نحن ممتنون ل P. كيس و T. شميدت-ول للمساعدة التقنية الممتازة. وقد حظي هذا العمل بدعم من منحة البحوث التعاونية TRR81 وبرنامج هيزنبرغ (بو 1639 / 5-1) التابع لمؤسسة البحوث الألمانية، وجمعية ماكس بلانك، و إكسك 294 في فرايبورغ، ومجموعة التميز لنظام القلب الرئوي (إكبس) في جيسن إلى مرض السل

ملاحظة: يتم سرد كافة المخازن المؤقتة والمتوسطة المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1 . اليومان 1 و 2 1. يشابك الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الماوس خلايا T من لوحة 6 جيدا إلى أنبوب 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و ~ 271 س ز. ريسوسبيند خلية بيليه في 30 مل من إدمم خلية ثقافة المتوسطة وعد الخلايا باستخدام غرفة نيوبور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع قسامة من 20 × 10 6 خلايا في أنابيب 50 مل جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الفورمالديهايد (فما) إلى تركيز النهائي 1٪ مباشرة إلى وسط زراعة الخلايا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. تنبيه: فما سامة إذا استنشقت، لذلك العمل تحت غطاء الدخان وارتداء المعدات الواقية المناسبة. أيضا، يرجى التعامل مع النفايات فم وفقا لقواعد المؤسسة المضيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1/8 الحجم من 1 M الجلايسين، ودرجة الحموضة 7.0، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5دقيقة في 4 درجات مئوية و ~ 271 زغ وغسل مع 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (بس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه الخلية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنابيب 1.5 مل. </li></ol> 2. خلية تحلل والكروماتين القص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريسوسبيند الخلية بيليه في 1 مل من سدز تحلل العازلة واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل عينة إلى أنبوب سونيكاتيون وأداء القص باستخدام أولتراسونيكاتور تركز وفقا للإعدادات المشار إليها في الجدول 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد القص، ونقل العينات إلى 1.5 مل أنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و ~ 18000 x ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف إلى أنابيب جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 50 ميكرولتر لتحديد كفاءة القص وفقا للخطوة 3 والمفاجئة تجميد المحللة في النيتروجين السائل. تخزين المحللة في أليكوتس ذات الاستخدام الواحد في -80 درجة مئوية. </li></ol> 3. تحديد كفاءة القص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من العازلة شطف إلى 50 و #181؛ L من كل المحللة المقطعة واحتضان عند 65 درجة مئوية خلال الليل، مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من العازلة تي و 4 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ريبونوكلياز (0.2 ميكروجرام / ميكرولتر التركيز النهائي). مزيج واحتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتين K (0.2 ميكروغرام / ميكرولتر التركيز النهائي) لكل عينة واحتضان لمدة 2 ساعة عند 55 درجة مئوية، مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل عينة إلى أنبوب هلام مناسبة لاستخراج الكحول الفينول / الكلوروفورم / الإيزوميل. مقبض وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من الفينول / الكلوروفورم / الكحول الإيزوامل (25: 24: 1) ويهز الأنابيب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 24 درجة مئوية و ~ 16000 زغ ونقل المرحلة العليا إلى أنابيب جديدة. تنبيه: الفينول، الكلوروفورم، والكحول الإيزواميلي هي سامة إذا استنشاق وتآكل. والعمل تحت غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. أيضا، التعامل مع الفينول، الكلوروفورم، و أسوميل الكحول أس النفاياتوفقا لقواعد المؤسسة المضيفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكرار مرة واحدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية الحمض النووي باستخدام أعمدة تنقية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع التعديلات التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الغشاء مرتين. بعد غسل الماضي، وترك أنبوب مفتوح لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتبخير الايثانول المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على شطف، إضافة 50 ميكرولتر من H 2 O، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة، وتدور الأنبوب لمدة 1 ثانية ل رطب بشكل صحيح الغشاء، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة قبل التنازل عن الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 24 ° C و ~ 17،900 x ز. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الحمض النووي المنقى على فلوروميتر باستخدام مجموعة عالية الحساسية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل ما يقرب من 500 نانوغرام من الحمض النووي المنقى على هلام الاغاروز 1.8٪ وحوالي 1 نانوغرام على نظام الكهربائي باستخدام مجموعة عالية الحساسية. ملاحظة: سيز المتوقعه من شظايا الحمض النووي ما بين 200 و 500 نقطة أساس. </li></ol> اليومان 3 و 4 4. مناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 1 حجم من المحللة قص مع 5 مجلدات من المخزن المؤقت التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بريكليري مع 30 ميكرولتر / مل البروتين وحبات الاغاروز (أعدت وفقا للتذييل ألف ) لمدة 30 دقيقة في حين الدورية في الغرفة الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق في ~ 750 x ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 10٪ من المدخلات وتخزينه في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة المبلغ المطلوب من المحللة في أنابيب جديدة (انظر الجدول 3 لمزيد من التفاصيل). إضافة الأجسام المضادة المطلوبة لكل أنبوب (انظر الجدول 3 لمزيد من التفاصيل) وتناوب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 ميكرولتر من البروتين وحبات واحتضان لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية في حين الدورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخرز مع 1 مل من العازلة منخفضة الملح، العازلة عالية الملح، العازلة ليكل، والعازلة تي (لكل غسل، واحتضان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في حين الدورية وأجهزة الطرد المركزيلمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية و ~ 950 زغ). انظر الجدول 3 للحصول على التفاصيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 110 ميكرولتر من العازلة شطف واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، فورتيكسينغ كل 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية و ~ 950 زغ ونقل 100 ميكرولتر من طاف إلى أنبوب 1.5 مل جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 4.7-4.8 مع 100 ميكرولتر من العازلة شطف والجمع بين إيليتس. إضافة شطف عازلة تصل إلى 200 ميكرولتر لإدخال العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان جميع العينات بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية، مع اهتزاز. </li></ol> يوم 5 5. دنا تنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من العازلة تي إلى كل شطافة و 8 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ريبونوكلياز (0.2 ميكروجرام / ميكرولتر التركيز النهائي). مزيج واحتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتين K (0.2 ميكروغرام / ميكرولتر التركيز النهائي) إلى كل شطافة واحتضان لمدة 2 ساعة عند 55 درجة مئوية، مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل عينة إلى هلامأنبوب مناسب ل فينول / كلوروفورم / إيسواميل كحول إستخراج؛ مقبض وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 400 ميكرولتر من الفينول / الكلوروفورم / الكحول الإيزوامل (25: 24: 1) ويهز الأنابيب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 24 درجة مئوية و ~ 16،000 x ز. نقل المرحلة العليا إلى أنابيب جديدة. تنبيه: الفينول، الكلوروفورم، والكحول الإيزواميلي هي سامة إذا استنشاق وتآكل. والعمل تحت غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. أيضا، التعامل مع الفينول، الكلوروفورم، ونفايات الكحول الإيزواميلي وفقا لقواعد المؤسسة المضيفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكرار مرة واحدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية الحمض النووي باستخدام أعمدة تنقية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع التعديلات التالية: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الغشاء مرتين. بعد غسل الماضي، وترك الأنابيب مفتوحة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتبخير الايثانول المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على شطف، إضافة 50 ميكرولتر من H 2 O، احتضان في تمبراتو الغرفةإعادة لمدة 1 دقيقة، وتدور الأنابيب لمدة 1 ثانية ل رطب بشكل صحيح الغشاء، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة قبل التنازل عن الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 24 درجة مئوية و ~ 17،900 x ز. </li></ol>

<ol>
	<li>Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+landscape+and+transcription+factors+in+T+cell+programming.">The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming.</a> Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).</li><li>Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transformations+of+genome-wide+epigenetic+marking+and+transcriptional+control+establish+T+cell+identity.">Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity.</a> Cell. 149 (2), 467-482 (2012).</li><li>Cauchy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+recruitment+of+Ets1+to+both+nucleosome-occupied+and+-depleted+enhancer+regions+mediates+a+transcriptional+program+switch+during+early+T-cell+differentiation.">Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation.</a> Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).</li><li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+initiation+platforms+and+GTF+recruitment+at+tissue-specific+enhancers+and+promoters.">Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).</li><li>Pekowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4+tri-methylation+provides+an+epigenetic+signature+of+active+enhancers.">H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers.</a> EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).</li><li>Vanhille, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+quantitative+assessment+of+enhancer+activity+in+mammals+by+CapStarr-seq.">High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq.</a> Nat Commun. 6, 6905 (2015).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression.">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li><li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types.">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li><li>Ostuni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+enhancers+activated+by+stimulation+in+differentiated+cells.">Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells.</a> Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).</li><li>Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+regulation+at+Notch+target+genes.">Dynamic chromatin regulation at Notch target genes.</a> Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).</li><li>Liefke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylase+KDM5A+is+an+integral+part+of+the+core+Notch-RBP-J+repressor+complex.">Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex.</a> Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).</li><li>Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+helicase+Ddx5+and+the+noncoding+RNA+SRA+act+as+coactivators+in+the+Notch+signaling+pathway.">RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).</li><li>Oswald, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phospho-dependent+mechanism+involving+NCoR+and+KMT2D+controls+a+permissive+chromatin+state+at+Notch+target+genes.">A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes.</a> Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).</li><li>Arrigoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+chromatin+research:+a+simple+and+universal+method+for+ChIP-seq.">Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq.</a> Nucl Acids Res. 44 (7), e67 (2016).</li><li>Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+interactions+involved+in+Th+cell+memory.">Cellular interactions involved in Th cell memory.</a> J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).</li><li>White, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+better+cell+lines+for+making+hybridomas+expressing+specific+T+cell+receptors.">Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors.</a> J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).</li><li>Ghisletti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+enhancers+controlling+the+inflammatory+gene+expression+program+in+macrophages.">Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages.</a> Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity.">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li><li>Fenouil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+islands+and+GC+content+dictate+nucleosome+depletion+in+a+transcription-independent+manner+at+mammalian+promoters.">CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters.</a> Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).</li><li>Hein, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+methylation+of+Notch1+controls+the+amplitude+and+duration+of+the+Notch1+response.">Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response.</a> Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة.

تشيب هو تقنية صالحة للتحقيق في ما إذا كانت البروتينات أو بتمس لها إثراء في مناطق الجينومية محددة. نتائج فحص رقاقة غالبا ما تكون صعبة للتفسير لأسباب بيولوجية أو فنية. الأسباب البيولوجية كثيرة و تشمل ضعف أو غير مباشر ملزمة من البروتينات إلى الحمض النووي. وهناك أيضا قيود تقنية، مثل خصوصية الأجسام المضادة محدودة وتحلل الخلايا غير فعالة أو القص الكروماتين. دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها ( الجدول 5 ) يمكن أن تساعد القارئ على حل المشاكل التي قد تواجهها مع المقايسات رقاقة. هذا البروتوكول، والاستفادة من جهاز أولتراسونيكاتور تركز التبريد، يسمح واحد لكفاءة القص لونين من ناضجة الماوس T- خط الخلية. وتتمثل الخطوة الحاسمة الرئيسية للبروتوكول من قبل القص من لونين، والتي يجب دائما أن يكون الأمثل لكل نوع من الخلايا. ويقترح لتغيير عدد الخلايا وعدد دورات سونيكيشن. وعلاوة على ذلك، وقالت انها<html> أرينغ الكفاءة يتأثر سلبا وجود سدز يترسب في العينات، والتي قد تشكل خلال تحلل الخلايا على الجليد مع سدز تحلل العازلة. في هذه الحالة، فمن الأفضل لاحتضان العينة بعد تحلل في درجة حرارة الغرفة لبضع دقائق للحد من وجود رواسب سدز. فمن المستحسن لتحسين البروتوكول للحصول على شظايا مقطوعة بين 200 و 500 نقطة في البوصة وتقييم دائما جودة القص من العينات قبل الشروع في مناعي. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون الأمثل الوقت التثبيت، وكمية من الأجسام المضادة و / أو الخلايا، وظروف الغسيل الأمثل لكل الأجسام المضادة. خطوة واحدة أكثر أهمية في اتخاذ إجراء رقاقة ناجحة هو اختيار الأجسام المضادة، والأجسام المضادة منخفضة النوعية تقلل بشكل كبير من كفاءة إمونوبريسيانتاتيون. سابقا، يسمح إجراء اختبار الجودة موحدة لتقييم خصوصية العديد من الأجسام المضادة المتاحة في السوق<html> سس = &quot;كريف&quot;&gt; 19. واستند خط أنابيب الفرز على لطخة نقطة، وصمة عار الغربية، و تشيب، وتوفير قائمة من الكواشف عالية الجودة مناسبة ل تشيب 19 . في الآونة الأخيرة، تم تقييم خصوصية العديد من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا باستخدام عالية الكثافة هيستون الببتيد ميكروأري منصات، مما يسمح لإنشاء قاعدة بيانات حول خصوصية الأجسام المضادة 20 . يمكن للقارئ استخدام هذه الأداة المفيدة لتحديد الأجسام المضادة الأكثر تحديدا التي يمكن استخدامها لتجارب رقاقة. لم يتم اختبار هذا البروتوكول لخلايا T الأولية، وفي هذه الحالة، يجب على القارئ الرجوع إلى البروتوكولات المنشورة الأخرى التي تؤدي بنجاح رقاقة على خلايا T الأولية 3 ، 4 ، 21 . ومن الجدير بالذكر، وقد تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لأداء رقاقة على السلف الفأر خط T- الخلية، وكذلك على خط الخلايا البطانية الماوس. ove_content &quot;&gt; 5 × 10 6 خلايا ينبغي أن تستخدم لكل مناعي لتحليل علامات هيستون لأن هذا البروتوكول يمكن أيضا أن تكون مناسبة، مع بعض التحسين، لأداء رقاقة على تفس أو العوامل المساعدة، فمن الأفضل لزيادة عدد الخلايا المستخدمة في إمونوبريسيانتاتيون في هذه الحالات.من أجل الوصول إلى العدد المطلوب من الخلايا لكل تجربة، يمكن تجميع أكثر أليكوتس من المحللة المقطوعة معا قبل تمييع لونين في المخزن المؤقت التخفيف. ويمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول لأداء رقاقة على البروتينات الذاتية التي لا ترتبط مباشرة إلى الحمض النووي. في هذه الحالة، قد يكون مطلوبا تثبيت مسبق مع بروسلينكرز البروتين البروتين (على سبيل المثال، ديميثيل أديبيميديت، دما) (انظر الملحق ب لمزيد من المعلومات). كان أداء ناجح من رقاقة على العوامل المساعدة سابقا من خلال أوفيركسريسينغ البروتينات التي تنصهر إلى علامة البيوتين. في هذه الحالة، تم تنقية البروتين مع ستريبتافيدين-كونجوغاتيد الخرز المغناطيسي، و قبل تثبيت مع دما تم تنفيذ 22 .

تعتمد التنمية والتمايز والتوازن على برامج التعبير الجيني محددة التي يتم إنشاؤها من خلال إشارات الأحداث التي تعدل بنية الكروماتين، وبالتالي تحديد ما إذا كان يتم تنشيط جين معين أو قمعها بطريقة الخلية والوقت المحدد. خلال تطوير الخلايا التائية، يجب إنشاء برامج التعبير الجيني محددة لتحديد نضوج السلائف خلية T من السلبي المزدوج (دن) إلى حالة إيجابية واحدة (سب)، يمر عبر عدة مراحل وسيطة 1 . كيف تم تنظيم برنامج التعبير الجيني ديناميكيا خلال تطوير الخلايا التائية تم التحقيق على نطاق واسع في السنوات السابقة من قبل العديد من المختبرات 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . عن طريق التعديلات بعد متعدية (بتمس) من الهيستونات، وتبادلهيستونيس الكنسي مع المتغيرات هيستون، الطرد نوكلأوسوم، ومثيلة الحمض النووي تنظم التبديل أون / أوف من الجينات. وقد حققت عدة مجموعات في توزيع الجينوم على نطاق واسع من بتمس والمتغيرات هيستون لتحديد العلامات التي ترتبط مع مختلف دول الكروماتين في كل من المناطق التنظيمية القريبة والبعيدة 7 ، 8 ، 9 ، 10 . تشوير الشلالات تنظيم تنظيم كروماتين الديناميكي عن طريق تبادل الإيجابية والسلبية إنزيمات تعديل الكروماتين (المعروف أيضا باسم معدلات الكروماتين) في عناصر محسن محددة. هذه المعدلات لونين تنظيم هيكل الكروماتين، وبالتالي الناتج النسخي من قبل، على سبيل المثال، مثيلة هيستون الديناميكي والأستيلاتيون. هذا هو الحال في مسار إشارات الشق 11 ، 12 ، 13 ،14 - ديناميكية هيستون بتمس. التبادلات مع المتغيرات هيستون. وإمكانية الإشغال الديناميكي للهيستونات، عوامل النسخ، والعوامل المساعدة يمكن التحقيق من قبل المقايسات المناعية (رقاقة) لونين. وتستخدم الأجسام المضادة محددة للغاية لتنقية المجمعات الحمض النووي البروتين محددة، ويتم تحليل الحمض النووي المنقى عن طريق ير الكمية (قر). تسلسل عميق (تشيب-سيق)؛ أو أقل تواترا في الوقت الحاضر، التهجين ل ميكروأري (رقاقة رقاقة). مقايسات رقاقة في بعض الأحيان تحديا بسبب المضاعفات مع تحلل الخلايا، القص من لونين، و / أو خصوصية منخفضة من الأجسام المضادة. وقد اعتمدت عدة استراتيجيات لتحسين البروتوكول، كما هو الحال بالنسبة إلى نيكسون 15 . استخدام التبريد سونيكاتورس حمام المياه يتجنب عينة التدفئة التي قد تلحق الضرر الحواتم الموجودة على البروتين قيد التحقيق، ولكن الطاقة المطلوبة لقص العينات يحصل فرقت في الماء.تم إجراء تحسين آخر مع تطوير أجهزة أولتراسونيكاتيون تركز التي تمنع تشتت الطاقة. ولذلك، تركز أجهزة أولتراسونيكاتور تسمح للتحسينات في تحلل الخلايا والكروماتين القص، والقضاء على الاختلافات التي يسببها المشغل وزيادة كبيرة في استنساخه. يصف هذا العمل بروتوكول (نظرة عامة التخطيطي في الشكل 1 ) لأداء بكفاءة رقاقة من البروتينات هيستون في خط ناضج الفأر T- دعا E2-10HA 16 ، 17 . الخلايا التائية عادة ما تكون صعبة ل ليس، وقد تم الكشف عن القص من الكروماتين لتكون غير فعالة. في هذا البروتوكول، مما يجعل من استخدام أولتراسونيكاتور تركز على التبريد، تم تحسين عدد الخلايا، العازلة تحلل، ووضع القص ل E2-10HA الماوس خط الخلايا T. يسمح هذا البروتوكول واحد لأداء رقاقة مع استنساخ عالية وفي وقت معقول. في الواقع، فإنه ريكيرإس ما يقرب من يومين لقص الكروماتين وتقييم نوعية القص، وثلاثة أيام لأداء المناعي، عكس الارتباط، وتنقية الحمض النووي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="912">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:496px;">Agilent High Sensitivity D5000 Reagents</td>
			<td style="width:223px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:129px;">5067-5593</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent Tapestation 4200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Covaris S220 AFA System</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">dimethyl adipimidate (DMA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>1502-P121301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Formaldehyde (FMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Insulin solution human&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Iscove&#39;s modified Dulbecco&#39;s medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21980-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5280-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Peptone primatone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phase Lock Gel Heavy 2 ml</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tube AFA Fiber &#38; Cap</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines

وتقوم مسارات التشوير بتنظيم برامج التعبير الجيني من خلال تشكيل بنية الكروماتين على مستويات مختلفة، مثل التعديلات بعد متعدية (تي تي أم) لتيول هيستون، وتبادل الهيستونات المتعارف عليها مع المتغيرات هيستون، وإخلاء النيوكليوسومات. يتطلب هذا التنظيم ملزمة لعوامل النسخ الحساسة للاشارات (تفس) التي تجنيد الانزيمات تعديل الكروماتين في العناصر التنظيمية التي تعرف بأنها المعززات. فهم كيفية تنظيم شلالات تنظيم نشاط محسن يتطلب تحليل شامل لربط تفس، الكروماتين تعديل الإنزيمات، وإشغال علامات هيستون محددة والمتغيرات هيستون. المقايسات المناعية (رقاقة) الكروماتين استخدام أجسام مضادة محددة للغاية ل إيمونوبريسيبيتات بروتين معين / المجمعات دنا. تحليل لاحق من الحمض النووي المنقى يسمح لتحديد المنطقة المحتلة من قبل البروتين المعترف بها من قبل الأجسام المضادة. يصف هذا العمل بروتوكول ل بي كفاءةتشوه، بسبب، هيستون، بروتينز، إلى داخل، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، إنضج، الفأر، T-سيل، سطر. بروتوكول عرض يسمح لأداء المقايسات رقاقة في إطار زمني معقول ومع استنساخ عالية.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

يصف هذا العمل بروتوكول ل لونين إمونوبريسيانتاتيون (رقاقة) باستخدام ناضجة الماوس T- خط الخلية. هذا البروتوكول هو مناسبة للتحقيق في توزيع علامات هيستون محددة في مواقع المروج محددة أو الجينوم واسعة.

كروماتين إمونوبريسيبيتاتيون (رقاقة) في الماوس خلايا T- خطوط

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-in-mouse-t-cell-lines

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

18.2K Views.  University of Giessen.  يصف هذا العمل بروتوكول ل لونين إمونوبريسيانتاتيون (رقاقة) باستخدام ناضجة الماوس T- خط الخلية. هذا البروتوكول هو مناسبة للتحقيق في توزيع علامات هيستون محددة في مواقع المروج محددة أو الجينوم واسعة. 

Video: Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

عمليات الاستخراج الملح متسلسلة لتحليل الكروماتين الأكبر ربط خصائص لتعديل مجمعات الكروماتين

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

تحليل ج- كيت يجند المروج باستخدام الكروماتين مناعي

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) بروتوكول لعينات جنينية وفرة منخفضة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية لتحليل تطور البويضات الماوس من الطور الأول الطورية الثاني

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من "التعديلات هستون" من Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

كريسبر بوساطة إعادة تنظيم هيكل حلقة الكروماتين

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين للنسيج الدهني البنى موريني

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

تحرير الجينوم في "خطوط خلايا الثدييات" استخدام Cas كريسبر

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

الكروماتين المناعية الترسيب الفحص باستخدام النوكلور اتوcleases Micrococcal في خلايا الثدييات

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...