Esta pesquisa foi apoiada pela Universidade de Cornell. Este trabalho fez uso do centro Cornell para materiais compartilhados instalações de pesquisa, que são suportados pelo programa NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. reconhece apoio por uma bolsa de pesquisa da pós-graduação NSF (Grant DGE - 1650441) e Dr. Dave Holowka para assistência com os experimentos de cálcio. Qualquer opinião, conclusões e conclusões ou recomendações expressadas neste material são as dos autores (s) e não refletem necessariamente as opiniões da National Science Foundation.

Nota: ácidos concentrados e bases são usadas nesta síntese. Usar todas as práticas de segurança adequadas ao realizar a reação, incluindo o uso de controles de engenharia (coifa) e equipamentos de proteção individual (EPI) incluindo óculos de segurança, luvas, jaleco, calça comprida e sapatos fechados.
 1. preparação de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>síntese de [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12 <ol><li>dissolver 1,00 g de RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru por peso, 4,1 mmol) em 5 mL de H 2 Cool O. a solução de marrom escura a 0 ° C em banho de gelo. Adicione 11 mL (0,23 mol) da solução de hidrato de hidrazina 80% de forma gota a gota. A reação inicial será vigorosa com o gás de evolução, resultando em uma solução de marrom. Deixe a solução resultante agitar à temperatura de 16 h; a solução final será vermelho escuro 
		Cuidado: Hidrazina é extremamente tóxico e cancerígeno. Além disso, formas anidra estes reagentes são explosivas. Como sempre, use capuzes PPE e emanações apropriados ao manusear. Não se concentrar essas soluções à secura.</li>
		<li>a esta solução, adicionar cerca de 5-10 mL de HCl concentrado para ajustar o pH a 2. Neste ponto, a solução será amarelo-marrom na cor.</li>
		<li>Calor esta solução a 105 ° C, agitando para 1-2 h. Um sólido amarelo irá precipitar fora da solução. Quando não mais visivelmente precipitar formas, retire do fogo.</li>
		<li>Permitir a mistura de reação para arrefecer à temperatura ambiente e em seguida, coloque em banho de gelo a 0 ° C por 10 min. recolher o sólido amarelo por vácuo filtração e lavagem com 5 mL de etanol e éter dietílico.</li>
		<li>Dissolver completamente o produto bruto em 15-25 mL de água quente. Fica frio 10 mL de uma solução de HCl concentrada em um frasco de filtro, colocando-o em um banho de gelo. Filtre a solução amarela para a solução de HCl refrigerada para induzir a precipitação de um sólido puro amarelo pálido. Esse precipitado de filtrar e lavar com 5 mL de HCl 0,5 M, etanol e éter.</li>
		<li>Caracterizar o composto usando espectroscopia de IR. Verificar a pureza pela identificação de alongamento as frequências de 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 e 801 cm -1. Uma impureza comum menor em 2069 cm -1 é atribuída ao [Ru (NH 3) 5 N. 2] Cl 3.</li>
	</ol></li> <li>Síntese de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>dissolver 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 em 50 mL de 1 M NH 4 OH em uma embarcação de pressão redondo de parede pesados de 200 mL. Vagamente tampar o frasco com uma rolha e aquecer a mistura de reação a 75 ° C, durante 6 h. Retire do fogo e misture à temperatura ambiente durante 4 dias produzir uma solução verde escura. 
		Cuidado! Um resultado de recipiente selado em um acúmulo de pressão de aquecimento. Certifique-se de usar produtos vidreiros de pressão-seguro apropriado. Para esta reação, a finalidade de selar o recipiente é minimizar a perda de gases NH 3. Portanto, coloque a rolha frouxamente para permitir a liberação do excesso de pressão.</li>
	</ol></li> <li>Purificação por cromatografia de permuta catiónica <ol><li>em uma proveta de 25 mL, suspender resina permutadora de catiões de 5 g (por exemplo, malha Dowex 50WX2 200-400 (formulário H +) em 10 mL de 0.1 M HCl.</li>
		<li>Carregar este chorume em uma coluna de 10 mL (10 mm de diâmetro, 15 cm de altura) afixado com um reservatório de solvente de 50 mL. Lave a resina com cerca de 20-30 mL de 0.1 M HCl, até que o eluído esteja incolor.</li>
		<li>Voltar para a solução de verde de reação isolada na etapa 1.2.1. Para esta solução, adicionar HCl concentrado para ajustar o pH a 2, no ponto em que a cor da solução muda para marrom.</li>
		<li>Carregar esta solução acidificada à coluna de resina permutadora de catiões, preparada na etapa 1.3.2 pipetando suavemente em cima da resina. Deixe o eluato completamente escorra e continuar a carregar a solução. Repita este processo até que toda a solução foi adicionada. O topo da resina será castanho escuro/preto. A resina irá diminuir volume ligeiramente.</li>
		<li>, Grânulos de vidro de uso para cobrir o topo da resina. Estas impedirá a resina de ser incomodado quando novas soluções são adicionadas.</li>
		<li>Eluir a coluna com 20 mL de 1 HCl, M.</li>
		<li>Eluir a coluna com uma maior concentração de HCl de 1,5 M (&#8776; 50 mL). Uma solução amarela começará a sair da coluna. Aumentar a concentração de HCl a 2 M e continuar até o eluato é incolor de eluição ou um verde-amarelo muito pálido. Um volume total de 150-200 mL serão necessário para este processo.</li>
		<li>Aumentar a concentração de HCl a 2,5 M (20-50 mL). Recolha o eluato em fracções em tubos de ensaio. Aumentar para 3 M HCl. O produto vai eluir da coluna como uma solução verde-marrom. Uma fração de vermelho-marrom também pode começar a sair da coluna. Como estas frações são impurezas oxidadas rutênio vermelho, não da piscina com as frações de verde-marrom.</li>
	</ol></li> <li>Caracterização e verificação de pureza de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>testar todas as frações de Passo 1.3.8. por espectroscopia UV-vis. Para realizar essa tarefa, adicionar 100 µ l de uma fração dada em 2 mL de 3 M de NH3 e analisar por espectroscopia UV-vis. Frações que contêm o produto puro terá uma banda grande absorvância a 360 nm e uma absorvância menos intensa em 600 nm. Absorvância a 480 ou 533 nm é indicativa de oxidado rutênio vermelho e impurezas de rutênio vermelho, respectivamente.</li>
		<li>Piscina frações contendo o produto puro e evaporar a solução para o ressecamento por evaporação rotativa. O produto será isolado como um sólido verde-marrom. Rendimentos são tipicamente da ordem de 5-15 mg (10-20% de rendimento). Single-cristais, apropriados para difração de raios x, podem ser obtidas através da difusão de vapor de etanol em solução aquosa do composto.</li>
		<li>Para verificar a pureza, analisar o composto por espectroscopia UV-vis em uma solução de pH 7,4 fosfato salino (PBS). Pureza pode ser avaliada tendo a relação de intensidade do 360 nm e 600 nm de picos. Esta proporção é 31 para um composto puro. Para compostos impuros, a proporção será menor.</li>
		<li>Analisar a amostra no estado sólido por espectroscopia de IR. Bandas de diagnósticos estão no 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 e 815 cm -1. Bandas de impureza comum são vistas em 1762 cm -1 e 1400 cm -1, característico de NH 4 vermelho de rutênio CL pode ser identificado por bandas em 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 e 800 cm -1.</li>
	</ol></li> <li>Avaliação da inibição de absorção de cálcio mitocondrial por espectroscopia de fluorescência cuidado! Os procedimentos a seguir usam células de mamíferos. Trabalho deve ser efectuado em capas de adequado fluxo laminar que são certificadas para a segurança biológica de nível 2 (BSL2) pesquisa. 
	&#8203; Nota: [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 será referido como [Ru] nesta seção <ol><li>fazer buffer glicose contendo solução salina (BGSS) como a mídia de ensaio. BGSS é uma solução composta por 110 mM KCl, 1mm KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, ácido de-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic de 20 mM 4 (HEPES), succinato de sódio de 5 mM, 30 µM glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N &#39;, N &#39;-ácido etilenodiaminotetracético (EGTA). Combinam com tudo, exceto o EGTA, ajustar o pH para 7,4. Adicionar EGTA e reajustar o pH para 7,4. Para 50 mL de mídia de ensaio, adicionar 0,5 mL de glicose 1 mg/mL.</li>
		<li>Células HeLa cultura em 500 cm 2 placas de Petri em Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% soro bovino fetal (FBS) numa incubadora umidificado com 5% CO 2 a 37 ° C. amplificar as células HeLa crescendo em uma placa de Petri de 100mm por semeadura -os em um prato de petri de 2 500 cm. O volume total de mídia no prato grande é 115 mL. Cada prato grande produzirá cerca de 18 milhões células, suficiente para dois experimentos de espectroscopia de fluorescência.
		<ol><li>Crescer as células até atingirem 90-95% Confluencia. Remova a mídia e lave as células com PBS pH 7,4 de 15 mL. Adicionar 15 mL de ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em PBS e incubar durante 10 min separar as células. Transferir as células para 14 mL redonda Falcão tubos</li></ol></li> <li>contar células usando trypan azul e um hemocytometer com um microscópio invertido e calcular o número total de células e o volume dos meios necessários para atingir 7,5 milhões de células por volume de 1,8 mL do meio. Centrifugar as células durante 10 minutos a 5310 × g. decantar o sobrenadante e adicionar o volume calculado de BGSS. Ressuspender as células suavemente.
		<ol><li>Para este ensaio, preparar soluções estoque de digitonin de 40 mM em dimetilsulfóxido (DMSO), 1mm verde de cálcio-5N em H 2 O e 10 mM CaCl 2 em H 2 O. [Ru] Soluções conservadas em estoque, preparadas em água pura, pode variar de 1 a 3 mM. 
			&#8203; Nota: cálcio Green-5N é sensível à luz. Armazenar no escuro e minimizar a exposição à luz.</li>
		</ol></li> <li>Configurar o fluorímetro para excitar a 506 nm e leitura das emissões em 532 nm com a cubeta do titular controlada em 37 ° C. Prepare uma cubeta do acrílica com uma barra de agitação ou roda, suspensão de células de 1,8 mL de 1.5.2 acima, 1,8 µ l digitonin de solução, 3.6 & #181; L cálcio Green-5N (solução) e 9 µ l [Ru] (para solução estoque de 1 mM, concentração final de 5 µM). Incube as células durante 15 min no fluorímetro.
		<ol><li>Ler os dados como a relação de excitação/emissão, em vez da absorção bruta. Esta prática minimiza os erros associados com as flutuações da intensidade da fonte de luz.</li>
			<li>Análise da primeira amostra na ausência de [Ru] para medir o efeito da adição de CaCl 2 sobre a resposta das células.</li>
			<li>Begin análise sobre o fluorímetro com as configurações descritas na 1.5.4. Espere aproximadamente 2 minutos para estabelecer uma base estável de emissão e em seguida, adicionar 1,8 µ l de CaCl 2 (concentração final de 10 µM). A intensidade de emissão vai aumentar imediatamente após a adição do CaCl 2 e então irá decair ao longo dos minutos como os íons cálcio entram na mitocôndria. Esperar até que tenha terminado a decadência (&#8776; 5 min). Adicionar bolus de cálcio adicional para determinar a resposta de absorção de cálcio mitocondrial das células não tratadas com [Ru].</li>
		</ol></li> <li>Em uma outra cubeta contendo 5 µM [Ru], repetir a experiência, como descrito acima em 1.5.4.3. Na presença do inibidor, intensidade de emissão vai aumentar, mas não decadência. Esta observação significa que bloqueou a absorção de cálcio mitocondrial.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enjoy+the+trip:+Calcium+in+mitochondria+back+and+forth.">Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth.</a> Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).</li><li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+calcium+connection.">Mitochondria: the calcium connection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li><li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+homeostasis+as+potential+target+for+mitochondrial+medicine.">Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine.</a> Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).</li><li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szab&#242;, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li><li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).</li><li>Kamer, K. J., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+era+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).</li><li>Ying, W. -. L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport+by+an+oxo-bridged+dinuclear+ruthenium+ammine+complex.">Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex.</a> Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).</li><li>Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+component+of+"ruthenium+red"+responsible+for+inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport.+Spectra,+electrochemistry,+and+aquation+kinetics.+Crystal+structure+of+&#181;-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.">The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of &#181;-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).</li><li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-bridged+Dinuclear+Ruthenium+Amine+Complex+Specifically+Inhibits+Ca2++Uptake+into+Mitochondria+in+Vitro+and+in+Situ+in+Single+Cardiac+Myocytes.">Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes.</a> J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li><li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li><li>Nathan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Methods+for+the+Preparation+of+a+Functional+Analogue+of+Ru360,+a+Potent+Inhibitor+of+Mitochondrial+Calcium+Uptake.">Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake.</a> Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).</li><li>Allen, A. D., Senoff, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+infrared+spectra+of+some+ammine+complexes+of+ruthenium(II)+and+ruthenium(III).">Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III).</a> Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li><li>Deak, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+mitochondrial+Ca&#8314;+uptake.">Assessment of mitochondrial Ca&#8314; uptake.</a> Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar

O cálcio mitocondrial absorção inibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 pode ser sintetizada de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, um ruthenium(III) bem conhecido começando o material, conforme descrito neste procedimento. A síntese de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 é facilmente alcançada com pouca dificuldade. Após agitação RuCl3 para 16 h na hidrazina hidrato, o pH da solução deve ser ajustado para um valor de 2 com HCl. A queda de pH é crítica para atingir o produto desejado. Se desejado, essa síntese pode ser modificada de forma [Ru (NH3)5Br] Br2 por refluxo na HBr em vez de HCl.
Temos observado algumas estratégias para minimizar a formação de subprodutos indesejáveis durante a síntese do inibidor de absorção de cálcio mitocondrial. Notavelmente, manter o recipiente tampado é fundamental para o sucesso desta reação; Se o frasco for aberto, uma série de outros subprodutos, incluindo rutênio vermelho (RuRed), é formada em quantidades apreciáveis. Presumivelmente, amônia gasosa está perdida desde a embarcação da reação aberta e esta formação de compromissos de evento do produto desejado. O tamanho do balão e o volume de amônia aquosa também são parâmetros importantes que não devem ser modificados significativamente daqueles descritos no presente protocolo, como temos notado que a eficiência desta reação é diminuída em frascos menores. Este método não aumenta drasticamente o rendimento deste composto em comparação com os outros dois métodos que tinha anteriormente divulgada. , No entanto, conter menos etapas e dar origem à formação de produto menos colaterais, tais como RuRed. O baixo rendimento pode ser atribuído à presença de uma pequena quantidade de não tenha reagido [Ru (NH3)5Cl] Cl2 , bem como desconhecido altamente carregada de impurezas que são retidas no topo da coluna. Embora não exploramos muitas condições de reação adicional, é possível que melhorias podem ser realizadas através da variação do tempo de reação e as concentrações de reagente, para obter rendimentos mais elevados.
A purificação de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 é a parte mais difícil e tedioso do presente protocolo. Uma coluna bem embalada irá ajudar muito na separação; carregando a resina como chorume é uma abordagem eficaz para embalar a coluna. Note-se que como a concentração de HCl é aumentada ao longo de eluição da coluna, a resina contrato em tamanho. Para obter êxito material puro, a taxa na qual a concentração do ácido é aumentada não deve desviar o procedimento indicado. O produto final será um sólido verde-marrom; uma solução básica será verde-escuro, mas soluções ácidas será marrons. Se for observada uma solução-rosa ao vermelho brilhante, contaminações de rutênio vermelho estão presentes. A quantidade de RuRed pode ser determinada utilizando-se o coeficiente de extinção (62.000 M-1·cm-1 em 533 nm). Este processo de purificação é relativamente geral para colunas de resina permutadora de catiões forte.
A inibição de absorção de cálcio mitocondrial pode ser testada usando permeabilized as células HeLa, o sensor de cálcio fluorescente verde-5N de cálcio e um spectrofluorimeter. 13 , 14 este ensaio requer uma grande quantidade de células e, portanto, exigem a amplificação da cultura em um grande 500 cm2 placa de Petri. Estes frascos de cultura grande evitar desafios adicionais em minimizar a contaminação microbiana, porque as áreas de superfície expostas são muito grandes. Trabalho deve ser realizado em um fluxo laminar para manter a esterilidade. A resposta de fluorescência de cálcio Green-5N em pilhas HeLa permeabilized é monitorada por espectroscopia de fluorescência. A adição de um bolus externo de cálcio para a célula provoca um aumento imediato na fluorescência, decorrentes de íons de cálcio interagindo com o sensor. Ao longo de vários minutos na ausência de um inibidor, a intensidade decai devido a absorção destes íons cálcio na mitocôndria, uma organela que não pode ser acessada pelo corante. Quando este ensaio é realizado na presença de um inibidor a adição de um bolus de íons cálcio dá origem a um aumento na intensidade de emissão. A decadência devido a absorção de cálcio mitocondrial, no entanto, não está presente, verificando as propriedades de inibitória de absorção de cálcio mitocondrial deste composto. Este processo pode ser usado como uma tela geral para inibidores de absorção de cálcio. Além disso, este procedimento pode ser aplicado a outras células eucarióticas de interesse. Este ensaio depende a permeabilização do exterior membrana celular, portanto, não fornece informações sobre a capacidade de absorção celular de um complexo.
Em resumo, este protocolo descrever a síntese e purificação de um inibidor de absorção de romance de cálcio mitocondrial rutênio-baseado. Este composto é de valor significativo para o estudo da biologia de cálcio mitocondrial e seu papel na fisiologia da célula mamífera. O ensaio relativamente simples para teste de absorção de cálcio mitocondrial também é útil para a triagem e a investigação de novos inibidores.

Cálcio mitocondrial é um regulador chave para um número de processos que são críticos para a função celular normal, incluindo apoptose e produção de energia. 1 , 2 , 3 o uniporter cálcio mitocondrial (MCU), uma proteína de transporte de íon que reside na membrana mitocondrial interna, regula o influxo de íons cálcio na mitocôndria. 4 , 5 , 6 químicos inibidores do MCU são ferramentas valiosas para continuar os esforços para estudar a função e funções celulares deste transporte de proteína e cálcio mitocondrial. O composto [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, é um dos único conhecidos inibidores seletivos para o MCU com um valor ded K relatado de 24 µM.7 ,8,9,10 , este complexo é uma impureza comum encontrada em comerciais formulações de rutênio vermelho (RuRed), um triruthenium di-µ-oxo em ponte hexacation da fórmula [(NH3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, que também tem sido usado como um inibidor de absorção de cálcio. Embora Ru360 seja disponível comercialmente, é muito caro. Além disso, a síntese e isolamento de Ru360 é desafiado por processos de purificação difícil e métodos de caracterização ambíguo.
Recentemente informamos procedimentos alternativos para acessar um Ru360 análogo, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 este composto inibe a MCU com alta afinidade, semelhante ao Ru360. Neste protocolo, descreveremos nossa mais eficaz síntese deste composto, que se inicia a partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purificação do produto usando resina permutadora de catiões fortemente ácida é detalhada, juntamente com armadilhas comuns para este procedimento. Podemos também apresentar métodos para caracterização e avaliação da pureza de compostos e delinear uma abordagem simples para testar a sua eficácia em bloquear a absorção de cálcio mitocondrial.

<table style="border-collapse:collapse;width:663pt" width="884">
	<colgroup>
		<col style="width:182pt" width="243" />
		<col style="width:227pt" width="302" />
		<col style="width:129pt" width="172" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl69" height="23" style="width:182pt;height:17.25pt" width="243">Ruthenium Trichloride hydrate</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Pressure Chemical</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">3750</td>
			<td class="xl70" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Concentrated hydrochloric acid</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">J.T. Baker</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">9535</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl69" height="22" style="width:182pt;height:16.5pt" width="243">Concentrated ammonium hydroxide</td>
			<td class="xl71" style="width:227pt" width="302">Mallinckrodt Chemical Works</td>
			<td class="xl71" style="width:129pt" width="172">A669C-2 1</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td class="xl69" height="24" style="width:182pt;height:18.0pt" width="243">Dowex 50 WX2 200-400 Mesh</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">13945</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="25" style="height:18.75pt">
			<td class="xl69" height="25" style="width:182pt;height:18.75pt" width="243">Calcium Green 5N</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Invitrogen</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">C3737</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Digitonin</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Aldrich</td>
			<td class="xl71" style="width:129pt" width="172">260746</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">DMSO</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">471267</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">EGTA</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">E3889</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">KCl</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">USB</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">20598</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">KH2PO4</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">P3786</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">MgCl2</td>
			<td class="xl77" style="width:227pt" width="302">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">M33-500</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">HEPES</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Fluka</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">54466</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl69" height="22" style="width:182pt;height:16.5pt" width="243">Sodium Succinate</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">33386</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl69" height="22" style="width:182pt;height:16.5pt" width="243">EDTA</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">J.T. Baker</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">8993-01</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Glucose</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">Aldrich</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">G5000</td>
			<td class="xl70"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl69" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">200 Round bottom flask</td>
			<td class="xl69" style="width:227pt" width="302">ChemGlass</td>
			<td class="xl75">CG-1506-14</td>
			<td class="xl74" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Glass stopper</td>
			<td class="xl65" style="width:227pt" width="302">ChemGlass</td>
			<td class="xl65" style="width:129pt" width="172">CG-3000-05</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl65" height="42" style="width:182pt;height:31.5pt" width="243">10 mm x 15 cm glass column with reservoirs</td>
			<td class="xl77" style="width:227pt" width="302">Custom - similar to Chemglass columns</td>
			<td class="xl77" style="width:129pt" width="172">Similar to CG-1203-20</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl65" height="20" style="width:182pt;height:15.0pt" width="243">DMEM</td>
			<td class="xl77" style="width:227pt" width="302">Corning</td>
			<td class="xl77" style="width:129pt" width="172">10-017-CV</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">FBS</td>
			<td class="xl77" style="width:227pt" width="302">Gibco</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">10437028</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">PBS</td>
			<td class="xl77" style="width:227pt" width="302">Corning</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">21-040-CV</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Round bottom Falcon tubes</td>
			<td class="xl77" style="width:227pt" width="302">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl69" style="width:129pt" width="172">14-959-11B&#160;</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">500 cm2 petri dishes</td>
			<td class="xl65" style="width:227pt" width="302">Corning</td>
			<td class="xl76" style="width:129pt" width="172">431110</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Trypan blue</td>
			<td class="xl65" style="width:227pt" width="302">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl76" style="width:129pt" width="172">15250061</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Hemacytometer</td>
			<td class="xl65" style="width:227pt" width="302">Aldrich</td>
			<td class="xl76" style="width:129pt" width="172">Z359629</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Acrylic Cuvettes</td>
			<td class="xl65" style="width:227pt" width="302">VWR&#160;</td>
			<td class="xl76" style="width:129pt" width="172">58017-875</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl72" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">UV-Vis spectrometer</td>
			<td class="xl68">Agilent Model Cary 8454&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:129pt" width="172"></td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl72" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Spectrofluorimeter</td>
			<td class="xl68">SLM Model 8100C</td>
			<td class="xl65" style="width:129pt" width="172"></td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl72" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">IR spectrometer</td>
			<td class="xl68">Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment</td>
			<td class="xl65" style="width:129pt" width="172"></td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Centrifuge</td>
			<td class="xl65" style="width:227pt" width="302">ALC Model PM140R</td>
			<td class="xl65" style="width:129pt" width="172"></td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:182pt;height:15.75pt" width="243">Inverted light microscope</td>
			<td class="xl65" style="width:227pt" width="302">VWR&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:129pt" width="172">89404-462</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and evaluation of a ruthenium-based mitochondrial calcium uptake inhibitor

Detalhamos a síntese e purificação de um inibidor de absorção cálcio mitocondrial,5 +[(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)]. A síntese otimizada deste composto começa de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 em 1 M NH4OH em um recipiente fechado, produzindo uma solução verde. Purificação é realizada com a cromatografia de permuta catiónica. Este composto é caracterizado e verificado ser puro por espectroscopia UV-vis e IR. As propriedades inibitório de absorção de cálcio mitocondrial são avaliadas em pilhas HeLa permeabilized por espectroscopia de fluorescência.

Este método descreve uma síntese do cálcio mitocondrial absorção inibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 a partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, um matérias-primas ruthenium(III) conhecidos. [Ru (NH3)5Cl] CL2 caracteriza-se por espectroscopia de IR, com modos vibracionais em 3200 cm-1, cm 1608-1, 1298 cm-1e 798 cm-1 (Figura 1). Uma impureza menor em 2069 cm-1 pode ser atribuída à [Ru (NH3)5N2] Cl3. A reação desta espécie de Ru(III) com 1 M NH4OH proporciona [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. O progresso desta reação é evidenciado por uma dramática mudança na cor da solução de amarelo para verde. A solução final da reação é verde escuro na cor. A acidificação da solução com HCl concentrado resulta em uma mudança de cor para marrom; um subproduto desta neutralização é cloreto de amônio, que pode contaminar o produto final se não cuidado. Purificação do composto prossegue através de cromatografia de permuta catiónica usando resina de malha fortemente ácida (formulário H+ ). A resina é incubada primeiro com 0,10 M de HCl, e a solução de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 é carregada na coluna. O subproduto de cloreto de amônio elutes com as lavagens de HCl 1 M. Compostos de rutênio contendo eluir em altas concentrações de HCl. Uma série de frações amarelas, que contêm não tenha reagido [Ru (NH3)5Cl] Cl2 material começar, saem da coluna quando a concentração de HCl é de 1,5 M. O produto desejado elutes entre 2.5-3.0 M HCl e as frações resultantes aparecem verde para verde-marrom na cor.
Antes de reunir as frações do produto, deve ser verificada a sua pureza. Porque o composto desejado exibe alguma dependência do pH em seu espectro de UV-vis, sugerimos adicionar pequenas alíquotas das frações de soluções altamente básicas da3 do NH 3 M para garantir que as características espectrais são os mesmos para todas as frações. Frações puras só devem exibir um pico intenso a 360 nm e um pico fraco em 600 nm (Figura 2). Picos perto de 480 e 533 nm indicam a presença de rutênio marrom e vermelho, respectivamente e um pico significativo em 260 nm, com um ombro em 290 nm, significa a presença de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 prima (Figura 3 ). Evaporação rotativa de frações puras proporciona o composto desejado como um sólido verde-marrom.
O composto isolado, ainda mais, pode ser caracterizado por espectroscopia UV-vis e IR tanto. O UV-vis espectro (Figura 2) exibe a 360 nm e 600 bandas de absorvância nm conforme descrito acima. O coeficiente de extinção para a banda de 600 nm é 850 M-1cm-1 e da banda de 360 nm é 27000 M-1cm-1. A relação entre a intensidade da banda 360 nm em comparação com a banda de 600 nm deve ser 31 em PBS pH 7,4, e essa métrica pode ser efetivamente usada para medir a pureza do composto. O espectro de IR deve aparecer como mostrado na Figura 4. A frequência de estiramento O-Ru-Ru, por exemplo, é um diagnóstica em 850 cm-1. O espectro de IR foi utilizado para determinar o estiramento O-Ru-Ru e certifique-se de que cloreto de amônio não estava presente no produto final. Cloreto de amônio, uma impureza comum, tem modos vibracionais em 1762 cm-1 (muito fraca) e 1400 cm-1 (forte) que pode ser facilmente discernido a partir do espectro de IR (Figura 5). Rutênio Vermelho é um subproduto comum da reação e pode ser identificado no IR espectro com trechos em 1404 cm-1, 1300 cm-1, 1037 cm-1 e 800 cm-1, embora alguns se sobrepõem com o produto desejado irá ocorrer ( A Figura 6).
A resposta de absorção de cálcio em células de HeLa digitonin-permeabilizado é observada (Figura 7). Os asteriscos indicam que a adição de CaCl2 em bolus. Na presença de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 um aumento na intensidade de emissão é observado após a adição de cálcio, mas nenhuma deterioração devido ao cálcio mitocondrial absorção é observada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig1.jpg"> 
Figura 1 : Espectros de infravermelhos de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Os espectros de infravermelhos de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 com uma muito pequeno [Ru (NH3)5N.2] Cl3 impureza. A seta vermelha indica a impureza no 2.069 cm-1. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56527/56527fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig2.jpg"> 
Figura 2 : Espectros de UV-vis de representante para material puro. [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Espectros de absorvância CL5 UV-vis e perto de infravermelho (inserir) tomadas em PBS pH 7,4. O coeficiente de extinção para o major absorvância a 360 nm é 27.000 M-1 cm-1. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56527/56527fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig3.jpg"> 
Figura 3 : Espectros de UV-vis de mistura reacional bruto. [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] CL5 UV-vis espectros de absorvância da mistura de reação bruto antes da purificação tomada em PBS pH 7,4. As setas vermelhas indicam as impurezas comuns. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56527/56527fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig4.jpg"> 
Figura 4 : Representante espectros de infravermelhos para puro material. Os espectros de infravermelhos de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. O estiramento O-Ru-Ru em 850 cm-1, os outros trechos são de osciladores de3 o NH. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56527/56527fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig5.jpg" alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig5.jpg"></img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig5.jpg">/> 
Figura 5 : Espectros de infravermelhos contendo NH4Cl impurezas. Os espectros de infravermelhos de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 com cloreto de amônio impureza. A seta vermelha indica o cloreto de amónio em 1.400 cm-1. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56527/56527fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig6.jpg"> 
Figura 6 : Espectros de infravermelhos de rutênio comercial vermelho O espectro infravermelho de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 (traço preto) e comercial rutênio vermelho (traço vermelho). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56527/56527fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56527/56527fig7.jpg"> 
Figura 7 : Resultados de absorção de cálcio representativa. O aumento da fluorescência, devido à adição de cálcio para um coquetel de digitonin-permeabilizado as células HeLa, cálcio Green-5N e [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 em BGSS. O espaço em branco não contém nenhum [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 e diminuição de fluorescência devido a absorção de Ca2 + na mitocôndria pode ser vista. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56527/56527fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor at JoVE.com

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Síntese e avaliação de um inibidor de absorção de cálcio mitocondrial rutênio-baseado

Um protocolo para a síntese, purificação e caracterização de um inibidor de rutênio-baseado da absorção de cálcio mitocondrial é apresentado. Um procedimento para avaliar a sua eficácia em células de mamíferos permeabilized é demonstrado.

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

synthesis-evaluation-ruthenium-based-mitochondrial-calcium-uptake

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

7.8K visualizações.  Cornell University. Um protocolo para a síntese, purificação e caracterização de um inibidor de rutênio-baseado da absorção de cálcio mitocondrial é apresentado. Um procedimento para avaliar a sua eficácia em células de mamíferos permeabilized é demonstrado.

Vídeo: Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of molecular iodine to samarium metal in THF.1,2-3 It is a mild and selective single electron reductant and its versatility is a result of its ability to initiate a wide range of reductions including C-C bond-forming and cascade or sequential reactions. SmI2 can reduce a variety of functional groups including sulfoxides and sulfones, phosphine oxides, epoxides, alkyl and aryl halides, carbonyls, and conjugated double bonds.2-12 One of the fascinating features of SmI-2-mediated reactions is the ability to manipulate the outcome of reactions through the selective use of cosolvents or additives. In most instances, additives are essential in controlling the rate of reduction and the chemo- or stereoselectivity of reactions.13-14 Additives commonly utilized to fine tune the reactivity of SmI2 can be classified into three major groups: (1) Lewis bases (HMPA, other electron-donor ligands, chelating ethers, etc.), (2) proton sources (alcohols, water etc.), and (3) inorganic additives (Ni(acac)2, FeCl3, etc).3
Understanding the mechanism of SmI2 reactions and the role of the additives enables utilization of the full potential of the reagent in organic synthesis. The Sm-Barbier reaction is chosen to illustrate the synthetic importance and mechanistic role of two common additives: HMPA and Ni(II) in this reaction. The Sm-Barbier reaction is similar to the traditional Grignard reaction with the only difference being that the alkyl halide, carbonyl, and Sm reductant are mixed simultaneously in one pot.1,15 Examples of Sm-mediated Barbier reactions with a range of coupling partners have been reported,1,3,7,10,12 and have been utilized in key steps of the synthesis of large natural products.16,17 Previous studies on the effect of additives on SmI2 reactions have shown that HMPA enhances the reduction potential of SmI2 by coordinating to the samarium metal center, producing a more powerful,13-14,18 sterically encumbered reductant19-21 and in some cases playing an integral role in post electron-transfer steps facilitating subsequent bond-forming events.22 In the Sm-Barbier reaction, HMPA has been shown to additionally activate the alkyl halide by forming a complex in a pre-equilibrium step.23
Ni(II) salts are a catalytic additive used frequently in Sm-mediated transformations.24-27 Though critical for success, the mechanistic role of Ni(II) was not known in these reactions. Recently it has been shown that SmI2 reduces Ni(II) to Ni(0), and the reaction is then carried out through organometallic Ni(0) chemistry.28
These mechanistic studies highlight that although the same Barbier product is obtained, the use of different additives in the SmI2 reaction drastically alters the mechanistic pathway of the reaction. The protocol for running these SmI2-initiated reactions is described.

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

A straightforward procedure for the preparation of samarium diiodide (SmI2) in THF is described. The role of two main additives namely hexamethylphosphoramide (HMPA) and Ni(acac)2 in Sm mediated reactions is demonstrated in the Sm-Barbier reaction.

Preparação e Uso de Samário diiodeto (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) Em Organic Synthesis: The Role mecanístico de HMPA e (II) de Ni Sais na Reacção Barbier Samário

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Química

Seeded Synthesis of CdSe/CdS Rod and Tetrapod Nanocrystals

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded synthesis strategy is used in which spherical seeds of CdSe are prepared first using a hot-injection technique. By controlling the crystal structure of the seed to be either wurtzite or zinc-blende, the subsequent hot-injection growth of CdS off of the seed results in either a rod-shaped or tetrapod-shaped nanocrystal, respectively. The phase and morphology of the synthesized nanocrystals are confirmed using X-ray diffraction and transmission electron microscopy, demonstrating that the nanocrystals are phase-pure and have a consistent morphology. The extinction coefficient and quantum yield of the synthesized nanocrystals are calculated using UV-Vis absorption spectroscopy and photoluminescence spectroscopy. The rods and tetrapods exhibit extinction coefficients and quantum yields that are higher than that of the bare seeds. This synthesis demonstrates the precise arrangement of materials that can be achieved at the nanoscale by using a seeded synthetic approach.

A protocol for the seeded synthesis of rod-shaped and tetrapod-shaped multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe is presented.

Semeado Síntese de CdSe / CdS Rod e tetrápodes Nanocristais

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded ...

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; therefore their preparation should be conducted under an inert atmosphere. Evaluation of the anticancer activity of these complexes can be achieved by the MTT assay.
The MTT assay is a colorimetric viability assay based on enzymatic reduction of the MTT molecule to formazan when it is exposed to viable cells. The outcome of the reduction is a color change of the MTT molecule. Absorbance measurements relative to a control determine the percentage of remaining viable cancer cells following their treatment with varying concentrations of a tested compound, which is translated to the compound anticancer activity and its IC50 values. The MTT assay is widely common in cytotoxicity studies due to its accuracy, rapidity, and relative simplicity.
Herein we present a detailed protocol for the synthesis of air sensitive metal based drugs and cell viability measurements, including preparation of the cell plates, incubation of the compounds with the cells, viability measurements using the MTT assay, and determination of IC50 values.

A method for synthesis of air-sensitive titanium and vanadium anticancer agents is described, along with the evaluation of their cytotoxic activity towards human cancer cell line by the MTT Assay.

Anticâncer metal Complexos: Síntese e Avaliação de citotoxicidade pelo ensaio MTT

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Synthesis and Purification of Iodoaziridines Involving Quantitative Selection of the Optimal Stationary Phase for Chromatography

The highly diastereoselective preparation of cis-N-Ts-iodoaziridines through reaction of diiodomethyllithium with N-Ts aldimines is described. Diiodomethyllithium is prepared by the deprotonation of diiodomethane with LiHMDS, in a THF/diethyl ether mixture, at -78 &#176;C in the dark. These conditions are essential for the stability of the LiCHI2 reagent generated. The subsequent dropwise addition of N-Ts aldimines to the preformed diiodomethyllithium solution affords an amino-diiodide intermediate, which is not isolated. Rapid warming of the reaction mixture to 0 &#176;C promotes cyclization to afford iodoaziridines with exclusive cis-diastereoselectivity. The addition and cyclization stages of the reaction are mediated in one reaction flask by careful temperature control.
Due to the sensitivity of the iodoaziridines to purification, assessment of suitable methods of purification is required. A protocol to assess the stability of sensitive compounds to stationary phases for column chromatography is described. This method is suitable to apply to new iodoaziridines, or other potentially sensitive novel compounds. Consequently this method may find application in range of synthetic projects. The procedure involves firstly the assessment of the reaction yield, prior to purification, by 1H NMR spectroscopy with comparison to an internal standard. Portions of impure product mixture are then exposed to slurries of various stationary phases appropriate for chromatography, in a solvent system suitable as the eluent in flash chromatography. After stirring for 30 min to mimic chromatography, followed by filtering, the samples are analyzed by 1H NMR spectroscopy. Calculated yields for each stationary phase are then compared to that initially obtained from the crude reaction mixture. The results obtained provide a quantitative assessment of the stability of the compound to the different stationary phases; hence the optimal can be selected. The choice of basic alumina, modified to activity IV, as a suitable stationary phase has allowed isolation of certain iodoaziridines in excellent yield and purity.

A protocol for the diastereoselective one-pot preparation of cis-N-Ts-iodoaziridines is described. The generation of diiodomethyllithium, addition to N-Ts aldimines and cyclization of the amino gem-diiodide intermediate to iodoaziridines is demonstrated. Also included is a protocol to rapidly and quantitatively assess the most appropriate stationary phase for purification by chromatography.

Síntese e Purificação de Iodoaziridines Envolvendo Quantitative Seleção do Optimal fase estacionária para cromatografia

The highly diastereoselective preparation of cis-N-Ts-iodoaziridines through reaction of diiodomethyllithium with N-Ts aldimines is described. ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

Síntese e caracterização de funcionalizados metal-organic frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis and Exfoliation of Discotic Zirconium Phosphates to Obtain Colloidal Liquid Crystals

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and engineers. Growth of such anisotropic nanocrystals through a simple chemical method is a challenging task. In this study, we fabricate discotic nanodisks of zirconium phosphate [Zr(HPO4)2&#183;H2O] as a model material using hydrothermal, reflux and microwave-assisted methods. Growth of crystals is controlled by duration time, temperature, and concentration of reacting species. The novelty of the adopted methods is that discotic crystals of size ranging from hundred nanometers to few micrometers can be obtained while keeping the polydispersity well within control. The layered discotic crystals are converted to monolayers by exfoliation with tetra-(n)-butyl ammonium hydroxide [(C4H9)4NOH, TBAOH]. Exfoliated disks show isotropic and nematic liquid crystal phases. Size and polydispersity of disk suspensions is highly important in deciding their phase behavior.

A two dimensional model material of discotic zirconium phosphate was developed. The inorganic crystal with lamellar structure was synthesized by hydrothermal, reflux, and microwave-assisted methods. On exfoliation with organic molecules, layered crystals can be converted to monolayers, and nematic liquid crystal phase was formed at sufficient concentration of monolayers.

Síntese e esfoliação da discotic Zircônio Fosfatos obter cristais coloidais líquidos

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

Síntese e determinação da estrutura de µ-conotoxina PIIIA isômeros com bissulfeto diferentes conetividades

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Solid-phase Synthesis of [4.4] Spirocyclic Oximes

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of solid-phase synthesis, regenerating Michael (REM) linker strategies, and 1,3-dipolar cycloaddition, a library of structurally similar heterocycles, both with and without a spirocyclic center, can be constructed. The main advantages of the solid-support synthesis are as follows: first, each reaction step can be driven to completion using a large excess of reagents resulting in high yields; next, the use of commercially available starting materials and reagents keep the costs low; finally, the reaction steps are easy to purify via simple filtration. The REM linker strategy is attractive because of its recyclability and traceless nature. Once a reaction scheme is completed, the linker can be reused multiple times. In a typical solid-phase synthesis, the product contains either a part of or the whole linker, which can prove undesirable. The REM linker is &#34;traceless&#34; and the point of attachment between the product and the polymer is indistinguishable. The high diastereoselectivity of the intramolecular 1,3-dipolar cycloaddition is well documented. Limited by the insolubility of the solid support, the reaction progression can only be monitored by a change in the functional groups (if any) via infrared (IR) spectroscopy. Thus, the structural identification of intermediates cannot be characterized by conventional nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Other limitations to this method stem from the compatibilities of the polymer/linker to the desired chemical reaction scheme. Herein we report a protocol that allows for the convenient production of spirocyclic heterocycles that, with simple modifications, can be automated with high-throughput techniques.

Here we present a protocol to demonstrate an efficient method for the synthesis of spirocyclic heterocycles. The five-step process utilizes solid-phase synthesis and regenerating Michael linker strategies. Generally difficult to synthesize, we present a customizable method for the synthesis of spirocyclic molecules otherwise inaccessible to other modern approaches.

Fase sólida síntese de [4,4] Spirocyclic oximas

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of ...

Synthesis of Esters Via a Greener Steglich Esterification in Acetonitrile

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the reaction is commonly performed using chlorinated or amide solvent systems, which are hazardous to human health and the environment. Our methodology utilizes acetonitrile as a greener and less hazardous solvent system. This protocol exhibits rates and yields that are comparable to traditional solvent systems and employs an extraction and wash sequence that eliminates the need for the purification of the ester product via column chromatography. This general method can be used to couple a variety of carboxylic acids with 1&#176; and 2&#176; aliphatic alcohols, benzylic and allylic alcohols, and phenols to obtain pure esters in high yields. The goal of the protocol detailed here is to provide a greener alternative to a common esterification reaction, which could serve useful for ester synthesis in both academic and industrial applications.

A modified Steglich esterification reaction was used to synthesize a small library of ester derivatives with primary and secondary alcohols. The methodology uses a non-halogenated and greener solvent, acetonitrile, and enables product isolation in high yields without the need for chromatographic purification.

Síntese de ésteres através de uma esterificação Steglich mais verde em acetonitrila

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the ...

Synthesis Method for Cellulose Nanofiber Biotemplated Palladium Composite Aerogels

Here, a method to synthesize cellulose nanofiber biotemplated palladium composite aerogels is presented. Noble metal aerogel synthesis methods often result in fragile aerogels with poor shape control. The use of carboxymethylated cellulose nanofibers (CNFs) to form a covalently bonded hydrogel allows for the reduction of metal ions such as palladium on the CNFs with control over both nanostructure and macroscopic aerogel monolith shape after supercritical drying. Crosslinking the carboxymethylated cellulose nanofibers is achieved using 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) in the presence of ethylenediamine. The CNF hydrogels maintain their shape throughout synthesis steps including covalent crosslinking, equilibration with precursor ions, metal reduction with high concentration reducing agent, rinsing in water, ethanol solvent exchange, and CO2 supercritical drying. Varying the precursor palladium ion concentration allows for control over the metal content in the final aerogel composite through a direct ion chemical reduction rather than relying on the relatively slow coalescence of pre-formed nanoparticles used in other sol-gel techniques. With diffusion as the basis to introduce and remove chemical species into and out of the hydrogel, this method is suitable for smaller bulk geometries and thin films. Characterization of the cellulose nanofiber-palladium composite aerogels with scanning electron microscopy, X-ray diffractometry, thermal gravimetric analysis, nitrogen gas adsorption, electrochemical impedance spectroscopy, and cyclic voltammetry indicates a high surface area, metallized palladium porous structure.

A synthesis method for cellulose nanofiber biotemplated palladium composite aerogels is presented.The resulting composite aerogel materials offer potential for catalysis, sensing, and hydrogen gas storage applications.

Método de síntese para celulose Nanofiber Biotemplated paládio composto Aerogéis

Here, a method to synthesize cellulose nanofiber biotemplated palladium composite aerogels is presented. Noble metal aerogel synthesis methods often ...