Bu araştırma Cornell Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Bu eser Cornell Merkezi malzemeleri araştırma paylaşılan Tesisatı, NSF MRSEC programı (Grant DMR-1120296) ile desteklenen için kullanın yaptı. S.R.N. destek bir NSF yüksek lisans araştırma bursu (Grant DGE - 1650441) ve Dr Dave Holowka kalsiyum deneyler hakkında yardım almak için kabul eder. Herhangi bir görüş, bulgular ve sonuç ya da öneriler bu malzeme ifade yazarlar (s) ve mutlaka Ulusal Bilim Vakfı görüşlerini yansıtmamaktadır.

Not: Konsantre asitler ve bazlar bu sentezinde kullanılır. Mühendislik kontrolleri (duman hood) ve koruyucu gözlük, eldiven, önlük, tam uzunlukta pantolon ve kapalı-toe ayakkabı da dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanımı gibi tepki yerine getirirken tüm uygun güvenlik uygulamaları kullanın.
 1. hazırlanması [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (μ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>sentez [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 12 <ol>RuCl 3 · n H 2 O <li>erimesi 1.00 g (% 40 ağırlık Ru, 4.1 mmol) H 2 O. serin bir buz banyosu 0 ° C'de koyu kahverengi çözümü 5 ml. 11 mL (0,23 mol) % 80 hidrazin hidrat çözüm dropwise bir şekilde ekleyin. İlk tepki kahverengi bir çözümde kaynaklanan evrim gaz ile güçlü olacak. 16 h için oda sıcaklığında karıştırın elde edilen çözüm izin; nihai çözüm koyu kırmızı olacak 
		Dikkat: Hidrazin akut toksik ve kanserojen. Ayrıca, susuz Bu reaktif patlayıcı biçimleridir. Her zaman olduğu gibi uygun KKE ve duman davlumbaz işlerken kullanın. Bu çözümler kuruluk için konsantre değil.</li>
		<li>Bu, yaklaşık 5-10 mL konsantre HCL pH 2 ayarlamak için ekleyin. Bu noktada, belgili tanımlık eriyik-ecek var olmak sarı-kahverengi renkte.</li>
		<li>Bu çözüm karıştırarak 1-2 h için ise 105 ° c ısı. Sarı bir katı eriyik dışarı çökelti. Zaman artık gözle görülür formları çökelti, ısı kaldırmak.</li>
		<li>Her etanol ve Dietil eter oda sıcaklığına kadar serin ve 10 dk. toplamak için vakum filtrasyon ve yıkama ile 5 mL sarı katı bir 0 ° C buz banyosunda koyun reaksiyon karışım izin verin.</li>
		<li>15-25 ml sıcak su ham ürün tamamen erimesi. 10 mL konsantre HCl bir çözüm bir filtre şişesi içinde bir buz banyosu yerleştirerek chill. Sarı çözüm soğutulmuş HCl çözüm içine soluk sarı saf sağlam bir yağış ikna etmek için filtre. Bu çökelti filtre ve yıkama 5 mL ile her 0,5 M HCl, etanol ve eter.</li>
		<li>Bileşik kullanarak karakterize IR spektroskopisi. By 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 ve 801 cm -1 germe frekanslarda tanımlaması saflık doğrulayın. 2069 cm -1, ortak bir küçük kirlilik [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3 ' e atanır.</li>
	</ol></li> <li>[(OH 2) (NH 3) 4 (μ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 sentezi <ol><li>100 mg (0,34 mmol) dağıtılması [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 50 mL / 1 M NH 4 OH 200 mL ağır duvar yuvarlak popolu basınç gemi içinde. Gevşek bir tıpa ile balonun kap ve 75 ° C 6 h. Kaldır ısı için tepki karisimin ısı ve koyu yeşil çözüm verim 4 gün için oda sıcaklığında karıştırın. 
		Dikkat! Basınç birikmesi mühürlü gemi sonuçlarında Isıtma. Uygun basınç güvenli cam kullandığınızdan emin olun. Bu reaksiyon, gaz halinde olan yakıtlar NH 3 kaybını en aza indirmek için gemi sızdırmazlık amaçlı var. Bu nedenle, gevşek aşırı baskı yayın için izin vermek için tıpa yerleştirin.</li>
	</ol></li> <li>Arıtma katyon değişim Kromatografi tarafından <ol><li>25 mL kabı içinde 5 g katyon değişim reçine askıya alma (10 ml 0.1 M Örneğin, kafes (H + form) Dowex 50WX2 200-400 HCl.</li>
		<li>50 mL çözelti su deposu ile yapıştırılmış bu Bulamaç bir 10 mL sütununa (10 mm çap, 15 cm yükseklik) yükleyin. Eluate renksiz olana reçine ile yaklaşık 20-30 mL 0.1 M HCL, yıka.</li>
		1.2.1. adımda izole yeşil tepki çözüm <li>dönün. Bu, konsantre HCl pH 2, hangi noktasında çözüm renk değiştirir Brown'a ayarlamak için çözüm.</li>
		<li>Bu acidified çözüm adım 1.3.2 yavaşça üzerine reçine pipetting tarafından hazırlanan katyon değişim reçine sütuna yerleştirin. Tamamen drenaj ve çözüm yüklemeye devam eluate izin ver. Tüm çözüm eklenene kadar bu işlemi yineleyin. Reçine üst koyu kahverengi/siyah olacak. Reçine hacmindeki biraz azalacak.</li>
		<li>Reçine üst kapsayacak şekilde kullanım cam boncuk. Bunlar-ecek önlemek reçine yeni çözümler eklendiğinde rahatsız.</li>
		<li>20 mL 1 M HCL sütunla elute.</li>
		<li>Elute sütun ile bir artan 1,5 M HCl konsantrasyonu (&#8776; 50 mL). Sarı bir çözüm sütun gelmeye başlayacak. 2 m HCl konsantrasyonu artırmak ve devam eluate renksiz olana eluting veya bir çok soluk yeşil-sarı. 150-200 mL toplam hacmi bu işlem için gerekli olacak.</li>
		<li>2.5 m (20-50 mL) HCl konsantrasyonu artırmak. Kesirler testi tüpler olarak eluate toplamak. 3 M HCl artırın. Ürün sütundan bir yeşil-kahverengi çözüm olarak elute. Kırmızı-kahverengi kesir de uzakta-in sütun gelmeye başlayabilir. Bu kesirler oksitlenmiş rutenyum kırmızı kirleri olduğundan, yeşil-kahverengi kesirler ile havuz değil.</li>
	</ol></li> <li>Karakterizasyonu ve doğrulama saflık [(OH 2) (NH 3) 4 (μ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>kesirler Test Adım 1.3.8. UV-VIS spektroskopisi tarafından. Bu görevi gerçekleştirmek için belirli bir kısmını 100 µL 3 M NH3 2 mL ekleyin ve UV-VIS spektroskopisi tarafından analiz. Saf ürün içeren kesirleri 360'a büyük Absorbans grubu olacak nm ve daha az yoğun Absorbans 600 nm. 480 veya 533 nm Absorbans oksitlenmiş rutenyum kırmızı ve rutenyum kırmızı kirleri, gösterge sırasıyla.</li>
		<li>Saf ürün içeren kesirleri havuz ve kuruluk çözümü tarafından döner buharlaşma buharlaşır. Ürün bir yeşil-kahverengi katı izole olacak. Verimleri genellikle 5-15 mg (% 10-20 verim) sırasına bulunmaktadır. Tek kristalleri, x-ışını kırınımı için uygun etanol buharı difüzyon bahçedeki sulu çözümler içine tarafından elde edilebilir.</li>
		Saflık, doğrulamak için <li>UV-VIS spektroskopisi bir çözüm pH 7.4 fosfat tamponlu tuz (PBS) tarafından bileşik analiz. Saflık-var değerlendirildi 360 yoğunluğu oranı alarak nm ve 600 nm tepeler. Bu oran saf bir bileşiği 31'dir. Saf olmayan bileşikler için oranı daha küçük olur.</li>
		<li>Katı hal örnek tarafından IR spektroskopi analiz. Tanılama bantları 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 ve 815 cm -1 vardır. Ortak kirlilik bantları 1762 cm -1 ve 1400 cm -1 de görülür, NH karakteristik 4 CL rutenyum kırmızı bantları 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 ve 800 cm -1 belirlenebilir.</li>
	</ol></li> <li>Mitokondrial kalsiyum alımını inhibisyon Floresans spektroskopisi tarafından değerlendirilmesi dikkat! Memeli hücreleri aşağıdaki yordamları kullanın. İş yürütülen biyolojik güvenlik seviye için 2 (BSL2) araştırma sertifikalıdır uygun laminar akış davlumbaz içinde. 
	&#8203; Not: [(OH 2) (NH 3) 4 (μ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 atıfta [Ru] Bu bölümde <ol><li>arabelleğe alınmış olun glikoz içeren tuzlu çözüm (BGSS) olarak tahlil medya. BGSS bir çözümdür oluşan 110 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 5 mM sodyum süksinat, 30 µM etilen glikol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N &#39;, N &#39;-tetraacetic asit (EGTA). EGTA dışında her şeyi birleştirmek, pH 7.4 için ayarlayın. EGTA ekleyin ve pH 7.4 için yeniden ayarlayabilirsiniz. Tahlil medya için 50 mL 0.5 mL 1 mg/mL glikoz ekleyin.</li>
		<li>Kültür HeLa hücreleri 500 cm 2 Petri yemeklerinde Dulbecco &#39; s % 10 fetal sığır serum (FBS) ile % 5 CO 2 tohum tarafından bir 100 mm Petri kabına büyüyen 37 ° c yükseltmek HeLa hücreleri de oksijen bir kuluçka ile modifiye kartal orta (DMEM) Onları bir 500 cm 2 Petri içinde. 115 mL büyük tabak içinde toplam medya birimdir. Her büyük çanak yaklaşık 18 milyon hücre, iki Floresans spektroskopisi deneyler için yeterli verim.
		<ol><li>Büyümek hücreleri % 90-95 ulaşana kadar confluency. Medyayı çıkarın ve 15 mL pH 7.4 PBS hücrelerle durulayın. PBS içinde 15 mL 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin ve hücreleri ayırmak 10 dakikadır kuluçkaya. Hücreleri alt Şahin tüpler yuvarlak 14 mL transfer</li></ol></li> <li>Say trypan mavi ve bir hemasitometre ile ters bir mikroskop kullanarak hücreleri ve hücre ve toplam 7.5 milyon hücre 1,8 mL birim başına ulaşması için gerekli ortam hacmi hesaplamak Orta. Hücreler için 5310 × g. Decant süpernatant, 10 dk santrifüj kapasitesi ve BGSS hesaplanan hacmi ekleyin. Hücreleri nazikçe resuspend.
		<ol><li>Bu tahlil için Dimetil sülfoksit (DMSO), 1 mM kalsiyum yeşil-5N H 2 O ve 10 mM CaCl 2 H 2 o [Ru] hisse senedi çözümlerinde, 40 mM digitonin hisse senedi çözümler saf suda hazırlanan hazırlamak, 1-3 mM arasında değişen olabilir. 
			&#8203; Not: kalsiyum yeşil-5N ışığa duyarlı. Saklamak karanlıkta ve pozlama ışık en aza indirgemek.</li>
		</ol></li> <li>Fluorimeter 506 nm ve okuma 532, emisyon heyecanlandırmak için kurulum nm ile 37, kontrollü küvet tutucu ° C. hazırlayın bir heyecan bar veya tekerlek, 1,8 mL hücre süspansiyon 1.5.2 yukarıda, 1.8 µL digitonin çözüm, 3.6 üzerinden bir akrilik küvet ve #181; L kalsiyum yeşil-5N (çözüm) ve 9 µL [Ru] (1 mM hisse senedi çözüm, 5 µM son konsantrasyonu için). Hücreler fluorimeter 15dk için kuluçkaya.
		<ol><li>Veri ham emme yerine uyarma/emisyon oranı olarak okuyun. Bu uygulama ışık kaynağı şiddeti dalgalanmalar ile ilişkili hatalar en aza indirir.</li>
			<li>Hücreleri yanıt CaCl 2 ek etkisini ölçmek için [Ru] yokluğunda ilk örnek analizi gerçekleştirmek.</li>
			<li>Begin analiz 1.5.4 içinde açıklanan ayarları ile fluorimeter. Bir sabit emisyon temel kurmak için yaklaşık 2 dakika bekleyin ve sonra 1.8 µL CaCl 2 (10 µM son konsantrasyonu) ekleyin. Emisyon yoğunluğu hemen CaCl 2 eklenmesi artacak ve kalsiyum iyonları mitokondri girerken sonra dakika boyunca çürüme. Çürüme işlemini tamamlayana kadar bekleyin (&#8776; 5 dk). Mitokondrial kalsiyum alımını yanıt [Ru] tedavi değil hücre belirlemek için ek kalsiyum boluses eklemek.</li>
		</ol></li> <li>1.5.4.3 içinde yukarıda açıklandığı gibi başka bir küvet içinde deneme tekrar 5 mikron [Ru], içeren. İnhibitörü huzurunda emisyon yoğunluğu artırmak ama değil çürük. Bu gözlem ettiğinizi mitokondrial kalsiyum alımı bloke.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enjoy+the+trip:+Calcium+in+mitochondria+back+and+forth.">Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth.</a> Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).</li><li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+calcium+connection.">Mitochondria: the calcium connection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li><li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+homeostasis+as+potential+target+for+mitochondrial+medicine.">Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine.</a> Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).</li><li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szab&#242;, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li><li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).</li><li>Kamer, K. J., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).</li><li>Ying, W. -. L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport+by+an+oxo-bridged+dinuclear+ruthenium+ammine+complex.">Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex.</a> Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).</li><li>Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+component+of+"ruthenium+red"+responsible+for+inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport.+Spectra,+electrochemistry,+and+aquation+kinetics.+Crystal+structure+of+&#181;-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.">The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of &#181;-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).</li><li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-bridged+Dinuclear+Ruthenium+Amine+Complex+Specifically+Inhibits+Ca2++Uptake+into+Mitochondria+in+Vitro+and+in+Situ+in+Single+Cardiac+Myocytes.">Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes.</a> J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li><li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li><li>Nathan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Methods+for+the+Preparation+of+a+Functional+Analogue+of+Ru360,+a+Potent+Inhibitor+of+Mitochondrial+Calcium+Uptake.">Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake.</a> Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).</li><li>Allen, A. D., Senoff, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+infrared+spectra+of+some+ammine+complexes+of+ruthenium(II)+and+ruthenium(III).">Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III).</a> Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li><li>Deak, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+mitochondrial+Ca&#8314;+uptake.">Assessment of mitochondrial Ca&#8314; uptake.</a> Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 sentezlenmiş [Ru (NH3)5Cl] Cl2, iyi bilinen bir ruthenium(III) olabilir malzeme, bu yordamda açıklandığı gibi başladı. [Ru (NH3)5Cl] Cl2 sentezi kolayca küçük zorlukla elde edilir. 16 h için RuCl3 hidrazin içinde karıştırma sonra hidrat, çözüm pH HCl ile 2 değeri için ayarlanmalıdır. PH bırakma istediğiniz ürün elde etmek için önemlidir. İstenirse, bu sentez formu [Ru (NH3)5Br] Br2 ' ye HBr HCl yerine refluxing tarafından değiştirilebilir.
İstenmeyen yan oluşumu mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü sentezi sırasında en aza indirmek için bazı stratejiler gözlemledim. Özellikle, Şapkalı şişesi tutarak bu reaksiyon başarısı için önemlidir; şişeye açıksa, bir dizi rutenyum kırmızı (RuRed), dahil olmak üzere diğer yan kayda değer miktarda oluşur. Muhtemelen, gaz halinde olan yakıtlar amonyak açık tepki gemi ve istediğiniz ürün bu olay tavizler oluşumu kaybolur. Şişeye boyutunu ve sulu amonyak hacmi de bu reaksiyon verimliliğini daha küçük şişeler içinde azalır fark etmiş gibi önemli ölçüde bu protokol için açıklanana değiştirilmemelidir önemli parametreler bulunur. Bu yöntem daha önce açıklanması diğer iki yöntem ile karşılaştırıldığında bu bileşik verimi büyük ölçüde artırmaz. Bu, ancak, daha az sayıda adımla içeren ve daha az yan ürün oluşumu, RuRed gibi ortaya çıkmasına. Düşük verim unreacted [Ru (NH3)5Cl] Cl2 yanı sıra son derece sütunun üst kısmında korunur kirleri tahsil bilinmeyen küçük bir miktar varlığı ilişkilendirilebilir. Her ne kadar birçok ek reaksiyon koşulları araştırılmalıdır değil, iyileştirmeler reaksiyon süresi ve daha yüksek verim elde etmek için kontrollerimiz konsantrasyonları, değişen tarafından gerçekleştirilebilir mümkündür.
[(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 arıtma en sıkıcı ve zor bu protokolü bölümüdür. Bir de paketlenmiş sütun büyük ölçüde ayrılma için size yardımcı olacaktır; reçine Bulamaç olarak yükleme sütun paketi için etkili bir yaklaşımdır. Bu sütun elüsyon boyunca HCl konsantrasyonu arttıkça, reçine boyutunda sözleşme olması gerekmektedir. Başarılı bir şekilde saf malzemesi elde etmek üzere hangi asit konsantrasyonu artar oranı belirtilen yordam sapma değil. Nihai ürün-ecek var olmak sağlam bir yeşil-kahverengi; temel bir çözüm koyu yeşil olacaktır ama asidik çözümleri kahverengi olacak. Parlak pembe-kırmızı çözüm gözlem yapılırsa rutenyum kırmızı contaminations mevcuttur. RuRed miktarı geçersiz kalma katsayısı kullanarak belirlenebilir (533, 62,000 M-1·cm-1 nm). Bu arıtma nispeten güçlü katyon değişim reçine sütunlar için genel bir süreçtir.
Mitokondrial kalsiyum alımını inhibisyon permeabilized HeLa hücreleri, florasan kalsiyum sensör kalsiyum yeşil-5N ve bir spectrofluorimeter kullanarak test edilebilir. 13 , 14 bu tahlil hücrelerinin büyük bir miktar gerektirir ve bu nedenle bir çok büyük 500 cm2 Petri kabına kültüründe amplifikasyon gerektirebilir. Bu büyük kültür şişeler maruz yüzey alanlarını çok büyük olduğundan mikrobiyal kirlenme en aza indirme ek zorluklar önlemek. İş laminar akış kısırlık korumak için kabine yapılmalıdır. Kalsiyum yeşil-5N permeabilized HeLa hücreleri floresan yanıt Floresans spektroskopisi tarafından izlenir. Kalsiyum küvet için bir dış bolus ilavesi Floresan, sensör ile etkileşim kalsiyum iyonları kaynaklanan hemen artış tetikler. Yokluğunda bir inhibitörü, birkaç dakika boyunca, yoğunluğu alımını mitokondri, bu kalsiyum iyonu tarafından boya erişilemiyor bir organel nedeniyle bozunmaları. Ne zaman bu tahlil bir inhibitörü bir bolus kalsiyum iyonlarının ilavesi huzurunda gerçekleştirilen emisyon yoğunluğu için bir artış açmaktadır. Çürümesi nedeniyle mitokondrial kalsiyum alımı, mevcut, değil, ancak, mitokondrial kalsiyum alımını inhibitör özelliklerini bu bileşik doğrulanıyor. Bu işlem genel bir ekran olarak kalsiyum alımını inhibitörleri için kullanılabilir. Buna ek olarak, bu yordamı ilgi diğer ökaryotik hücreler için uygulanabilir. Bu tahlil, dış permeabilization bağlı hücresel membran böylece bir kompleks hücresel alımını yeteneği hakkında bilgi sağlamaz.
Özet olarak, bu iletişim kuralını sentezi ve rutenyum tabanlı roman mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü arıtma açıklayan. Mitokondrial kalsiyum ve memeli hücre fizyolojisi rolü biyoloji okuyan için önemli bir değer olan bileşiktir. Mitokondrial kalsiyum alımını testleri için nispeten basit tahlil tarama ve yeni inhibitörleri incelenmesi için kullanım da.

Mitokondrial kalsiyum enerji üretimi ve Apoptozis dahil olmak üzere normal hücre işlevi için kritik süreçlerin bir dizi için anahtar bir düzenleyicisidir. 1 , 2 , 3 mitokondrial kalsiyum uniporter (MCU), iç mitokondrial membran üzerinde bulunduğu bir iyon taşıyıcı protein kalsiyum iyonları akını mitokondri düzenlemektedir. 4 , 5 , 6 MCU kimyasal inhibitörleri çalışmaları bu taşıma protein ve mitokondrial kalsiyum hücresel roller ve işlev çalışmaya devam değerli araçlardır. Bileşik [(HCO2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, MCU bildirilen Kd değeri olan 24 µM.7 için tek bilinen seçici inhibitörleri biridir Bu karmaşık ortak bir kirlilik ticari formülasyonları ve rutenyum kırmızı (RuRed), bir triruthenium di-μ-oxo bulunan ,8,9,10 köprü hexacation Formula [(NH3) 5 Aynı zamanda kalsiyum alımını inhibitörü olarak kullanılan (μ-O) Ru Ru (NH3)4(μ-O) Ru (NH3)5)]6 +. Ru360 ticari olarak mevcut olmasına rağmen çok pahalıya mal olur. Ayrıca, sentez ve Ru360 yalıtım, meydan zor arıtma işlemleri ve belirsiz karakterizasyon yöntemleri tarafından.
Son zamanlarda bir Ru360 analog, [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5erişmek için alternatif prosedürler bildirdin. 11 bu bileşik ile yüksek afinite, Ru360 için benzer MCU engeller. Bu protokol için [Ru (NH3)5Cl] Cl2den başlar bizim en etkili sentezi olan bu bileşik anlatacağız. Arıtma kesinlikle asidik katyon değişim reçine kullanarak ürün ile birlikte ortak tuzaklar bu yordam için detaylı. Ayrıca, karakterizasyonu ve bileşik saflık değerlendirme yöntemleri sunmak ve mitokondrial kalsiyum alımını engelleme onun etkinliğini test etmek için basit bir yaklaşım betimlemek.

<table style="border-collapse:collapse;width:663pt" width="884">
	<colgroup>
		<col style="width:182pt" width="243" />
		<col style="width:227pt" width="302" />
		<col style="width:129pt" width="172" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl69" height="23" style="width:182pt;height:17.25pt" width="243">Ruthenium Trichloride hydrate</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Pressure Chemical</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">3750</td>
			<td class="xl70" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Concentrated hydrochloric acid</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">J.T. Baker</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">9535</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl69" height="22" style="width:182pt;height:16.5pt" width="243">Concentrated ammonium hydroxide</td>
			<td class="xl71" style="width:227pt" width="302">Mallinckrodt Chemical Works</td>
			<td class="xl71" style="width:129pt" width="172">A669C-2 1</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td class="xl69" height="24" style="width:182pt;height:18.0pt" width="243">Dowex 50 WX2 200-400 Mesh</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">13945</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="25" style="height:18.75pt">
			<td class="xl69" height="25" style="width:182pt;height:18.75pt" width="243">Calcium Green 5N</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Invitrogen</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">C3737</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Digitonin</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Aldrich</td>
			<td class="xl71" style="width:129pt" width="172">260746</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">DMSO</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">471267</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">EGTA</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">E3889</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">KCl</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">USB</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">20598</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">KH2PO4</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">P3786</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">MgCl2</td>
			<td class="xl77" style="width:227pt" width="302">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">M33-500</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">HEPES</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Fluka</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">54466</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl69" height="22" style="width:182pt;height:16.5pt" width="243">Sodium Succinate</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">33386</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl69" height="22" style="width:182pt;height:16.5pt" width="243">EDTA</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">J.T. Baker</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">8993-01</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Glucose</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">G5000</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">200 Round bottom flask</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">ChemGlass</td>
			<td class="xl75">CG-1506-14</td>
			<td class="xl74" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Glass stopper</td>
			<td class="xl65" style="width:227pt" width="302">ChemGlass</td>
			<td class="xl65" style="width:129pt" width="172">CG-3000-05</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl65" height="42" style="width:182pt;height:31.5pt" width="243">10 mm x 15 cm glass column with reservoirs</td>
			<td class="xl77" style="width:227pt" width="302">Custom - similar to Chemglass columns</td>
			<td class="xl77" style="width:129pt" width="172">Similar to CG-1203-20</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl65" height="20" style="width:182pt;height:15.0pt" width="243">DMEM</td>
			<td class="xl77" style="width:227pt" width="302">Corning</td>
			<td class="xl77" style="width:129pt" width="172">10-017-CV</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">FBS</td>
			<td class="xl77" style="width:227pt" width="302">Gibco</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">10437028</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">PBS</td>
			<td class="xl77" style="width:227pt" width="302">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">21-040-CV</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Round bottom Falcon tubes</td>
			<td class="xl77" style="width:227pt" width="302">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">14-959-11B&#160;</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">500 cm2 petri dishes</td>
			<td class="xl65" style="width:227pt" width="302">Corning</td>
			<td class="xl76" style="width:129pt" width="172">431110</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Trypan blue</td>
			<td class="xl65" style="width:227pt" width="302">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl76" style="width:129pt" width="172">15250061</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Hemacytometer</td>
			<td class="xl65" style="width:227pt" width="302">Aldrich</td>
			<td class="xl76" style="width:129pt" width="172">Z359629</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Acrylic Cuvettes</td>
			<td class="xl65" style="width:227pt" width="302">VWR&#160;</td>
			<td class="xl76" style="width:129pt" width="172">58017-875</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl72" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">UV-Vis spectrometer</td>
			<td class="xl68">Agilent Model Cary 8454&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:129pt" width="172"></td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl72" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Spectrofluorimeter</td>
			<td class="xl68">SLM Model 8100C</td>
			<td class="xl65" style="width:129pt" width="172"></td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl72" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">IR spectrometer</td>
			<td class="xl68">Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment</td>
			<td class="xl65" style="width:129pt" width="172"></td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Centrifuge</td>
			<td class="xl65" style="width:227pt" width="302">ALC Model PM140R</td>
			<td class="xl65" style="width:129pt" width="172"></td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Inverted light microscope</td>
			<td class="xl65" style="width:227pt" width="302">VWR&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:129pt" width="172">89404-462</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and evaluation of a ruthenium-based mitochondrial calcium uptake inhibitor

Sentez ve bir mitokondri kalsiyum alımını inhibitörü, [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)]5 +arıtma ayrıntı. Bu bileşik bir en iyi duruma getirilmiş sentez [Ru (NH3)5Cl] Cl2 den 1 M NH4OH yeşil bir çözüm verimli kapalı bir kap içinde başlar. Arıtma katyon değişim Kromatografi ile gerçekleştirilir. Bu bileşik ile karakterize olan ve saf olmak UV-VIS ve IR spektroskopisi tarafından doğrulandı. Mitokondrial kalsiyum alımını inhibitör özellikleri permeabilized HeLa hücreleri Floresans spektroskopisi tarafından değerlendirilir.

Bu yöntem bir sentez [Ru (NH3)5Cl] Cl2başlayarak mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 açıklar bir iyi bilinen ruthenium(III) başlangıç materyali. [Ru (NH3)5Cl] CL2 IR spektroskopisi, 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1ve 798 cm-1 (şekil 1) titreşim modları ile karakterizedir. 2069 cm-1 adlı küçük bir kirlilik [Ru (NH3)5N2] Cl3' e bağlanabilir. Bu Ru(III) tür 1 M NH4OH ile tepki [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5affords. Bu reaksiyon ilerlemesini kanıtladığı sarı çözümden yeşil rengini dramatik bir değişim. Koyu yeşil renkli son tepki çözümdür. Asitleştirme konsantre HCl sonuçlarında kahverengi bir renk değişikliği ile bu çözümün; Bu nötralizasyon bir yan ürünü amonyum klorür, bakım değil icra hangi nihai ürün kontamine olduğunu. Bahçedeki arıtma kesinlikle asidik mesh (H+ form) reçine kullanarak katyon değişim Kromatografi ile devam eder. Reçine ilk 0,10 M HCl ile equilibrated ve çözüm [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 sütun üzerinde yüklenir. Amonyum klorür yan ürünü 1 M HCl yıkama ile elutes. Rutenyum içeren bileşikler yüksek HCl konsantrasyonu elute. Malzeme başlayan unreacted [Ru (NH3)5Cl] Cl2 içeren, sarı kesirler bir dizi sütun kapalı HCl konsantrasyonu 1,5 M olduğunda gel. İstenen ürün 2.5-3.0 M arasında elutes HCl ve ortaya çıkan kesirler için yeşil görünür yeşil-kahverengi renkte.
Ürünün kesirler havuzu önce onların saflık doğrulanması gerekir. Bazı pH bağımlılığı, UV-vis spektrum içinde istenen bileşik sergileyen çünkü son derece temel 3 M NH3 çözümlere spektral özellikleri tüm kesirler için aynı olduğundan emin olmak için kesirler küçük aliquots ekleyerek öneririz. Saf kesirler, yalnızca görüntüler yoğun bir tepe 360'nm ve zayıf bir tepe 600 nm (Şekil 2). Tepeler 480 ve 533 nm yakınındaki belirtmek rutenyum kahverengi ve kırmızı, sırasıyla ve önemli bir tepe 260 nm, 290, bir omuz ile nm, malzeme (şekil 3 Başlangıç [Ru (NH3)5Cl] Cl2 varlığı belirtir ). Saf kesirler döner buharlaşma istenen bileşik bir yeşil-kahverengi katı tanıyor.
İzole bileşik daha fazla UV-VIS ve IR spektroskopisi ile karakterize edilebilir. UV-vis spektrum (Şekil 2) görüntüler 360 nm ve yukarıda açıklandığı gibi 600 nm Absorbans bantları. Geçersiz kalma katsayısı 600 nm grup için 850 M-1cm-1 ve 360 nm grup için 27000 M-1cm-1. 600 nm gruba göre 360 nm grup yoğunluğu oranı 31 pH 7.4 PBS içinde olmalı ve bu ölçümü etkin bileşik saflığı ölçmek için kullanılabilir. IR spektrum şekil 4' te gösterildiği gibi görünmesi gerekir. Ru-O-Ru germe, örneğin, 850 cm-1tanı sıklığıdır. IR spektrum Ru-O-Ru streç belirlemek için ve hiçbir amonyum klorür son üründe mevcut sağlamak için istihdam edildi. Amonyum klorür, ortak bir kirlilik, 1762 cm-1 (çok zayıf) ve bu kolayca IR spektrum (şekil 5) ayırt edilebilir 1400 cm-1 (güçlü) titreşim modu vardır. Rutenyum kırmızı tepki ortak bir yan ürünü ve IR spektrumu uzanıyor, 1404 cm-1ile 1300 cm-1, 1037 cm-1 ve 800 cm-1tanımlanan, her ne kadar bazı istenilen ürün ile üst üste ortaya çıkar) Şekil 6).
Kalsiyum alımını yanıt HeLa hücreleri digitonin permeabilized olarak (Şekil 7) görülmektedir. Yıldız işaretlerini CaCl2 bolus eklenmesi gösterir. [(OH2) (NH3)4varlığında (μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] kalsiyum ek ama hayır çürümesi mitokondrial kalsiyum nedeniyle üzerine Cl5 emisyon yoğunluğu bir artış görülmektedir alımı görülmektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig1.jpg"> 
Resim 1 : [Ru (NH3)5Cl] Cl2Infrared spektrumları. [Ru (NH3)5Cl] Cl2 bir çok küçük [Ru (NH3)5N2] Cl3 kirlilik ile kızılötesi spectra. Kırmızı ok kirlilik 2.069 cm-1de gösterir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56527/56527fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig2.jpg"> 
Resim 2 : Saf malzeme için temsilcisi UV-VIS spectra. [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] CL5 UV-VIS Absorbans spectra ve pH 7.4 PBS alınan kızılötesi (gömme) yakın. 360 büyük Absorbans için yok olma katsayısı nm olduğunu 27.000 M-1 cm-1. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56527/56527fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig3.jpg"> 
Şekil 3 : UV-VIS spectra ham tepki karışımı. [(OH2) (NH3)4Ru (μ-O) Ru (NH3)4(OH2)] CL5 UV-VIS Absorbans spectra pH 7.4 PBS alınan arıtma önce ham tepki karışımı. Kırmızı oklar, ortak yabancı maddeleri gösterir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56527/56527fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig4.jpg"> 
Şekil 4 : Saf malzeme için temsil edici kızılötesi spectra. Kızılötesi spectra [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5. Ru-O-Ru streç 850 cm-1, diğer uzanan NH3 osilatörler. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56527/56527fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig5.jpg" alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig5.jpg"></img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig5.jpg">/> 
Şekil 5 : NH4Cl yabancı maddeleri içeren kızılötesi spectra. [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 amonyum klorür kirlilik ile kızılötesi spectra. Kırmızı ok amonyum klorür 1400 cm-1de gösterir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56527/56527fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig6.jpg"> 
Şekil 6 : Ticari rutenyum kırmızı kızılötesi spectra [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 (siyah izleme) ve ticari rutenyum kırmızı (kırmızı izle) kızılötesi spektrum. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56527/56527fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig7.jpg"> 
Şekil 7 : Temsilcisi kalsiyum alımı sonuçları. Floresans artış nedeniyle kalsiyum digitonin permeabilized HeLa hücreleri, kalsiyum yeşil-5N ve [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 bir kokteyl için eklenmesi BGSS içinde. Boş yok [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 içerir ve mitokondri içine Ca2 + alımı nedeniyle Floresans azalma görülebilir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56527/56527fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor at JoVE.com

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Sentez ve rutenyum tabanlı mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü değerlendirilmesi

Bir protokol, arıtma, malzemelerin ve rutenyum tabanlı inhibitörü olan mitokondrial kalsiyum alımı için sunulmaktadır. Permeabilized memeli hücrelerinde onun etkinliğini değerlendirmek için bir yordam gösterilmiştir.

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

synthesis-evaluation-ruthenium-based-mitochondrial-calcium-uptake

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

7.8K Görüntüleme.  Cornell University. Bir protokol, arıtma, malzemelerin ve rutenyum tabanlı inhibitörü olan mitokondrial kalsiyum alımı için sunulmaktadır. Permeabilized memeli hücrelerinde onun etkinliğini değerlendirmek için bir yordam gösterilmiştir.

Video: Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of molecular iodine to samarium metal in THF.1,2-3 It is a mild and selective single electron reductant and its versatility is a result of its ability to initiate a wide range of reductions including C-C bond-forming and cascade or sequential reactions. SmI2 can reduce a variety of functional groups including sulfoxides and sulfones, phosphine oxides, epoxides, alkyl and aryl halides, carbonyls, and conjugated double bonds.2-12 One of the fascinating features of SmI-2-mediated reactions is the ability to manipulate the outcome of reactions through the selective use of cosolvents or additives. In most instances, additives are essential in controlling the rate of reduction and the chemo- or stereoselectivity of reactions.13-14 Additives commonly utilized to fine tune the reactivity of SmI2 can be classified into three major groups: (1) Lewis bases (HMPA, other electron-donor ligands, chelating ethers, etc.), (2) proton sources (alcohols, water etc.), and (3) inorganic additives (Ni(acac)2, FeCl3, etc).3
Understanding the mechanism of SmI2 reactions and the role of the additives enables utilization of the full potential of the reagent in organic synthesis. The Sm-Barbier reaction is chosen to illustrate the synthetic importance and mechanistic role of two common additives: HMPA and Ni(II) in this reaction. The Sm-Barbier reaction is similar to the traditional Grignard reaction with the only difference being that the alkyl halide, carbonyl, and Sm reductant are mixed simultaneously in one pot.1,15 Examples of Sm-mediated Barbier reactions with a range of coupling partners have been reported,1,3,7,10,12 and have been utilized in key steps of the synthesis of large natural products.16,17 Previous studies on the effect of additives on SmI2 reactions have shown that HMPA enhances the reduction potential of SmI2 by coordinating to the samarium metal center, producing a more powerful,13-14,18 sterically encumbered reductant19-21 and in some cases playing an integral role in post electron-transfer steps facilitating subsequent bond-forming events.22 In the Sm-Barbier reaction, HMPA has been shown to additionally activate the alkyl halide by forming a complex in a pre-equilibrium step.23
Ni(II) salts are a catalytic additive used frequently in Sm-mediated transformations.24-27 Though critical for success, the mechanistic role of Ni(II) was not known in these reactions. Recently it has been shown that SmI2 reduces Ni(II) to Ni(0), and the reaction is then carried out through organometallic Ni(0) chemistry.28
These mechanistic studies highlight that although the same Barbier product is obtained, the use of different additives in the SmI2 reaction drastically alters the mechanistic pathway of the reaction. The protocol for running these SmI2-initiated reactions is described.

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

A straightforward procedure for the preparation of samarium diiodide (SmI2) in THF is described. The role of two main additives namely hexamethylphosphoramide (HMPA) and Ni(acac)2 in Sm mediated reactions is demonstrated in the Sm-Barbier reaction.

Hazırlanması ve Samaryum Diiodide Kullanımı (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) In Organic Synthesis: Samaryum Barbier Reaksiyonu HMPA ve Ni (II) tuzlarının Mekanistik Rolü

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Kimya

Seeded Synthesis of CdSe/CdS Rod and Tetrapod Nanocrystals

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded synthesis strategy is used in which spherical seeds of CdSe are prepared first using a hot-injection technique. By controlling the crystal structure of the seed to be either wurtzite or zinc-blende, the subsequent hot-injection growth of CdS off of the seed results in either a rod-shaped or tetrapod-shaped nanocrystal, respectively. The phase and morphology of the synthesized nanocrystals are confirmed using X-ray diffraction and transmission electron microscopy, demonstrating that the nanocrystals are phase-pure and have a consistent morphology. The extinction coefficient and quantum yield of the synthesized nanocrystals are calculated using UV-Vis absorption spectroscopy and photoluminescence spectroscopy. The rods and tetrapods exhibit extinction coefficients and quantum yields that are higher than that of the bare seeds. This synthesis demonstrates the precise arrangement of materials that can be achieved at the nanoscale by using a seeded synthetic approach.

A protocol for the seeded synthesis of rod-shaped and tetrapod-shaped multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe is presented.

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded ...

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; therefore their preparation should be conducted under an inert atmosphere. Evaluation of the anticancer activity of these complexes can be achieved by the MTT assay.
The MTT assay is a colorimetric viability assay based on enzymatic reduction of the MTT molecule to formazan when it is exposed to viable cells. The outcome of the reduction is a color change of the MTT molecule. Absorbance measurements relative to a control determine the percentage of remaining viable cancer cells following their treatment with varying concentrations of a tested compound, which is translated to the compound anticancer activity and its IC50 values. The MTT assay is widely common in cytotoxicity studies due to its accuracy, rapidity, and relative simplicity.
Herein we present a detailed protocol for the synthesis of air sensitive metal based drugs and cell viability measurements, including preparation of the cell plates, incubation of the compounds with the cells, viability measurements using the MTT assay, and determination of IC50 values.

A method for synthesis of air-sensitive titanium and vanadium anticancer agents is described, along with the evaluation of their cytotoxic activity towards human cancer cell line by the MTT Assay.

MTT deneyi ile sentez ve Sitotoksisite Değerlendirilmesi: Anticancer Metal Kompleksleri

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Synthesis and Purification of Iodoaziridines Involving Quantitative Selection of the Optimal Stationary Phase for Chromatography

The highly diastereoselective preparation of cis-N-Ts-iodoaziridines through reaction of diiodomethyllithium with N-Ts aldimines is described. Diiodomethyllithium is prepared by the deprotonation of diiodomethane with LiHMDS, in a THF/diethyl ether mixture, at -78 &#176;C in the dark. These conditions are essential for the stability of the LiCHI2 reagent generated. The subsequent dropwise addition of N-Ts aldimines to the preformed diiodomethyllithium solution affords an amino-diiodide intermediate, which is not isolated. Rapid warming of the reaction mixture to 0 &#176;C promotes cyclization to afford iodoaziridines with exclusive cis-diastereoselectivity. The addition and cyclization stages of the reaction are mediated in one reaction flask by careful temperature control.
Due to the sensitivity of the iodoaziridines to purification, assessment of suitable methods of purification is required. A protocol to assess the stability of sensitive compounds to stationary phases for column chromatography is described. This method is suitable to apply to new iodoaziridines, or other potentially sensitive novel compounds. Consequently this method may find application in range of synthetic projects. The procedure involves firstly the assessment of the reaction yield, prior to purification, by 1H NMR spectroscopy with comparison to an internal standard. Portions of impure product mixture are then exposed to slurries of various stationary phases appropriate for chromatography, in a solvent system suitable as the eluent in flash chromatography. After stirring for 30 min to mimic chromatography, followed by filtering, the samples are analyzed by 1H NMR spectroscopy. Calculated yields for each stationary phase are then compared to that initially obtained from the crude reaction mixture. The results obtained provide a quantitative assessment of the stability of the compound to the different stationary phases; hence the optimal can be selected. The choice of basic alumina, modified to activity IV, as a suitable stationary phase has allowed isolation of certain iodoaziridines in excellent yield and purity.

A protocol for the diastereoselective one-pot preparation of cis-N-Ts-iodoaziridines is described. The generation of diiodomethyllithium, addition to N-Ts aldimines and cyclization of the amino gem-diiodide intermediate to iodoaziridines is demonstrated. Also included is a protocol to rapidly and quantitatively assess the most appropriate stationary phase for purification by chromatography.

Sentez ve Kromatografi için optimal sabit faz kantitatif seçimi dahil edilmesi Iodoaziridines saflaştırılması

The highly diastereoselective preparation of cis-N-Ts-iodoaziridines through reaction of diiodomethyllithium with N-Ts aldimines is described. ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

Fonksiyonlu Sentezi ve Karakterizasyonu Metal-organik Altyapıları

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis and Exfoliation of Discotic Zirconium Phosphates to Obtain Colloidal Liquid Crystals

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and engineers. Growth of such anisotropic nanocrystals through a simple chemical method is a challenging task. In this study, we fabricate discotic nanodisks of zirconium phosphate [Zr(HPO4)2&#183;H2O] as a model material using hydrothermal, reflux and microwave-assisted methods. Growth of crystals is controlled by duration time, temperature, and concentration of reacting species. The novelty of the adopted methods is that discotic crystals of size ranging from hundred nanometers to few micrometers can be obtained while keeping the polydispersity well within control. The layered discotic crystals are converted to monolayers by exfoliation with tetra-(n)-butyl ammonium hydroxide [(C4H9)4NOH, TBAOH]. Exfoliated disks show isotropic and nematic liquid crystal phases. Size and polydispersity of disk suspensions is highly important in deciding their phase behavior.

A two dimensional model material of discotic zirconium phosphate was developed. The inorganic crystal with lamellar structure was synthesized by hydrothermal, reflux, and microwave-assisted methods. On exfoliation with organic molecules, layered crystals can be converted to monolayers, and nematic liquid crystal phase was formed at sufficient concentration of monolayers.

Sentezi ve diskotik Zirkonyum Fosfatların Eksfoliasyon Kolloidal Sıvı Kristaller Edinme

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

Sentez ve μ-Conotoxin PIIIA izomerler farklı disülfür Connectivities ile yapı belirlenmesi

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Solid-phase Synthesis of [4.4] Spirocyclic Oximes

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of solid-phase synthesis, regenerating Michael (REM) linker strategies, and 1,3-dipolar cycloaddition, a library of structurally similar heterocycles, both with and without a spirocyclic center, can be constructed. The main advantages of the solid-support synthesis are as follows: first, each reaction step can be driven to completion using a large excess of reagents resulting in high yields; next, the use of commercially available starting materials and reagents keep the costs low; finally, the reaction steps are easy to purify via simple filtration. The REM linker strategy is attractive because of its recyclability and traceless nature. Once a reaction scheme is completed, the linker can be reused multiple times. In a typical solid-phase synthesis, the product contains either a part of or the whole linker, which can prove undesirable. The REM linker is &#34;traceless&#34; and the point of attachment between the product and the polymer is indistinguishable. The high diastereoselectivity of the intramolecular 1,3-dipolar cycloaddition is well documented. Limited by the insolubility of the solid support, the reaction progression can only be monitored by a change in the functional groups (if any) via infrared (IR) spectroscopy. Thus, the structural identification of intermediates cannot be characterized by conventional nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Other limitations to this method stem from the compatibilities of the polymer/linker to the desired chemical reaction scheme. Herein we report a protocol that allows for the convenient production of spirocyclic heterocycles that, with simple modifications, can be automated with high-throughput techniques.

Here we present a protocol to demonstrate an efficient method for the synthesis of spirocyclic heterocycles. The five-step process utilizes solid-phase synthesis and regenerating Michael linker strategies. Generally difficult to synthesize, we present a customizable method for the synthesis of spirocyclic molecules otherwise inaccessible to other modern approaches.

Katı faz [4.4] Spirocyclic Oximes sentezi

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of ...

Synthesis of Esters Via a Greener Steglich Esterification in Acetonitrile

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the reaction is commonly performed using chlorinated or amide solvent systems, which are hazardous to human health and the environment. Our methodology utilizes acetonitrile as a greener and less hazardous solvent system. This protocol exhibits rates and yields that are comparable to traditional solvent systems and employs an extraction and wash sequence that eliminates the need for the purification of the ester product via column chromatography. This general method can be used to couple a variety of carboxylic acids with 1&#176; and 2&#176; aliphatic alcohols, benzylic and allylic alcohols, and phenols to obtain pure esters in high yields. The goal of the protocol detailed here is to provide a greener alternative to a common esterification reaction, which could serve useful for ester synthesis in both academic and industrial applications.

A modified Steglich esterification reaction was used to synthesize a small library of ester derivatives with primary and secondary alcohols. The methodology uses a non-halogenated and greener solvent, acetonitrile, and enables product isolation in high yields without the need for chromatographic purification.

Esterleri bir yeşil Steglich esterleşme Asetonitril içinde yolu ile sentezi

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the ...

Synthesis Method for Cellulose Nanofiber Biotemplated Palladium Composite Aerogels

Here, a method to synthesize cellulose nanofiber biotemplated palladium composite aerogels is presented. Noble metal aerogel synthesis methods often result in fragile aerogels with poor shape control. The use of carboxymethylated cellulose nanofibers (CNFs) to form a covalently bonded hydrogel allows for the reduction of metal ions such as palladium on the CNFs with control over both nanostructure and macroscopic aerogel monolith shape after supercritical drying. Crosslinking the carboxymethylated cellulose nanofibers is achieved using 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) in the presence of ethylenediamine. The CNF hydrogels maintain their shape throughout synthesis steps including covalent crosslinking, equilibration with precursor ions, metal reduction with high concentration reducing agent, rinsing in water, ethanol solvent exchange, and CO2 supercritical drying. Varying the precursor palladium ion concentration allows for control over the metal content in the final aerogel composite through a direct ion chemical reduction rather than relying on the relatively slow coalescence of pre-formed nanoparticles used in other sol-gel techniques. With diffusion as the basis to introduce and remove chemical species into and out of the hydrogel, this method is suitable for smaller bulk geometries and thin films. Characterization of the cellulose nanofiber-palladium composite aerogels with scanning electron microscopy, X-ray diffractometry, thermal gravimetric analysis, nitrogen gas adsorption, electrochemical impedance spectroscopy, and cyclic voltammetry indicates a high surface area, metallized palladium porous structure.

A synthesis method for cellulose nanofiber biotemplated palladium composite aerogels is presented.The resulting composite aerogel materials offer potential for catalysis, sensing, and hydrogen gas storage applications.

Selüloz nanofiber Biotemkaplama Palladium kompozit Aerogels için sentez yöntemi

Here, a method to synthesize cellulose nanofiber biotemplated palladium composite aerogels is presented. Noble metal aerogel synthesis methods often ...