. (B) Bi-boyutlu nokta-leke yalnız kültüre ve 10 nM vinkristin ile tedavi canlı ve apoptotik RL hücrelerinin yüzdelerini göstermektedir. (C) Bi-boyutlu nokta- blot HL60 fark ile birlikte kültür ve 10 nM vinkristin ile tedavi canlı ve apoptotik RL hücrelerin yüzdelerini göstermektedir. (D) çubuk grafiği canlı RL hücrelerinin yüzdesini temsil eder. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edilir. *** P ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents at JoVE.com

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

neutrophil-isolation-analysis-to-determine-their-role-lymphoma-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.2K Görüntüleme.  Cancer Research Center in Lyon. Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. 

Video: Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

Timik Lenfoma T-hücre Hatları türetilmesi Atm - / -</sup Ve P53 - / -</sup Fare

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Yöntemler Küçük RNA&#39;ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila Dış Zar veziküller: İzolasyon ve Makrofajlar Onların Pro-inflamatuar Potansiyeli Analizi

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by pharmaceutical companies is a market opportunity, but it is also a strategy to increase drug accessibility and reduce therapy-associated costs. The protocols detailed here describe the evaluation of target binding and CDC induction by rituximab in Daudi cells. These two functions require different structural regions of the antibody and are relevant to the clinical effect induced by rituximab. The protocols allow the side-to-side comparison of a reference rituximab and a marketed rituximab biosimilar. The evaluated products showed differences both in target binding and CDC induction, suggesting that there are underlying physicochemical differences and highlighting the need to analyze the impact of those differences in the clinical setting. The methods reported here constitute simple and inexpensive in vitro models for the evaluation of the activity of rituximab biosimilars. Thus, they can be useful during biosimilar development, as well as for quality control in biosimilar production. Furthermore, the presented methods can be extrapolated to other therapeutic mAbs.

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

This protocol describes the in vitro comparison of two key functional characteristics of rituximab: target binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC) induction. The methods were employed for a side-to-side comparison between reference rituximab and a rituximab biosimilar. These assays can be employed during biosimilar development or as a quality control in their production.

Terapötik Antikorlar Arasındaki Hedef Bağlanma ve CDC İndüksiyonunu Karşılaştırmak İçin İn Vitro Yöntemler: Biyoeşdeğerlik Analizindeki Uygulamalar

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em&gt; Cis</em&gt; -prenıltransferaz in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...