Mükemmel teknik yardım için P. Käse ve T. Schmidt-Wöll&#39;e minnettarız. Bu çalışma, DFG (Alman Araştırma Vakfı )&#39;nın TRR81 ve Heisenberg programı (BO 1639 / 5-1), Freiburg&#39;daki Max Planck Topluluğu ve EXC 294 ortak araştırması hükmü ve Cardio Pulmoner Sistem için Mükemmellik Kümesi tarafından desteklendi. (ECCPS), Giessen&#39;de TB&#39;ye

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm tamponlar ve ortam Tablo 1&#39;de listelenmiştir . Gün 1 ve 2 1. Hücrelerin Çapraz Bağlanması <ol><li> 6-kuyucuklu bir plakadan fare T-hücrelerini, 4 ° C&#39;de ve ~ 271 x g&#39;de 5 dakika boyunca 50 mL tüp ve santrifüje aktarın. 30 mL IMDM hücre kültürü ortamında hücre topağını süspanse edin ve bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın. </li><li> Yeni 50 mL&#39;lik tüplere 20 x 10 6 hücrelik kısımlar toplayın. </li><li> % 1 final konsantrasyona doğrudan formaldehit (FMA) hücre kültürü ortamı ekleyin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Dikkat: FMA inhale edildiğinde toksiktir, bu nedenle duman kaputunun altında çalışın ve uygun koruyucu ekipman giyin. Ayrıca, lütfen ev sahibi kurumun kurallarına göre FMA atıklarını ele alınız. </li><li> 1/8 hacim 1 M glisin, pH 7.0 ekleyin ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 5 dakika süreyle santrifüj ederek hücreleri peletleyinMin, 4 ° C&#39;de ve ~ 271 xg&#39;de yıkanır ve 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanır. </li><li> Hücre pelletini 1 mL PBS ile yıkayın ve 1.5 mL tüplere aktarın. </li></ol> 2. Hücre Lizizi ve Kromatin Kesme <ol><li> Hücre peletini 1 mL SDS liziz tamponuna tekrar süspanse edin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. </li><li> Her bir numuneyi sonikasyon tüpüne aktarın ve Tablo 2&#39;de belirtilen ayarlara göre odaklanmış bir ultrasonatör kullanarak kesme işlemi yapın . </li><li> Makaslamadan sonra, örnekleri 1.5 mL tüplere aktarın ve 4 ° C&#39;de ve ~ 18.000 x g&#39;de 10 dakika santrifüjleyin. </li><li> Süpernatanı yeni tüplere aktarın. </li><li> Adım 3&#39;e göre kesilme verimliliğini belirlemek için 50 μL toplayın ve sıvı azot içinde kesilmiş lisatı derhal dondurun. Lizatı tek kullanımlık alikotlar halinde -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 3. Kesme Verimliliğinin Belirlenmesi <ol><li> 50 ul 50 ul elüsyon tamponu ekleyin ve #181 L; her bir kesilmiş lizatın l&#39;si ve gece boyunca 65 ° C&#39;de çalkalayarak inkübe edin. </li><li> 100 uL TE tampon ve 4 μL 10 mg / mL RNaz A (0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin. Karıştırıp 37 ° C&#39;de 2 saat çalkalayarak inkübe edin. </li><li> Her bir numuneye 2 mcL 20 mg / mL proteinaz K (0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin ve sallayarak 55 ° C&#39;de 2 saat inkübe edin. </li><li> Her numuneyi, fenol / kloroform / izoamil alkol ekstraksiyonu için uygun bir jel tüpüne aktarın; Üreticinin talimatlarına göre tutun. </li><li> 200 ul fenol / kloroform / izoamil alkol (25: 24: 1) ilave edin ve tüpleri sallayın. 24 ° C ve ~ 16000 xg&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve üst fazı yeni tüplere aktarın. Dikkat: Fenol, kloroform ve izoamil alkol inhale edildiğinde toksiktir ve koroziftir; Davlumbazın altında çalışın ve uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Ayrıca, fenol, kloroform ve izoamil alkollü atıkları idare edinEv sahibi kurumun kurallarına göre. <ol><li> Tekrarla. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre aşağıdaki değişikliklerle saflaştırma sütunları kullanarak DNA&#39;yı saflaştırın: <ol><li> Zar iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra kalan etanolün buharlaşması için tüp oda sıcaklığında 2 dakika açık bırakılmalıdır. </li><li> Elüsyon için, oda sıcaklığında 1 dakika inkübe 50 mcL H 2 O ekleyin, düzgün membran ıslak 1 s tüp ve 1 dakika için santrifüjleme ile DNA elute önce 1 dakika oda sıcaklığında inkübe 24 ° C ve ~ 17.900 x g. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre yüksek hassasiyetli bir kit kullanarak saflaştırılmış DNA&#39;yı bir florometre üzerinde ölçün. </li><li> % 1.8 agaroz jel üzerinde yaklaşık 500 ng saflaştırılmış DNA&#39;yı ve yüksek hassasiyetli bir kit kullanarak bir elektroforez sistemi üzerinde yaklaşık 1 ng analiz edin. Not: beklenen sizE DNA parçaları 200 ila 500 bp arasındadır. </li></ol> 3. ve 4. gün 4. İmmunopresipitasyon <ol><li> 1 hacim kesilmiş lizat, 5 hacim seyreltme tamponu ile seyreltin. </li><li> Soğuk odada dönerken 30 μL / mL protein A agaroz boncuk ( Ek A&#39;ya göre hazırlanmıştır) ile 30 dakika süreyle önceden temizleyin. </li><li> ~ 750 x g&#39;de 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Girişin% 10&#39;unu toplayın ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> İstenen lizat miktarını yeni tüplere koyun (ayrıntılar için Tablo 3&#39;e bakın). Her bir tüpe istenen antikorları ekleyin (ayrıntılar için Tablo 3&#39;e bakın) ve gece boyunca 4 ° C&#39;de döndürün. </li><li> 40 μL protein A boncuk ekleyin ve döndürürken 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Boncukları 1 mL düşük tuzlu tampon, yüksek tuzlu tampon, LiCl tampon ve TE tampon ile yıkayın (her yıkama için döndürürken 5 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin ve santrifüj edin4 ° C&#39;de ve ~ 950 xg&#39;de 3 dakika). Ayrıntılar için Tablo 3&#39;e bakın. </li><li> Elüsyon tampon 110 uL ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe, her 2 dakikada vorteksleme. </li><li> 4 ° C&#39;de ve ~ 950 xg&#39;de 3 dakika boyunca santrifüjleyin ve yüzer kısım 100 uL tekrar yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın. </li><li> 4.7-4.8 adımlarını 100 uL elüsyon tamponuyla tekrarlayın ve eluatları birleştirin. Örnekleri girmek için elüsyon tamponu 200 μL&#39;ye kadar ekleyin. </li><li> Bütün örnekleri gece boyunca 65 ° C&#39;de çalkalayarak inkübe edin. </li></ol> 5. Gün 5. DNA Saflaştırması <ol><li> Her eluat için 200 uL TE tamponu ve 10 mg / mL RNaz A (8 μL, 0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin. Karıştırıp 37 ° C&#39;de 2 saat çalkalayarak inkübe edin. </li><li> Her bir eluat için 4 μL 20 mg / mL proteinaz K (0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin ve çalkalamayla 55 ° C&#39;de 2 saat inkübe edin. </li><li> Her bir örneği jöle haline getirinFenol / kloroform / izoamil alkol ekstraksiyonu için uygun tüp; Üreticinin talimatlarına göre tutun. </li><li> 400 μL fenol / kloroform / izoamil alkol (25: 24: 1) ilave edin ve tüpleri sallayın. 24 ° C&#39;de ve ~ 16.000 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Üst fazı yeni tüplere aktarın. Dikkat: Fenol, kloroform ve izoamil alkol inhale edildiğinde toksiktir ve koroziftir; Davlumbazın altında çalışın ve uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Ayrıca, ev sahibi kurumun kurallarına göre fenol, kloroform ve isoamil alkol atığını ele alınız. <ol><li> Tekrarla. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre aşağıdaki değişikliklerle saflaştırma sütunları kullanarak DNA&#39;yı saflaştırın: </li><li> Zar iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra kalan etanolün buharlaşması için tüpleri oda sıcaklığında 2 dakika açık bırakın. </li><li> Elüsyon için, 50 μL H 2 O ekleyin, oda temperatuasında inkübe edin1 dakika boyunca tekrarlayın, zarları düzgün ıslatmak için tüpleri 1 s döndürün ve 1 dakika boyunca 24 ° C&#39;de ve ~ 17.900 x g&#39;de santrifüje tabi tutarak DNA&#39;yı elute etmeden önce oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+landscape+and+transcription+factors+in+T+cell+programming.">The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming.</a> Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).</li><li>Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transformations+of+genome-wide+epigenetic+marking+and+transcriptional+control+establish+T+cell+identity.">Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity.</a> Cell. 149 (2), 467-482 (2012).</li><li>Cauchy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+recruitment+of+Ets1+to+both+nucleosome-occupied+and+-depleted+enhancer+regions+mediates+a+transcriptional+program+switch+during+early+T-cell+differentiation.">Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation.</a> Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).</li><li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+initiation+platforms+and+GTF+recruitment+at+tissue-specific+enhancers+and+promoters.">Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).</li><li>Pekowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4+tri-methylation+provides+an+epigenetic+signature+of+active+enhancers.">H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers.</a> EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).</li><li>Vanhille, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+quantitative+assessment+of+enhancer+activity+in+mammals+by+CapStarr-seq.">High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq.</a> Nat Commun. 6, 6905 (2015).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression.">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li><li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types.">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li><li>Ostuni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+enhancers+activated+by+stimulation+in+differentiated+cells.">Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells.</a> Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).</li><li>Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+regulation+at+Notch+target+genes.">Dynamic chromatin regulation at Notch target genes.</a> Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).</li><li>Liefke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylase+KDM5A+is+an+integral+part+of+the+core+Notch-RBP-J+repressor+complex.">Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex.</a> Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).</li><li>Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+helicase+Ddx5+and+the+noncoding+RNA+SRA+act+as+coactivators+in+the+Notch+signaling+pathway.">RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).</li><li>Oswald, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phospho-dependent+mechanism+involving+NCoR+and+KMT2D+controls+a+permissive+chromatin+state+at+Notch+target+genes.">A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes.</a> Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).</li><li>Arrigoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+chromatin+research:+a+simple+and+universal+method+for+ChIP-seq.">Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq.</a> Nucl Acids Res. 44 (7), e67 (2016).</li><li>Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+interactions+involved+in+Th+cell+memory.">Cellular interactions involved in Th cell memory.</a> J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).</li><li>White, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+better+cell+lines+for+making+hybridomas+expressing+specific+T+cell+receptors.">Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors.</a> J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).</li><li>Ghisletti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+enhancers+controlling+the+inflammatory+gene+expression+program+in+macrophages.">Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages.</a> Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity.">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li><li>Fenouil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+islands+and+GC+content+dictate+nucleosome+depletion+in+a+transcription-independent+manner+at+mammalian+promoters.">CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters.</a> Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).</li><li>Hein, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+methylation+of+Notch1+controls+the+amplitude+and+duration+of+the+Notch1+response.">Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response.</a> Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).</li></ol>

Yazarların rekabette finansal çıkarları yoktur.

ChIP, proteinlerin veya bunların PTM&#39;lerinin spesifik genomik bölgede zenginleşip zenginleşmediğini araştırmak için geçerli bir tekniktir. ChIP test sonuçları biyolojik veya teknik nedenlerden dolayı genellikle yorum yapmakla zorlanır. Biyolojik nedenler çok katlıdır ve proteinlerin DNA&#39;ya zayıf veya dolaylı olarak bağlanmasını içerir. Sınırlı antikor özgüllüğü ve verimsiz hücre lizisi veya kromatin kesme gibi teknik sınırlamalar da vardır. Bir sorun giderme kılavuzu ( Çizelge 5 ), okuyucunun ChIP analizlerinde karşılaşılabilecek sorunları çözmesine yardımcı olabilir. Soğutma odaklı bir ultrasonator cihazından yararlanan bu protokol, olgunlaşmış bir fare T hücre çizgisinin kromatinini verimli bir şekilde kesmesine izin verir. Protokolün asıl kritik basamağı, her zaman her hücre tipi için optimize edilmiş olması gereken kromatin kesilmesi ile temsil edilir. Hücrelerin sayısını ve sonikasyon çevrimlerinin sayısını değiştirmek önerilir. Ayrıca, o<html> SDS liziz tamponu ile buz üzerinde hücrelerin lizizi sırasında oluşabilecek örneklerdeki SDS çökeltilerinin varlığı olumsuz etkilenir. Bu durumda, SDS çökeltilerinin varlığını azaltmak için numuneyi oda sıcaklığında birkaç dakika boyunca lüsizasyondan sonra inkübe etmek en iyisidir. 200 ile 500 bp arasında kesilmiş fragmanları elde etmek için protokolü optimize etmek ve immüno çökeltme işlemine başlamadan önce numunelerin kesilme kalitesini daima değerlendirmek önerilir. Ayrıca sabitleme zamanı, antikor ve / veya hücrelerin miktarı ve yıkama koşulları, her bir antikor için optimize edilmelidir. Bir ChIP prosedürünü başarılı bir hale getirirken bir diğer kritik adım, antikorun seçilmesidir, çünkü düşük özgünlük antikorları immüno çökelmenin etkinliğini önemli ölçüde azaltır. Daha önce, piyasada bulunan çeşitli antikorların özgüllüğünün değerlendirilmesine izin verilen birleştirilmiş bir kalite testi prosedürü<html> Ss = &quot;xref&quot;&gt; 19. Tarama hattı, dot blot, Western blot ve ChIP&#39;e dayanılarak ChIP 19 için uygun yüksek kaliteli reaktiflerin bir listesi sağladı. Daha yakın zamanlarda, ticari olarak temin edilebilen birkaç antikorun spesifitesi, antikor özgüllüğü üzerine bir veri tabanının oluşturulmasına izin veren, yüksek yoğunluklu histon peptid mikrodizi platformları kullanılarak değerlendirildi. Okuyucu ChIP deneyleri için kullanılabilecek en spesifik antikorları tanımlamak için bu yararlı aracı kullanabilir. Bu protokol, birincil T hücreleri için test edilmemiştir ve bu durumda okuyucu, birincil T hücreleri 3 , 4 ve 21 üzerinde ChIP&#39;yi başarılı bir şekilde gerçekleştiren yayınlanmış protokollere başvurmalıdır. Özellikle, bu protokol bir fare endojen hücre hattının yanı sıra bir fare progenitör T-hücresi hattı üzerinde ChIP&#39;i başarıyla yerine getirmek için kullanılmıştır. Ove_content &quot;&gt; Histon işaretlerinin analizi için her immüno çökelme için 5 x 106 hücre kullanılmalıdır.Bu protokol TF&#39;ler veya kofaktörler üzerinde ChIP gerçekleştirmek için bazı optimizasyonlarla birlikte de uygun olabilir, bu nedenle hücre sayısını artırmak en iyisidir Bu vakalarda immüno çökeltme için kullanılmıştır Her deney için gerekli hücre sayısına ulaşmak için, dilimlenmiş lizatın daha küçük kısımları seyreltme tamponu içerisinde kromatin seyreltmeden önce bir araya toplanabilir. Bu protokol doğrudan DNA&#39;ya bağlanmayan endojen proteinler üzerinde ChIP gerçekleştirmek üzere modifiye edilebilir. Bu durumda, protein-protein çapraz bağlayıcılarla ( örneğin dimetil adipimidat, DMA) ön fiksasyon gerekebilir (daha fazla bilgi için Ek B&#39;ye bakınız). Kofaktörlerde ChIP&#39;in başarılı bir performansı, daha önce bir biotin etiketi ile kaynaştırılmış aşırı ifade eden proteinler tarafından yapılmıştır. Bu durumda, protein streptavidin-konjuga ile saflaştırılmıştırTed manyetik boncuklar ve DMA ile ön fiksasyon yapıldı 22 .

Gelişme, farklılaşma ve homeostaz, kromatin yapısını modüle eden ve bu nedenle belirli bir genin bir hücre ve zamana özgü biçimde aktive edilip engellenmediğini belirleyen olayları bildiren belirli gen ekspresyon programlarına bağlıdır. T-hücresi gelişimi sırasında, birkaç ara evreden 1 geçerek çift negatif (DN) ila tek pozitif (SP) haldeki T hücresi öncüllerinin olgunlaşmasını doğru bir şekilde belirlemek için spesifik gen ekspresyon programları oluşturulmalıdır. Gen ekspresyon programının T hücresi gelişimi sırasında dinamik olarak nasıl düzenlendiği, önceki laboratuvarlarda 2 , 3 , 4 , 5 , 6 numaralı laboratuvarlar tarafından geniş çapta araştırılmıştır. Histonların post translasyonel modifikasyonları (PTM&#39;ler) ile,Histon varyantlarına sahip kanonik histonlar, nükleozom tahliye ve DNA metilasyonu, genlerin ON / OFF anahtarını düzenler. Çeşitli gruplar, proksimal ve distal düzenleyici bölgelerde 7 , 8 , 9 , 10 farklı kromatin durumlarıyla ilişkili işaretleri belirlemek için PTM&#39;lerin ve histon varyantlarının genom çapında dağılımını araştırdılar. Sinyalizasyon, spesifik arttırıcı elementlerde pozitif ve negatif kromatin değiştirici enzimlerin (ayrıca kromatin modifiye edici olarak da bilinir) değişimi yoluyla dinamik kromatin düzenlenişini düzenler. Bu kromatin değiştiriciler kromatin yapısını ve dolayısıyla transkripsiyonel çıktıyı örneğin dinamik histon metilasyonu ve asetilasyon ile düzenler. Notch sinyal yolunda 11 , 12 , 13 ,14. Dinamik histon PTM&#39;leri; Histon varyantları ile alışverişler; Ve histonların, transkripsiyon faktörlerinin ve kofaktörlerin dinamik dolaşımı, kromatin immüno-çökeltme (ChIP) tahlilleri ile araştırılabilir. Belirli DNA-protein komplekslerini saflaştırmak için oldukça spesifik antikorlar kullanılır ve saflaştırılmış DNA kantitatif PCR (qPCR) ile analiz edilir; Derin dizilim (ChIP-Seq); Veya günümüzde daha az sıklıkla, mikrodiziye hibridizasyon (ChIP-ChIP). ChIP tahlilleri, bazen hücrelerin lizisi, kromatin kesilmesi ve / veya antikorların düşük özgüllüğü ile ilgili komplikasyonlar nedeniyle zorlayıcıdır. NEXSON 15&#39;te olduğu gibi, protokolü geliştirmek için çeşitli stratejiler benimsenmiştir. Soğutma suyu banyosu sonikatörlerinin kullanılması, araştırılan protein üzerindeki epitoplara zarar verebilecek numune ısıtmasından kaçınır, ancak numunelerin kesilmesi için gereken enerji suya dağılır.Enerjinin dağılmasını önleyen odaklanmış ultrasonication cihazlarının geliştirilmesi ile bir başka gelişme yapılmıştır. Bu nedenle, odaklanmış ultrasonatör cihazları, hücre lizizinde ve kromatin makaslamada iyileştirme yapmaya, operatöre bağlı varyasyonları ortadan kaldırmaya ve tekrarlanabilirliği önemli ölçüde arttırmaya olanak tanır. Bu çalışma , E2-10HA 16 , 17 olarak adlandırılan olgun bir fare T hücresi çizgisindeki histon proteinlerinin ChIP&#39;ini etkili bir şekilde gerçekleştirmek için bir protokolü ( Şekil 1&#39;deki şematik genel bilgi) açıklar. T-hücrelerinin çözülmesi genellikle zordur ve kromatinlerinin kesilmesi yetersizdir. Soğutma odaklı bir ultrasonatörü kullanan bu protokolde, hücre sayısı, liziz tamponu ve kesme ayarı E2-10HA fare T hücre dizisi için optimize edildi. Bu protokol, yüksek bir tekrarlanabilirlik ve makul bir zamanda ChIP gerçekleştirmesine olanak tanır. Aslında, requirKromatin kesmek ve makaslama kalitesini değerlendirmek için yaklaşık iki gün, immüno çökelmeyi gerçekleştirmek için üç gün, çapraz bağın tersini çevirin ve DNA&#39;yı arındırın.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="912">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:496px;">Agilent High Sensitivity D5000 Reagents</td>
			<td style="width:223px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:129px;">5067-5593</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent Tapestation 4200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Covaris S220 AFA System</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">dimethyl adipimidate (DMA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>1502-P121301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Formaldehyde (FMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Insulin solution human&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Iscove&#39;s modified Dulbecco&#39;s medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21980-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5280-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Peptone primatone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phase Lock Gel Heavy 2 ml</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tube AFA Fiber &#38; Cap</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines

Sinyal yolakları, histon kuyruklarının post translasyonel modifikasyonları (PTM&#39;ler), histon varyantları ile kanonik histonların değişimi ve nükleozom tahliye gibi farklı seviyelerde kromatin yapısının modülasyonu yoluyla gen ekspresyon programlarını düzenler. Bu düzenleme, arttırıcılar olarak tanımlanan düzenleyici elemanlarda kromatin değiştirici enzimleri işe yarayan sinyal duyarlı transkripsiyon faktörlerinin (TF&#39;ler) bağlanmasını gerektirir. Sinyal olay kaskadlarının arttırıcı aktiviteyi nasıl düzenlediğini anlamak TF&#39;lerin, kromatin değiştirici enzimlerin bağlanmasının ve spesifik histon işaretlerinin ve histon varyantlarının dolaşımının kapsamlı bir analizini gerektirir. Kromatin immüno-çökeltme (ChIP) tahlilleri, spesifik protein / DNA komplekslerini immüno-çökeltmek için yüksek spesifik antikorları kullanır. Saflaştırılmış DNA&#39;nın sonraki analizi, antikor tarafından tanınan protein tarafından işgal edilen bölgenin tanımlanmasına izin verir. Bu çalışma verimli bir şekilde peOlgun fare T hücre dizisinde histon proteinlerinin ChIP&#39;ini oluşturun. Sunulan protokol, ChIP tahlillerinin makul bir zaman aralığında ve yüksek tekrarlanabilirlik ile gerçekleştirilmesini sağlar.

Olgun fare T hücreleri, lizin 4&#39;ün histon 3&#39;te (H3K4me1) histon marka mono-metilasyonunun zenginleştirilmesini, histon 3&#39;ün (H3K4me3) lisin 4&#39;ün tri-metilasyonunu ve lizin 27&#39;nin asetillenmesini incelemek için ChIP analizine tabi tutuldu. Histone 3 (H3K27ac) yanı panH3 ChIP tarafından ortaya çıkarılan nükleozom doluluğu. Kesme kalitesi,% 1.8 agaroz jeli ( Şekil 2A ) ve bir elektroforez sistemi ( Şekil 2B ) üzerinde analizle değerlendirildi. H3K4me1 ve H3K4me3, sırasıyla arttırıcı bölgeleri ve yükselticileri tanımlamak için kullanılır ( Şekil 3A ). Nitekim H3K4me3 belirgin olup yalnızca promotörler 5 , 8 , 14&#39;te zenginleştirilmiş değildir. Aktif arttırıcıların bir özelliği, H3K4me1 ve H3K27ac için oldukça zenginleştirilmiş olması ve H3K4me3 için zayıf şekilde zenginleştirilmiş olmasıdır (&lt;Inaktif arttırıcılar, düşük H3K4me3 ve H3K27ac seviyeleri, ancak yüksek H3K4me1 seviyeleri gösterirler ( Şekil 3A , alt panel). Şekil 3B&#39;de gösterildiği gibi, Glyceraldehyde 3-fosfat dehidrogenaz ( Gapdh ) geni, aktif gen promotörlerinin ( Gapdh promotörünün ) analizini temsil etmektedir . Gerçekte, yüksek seviyelerde H3K4me3 ve H3K27ac ve düşük H3K4me1 seviyeleri gösterir. Şekil 3B&#39;de Deltex1 ( Dtxl ), H3K4me1 için zenginleştirilmiş ve H3K4me3 ve H3K27ac için zayıf şekilde zenginleştirilmiş olduğu için, inaktif arttırıcıları ( Dtx1 arttırıcı ) temsil etmektedir. Gen çölü , kodlayıcı genlerden yoksun bir bölgeyi temsil eder ve genellikle aktif kromatin işaretleri için negatif bir kontrol olarak dava edilir. H3K4me1, iyi kabul görmüş arttırıcı işaret 4 , 5 , </sup&gt; 7 , 14 , 18 , Gen çölde zenginleştirilmiş değil, bu bölgenin güçlendirici bulunmadığını öne sürüyor. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> Şekil 1: Sunulan ChIP protokolünün şematik görünümü. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> Şekil 2: olgun fare T hücre hattının kesme kalitesi kontrolü. ( A ) Olgun fare T hücre çizgisi E2-10HA&#39;nın iki farklı bölüntüsü kesildi ve yaklaşık% 500 saflaştırılmış DNA,% 1.8 agaroz jeli üzerinde analiz edildi ve kesilip alınmadığı değerlendirildiIng kalitesi. ( B ) numune 2&#39;den 1 ng saflaştırılmış DNA, kesme kalitesini değerlendirmek için elektroforez ile analiz edildi. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> Şekil 3: arttırıcıları ve yükselticileri karakterize eden kromatin işaretleri. ( A ) Aktif arttırıcılar (üst panel) yüksek H3K4me1, düşük H3K4me3 ve yüksek H3K27ac ile karakterize edilirken, inaktif arttırıcılar (alt panel) yüksek H3K4me1, düşük H3K4me3 ve düşük H3K27ac sunar. ( B ) Şekil 2A&#39;da sunulan numuneler bir araya getirildi ve panH3 ChIP tarafından ortaya çıkarıldığı üzere, histon markları H3K4me1, H3K4me3 ve H3K27ac ve histon doluluğu için ChIP analizi için kullanıldı. Bu analiz,E destekçisi Glyceraldehyde 3-fosfat dehidrogenaz ( Gapdh promotörü ), H3K4me3 ve H3K27ac için zenginleştirilmiş ve H3K4me1 için az zenginleştirilmiş. Öte yandan, aktif olmayan gen Deltex1&#39;in ( Dtx1 arttırıcı ) zenginleştiricisi, H3K4me1 için zenginleştirilmiş ancak H3K4me3 ve H3K27ac için zayıf şekilde zenginleştirilmiş. Nükleozomun doluluk oranını araştırmak için bir panH3 antikoru kullanan ChIP kullanıldı. Gen çölü negatif bir kontrol olarak kullanıldı. Bir temsilci deney gösterilmiştir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Arabellek adı </td><td> reaktif </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td rowspan="5"> Seyreltme tamponu </td><td> Sodyum dodekIl sülfat (SDS) </td><td> % 0.01 (ağ / hac) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 1.1 (h / h) </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1.2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.1 </td><td> 16.7 mM </td></tr><tr><td> Sodyum klorür (NaCI) </td><td> 167 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> DMA çözümü </td><td> Dimetil adipimidat (DMA) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Fosfat tamponlu salin (PBS) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="3"> Elüsyon tamponu </td><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> % 1 (a / h) </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Yüksek tuz tamponu </td><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> % 0.1 (a / h) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 1 (h / h) </td></tr><tr><td> EthylenediamiNetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Sodyum klorür (NaCI) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td rowspan="6"> IMDM aracı </td><td> Iscove&#39;un modifiye Dulbecco&#39;s medium (IMDM) </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) </td><td> % 2 (h / h) </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Pepton primatonu </td><td> 0.3 mg / mL </td></tr><tr><td> Insan insülini çözeltisi </td><td> 4.8 mg / mL </td></tr><tr><td> Minimum esansiyel orta zorunlu olmayan amino asitler (MEM NEAA) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="4"> LiCl tuz tamponu </td><td> Lityum klorür (LiCI) </td><td> 0,25 M </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> % 1 (h / h) </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.1 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Düşük tuz tamponu </td><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> % 0.1 (a / h) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 1 (h / h) </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Sodyum klorür (NaCI) </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Protein A Sepharose boncuk yıkama tamponu </td><td> Tris-HC1 pH 8.0 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Sodyum klorür (NaCI) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> % 0.1 (a / h) </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> % 1 (h / h) </td></tr><tr><td rowspan="3"> SDS Lysis tamponu </td><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> % 1 (a / h) </td></tr><tr><td> EthylenediAminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.1 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> TE tamponu </td><td> Tris-HC1 pH 8.0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Bu protokolde kullanılan tamponların ve ortamın listesi. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> AÇIK </td><td> KAPALI </td></tr><tr><td> Zirve gücü </td><td> 150,0 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Görev faktörü </td><td> 15.0 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> Döngüleri / patlama </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Devir sayısı </td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>Tablo 2: Bu protokolde kullanılan kesme ayarları. Bu koşullar olgun bir fare T-hücresi hattı için optimize edilmiştir. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Antikor </td><td> satıcı </td><td> Antikor miktarı / immüno çökeltme </td><td> Hücrelerin miktarı / immüno çökeltme </td><td> Yıkama koşulları </td></tr><tr><td> H3 </td><td> Abcam (ab1791) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Bir kez düşük tuz tamponunda, iki kez Yüksek tuz tamponunda, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponunda </td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td> Abcam (ab8895) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Bir kez düşük tuz tamponunda, iki kez Yüksek tuz tamponunda, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponunda </td></tr><tr><td> H3K4me3 </td><td> Diagenode (pAb-003-050) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Bir kez düşük tuz tamponunda, iki kez Yüksek tuz tamponunda, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponunda </td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td> Diagenode (pAb-174-050) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Düşük tuz tamponunda Oce, iki kez Yüksek tuz tamponu, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponu </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Diagenode (C15410206) </td><td> Değişken* </td><td> Değişken* </td><td> Değişken* </td></tr><tr><td colspan="5"> * IgG kontrolü durumunda hem antikor hem de hücrelerin miktarı, yıkama adımları, diğer immüno çökeltilerin koşullarını yansıtmalıdır. </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Bu çalışmada kullanılan antikorlar ve yıkama koşulları. <table border="1" fo:keEp-together.within-sayfa = &quot;1&quot; fo: keep-with-next.within-sayfa = &quot;her zaman&quot;&gt; <tbody><tr><td> Gen </td><td> Ileri astar </td><td> Ters astar </td><td> sonda </td></tr><tr><td> Gapdh yönlendiricisi (0 kb) </td><td> 5&#39;-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Dtx1 arttırıcı (+26 kb) </td><td> 5&#39;-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> Gen çölü </td><td> 5&#39;-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Bu çalışmada qPCR için kullanılan primerler ve problar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within sayfalık = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Sorun </td><td> Nedenler </td><td> Çözüm </td></tr><tr><td rowspan="3"> Kromatin makaslanmış ve parçacıklar çok büyük. </td><td> Çok fazla hücre kullanılmıştır. </td><td> Hücrelerin sayısını azaltın. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Makaslama çok düşüktür. </td><td> Kesme çevrimi sayısını artırın. </td></tr><tr><td> Kesme tepe gücü, çalışma faktörü ve / veya devir / patlamayı arttırın. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Kromatin kesilmiş ve fragmanlar çok küçük. </td><td> Çok az hücre kullanılmıştır. </td><td> Hücre sayısını artırın. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Kesme çok yüksek. </td><td> Kesme çevrimi sayısını azaltın. </td></tr><tr><td> Kesme tepe enerjisini, görev faktörünü ve / veya devir / patlamayı azaltın. </td></tr><tr><td rowspan="11"> Ben üzerinde çok düşük kurtarmaGG kontrolü ve / veya negatif kontrol (yüksek arka plan). </td><td> Deney için yeterli kromatin kullanıldı. </td><td> Kromatin miktarını arttırın. </td></tr><tr><td> Antikor miktarı çok düşüktür. </td><td> Antikor miktarını arttırın. </td></tr><tr><td> Antikor miktarı çok yüksek. </td><td> Antikor miktarını azaltın. </td></tr><tr><td> Antikorun özgüllüğü düşüktür. </td><td> Antikoru değiştir. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Yıkama koşulları çok katıdır. </td><td> Yıkama sayısını azaltın. </td></tr><tr><td> Yıkama tamponlarının sıkılığını azaltın. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Yıkama koşulları yeterince sıkı değildir. </td><td> Yıkama sayısını arttırın. </td></tr><tr><td> Yıkama tamponlarının sıkılığını arttırın. </td></tr><tr><td> QPCR&#39;de çok fazla DNA pipetle alındı. </td><td> QPCR&#39;de pipetle alınan DNA miktarını azaltın. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR koşulları optimal değildir. </td><td> QPCR koşullarını optimize edin. </td></tr><tr><td> Çevrim sayısını azaltın. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Girdi örneğinin qPCR reaksiyonunda hiçbir ürün veya ürün çok düşüktür. </td><td> QPCR&#39;de yeterli DNA pipete konmadı. </td><td> QPCR&#39;de pipetle alınan DNA miktarını arttırın. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR koşulları optimal değildir. </td><td> QPCR koşullarını optimize edin. </td></tr><tr><td> Çevrim sayısını arttırın. </td></tr><tr><td> Deney için yeterli kromatin kullanıldı. </td><td> Kromatin miktarını arttırın. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Pozitif kontrol ve / veya panH3 Çipinde sinyal yok. </td><td> Deney için yeterli kromatin kullanıldı. </td><td> Kromatin miktarını arttırın. </td></tr><tr><td> Antikor miktarı çok düşüktür. </td><td> Antikor miktarını arttırın. </td></tr><tr><td> AntiVücut özgüllüğü düşüktür. </td><td> Antikoru değiştir. </td></tr><tr><td> Elüsyon uygun değildir. </td><td> Boncukları çözelti içinde tutmak için numuneleri sık sık girdapladığınızdan emin olun. </td></tr></tbody></table> Tablo 5: Sorun Giderme.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Bu çalışma olgun bir fare T-hücresi hattı kullanarak kromatin immüno çökeltme (ChIP) için bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, spesifik histon marklarının belirli promotör alanlarında veya genom çapında dağılımını araştırmak için uygundur.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-in-mouse-t-cell-lines

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

18.2K Görüntüleme.  University of Giessen.  Bu çalışma olgun bir fare T-hücresi hattı kullanarak kromatin immüno çökeltme (ChIP) için bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, spesifik histon marklarının belirli promotör alanlarında veya genom çapında dağılımını araştırmak için uygundur. 

Video: Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Genetik

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

Kromatin döngü yapısı yeniden yapılanma CRISPR-aracılı

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...