We thank O. Subach for providing the original H2B-PSmOrange plasmid and our fish facility team for fish care. We are grateful to the Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg for access to microscopy equipment and analysis software. We acknowledge the support of the Core Facility Live Cell Imaging Mannheim at the CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). This work was supported by the Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), University of Heidelberg to C.A.B. and the Medical Faculty Mannheim of the University Heidelberg and the DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 and 298/6-1) to M.C.

1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro transkripsiyon ve mRNA Saflaştırma <ol><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak Notl kısıtlama enzimi ile pCS2 plazmidi içeren H2B-PSmOrange linearize. Not: mRNA kontaminasyonu ve bozulmasını önlemek için eldiven ve laboratuvar kat olarak uygun korumaları kullanarak bir sonraki adımları gerçekleştirin. </li><li> üreticinin protokollerine göre olan bir PCR Saflaştırma kiti ya da fenol-kloroform göre yöntemler kullanılarak Doğrusal hale getirilen DNA saflaştırılır. </li><li> üreticinin talimatlarına göre Sp6-mRNA transkripsiyonu için doğrusallaştırılmış şablon DNA 1 ug kullanın. </li><li> 37 ° C&#39;de 10-20 dakika boyunca 1.0 U RNaz bilgilerini DNaseI eklenerek DNA çıkarın. </li><li> Bir RNA üreticinin protokolüne göre kiti temizlemek kullanarak mRNA temizleyin. </li><li> MRNA saflık ve konsantrasyon geliştirmek 6 ul sodyum asetat (3.0 M, pH 5.2) ve 150 ul% 96 ​​etanol eklenerek mRNA çökeltildi. m inkübeEn az 30 dakika boyunca ve 24 saat kadar, -20 ° C&#39;de ixed çözeltisi. </li><li> 4 ° C&#39;de 45 dakika boyunca 18,407 x g&#39;de çözelti eğirme mRNA toplayın. sıvı atılır ve 150 ul% 70 etanol içinde mRNA tekrar süspansiyon. Karıştırın ve 4 ° C sıcaklıkta ilave bir 15 dakika boyunca çözeltiden santrifüjlenir. , Sıvı atın buz üzerinde 5 dakika boyunca pelet kurutulur ve 20 ul ultra-saf RNazsız su içinde mRNA tekrar süspansiyon. </li><li> 100 mRNA seyreltme (99 ul ultra-saf RNazsız su içinde 1 ul mRNA) bir 1: fotometrik ölçümüyle mRNA konsantrasyonu ve saflığı değerlendirmek. </li><li> Kısa süreli depolama için, -20 ° C&#39;de mRNA çözüm tutun. Uzun süreli depolama için, -80 ° C mRNA tutun. </li></ol> Zebra balığı Embriyolar içine 2. H2B-PSmOrange mRNA Mikroenjeksiyon <ol><li> tg kullanarak enjeksiyon öncesi eşleyen gece çiftleşme kurmak (Foxd3: GFP); tg (FLH: GFP) çift transgenik balık (ya da diğer herhangi bir GFP transgenik balık). Bir boşluk koyarak ayrılmış balık bırakınAralarında çiftleşme kontrol etmek. </li><li> enjeksiyon sabah ayırıcı çıkarın ve 20 dakika süre ile balık eş sağlar. </li><li> süresi çiftleşme sırasında, 130 ug son konsantrasyona H2B-PSmOrange mRNA seyreltik / nl ve Microloader ucunu kullanarak mikroenjeksiyon, tüpün içine transferi 6 ul enjeksiyon çözeltisi (RNazsız su içinde). kalibre cam slayt ile enjeksiyon hacmi kontrol edin. 2 nl mRNA çözeltisi (260 pg) enjekte etmek için enjeksiyon basıncını ayarlayın. </li><li> 1x Embriyo (E3) orta içeren bir sterilize plastik petri kabına yumurta toplamak. </li><li> Bir plastik pastör pipet kullanarak bir enjeksiyon çanak 20 30 embriyoların transferi. </li><li> Tek hücreli aşamada 11&#39;de sarısı içine hücreye hücreye ya da hemen altında solüsyon içeren 2 nl mRNA enjekte edilir. </li><li> 1x E3 ortamı içeren bir petri-çanak içine Transferi enjekte embriyolar, döllenmemiş veya normal gelişim gösteren embriyolar kaldırmak ve 28 ° C&#39;de onları büyümek. Not: Işık koruma oembriyoların f deney boyunca gerekli değildir. </li><li> 1x E3 ortam içinde zebra balığı embriyolar kaldırın ve pigmentasyonu önlemek için gastrulasyon sonra 0.2 mM PTU (1-fenil-2 tiyoüre) ekleyin. Bakteriyel kontaminasyon tehlikesini en aza indirmek için günde iki kez orta değiştirin. </li></ol> 3. Embriyo Gömme <ol><li> GFP (yeşil) ve PSmOrange bir floresan lamba ve uygun emisyon filtreleri ile donatılmış bir binoküler mikroskop kullanılarak (kırmızı / turuncu) birlikte ifade embriyolar seçin. 1x E3 ortamı içeren steril bir petri kabına pozitif embriyolar aktarın. </li><li> Forseps 12 kullanarak bir stereomicroscope altında dechorionate embriyolar. </li><li> 1.0 ml ihtiva eden 1.5 ml bir tüp içinde transferi bir embriyo, bir kesme ucu pipet (P200) kullanarak, ultra saf su içinde hazırlanmış% 1.0 düşük erimeli agaroz (LM) önceden ısıtılmış. Not: 80 ° C LMA ısıtın ve embriyo yerleştirmeden önce, oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca soğumaya. </li><li> Bir içine 150 ul LMA embriyo transfercoverglass bölmeli ve ince bir plastik uç kullanılarak ters döndürülür konfokal lazer tarama mikroskobu A1R + (ya da uygun olan herhangi bir mikroskop) için tarif edilen deneyde embriyonun yönünü örneğin dorsal tarafına ayarlayın. LMA polimerize olduğunda, anestezi için 0.2 mM propiltiourasil&#39;in% 0.02 etil 3-aminobenzoat metansülfbnat (Tricaine) içeren balık su haznesi doldurun. </li><li> örnek görüntüleme önce Tricaine etkisini tespit etmek için 15 dakika bekleyin. Anestezi aydınlık aydınlatma ile donatılmış bir stereomikroskop kullanılarak izlenebilir embriyo hareketleri önler. Not: odaları iki kez tekrar edilebilir. </li></ol> 4. PSmOrange Fotoçevrim <ol><li> konfokal mikroskop altında örnek yerleştirin ve 488 nm ve sırasıyla GFP ve PSmOrange görüntüleme için 561 nm lazerler kullanarak photoconvert için bölgeyi tanımlamak için örnek tarayın. Not: ters sta üzerine ters konfokal lazer tarama mikroskobu A1R + kullanınge mikroskop görüntüleme yazılımı ile TiEcontrolled ve 488 nm, 561 nm ve Fotoçevrim ve görüntüleme için 640 nm lazer ile donatılmış. Bununla birlikte, uygulama kesinlikle uzun dönüşüm ve görüntüleme için bir lazer hattı mevcuttur Bu mikroskop ile sınırlı değildir. <ol><li> yerine 20X hava hedefi koydu (NA: 0.75; WD: 1,0 mm; FOV: 0.64 x 0.64 mm). </li><li> Fotoçevrim önce PSmOrange proteini tespit etmek için aşağıdaki mikroskop ayarları kullanın: 561 nm lazer, objektif üzerindeki odak düzleminde ölçülen 0.74 mW. Not: Bu, bu sistemde% 40 tekabül (Odak düzleminde ölçme etkili gücünü belirlemek için tek yoldur). değişebilir H2B-PSmOrange enjeksiyonları verimliliği gibi deneysel ihtiyaçlarına göre lazer gücünü ayarlayın. </li><li> ilgi alanı vurgulamak için yakınlaştırma faktörlerini ekleyin. Daha yüksek büyütme görüntü elde etme süresi ve bu nedenle fototoksisite azaltır. </li></ol></li><li> yapıyı kapsayan bir z-yığını Edinme488 nm ve sıralı mod (hat modu 1-&gt; 4) 561 nm lazerler kullanarak ilgi s. 1.0 ve 2.0 mikron arasında z-adım sabitleyin. Çizgi ortalama ve tarama frekans görüntü kalitesini optimize etmek için de kullanılabilir. </li><li> örnek Tarama ve photoconvert alanı vurgulamak için ilgi (ROI) aracı bölgeyi seçin. stimülasyon alanı olarak ROI sabitleyin. Fotoğraf Aktivasyon / Beyazlatma modülü seçin, ilgili kutucuğu işaretleyerek 488 nm lazer etkinleştirmek ve% 80 (objektif ölçülen 1 mW lazer gücü) için 488 nm lazer ayarlayın. 0.5 sn / Frame tarama hızını ayarlayabilirsiniz. </li><li> Fotoçevrim programı (ND Uyarım) açın ve Fotoçevrim ayarlarını belirtin. <ol><li> Fotoçevrim protokolünü belirtmek için &quot;Ekle&quot; komutu üzerine tıklayın. </li><li> &quot;Toplama / Stimülasyon&quot; menüsüne &quot;Toplama&quot; in &quot;Faz&quot; 1 Set ve görüntü sayısı &quot;Döngüleri&quot; menüsündeki Fotoçevrim önce elde edilecek göstermektedir. </li><li> St &quot;olarak ayarlayın&quot; Faz &quot;2imulation &quot;ve stimülasyon olayların sayısını girmek yapılacak. </li><li> Ayarı &quot;Faz&quot; 3 &quot;Faz&quot; 1. İsteğe bağlı için tarif edildiği gibi, görüntü alımı son turdan önce beklenecek süre girerek &quot;Faz&quot; 2 sonra bekleyen &quot;Faz&quot; takın. </li><li> Tüm parametreler ayarlandıktan sonra, uyarım ayarı uygulamak ve Fotoçevrim çalıştırın. Lazer gücü, değişebilir Fotoçevrim her tur için tarama ve adım sayısı sıklığı ve embriyoya embriyo farklıdır: edin. Bir ayar Tablo 1&#39;de gösterilmiştir ile başlayın. </li></ol></li><li> 488 nm, 561 nm ve yukarıdaki gibi ayarları uygulayarak 640 nm lazerler kullanarak nihai z-yığını edinin. (4.5 mW kadar) yüksek lazer gücünü kullanarak dönüştürülen PSmOrange görselleştirmek için 640 nm lazer ayarlayın. </li></ol> LMA 5. Dismount Embriyo <ol><li> mikroskop bölmeyi içeren embriyo çıkarın. Dikkatle agaroz u embriyo kaldırmakforseps şarkı. </li><li> Yeni bir steril plastik Petri-çanağı içine veya 1 x E3 ve 0.2 mM PTU içeren steril bir 6-yuvalı plaka içinde embriyo transferi. arzu edilen gelişme aşamasına kadar 28 ° C &#39;de embriyo inkübe edin. </li></ol> 6. Photoconverted PSmOrange proteini ifade eden hücrelerin kaderini analiz <ol><li> nokta 3.3 ve 3.4 bölümünde anlatıldığı gibi embriyo Yeniden embed. </li><li> konfokal mikroskop altında örnek yerleştirin ve ilgi (488 nm) GFP transgenik yapısında photoconverted hücreleri (640 nm) tanımlamak için örnek tarayın. </li><li> 488 nm, 561 nm ve sıralı mod (hat modu 1-&gt; 4) 640 nm lazerler kullanarak ilgi yapıları kapsayan bir z-yığını edinin. 1.0 ve 2.0 mikron arasında z-adım sabitleyin. Çizgi ortalama ve tarama frekans görüntü kalitesini optimize etmek için de kullanılabilir. </li><li> , Burada ko-ifade GFP ve photoconverted protein hücreleri belirlemek için, aşağıdaki yöntemlerden birini kullanabilirsiniz. <ol><li> Özel yapım otomatik Fiji GörüntüJ Makro 3 <ol><li> Convolve &quot;GaussianBlur&quot; eklentisi kullanarak orijinal yığın (→ Süreç → GaussianBlur → Filtreler) ve &quot;Görüntü Hesaplama&quot; eklentisi (→ Süreç → Görüntü Hesaplama) kullanarak orijinal pürüzsüz yığınları çıkarmak. ilgi yapılarını görselleştirmek ve analiz için hesaplama süresini azaltmak için bu adımı kullanın. </li><li> photoconverted hücreleri vurgulamak amacıyla yeşil ve uzak-kırmızı kanallara özgü eşikler uygulayın (→ Görüntü → → Eşiği ayarlayın). Uygun bir ayar ile eşik alanlarını tespit etmek için &quot;Parçacıklar Analiz&quot; aracını kullanın (→ Parçacıklar Analiz → Analiz). </li><li> &quot;Görüntü Hesaplama&quot; eklentisi açın ve sarı (→ Süreç → Görüntü Hesaplama) yeşil ve uzak-kırmızı kanalda örtüşen ROI&#39;ları görüntüler. </li></ol></li><li> 3D veri değerlendirme için mikroskop görüntüleme yazılımı <ol><li> yığını görüntülemek(3D Görselleştirme Menü → göster Ses Görünüm →) göstermek hacmi görünümü seçeneğini kullanarak 3D. Yeşil, kırmızı ve uzak-kırmızı kanalları seçmek parlaklık ve kontrast ayarı ve photoconverted alanı (Şekil 1) vurgulamak için 3D yığını kırpmak için grafik arayüzü kullanın. Not: Veri görüntü analizi için ortak yazılımların çoğu mevcuttur analiz etmek için benzer yöntemler. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development.">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (4350), (2012).</li><li>Subach, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoswitchable+orange-to-far-red+fluorescent+protein,+PSmOrange.">A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange.</a> Nature Methods. 8, 771-777 (2011).</li><li>Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ventral+habenulae+of+zebrafish+develop+in+prosomere+2+dependent+on+Tcf7l2+function.">The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function.</a> Neural Development. 8, 19 (2013).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).</li><li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mKikGR,+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein.">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3, e3944 (2008).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 6, 153-159 (2009).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297, 1873-1877 (2002).</li><li>Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+monomeric+photoactivatable+red+fluorescent+protein+for+two-color+super-resolution+sptPALM+of+live+cells.">Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.</a> J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Concha, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+tissue+interactions+across+the+dorsal+midline+of+the+forebrain+establish+CNS+laterality.">Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality.</a> Neuron. 39, 423-438 (2003).</li><li>Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+conversion+of+eGFP-+into+Gal4-transgenic+lines+in+zebrafish.">CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish.</a> Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).</li><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Research. 24, 142-153 (2014).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy.">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

floresan gazetecilere taşıyan transgenik embriyolar embriyo gelişimini anlamak için temelde yardımcı olmuştur. Bununla birlikte, özellikle yapıların belirli bir görselleştirme kolaylaştırmak için promotörler için gerekli ihtiyaç vardır. Onların yokluğunda, araştırmacılar kendi ilgi yapısının kökeni ve gelişimi hakkında bilgi edinmek için bu tür floresan proteinleri Fotoçevrim gibi teknikler güveniyor. Bu da onun gelişiminde rol oynayan moleküler mekanizmaları tanımlamak için önemli bir ön koşuldur. Zebra balığı Alanında Teknik gelişmeler artık yaklaşımı 14,15 bir CRISPR-Cas9 aracılı vuruş kullanan örneğin transgenik, photoconvertible proteinlerde FP yerine izin verir. Ancak, bu teknik, nispeten zaman alan ve her zaman başarılı değildir. Buna karşılık, ubiquitously uygulama GFP H2B-PSmOrange ve muhtemelen diğer transgenik arka dile em yoluyla hücrelere takip etmek bir düz-İleri tekniktirbryonic gelişme. Örneğin, Zebra balığı ventral habenulae kökeni, omurgalıların dorsal diensefalon korunmuş sinir iletim sisteminin bir parçası, son zamanlarda ve dolayısıyla gelişmenin ardındaki genetik kaskad ortaya çıkarılmıştır kadar zor olmuştur. Göç hücreleri takip PSmOrange sistemi ve uzun vadeli time-lapse analizi kullanarak, sol ve epifiz sağ bitişik Originate dorsal habenular çekirdekler, aksine, ventral habenular nöronlar talamus 3 bu bölgeye posterior geliştirmek olduğunu gösterebilir. Bu bilgi bize sonra ventral habenular nöron gelişimi için aşağı gen Tcf7l2 sinyalizasyon kanonik Wnt hayati işlevini tanımlamak için izin verdi. photoconvertible PSmOrange sisteminin uygulanması hızlı, basit ve embriyolar aydınlatma önce kuvvetli protein ifadesi için seçilebilir photoactivatible protein üzerinde bir avantaja sahiptir. sentetik mRH2B-PSmOrange NA şifreleyen her yerde her zaman tüm çekirdeklerde turuncu flüoresan proteini ifade etmek üzere GFP transgenik embriyo enjekte edilir. Bu enjeksiyonu üzerine hiç bir yan etkisi bulunan olmamış ve protein, en az 96 saat boyunca stabildir. Protein daha sonra 488 nm eksitasyon lazer kullanarak ROI GFP transgenik hücrelerde photoconverted, embriyo daha sonra yaklaşık 48 saat içinde hücreleri ihtiva eden artık uzak-kırmızı flüoresan protein için analiz edilebilir. Koşullar embriyo gelişim evresi ve hedef dokuya bağlı olarak değişebilir başarılı Fotoçevrim izlemek için çok önemlidir. mikroskop görüntüleme yazılımı öncesi ve Fotoçevrim sonra (kırmızı ve uzak-kırmızı yeşil) her kanalın bir görüntü kazanır. Fotoçevrim etkinliği öncesi ve sonrası Fotoçevrim farklı kanallar arasında ROI ortalama yoğunluğu floresan ölçüm değerlendirilebilir. Hiçbir uzak-kırmızı floresan Fotoçevrim reklamın hemen sonra tespit edilirseFotoçevrim arasında ditional mermi tatbik edilmelidir. GFP ağartma Fotoçevrim sonra sık görülür. Bununla birlikte, transjenik floresan protein sürekli için yaklaşık 2 saat içinde, bu sorunun üstesinden gelmektedir. Fiji ImageJ için özel yapılmış makro hücreleri photoconverted proteini birlikte sentezleyen ve transgenik GFP 3 kullanılabilir belirlenmesini kolaylaştırmak için. ayrıca bu prosedürü basitleştirecek H2B-PSmOrange ifade eden stabil transgenik hatlarının gelecek kurulması. Ayrıca doku rejenerasyonu gibi alanlarda araştırma ilginç bir değere sahip olabilir 4 gün sonra döllenme sonrası gelişimsel olayların analizini kolaylaştıracaktır. Buna ek olarak, maternal ifade PSmOrange transgenik ve zaman atlamalı görüntüleme 16 kombinasyonu tek bir hücre düzeyinde gastrulasyon önce başlayan hücre göçmen olayları araştıran için güçlü bir araçtır olacak. Diğer uygulamalar f ile H2B nükleer etiketinin değişimini içerebilirveya örneği, GAP43 Gelişmekte olan embriyoda hücre zarlarını ve potansiyel aksonlar görselleştirmek için. Bu tekniğin bir sınırlama zigotik proteinin, sadece gastrulasyon sonra ifade edilecek başlar ve bu nedenle Gastrulasyon süreçlerin analiz için geçerli değildir olmasıdır. Ayrıca, embriyo derin bulunduğu hücrelerdeki protein photoconvert oldukça zor olduğu göz önünde bulundurulmalıdır. Fotoçevrim ayarları yüksek lazer gücü ve dikkatle takip edilmesi gereken doku hasarı ile sonuçlanabilir Fotoçevrim için gerekli nispeten uzun bir uyarım süresi olarak uyarlanmalıdır.

Exponentially improving imaging techniques allow following developmental processes over time periods of up to about four consecutive days3. In zebrafish and many other animal model systems, specific cells, tissues, axonal or vascular structures are marked by transgenic green or sometimes red or yellow fluorescent proteins to facilitate visualization. However, in most transgenic lines the transgene is not specifically expressed in the cells of interest but also additional structures, which hinders the precise tracking of for instance single cells or groups of cells.
Fluorescent photoconvertible proteins are well suited for cell tracking during embryonic development. The prerequisites for the application of such proteins are a long-lived nature, a well-separated emission range upon conversion and bright fluorescence. Available photoconvertible proteins comprise those that change their emission range upon conversion such as Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 or Dendra27 and others which are only fluorescent when photoactivated (PAmCherry8, PAGFP9 or PATagRFP10). Their applications to track cells in existing FP-transgenic animals are however limited as they often involve a green fluorescent state or do not fulfill all of the above criteria. Only recently, Subach and colleagues reported the PSmOrange protein, which changes its emission from orange/red to far red upon photoconversion and was successfully applied in cells in culture and cultured cells injected into mice2.
To investigate the protein's suitability for cell tracking in a living embryo, we generated an expression construct for the microinjection of nuclear-tagged H2B-PSmOrange into zebrafish embryos. We find that the protein fulfills all prerequisites for successful cell tracking in GFP transgenic backgrounds during the first 4 (and possibly more) days of zebrafish embryonic development. During this time, most of the cell migratory events are completed in fish making the PSmOrange system an excellent addition to the zebrafish toolkit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="821">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:233px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy MiniElute Cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic Pasteur</td>
			<td>alpha laboratories</td>
			<td>LW4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Original H2B-PSmOrange Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>31920</td>
			<td>The plasmid described in the paper is available in the Carl lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FemtoJet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247 000.013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps (5 Inox)</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>2-1633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td align="right">155382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon A1R+</td>
			<td>Nikon GmbH Germany</td>
			<td>No Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon PLAN Apo &#955; 20x air objective&#160;</td>
			<td>Nikon GmbH Germany</td>
			<td>No Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)</td>
			<td>Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging</td>
			<td>No Number</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking cells in gfp-transgenic zebrafish using the photoconvertible psmorange system

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

Şekil 1, PSmOrange Fotoçevrim sisteminin bir örneğini göstermektedir. epifiz kompleks omurgalı dorsal diensefalon korunmuş bir yapıdır. diğer omurgalılarda olduğu gibi, bu karmaşık diensefalon ve sol parapineal hücrelerin merkezinde epifiz organı oluşur. Zarif ama zaman alıcı uncaging deneyler parapineal hücreler epifiz organı 13 ön kısmında menşeli olduğu görüldü. TG (Foxd3 GFP); tg (FLH: GFP) transgenik embriyolar, epifiz ve parapineal hem hücrelerin gelişimi sırasında etiketlenir. PSmOrange sisteminin uygunluğunu değerlendirmek için bildirilen pineal karmaşık gelişimini üretmek için bu embriyoları kullandı. PSmOrange, H2B-PSmOrange nükleer formunu kodlayan 260 fig mRNA, her hücre çekirdeğinde proteinini ifade etmek için tek hücreli aşamada, çift transgenik embriyoların içine enjekte edildi. Enjekte embriyolar 24 saat sonra fertilizat kadar 28 ° C&#39;de inkübe edildiiyon (hpf), GFP ve güçlü H2B-PSmOrange ifadesi için seçilen ve alt yönelik sırt tarafında bir bölmeli lamel sisteminde LMA gömülü. numune mikroskobu görüntüleme yazılımı tarafından kontrol edilir ve 488 nm, 561 nm ve 640 nm lazer ve Fotoçevrim ve izleme için 20X hava amacı ile donatılmış bir ters konfokal lazer tarama mikroskobu altında yerleştirildi. Epifiz ön bölümünde iki hücre kümeleri photoconverted ve hemen (Şekil 1A - F) görüntülendi. Photoconverted hücreler 640 nm lazer (çok kırmızı - Şekil 1C) kullanılarak görüntülendi olabilir, ancak 561 nm lazer ile (kırmızı / turuncu - Şekil 1B). Bu hücrelerde GFP tanımı ilk olarak da bağlı (Şekil 1A, 1B, 1F) ışıkla ağartma indirgendi. 52 hpf GFP ve H2B-PSmOrange photoconverted H2B-PSmOrange proteini ifade eden hücrelerde tespit edilmiştir (Şekil </strong&gt; 1A &#39;- F&#39;). Gerçekten de, bu hücrelerin birkaç beyin sol tarafında parapineal oluşturulmuş (Şekil 1A ok uçları &#39;- f). Bu sonuç parapineal hücre kökenli önceki çalışmalarla uyumludur ve yaşam omurgalı embriyoda PSmOrange tekniğinin uygulanabilirliğini göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53604/53604fig1.jpg" /> . Zebrafish embriyolar yaşayan PSmOrange Fotoçevrim sistemini kullanarak parapineal hücre orijinini belirlemek Şekil 1. (A - F &#39;) bir tg dorsal diensefalon odaklanmış üstüne anterior Dorsal görünümleri (Foxd3: GFP); tg (FLH: GFP) transgenik embriyo de epifiz bezleri (P) ve parapineal hücreleri (s) vurgulayarak (A - F) 26 hpf hemen sonra Fotoçevrim ve (A &#39;- F &amp; #<html> 39;) 26 saat sonra 52 hpf. Embriyo mRNA H2B-PSmOrange kodlayan enjekte edildi. resimleri göstermek 3D rekonstrüksiyon. (A, A &#39;) transgenik GFP (B, B&#39;) ifadesi değildir Fotoçevrim (uzak-kırmızı bir kanal) sonra H2B-PSmOrange (kırmızı kanal) ve (C, C &#39;) dönüştürülür. Beyaz noktalı çevreler kırmızı / turuncu floresan yoksun Fotoçevrim alanı, vurgulayın. (D, D &#39;) her üç kanal birleştirme (yeşil, uzak-kırmızı, kırmızı), (E, E&#39;) kırmızı ve uzak-kırmızı kanalları ve (F, F &#39;) yeşil ve uzak-kırmızı kanalları. (A&#39;-F &#39;) Beyaz ok başları yeşil, turuncu / kırmızı ve uzak-kırmızı floresan göstermek parapineal hücrelerin yerini vurgulayın. (AF &#39;) ölçek çubuğu her resmin sağ alt köşesinde görüntülenir.Güncelle / 53604 / 53604fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Faz </td><td> Döngü Sayısı </td><td> aktif Lazerler </td></tr><tr><td> Toplama </td><td> 1 döngü </td><td> 488 nm, 561 nm, 640 nm </td></tr><tr><td> Uyarım </td><td> 15-30 devir </td><td> 488 nm </td></tr><tr><td> olgunlaşma </td><td> 1 dakika </td><td> # </td></tr><tr><td> Toplama </td><td> 1 döngü </td><td> 488 nm, 561 nm, 640 nm </td></tr></tbody></table> Tablo 1: H2B-PSmOrange Fotoçevrim koşulları.

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System at JoVE.com

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

tracking-cells-gfp-transgenic-zebrafish-using-photoconvertible

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.5K Görüntüleme.  Heidelberg University. We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Video: Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Larva Zebra balığı Skin bir İndüklenebilir Gal4 / UAS İfade Sisteminin Kullanılması doğuştan gelen bağışıklık ve preneoplastik Hücre Etkileşimleri Canlı Görüntüleme

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Gelişim Biyolojisi

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Endotel Kolonisi Oluşturan Hücreler ve Mezenkimal Kök Hücreler tarafından Oluşturulan Eş Kültür Sfaoidler Kullanılarak Üç Boyutlu Anjiyogenez Tsay Sistemi

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, proliferation, and differentiation. Time-lapse imagining offers unique insight to the behavior of cells during eye development because it allows us to visualize oculogenesis in vivo. Zebrafish are an excellent model to visualize this process due to their highly conserved vertebrate eye and their ability to develop rapidly and externally while remaining optically transparent. Time-lapse imaging studies of zebrafish eye development are greatly facilitated by use of the transgenic zebrafish line Tg(rx3:GFP). In the developing forebrain, rx3:GFP expression marks the cells of the single eye field, and GFP continues to be expressed as the eye field evaginates to form an optic vesicle, which then invaginates to form an optic cup. High resolution time lapse imaging of rx3:GFP expression, therefore, allows us to track the eye primordium through time as it develops into the retina. Lightsheet microscopy is an ideal method to image ocular morphogenesis over time due to its ability to penetrate thicker samples for fluorescent imaging, minimize photobleaching and phototoxicity, and image at a high speed. Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software. The resulting dataset can provide valuable insights into the process of ocular morphogenesis, as well as perturbations to this process as a result of genetic mutation, exposure to pharmacological agents, or other experimental manipulations.

Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software.&#160;

Oküler Morfogenezi Lightsheet Microscopy ile rx3:GFP Transgenik Zebra Balığı Kullanarak Görselleştirme

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...