Siamo grati a P. Käse e T. Schmidt-Wöll per un&#39;ottima assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio collaborativa TRR81 e dal programma Heisenberg (BO 1639 / 5-1) della DFG (la Fondazione di ricerca tedesca), della Max Planck Society e della EXC 294 di Friburgo e del Cluster di eccellenza per il sistema cardio-polmonare (ECCPS) a Giessen alla TB

NOTA: Tutti i buffer e il mezzo utilizzato in questo protocollo sono elencati nella tabella 1 . Giorni 1 e 2 1. Incrociare le cellule <ol><li> Trasferire le cellule T da topo da una piastra a 6 pozzetti a un tubo da 50 mL e centrifugare per 5 min a 4 ° C e ~ 271 x g. Resuspendere il pellet cellulare in 30 ml di terreno di coltura cellulare IMDM e contare le cellule utilizzando una camera Neubauer. </li><li> Raccogliere aliquote di 20 x 10 6 cellule in nuovi tubi da 50 ml. </li><li> Aggiungere la formaldeide (FMA) ad una concentrazione finale del 1% direttamente al mezzo di coltura cellulare e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Attenzione: la FMA è tossica se inalato, quindi lavorare sotto una cappa di fumo e indossare attrezzature di protezione adeguate. Inoltre, si prega di gestire i rifiuti FMA secondo le regole dell&#39;istituto ospitante. </li><li> Aggiungere un volume di 1/8 di glicina 1 M, pH 7,0 e incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Pellet le cellule per centrifugazione per 5Min a 4 ° C e ~ 271 xg e lavare con 10 ml di soluzione salina fosfata-tamponata (PBS). </li><li> Lavare il pellet cellulare con 1 ml di PBS e trasferire in tubi da 1,5 ml. </li></ol> 2. Lysis cellulare e cricatura di cromatina <ol><li> Resuspendere il pellet cellulare in 1 ml di tampone di lisi SDS e incubare su ghiaccio per 10 min. </li><li> Trasferire ogni campione in un tubo di sonicazione e eseguire la tranciatura utilizzando un ultrasonicator focalizzato in base alle impostazioni indicate nella tabella 2. </li><li> Dopo il taglio, trasferire i campioni su tubi da 1,5 ml e centrifugare per 10 minuti a 4 ° C e ~ 18,000 x g. </li><li> Trasferire il surnatante ai nuovi tubi. </li><li> Raccogliere 50 μl per determinare l&#39;efficienza di taglio secondo la fase 3 e congelare il lattato tagliato in azoto liquido. Conservare il lisato in aliquote monouso a -80 ° C. </li></ol> 3. Determinazione dell&#39;efficienza di taglio <ol><li> Aggiungere 50 μl di tampone di eluizione al 50 &amp;181 L di ogni lisato tritato e incubare a 65 ° C per una notte, con agitazione. </li><li> Aggiungere 100 μl di tampone TE e 4 μL di 10 mg / mL RNasi A (0,2 μg / μL di concentrazione finale). Mescolare e incubare per 2 ore a 37 ° C, con agitazione. </li><li> Aggiungere 2 μL di 20 mg / mL proteinasi K (0,2 μg / μl di concentrazione finale) ad ogni campione e incubare per 2 ore a 55 ° C, agitando. </li><li> Trasferire ogni campione in un tubo di gel idoneo all&#39;estrazione di fenolo / cloroformio / isoamilico; Maneggiare secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Aggiungere 200 μl di fenolo / cloroformio / isoamilico alcool (25: 24: 1) e scuotere i tubi. Centrifugare per 5 min a 24 ° C e ~ 16.000 xg e trasferire la fase superiore a nuovi tubi. Attenzione: Il fenolo, il cloroformio e l&#39;isoamilico sono tossici se inalizzati e corrosivi; Lavorare sotto un cappuccio e utilizzare adeguate attrezzature di protezione individuale. Inoltre, trattare i residui di fenolo, cloroformio e isoamil acSecondo le regole dell&#39;istituzione ospitante. <ol><li> Ripetere una volta. </li></ol></li><li> Purificare il DNA utilizzando colonne di purificazione secondo l&#39;istruzione del produttore, con le seguenti modifiche: <ol><li> Lavare due volte la membrana. Dopo l&#39;ultimo lavaggio lasciare il tubo aperto per 2 minuti a temperatura ambiente per evaporare l&#39;etanolo residuo. </li><li> Per l&#39;eluizione, aggiungere 50 μl di H 2 O, incubare a temperatura ambiente per 1 min, spin il tubo per 1 s per bagnare correttamente la membrana e incubare a temperatura ambiente per 1 min prima di eluire il DNA per centrifugazione per 1 min 24 ° C e ~ 17.900 x g. </li></ol></li><li> Quantificare il DNA purificato su un fluorometro utilizzando un kit di alta sensibilità secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Analizzare circa 500 ng del DNA purificato su un agarosio di 1,8% e circa 1 ng su un sistema di elettroforesi usando un kit di alta sensibilità. NOTA: il siz attesoE dei frammenti di DNA è compresa tra 200 e 500 bp. </li></ol> Giorni 3 e 4 4. Immunoprecipitazione <ol><li> Diluire 1 volume di lisato tagliato con 5 volumi di tampone di diluizione. </li><li> Preclear con 30 μL / mL di agarosio A di proteina A (preparato in conformità all&#39;Appendice A ) per 30 minuti mentre ruota nella stanza fredda. </li><li> Centrifugare a 4 ° C per 5 minuti a ~ 750 x g. </li><li> Raccogliere il 10% dell&#39;input e conservarlo a 4 ° C. </li><li> Aliquota la quantità desiderata di lisato nei nuovi tubi (per ulteriori dettagli vedere la Tabella 3 ). Aggiungere gli anticorpi desiderati a ciascun tubo (vedere la tabella 3 per i dettagli) e ruotare per una notte a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 40 μL di proteine ​​A e incubare per 1 h a 4 ° C durante la rotazione. </li><li> Lavare le perle con 1 ml di tampone di sale basso, tampone ad alto sale, LiCl buffer e tampone TE (per ogni lavaggio, incubare per 5 minuti a 4 ° C durante la rotazione e centrifugarePer 3 minuti a 4 ° C e ~ 950 xg). Vedere la Tabella 3 per i dettagli. </li><li> Aggiungere 110 μl di tampone di eluizione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, vorticando ogni 2 min. </li><li> Centrifugare per 3 min a 4 ° C e ~ 950 xg e trasferire 100 μL di supernatante in un nuovo tubo da 1,5 ml. </li><li> Ripetere i passaggi 4.7-4.8 con 100 μl di tampone di eluizione e combinare gli eluati. Aggiungere un buffer di eluizione fino a 200 μL per immettere i campioni. </li><li> Incubare tutti i campioni durante la notte a 65 ° C, con agitazione. </li></ol> Giorno 5 5. Purificazione del DNA <ol><li> Aggiungere 200 μl di tampone TE ad ogni eluato e 8 μL di 10 mg / mL RNasi A (0,2 μg / μL di concentrazione finale). Mescolare e incubare per 2 ore a 37 ° C, con agitazione. </li><li> Aggiungere 4 μl di 20 mg / mL proteinasi K (0,2 μg / μL di concentrazione finale) ad ogni eluato e incubare per 2 ore a 55 ° C, con agitazione. </li><li> Trasferire ogni campione in un gelTubo adatto all&#39;estrazione di fenolo / cloroformio / isoamilico; Maneggiare secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Aggiungere 400 μl di fenolo / cloroformio / isoamilico alcool (25: 24: 1) e scuotere i tubi. Centrifugare per 5 min a 24 ° C e ~ 16.000 x g. Trasferire la fase superiore ai nuovi tubi. Attenzione: Il fenolo, il cloroformio e l&#39;isoamilico sono tossici se inalizzati e corrosivi; Lavorare sotto un cappuccio e utilizzare adeguate attrezzature di protezione individuale. Inoltre, trattare i rifiuti di fenolo, cloroformio e alcol di isoamilico secondo le regole dell&#39;istituto ospitante. <ol><li> Ripetere una volta. </li></ol></li><li> Purificare il DNA utilizzando colonne di purificazione secondo le istruzioni del produttore, con le seguenti modifiche: </li><li> Lavare due volte la membrana. Dopo l&#39;ultimo lavaggio lasciare i tubi aperti per 2 minuti a temperatura ambiente per evaporare l&#39;etanolo residuo. </li><li> Per l&#39;eluizione, aggiungere 50 μl di H 2 O, incubare a temperatura ambientePer 1 min, spin i tubi per 1 s per bagnare la membrana in modo adeguato e incubare a temperatura ambiente per 1 min prima di eluire il DNA mediante centrifugazione per 1 min a 24 ° C e ~ 17.900 x g. </li></ol>

<ol>
	<li>Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+landscape+and+transcription+factors+in+T+cell+programming.">The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming.</a> Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).</li><li>Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transformations+of+genome-wide+epigenetic+marking+and+transcriptional+control+establish+T+cell+identity.">Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity.</a> Cell. 149 (2), 467-482 (2012).</li><li>Cauchy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+recruitment+of+Ets1+to+both+nucleosome-occupied+and+-depleted+enhancer+regions+mediates+a+transcriptional+program+switch+during+early+T-cell+differentiation.">Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation.</a> Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).</li><li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+initiation+platforms+and+GTF+recruitment+at+tissue-specific+enhancers+and+promoters.">Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).</li><li>Pekowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4+tri-methylation+provides+an+epigenetic+signature+of+active+enhancers.">H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers.</a> EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).</li><li>Vanhille, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+quantitative+assessment+of+enhancer+activity+in+mammals+by+CapStarr-seq.">High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq.</a> Nat Commun. 6, 6905 (2015).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression.">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li><li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types.">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li><li>Ostuni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+enhancers+activated+by+stimulation+in+differentiated+cells.">Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells.</a> Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).</li><li>Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+regulation+at+Notch+target+genes.">Dynamic chromatin regulation at Notch target genes.</a> Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).</li><li>Liefke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylase+KDM5A+is+an+integral+part+of+the+core+Notch-RBP-J+repressor+complex.">Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex.</a> Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).</li><li>Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+helicase+Ddx5+and+the+noncoding+RNA+SRA+act+as+coactivators+in+the+Notch+signaling+pathway.">RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).</li><li>Oswald, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phospho-dependent+mechanism+involving+NCoR+and+KMT2D+controls+a+permissive+chromatin+state+at+Notch+target+genes.">A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes.</a> Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).</li><li>Arrigoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+chromatin+research:+a+simple+and+universal+method+for+ChIP-seq.">Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq.</a> Nucl Acids Res. 44 (7), e67 (2016).</li><li>Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+interactions+involved+in+Th+cell+memory.">Cellular interactions involved in Th cell memory.</a> J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).</li><li>White, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+better+cell+lines+for+making+hybridomas+expressing+specific+T+cell+receptors.">Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors.</a> J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).</li><li>Ghisletti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+enhancers+controlling+the+inflammatory+gene+expression+program+in+macrophages.">Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages.</a> Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity.">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li><li>Fenouil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+islands+and+GC+content+dictate+nucleosome+depletion+in+a+transcription-independent+manner+at+mammalian+promoters.">CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters.</a> Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).</li><li>Hein, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+methylation+of+Notch1+controls+the+amplitude+and+duration+of+the+Notch1+response.">Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response.</a> Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

ChIP è una tecnica valida per indagare se le proteine ​​oi loro PTM sono arricchite in regioni genomiche specifiche. I risultati del test di ChIP sono spesso impegnativi per interpretare a causa di motivi biologici o tecnici. Le ragioni biologiche sono molteplici e includono il legame debole o indiretto delle proteine ​​al DNA. Ci sono anche limitazioni tecniche, come la limitata specificità degli anticorpi e la lisi cellulare inefficace o la cricatura di cromatina. Una guida alla risoluzione dei problemi ( Tabella 5 ) può aiutare il lettore a risolvere i problemi che potrebbero verificarsi con i test ChIP. Questo protocollo, facendo uso di un dispositivo ultrasonator focalizzato sul raffreddamento, consente di tagliare in modo efficiente la cromatina di una linea cellulare T cellula matura. La fase principale critica del protocollo è rappresentata dalla tranciatura della cromatina, che deve sempre essere ottimizzata per ciascun tipo di cellula. Si suggerisce di variare il numero di celle e il numero di cicli di sonicazione. Inoltre, lei<html> L&#39;efficienza dell&#39;azione è influenzata negativamente dalla presenza di precipitazioni di SDS nei campioni che possono formarsi durante la lisi delle cellule sul ghiaccio con buffer di lisi SDS. In questo caso, è meglio incubare il campione dopo la lisi a temperatura ambiente per alcuni minuti per ridurre la presenza di precipitazioni SDS. Si raccomanda di ottimizzare il protocollo per ottenere frammenti tagliati tra 200 e 500 bp e valutare sempre la qualità di taglio dei campioni prima di procedere con l&#39;immunoprecipitazione. Inoltre, il tempo di fissazione, la quantità di anticorpo e / o le cellule e le condizioni di lavaggio devono essere ottimizzate per ciascun anticorpo. Un ulteriore passo avanti nella realizzazione di una procedura ChIP è la scelta dell&#39;anticorpo, poiché gli anticorpi a bassa specificità riducono in modo significativo l&#39;efficacia dell&#39;immunoprecipitazione. In precedenza, una procedura di test di qualità unificata ha permesso di valutare la specificità di diversi anticorpi disponibili sul mercato<html> Ss = &quot;xref&quot;&gt; 19. La pipeline di screening è stata basata su macchia dot blot, Western blot e ChIP, fornendo un elenco di reagenti di alta qualità adatti per ChIP 19 . Più recentemente, la specificità di alcuni anticorpi disponibili in commercio è stata valutata usando piattaforme microarray a peptide ad alta densità di istone, consentendo la creazione di un database sulla specificità degli anticorpi 20 . Il lettore può utilizzare questo strumento utile per identificare gli anticorpi più specifici che possono essere utilizzati per gli esperimenti ChIP. Questo protocollo non è stato testato per le cellule T primarie e, in questo caso, il lettore dovrebbe fare riferimento a altri protocolli pubblicati che eseguono con successo ChIP sulle cellule T primarie 3 , 4 , 21 . In particolare, questo protocollo è stato utilizzato con successo per eseguire ChIP su una linea di cellule T progenitor del mouse, così come su una linea cellulare endoteliale. Ove_content &quot;&gt; 5 x 10 6 cellule dovrebbero essere utilizzate per ogni immunoprecipitazione per l&#39;analisi dei segni di istone.Perché questo protocollo può anche essere adatto, con qualche ottimizzazione, per eseguire ChIP su TF o cofattori, è meglio aumentare il numero di cellule Utilizzata per l&#39;immunoprecipitazione in questi casi.Per arrivare al numero di cellule richiesto per ogni esperimento, più aliquote di lutea tagliata possono essere raggruppate insieme prima di diluire la cromatina nel tampone di diluizione. Questo protocollo potrebbe anche essere modificato per eseguire ChIP sulle proteine ​​endogene che non si legano direttamente al DNA. In questo caso, è possibile richiedere la pre-fissazione con crosslinkers proteico-proteico ( ad esempio, dimetiladipimidato, DMA) (vedere l&#39;Appendice B per ulteriori informazioni). La buona prestazione di ChIP sui cofattori è stata precedentemente effettuata mediante sovraespressione di proteine ​​che sono fuse con un tag biotinico. In questo caso, la proteina è stata purificata con streptavidin-conjugaPerline magnetiche, e una pre-fissazione con DMA è stata eseguita 22 .

Lo sviluppo, la differenziazione e l&#39;omeostasi dipendono da specifici programmi di espressione genica che vengono stabiliti mediante segnalazione di eventi che modulano la struttura della cromatina e pertanto determinano se un determinato gene viene attivato o represso in maniera cellulare e temporale. Durante lo sviluppo di cellule T, devono essere stabiliti programmi specifici di espressione genica per determinare correttamente la maturazione dei precursori delle cellule T dal doppio negativo (DN) allo stato singolo-positivo (SP), passando attraverso diverse fasi intermedie 1 . Come il programma di espressione genica è dinamicamente regolato durante lo sviluppo di cellule T è stato ampiamente studiato negli anni precedenti da diversi laboratori 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Con modificazioni post-traduzionali (PTMs) di istoni, lo scambio diIsonici canonici con varianti istone, sfratto nucleosomi e metilazione del DNA regolano l&#39;interruttore ON / OFF dei geni. Diversi gruppi hanno esaminato la distribuzione genoma di PTM e varianti istone per determinare marcature associate a diversi stati di cromatina sia nelle regioni regolatori prossimali che distali 7 , 8 , 9 , 10 . Le cascate di segnalazione orchestrano la regolazione dinamica della cromatina mediante lo scambio di enzimi positivi e negativi che modificano cromatina (noti anche come modificatori di cromatina) ad elementi specifici di potenziamento. Questi modificatori di cromatina regolano la struttura della cromatina e quindi la produzione trascrizionale con, ad esempio, la metilazione dinamica dell&#39;istone e l&#39;acetilazione. Questo è il caso nel percorso di segnalazione Notch 11 , 12 , 13 ,14. Dinamico istone PTMs; Scambi con varianti istone; E l&#39;occupazione dinamica degli istoni, dei fattori di trascrizione e dei cofattori può essere studiata mediante saggi di cromatin immunoprecipitazione (ChIP). Gli anticorpi altamente specifici vengono usati per purificare specifici complessi proteici del DNA e il DNA purificato viene analizzato mediante PCR quantitativo (qPCR); Sequenza profonda (ChIP-Seq); O, meno frequentemente, l&#39;ibridazione a microarray (ChIP-ChIP). I test di ChIP sono talvolta impegnativi a causa di complicanze con la lisi delle cellule, taglio della cromatina e / o bassa specificità degli anticorpi. Sono state adottate diverse strategie per migliorare il protocollo, come avviene per NEXSON 15 . L&#39;uso di sonicatori a bagno d&#39;acqua raffreddato evita il riscaldamento del campione che potrebbe danneggiare gli epitopi presenti sulla proteina in esame, ma l&#39;energia necessaria per la tranciatura dei campioni viene disperdita nell&#39;acqua.Un altro miglioramento è stato fatto con lo sviluppo di dispositivi a ultrasuoni focalizzati che impediscono la dispersione dell&#39;energia. Pertanto, i dispositivi a ultrasuoni focalizzati consentono di migliorare la lisi cellulare e la cricatura, eliminando le variazioni indotte dall&#39;operatore e aumentando notevolmente la riproducibilità. Questo lavoro descrive un protocollo (riepilogo schematico in Figura 1 ) per eseguire in modo efficiente il ChIP delle proteine ​​dell&#39;istone in una linea di cellule T di topi chiamata E2-10HA 16 , 17 . Le cellule T sono di solito difficili da lire e la loro cromatina è stata rivelata inefficiente. In questo protocollo, che utilizza un ultrasonicator raffreddato a raffreddamento, il numero di cellule, il buffer di lisi e l&#39;impostazione di taglio sono stati ottimizzati per la linea di cellule T2 mouse da mouse E2-10HA. Questo protocollo consente di eseguire ChIP con un&#39;elevata riproducibilità e in un tempo ragionevole. In effetti, richiedeCirca due giorni per tagliare la cromatina e valutare la qualità della tranciatura e tre giorni per eseguire l&#39;immunoprecipitazione, invertire il reticolato e purificare il DNA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="912">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:496px;">Agilent High Sensitivity D5000 Reagents</td>
			<td style="width:223px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:129px;">5067-5593</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent Tapestation 4200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Covaris S220 AFA System</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">dimethyl adipimidate (DMA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>1502-P121301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Formaldehyde (FMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Insulin solution human&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Iscove&#39;s modified Dulbecco&#39;s medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21980-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5280-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Peptone primatone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phase Lock Gel Heavy 2 ml</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tube AFA Fiber &#38; Cap</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines

I percorsi di segnalazione regolano i programmi di espressione genica attraverso la modulazione della struttura della cromatina a diversi livelli, ad esempio mediante modificazioni post-traslazionali (PTM) delle code di istone, lo scambio di istoni canonici con varianti istone e lo sfratto nucleosomico. Tale regolazione richiede il legame dei fattori di trascrizione sensibili al segnale (TFs) che reclutano gli enzimi che modificano cromatina agli elementi regolatori definiti come potenziatori. Comprendere come le cascate di segnalazione regolino l&#39;attività di miglioramento richiede un&#39;analisi completa del legame delle TF, degli enzimi che modificano cromatina e l&#39;occupazione di marchi specifici di istone e di varianti istone. I campioni di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) utilizzano anticorpi altamente specifici per immunoprecipitazioni di complessi proteici / DNA specifici. La successiva analisi del DNA purificato consente di identificare la regione occupata dalla proteina riconosciuta dall&#39;anticorpo. Questo lavoro descrive un protocollo in modo efficiente peRform ChIP di proteine ​​di istone in una linea cellulare T-cellule matura. Il protocollo presentato consente di eseguire i test ChIP in un tempo ragionevole e con un&#39;elevata riproducibilità.

Le cellule T murine mature sono state sottoposte ad analisi ChIP per indagare l&#39;arricchimento della mono-metilazione della lisin 4 sulla istone 3 (H3K4me1), tri-metilazione della lisina 4 sull&#39;istone 3 (H3K4me3) e l&#39;acetilazione della lisina 27 Istone 3 (H3K27ac), così come l&#39;occupazione nucleosomica, come rivelato da panH3 ChIP. La qualità di taglio è stata valutata mediante analisi su un agarosio di 1,8% ( Figura 2A ) e su un sistema di elettroforesi ( Figura 2B ). H3K4me1 e H3K4me3 sono generalmente utilizzati per identificare rispettivamente siti e promotori di miglioramento ( Figura 3A ). Infatti, H3K4me3 è prominente ma non solo arricchito nei promotori 5 , 8 , 14 . Una caratteristica di valorizzatori attivi deve essere altamente arricchita per H3K4me1 e H3K27ac e poco arricchita per H3K4me3 (&lt;(Figura 3A, pannello superiore), mentre gli incrementi inattivi presentano bassi livelli di H3K4me3 e H3K27ac, ma livelli elevati di H3K4me1 ( Figura 3A , pannello inferiore). Come mostrato nella figura 3B , il gene Glyceraldehyde 3-fosfato deidrogenasi ( Gapdh ) è rappresentativo dell&#39;analisi di promotori di gene attivi ( promotore di Gapdh ). Infatti, mostra livelli elevati di H3K4me3 e H3K27ac e bassi livelli di H3K4me1. Nella figura 3B , Deltex1 ( Dtx1 ) è rappresentativo di valorizzatori inattivi ( Dtx1 enhancer ), in quanto è altamente arricchito per H3K4me1 e poco arricchito per H3K4me3 e H3K27ac. Il deserto di Gene è rappresentativo di una regione priva di geni di codifica e di solito è stata citata come un controllo negativo per i segni attivi di cromatina. L&#39;osservazione che H3K4me1, un marchio di miglioramento ben accolto 4 , 5 , </sup&gt; 7 , 14 , 18 , non è arricchito nel deserto del Gene suggerisce che questa regione manca di potenziatori. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> Figura 1: Panoramica schematica del protocollo ChIP presentato. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> Figura 2: Controllo della qualità di taglio della linea di cellule T cellule mature. ( A ) Sono state tagliate due aliquote diverse della linea di cellule T-cellule T210HA del mouse, e circa 500 ng di DNA purificato sono state analizzate su un agarosio di 1,8% per valutare il loro taglioQualità. ( B ) 1 ng di DNA purificato del campione 2 è stato analizzato mediante elettroforesi per valutare la sua qualità di taglio. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> Figura 3: segni di cromatina che caratterizzano promotori e promotori. ( A ) I potenziatori attivi (pannello superiore) sono caratterizzati da un elevato livello H3K4me1, basso H3K4me3 e alto H3K27ac, mentre i rialzatori inattivi (pannello inferiore) presentano elevati livelli H3K4me1, basso H3K4me3 e basso H3K27ac. ( B ) I campioni presentati nella Figura 2A sono stati raggruppati e utilizzati per l&#39;analisi di ChIP contro i contrassegni istoni H3K4me1, H3K4me3 e H3K27ac e l&#39;occupazione dell&#39;istone, come rivelato da panH3 ChIP. Questa analisi mostra che thE promotore del gene di mantenimento Glyceraldehyde 3-fosfato deidrogenasi ( promoter Gapdh ) è altamente arricchito per H3K4me3 e H3K27ac e abbastanza arricchito per H3K4me1. D&#39;altra parte, l&#39;enhancer del gene inattivo Deltex1 ( Dtx1 enhancer ) è altamente arricchito per H3K4me1 ma poco arricchito per H3K4me3 e H3K27ac. ChIP utilizzando un anticorpo panH3 è stato utilizzato per indagare l&#39;occupazione dei nucleosomi. Il deserto del gene è stato usato come un controllo negativo. Viene mostrato un esperimento rappresentativo. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome del buffer </td><td> Reagente </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td rowspan="5"> Tampone di diluizione </td><td> Sodio dodecIl solfato (SDS) </td><td> 0,01% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1,1% (v / v) </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 16,7 mM </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> 167 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Soluzione DMA </td><td> Dimetil adipimidato (DMA) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Salina di tampone fosfato (PBS) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="3"> Tampone di eluizione </td><td> Sodio dodecilsolfato (SDS) </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Alta tampone di sale </td><td> Sodio dodecilsolfato (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> EthylenediamiAcido nitrutametico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td rowspan="6"> IMDM medium </td><td> Il mezzo di Dulbecco modificato da Iscove (IMDM) </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Siero del bovino fetale (FBS) </td><td> 2% (v / v) </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Peptone primatone </td><td> 0,3 mg / ml </td></tr><tr><td> Soluzione insulinica umana </td><td> 4,8 mg / ml </td></tr><tr><td> Minimo amminoacidi essenziali non essenziali (MEM NEAA) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="4"> Tampone di sale di LiCl </td><td> Cloruro di litio (LiCl) </td><td> 0,25 M </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Basso buffer di sale </td><td> Sodio dodecilsolfato (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Tampone di lavaggio dei branchi di proteine ​​A Sepharose </td><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Sodio dodecilsolfato (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Buffer SDS Lysis </td><td> Sodio dodecilsolfato (SDS) </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EthylenediAcido aminetraacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> TE buffer </td><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Elenco dei buffer e del mezzo utilizzato in questo protocollo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> SOPRA </td><td> OFF </td></tr><tr><td> Picco di potenza </td><td> 150.0 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Fattore di dovere </td><td> 15.0 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> Cicli / scoppio </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Numero di cicli </td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>Tabella 2: Shearing delle impostazioni utilizzate in questo protocollo . Queste condizioni sono state ottimizzate per una linea cellulare T-cellule matura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Fornitore </td><td> Quantità di anticorpo / immunoprecipitazione </td><td> Quantità di cellule / immunoprecipitazione </td><td> Condizioni di lavaggio </td></tr><tr><td> H3 </td><td> Abcam (ab1791) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Una volta in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE </td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td> Abcam (ab8895) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Una volta in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE </td></tr><tr><td> H3K4me3 </td><td> Diagenode (pAb-003-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Una volta in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE </td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td> Diagenode (pAb-174-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Oce in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Diagenode (C15410206) </td><td> Variabile* </td><td> Variabile* </td><td> Variabile* </td></tr><tr><td colspan="5"> * Nel caso del controllo IgG, la quantità di anticorpi e cellule, nonché i passi di lavaggio, devono rispecchiare le condizioni delle altre immunoprecipitazioni. </td></tr></tbody></table> Tabella 3: Anticorpi e condizioni di lavaggio utilizzate in questo studio. <table border="1" fo:keEp-together.within-page = &quot;1&quot; per: keep-with-next.within-page = &quot;sempre&quot;&gt; <tbody><tr><td> Gene </td><td> Primer avanti </td><td> Primer inverso </td><td> sonda </td></tr><tr><td> Promotore di Gapdh (0 kb) </td><td> 5&#39;-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ATTO GC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Enhancer Dtx1 (+26 kb) </td><td> 5&#39;-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> Deserto del gene </td><td> 5&#39;-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: Primer e sonde utilizzate per qPCR in questo studio. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Problema </td><td> Le cause </td><td> Soluzione </td></tr><tr><td rowspan="3"> La cromatina è sotto tosatura e i frammenti sono troppo grandi. </td><td> Sono state utilizzate troppe cellule. </td><td> Ridurre il numero di celle. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Il taglio è troppo basso. </td><td> Aumenta il numero di cicli di taglio. </td></tr><tr><td> Aumenta la potenza di picco di taglio, il fattore di carico e / oi cicli / burst. </td></tr><tr><td rowspan="3"> La cromatina è troppo tesa e i frammenti sono troppo piccoli. </td><td> Sono state utilizzate troppo poche cellule. </td><td> Aumenta il numero di celle. </td></tr><tr><td rowspan="2"> La cesoia è troppo alta. </td><td> Ridurre il numero di cicli di taglio. </td></tr><tr><td> Ridurre la potenza di picco di taglio, il fattore di carico e / oi cicli / burst. </td></tr><tr><td rowspan="11"> Troppo basso di recupero rispetto a meControllo gG e / o controllo negativo (alto sfondo). </td><td> Non è sufficiente cromatina utilizzata per l&#39;esperimento. </td><td> Aumenta la quantità di cromatina. </td></tr><tr><td> Il numero di anticorpi è troppo basso. </td><td> Aumenta la quantità di anticorpo. </td></tr><tr><td> Il numero di anticorpi è troppo elevato. </td><td> Ridurre la quantità di anticorpi. </td></tr><tr><td> L&#39;anticorpo ha bassa specificità. </td><td> Cambiare l&#39;anticorpo. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Le condizioni di lavaggio sono troppo severe. </td><td> Ridurre il numero di lavaggi. </td></tr><tr><td> Ridurre la rigidità dei tamponi di lavaggio. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Le condizioni di lavaggio non sono abbastanza rigorose. </td><td> Aumenta il numero di lavaggi. </td></tr><tr><td> Aumenta la rigidità dei tamponi di lavaggio. </td></tr><tr><td> Troppo DNA è stato pipettato nel qPCR. </td><td> Ridurre la quantità di DNA pipettata nel qPCR. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Le condizioni qPCR non sono ottimali. </td><td> Ottimizzare le condizioni qPCR. </td></tr><tr><td> Ridurre il numero di cicli. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Nessun prodotto o prodotto è troppo basso nella reazione qPCR del campione di input. </td><td> Non è stato sufficiente un DNA pipettato nel qPCR. </td><td> Aumenta la quantità di DNA pipettata nel qPCR. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Le condizioni qPCR non sono ottimali. </td><td> Ottimizzare le condizioni qPCR. </td></tr><tr><td> Aumenta il numero di cicli. </td></tr><tr><td> Non è sufficiente cromatina utilizzata per l&#39;esperimento. </td><td> Aumenta la quantità di cromatina. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Nessun segnale nel controllo positivo e / o PanH3 ChIP. </td><td> Non è sufficiente cromatina utilizzata per l&#39;esperimento. </td><td> Aumenta la quantità di cromatina. </td></tr><tr><td> Il numero di anticorpi è troppo basso. </td><td> Aumenta la quantità di anticorpo. </td></tr><tr><td> L&#39;antiIl corpo ha una bassa specificità. </td><td> Cambiare l&#39;anticorpo. </td></tr><tr><td> L&#39;eluizione è sub-ottimale. </td><td> Assicurarsi di vorticarsi frequentemente i campioni per mantenere le perle in soluzione. </td></tr></tbody></table> Tabella 5: Risoluzione dei problemi.

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Questo lavoro descrive un protocollo per l&#39;immunoprecipitazione cromatina (ChIP) usando una linea cellulare T-cellula matura. Questo protocollo è idoneo per indagare la distribuzione di marchi specifici di istoni in siti specifici di promozione o nel genoma.

Immunoprecipitazione cromatinica (ChIP) nelle linee di cellule T delle cellule

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-in-mouse-t-cell-lines

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

18.2K Views.  University of Giessen.  Questo lavoro descrive un protocollo per l'immunoprecipitazione cromatina (ChIP) usando una linea cellulare T-cellula matura. Questo protocollo è idoneo per indagare la distribuzione di marchi specifici di istoni in siti specifici di promozione o nel genoma. 

Video: Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Ricerca

Genetica

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Analisi del promotore di ligandi di c-KIT utilizzando l&#39;immunoprecipitazione cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina nativo sequenziamento librerie per analisi di densità del nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Cromatina diffusa i preparativi per l'analisi della progressione di ovocita Mouse dalla profase alla metafase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di modificazioni istoniche da Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

CRISPR-mediata di riorganizzazione della struttura della cromatina Loop

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

Modifica di genoma in linee cellulari di mammifero usando CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...