Bu araştırma için maddi destek Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2016YFC1200601) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31390421) tarafından sağlanmıştır.

1. Beyaz sinek yetiştiriciliği ve şifreli türlerin teşhisi <ol><li> 27 ± 1 ° C,% 70 ± 10 nem ve 14 saatlik ışık koşullarında kafeslerde pamuk Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) üzerindeki beyaz sinek türlerini 10 saat karanlık rejimde muhafaza edin. </li><li> Tek bir erişkin beyaz sinek toplayın ve 30 uL liziz tamponunda (10 mM Tris, pH 8.4, 50 mM KCI,% 0.45 [ağ / hacim] Tween-20,% 0.2 [ağ / hacim] jelatin,% 0.45 [hac / hac] Hacim] Nonidet P 40, 60 g / mL Proteinaz K). </li><li> Homojenatı 65 ° C&#39;de 1 saat inkübe edin ve daha sonra 100 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edin. NOT: Gerekirse, 65 ° C&#39;de inkübasyon süresi arttırılabilir. 100 ° C&#39;de inkübasyon süresi, Proteinaz K&#39;yi yeterince inaktive etmek ve DNA hasarını önlemek için kritik bir şekilde kontrol edilmelidir. </li><li> Mitokondrial sitokrom oksidaz primerlerine dayanan beyaz sinek DNA&#39;sını (bölüm 1.3&#39;te edinilen) kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin. COI-F: 5&#39;-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 &#39; COI-R: 5&#39;-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 &#39; <ol><li> PCR reaksiyonlarını, 1 U Taq DNA polimeraz, 2.5 uL 10x Tampon, 0.2 mM dNTP, her primerin 0.2 mM&#39;si ve beyaz sinek DNA&#39;sının 2 uL&#39;si içeren 25 uL&#39;lik bir son hacimde gerçekleştirin. </li><li> Aşağıdaki PCR prosedür koşullarını kullanın: 95 ° C&#39;de 3 dakika ilk denatürasyon ardından 45 saniye için 95 ° C&#39;de (denatürasyon), 45 saniye boyunca 50 ° C&#39;de (tavlama) ve 1 dakika süreyle 72 ° C&#39;de (uzatma) 35 devir döngüsü ve Daha uzatmak için 72 ° C&#39;de 10 dakika. </li></ol></li><li> PCR ile güçlendirilmiş ürünü bir DNA jel özütleme kiti ile önerilen protokolle temizleyin. </li><li> Saflaştırılmış DNA örneklerini üreticinin talimatlarını izleyerek bir DNA numune sıralama sistemi ile sıralayın. </li><li> Beyazilin kriptik türlerini tanımlamak ve diğer spesifikasyonların bulaşmasını önlemek için, Temel Yerel Hizalama Arama Aracını (BLAST) kullanarak dizileri analiz edines. </li></ol> 2. Endosymbiont Tanımlama ve Yerelleştirme <ol><li> Beyaz sineğin içindeki her endozimbiyonun spesifik genlerini yükseltmek için beyaz sinek DNA&#39;sında (Adım 1.3&#39;te edinilen) PCR yapın (PCR tarifi Bölüm 1.4&#39;te anlatılmıştır ve PCR prosedürleri ve primerler Tablo 1&#39;de listelenmiştir). </li><li> Güçlendirilmiş numuneyi, her bir bakterinin spesifik genini tanımlamak için önceden yayınlanmış protokol 20&#39;ye (1% agaroz jel, çalışma tamponu olarak Tris-asetat-EDTA, voltaj 5 V / cm) göre agaroz jel elektroforezine tabi tutun. </li><li> Beyaz sinek içindeki bakteri türünü belirlemek için her bandı kurtarın ve sekanslayın (bkz. Bölüm 1.5-1.7). </li><li> Daha önce yayınlanmış olan protokole göre endozimbiyonların yerlerini tanımlamak için beyaz sinekler üzerinde yerinde melezleşmeleri (FISH) gerçekleştirin 19 . NOT: Gerekirse floresan problarının konsantrasyonunu artırın. </li></ol&gt; 3. İletim Elektron Mikroskopisi (TEM) <ol><li> Beyaz sinekler,% 2.5 [hac / hacim] glutaraldehit içeren fosfat tamponunda (0.1 M, pH 7.0) 4 saat boyunca daldırıp sabitleyin. </li><li> Numuneleri fosfat tamponu (0.1 M, pH 7.0) içinde üç kez yıkayın, her seferinde 15 dakika yıkayın. </li><li> Numuneleri, 2 saat boyunca% 1 [ağırlık / hacim] OsO 4 içeren fosfat tamponunda (0.1 M, pH 7.0) tekrar batırın ve sabitleyin. </li><li> Numuneleri her seferinde 15 dk dereceli bir etanol serisi (% 30,% 50,% 70,% 80,% 90,% 95 ve% 100) ile kurutun. </li><li> Numuneleri 20 dk için% 100 aseton içine aktarın ve daldırın. </li><li> Numuneleri, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 100 aseton ve% 100 Spurr reçinesi (1: 1) karışımı içine yerleştirin. </li><li> Numuneleri oda sıcaklığında 3 saat boyunca% 100 aseton ve% 100 Spurr reçinesi (1: 3) karışımına aktarın. </li><li> Numuneleri, 9 saatten fazla süreyle% 100 Spurr reçinesine (70 ° C&#39;de inkübe edin) aktarın ve daldırın. </li><li> Beyaz sinek numunelerini bir mikrobana göre. </li><li> 5-10 dakika boyunca mutlak uranyil asetata daldırarak ultra ince filmleri (bölüm 3.9&#39;da edinilen), ardından 5-10 dakika süreyle% 50 alkalin kurşun sitrat içine daldırın. NOT: Bölüm 3.1-3.10&#39;da kullanılan reaktiflerin hacimleri numunelere bağlıdır. Numunelerin reaktiflere batırıldığından emin olun. </li><li> Bakteri lokalizasyonunu, şeklini ve büyüklüğünü belirlemek için transmisyon elektron mikroskopisi (15,000X) altında örnekleri inceleyin (bkz. Bölüm 4.6). </li></ol> 4. Whitefly Bakteriomunun Diseksiyonu ve Saflaştırılması <ol><li> Bir mikroskop lamı üzerine 100 uL 1x PBS solüsyonu ekleyin. Pamuk yapraklarından 3. veya 4. talaş nimflerini seçin ve onları PBS solüsyonuna daldırın. </li><li> Bir stereomikroskop altında ince entomolojik iğneler kullanın ve bakteriomları beyaz sinek cisiminden çekin. <ol><li> Nimfin bir tarafındaki bir deliği yavaşça kesip diğerine hafifçe bastırınBakterilerin dışarı çıkmasına izin verin. </li></ol></li><li> 0.5-10 μL&#39;lik bir pipette 20 μL&#39;lik bir mikro yükleyici (bakteriomun boyutunu karşılamak için ön uç kesilmiş olarak) monte edin. Tekli bakteriyi PBS solüsyonundan mikro yükleyiciye çıkarın. </li><li> Bakteriyi PBS solüsyonuna pipetle atarak ve bakteri özütleyerek diğer beyaz sinir dokularının kontaminasyonunu gidermek için bakteri yıkayın. Üç kez tekrarlayın. </li><li> Hemen yıkanmış bakteri 60 μL 1x PBS çözeltisi içeren bir santrifüj tüpüne pipetleyin. </li><li> Şırınga-monte edilen bakteri 5 μm filtre membranı ile filtrelenir (beyaz sinekte bakteriositlerinin bakteri ve çekirdek boyutlarına göre belirlenir). Karışık sıvıyı filtre zarından iyice geçirmek için defalarca tekrarlayın. NOT: Daha iyi bir amplifikasyon ve sıralama sonucu elde etmek için, 100&#39;den fazla bakteriomu bir araya getirin. Bakteri kaybını azaltmak için önce 1x PBS çözeltisi kullanarak filtre zarını ıslatın.Membrana bağlanma. </li></ol> 5. Endozymbiont Genomlarının Amplifikasyonu <ol><li> Süzüntüyü (esas olarak beyaz sinek endozimiviyonlarını içeren) bir DNA amplifikasyon kiti kullanarak, önerilen protokol ile bir miktar değişikliğe uğratarak büyütün. <ol><li> Kan veya hücrelerden genomik DNA amplifikasyonunun önerilen protokolünü seçin ve sonraki deneyler için D2 tamponu hazırlayın. </li><li> Direkt olarak 1.5 μL süzüntü (bkz. Bölüm 4.6) santrifüj tüpüne, ardından 1.5 μL Tampon D2 ilave edin ve iyice karıştırın. </li><li> 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve 1.5 mcL durdurma solüsyonu ekleyin. </li><li> Reaksiyon tamponu ve 1 μL DNA polimeraz&#39;dan 15 uL ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> Karışımı 30 ° C&#39;de 16 saat inkübe edin, bunu takiben 65 ° C&#39;de 3 dakika inkübe edin. </li></ol></li><li> Doğrudan amplifiye süzüntü üzerinde PCR gerçekleştirin (gerekirse amplifiye edilmiş numuneleri seyreltin), bac için tasarlanmış spesifik primerler kullanarakTeria&#39;nın bakteri türlerini teyit etmesi için (bkz. Bölüm 2.1). </li><li> Daha önce yayınlanmış yöntem 21&#39;e göre beyaz sinek gen beta-Aktin ve EF1 primerler kullanılarak konukçu genomunun kontaminasyon olup olmadığı teyit etmek için PCR uygulayın (PCR tarifi, bölüm 1.4&#39;te tanımlanmıştır). </li></ol> 6. Endosymbiont Metagenom Dizilemesi <ol><li> Numunelerin kalitesini test etmek için sekanslandınlmadan önce amplifiye filtrat bir spektrofotometreye ve bir florometreye (imalatçının talimatlarına göre) tabi tutulur ve numunelerin sıralama için kriterleri karşılayıp karşılamayacağına karar verilir. </li><li> Üretici üreticinin talimatlarına göre amplifikatı bir genom dizisine tabi tutun. </li></ol>

<ol>
	<li>Buchner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosymbiosis+of+animals+with+plant+microorganisms.">Endosymbiosis of animals with plant microorganisms.</a> J. Basic Microbiol. 7 (2), (1967).</li><li>Sloan, D. B., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosymbiotic+bacteria+as+a+source+of+carotenoids+in+whiteflies.">Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies.</a> Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).</li><li>Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+pipientis:+microbial+manipulator+of+arthropod+reproduction.">Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction.</a> Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).</li><li>Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+influences+thermotolerance+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci+B+biotype.">Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype.</a> Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).</li><li>Hansen, A. K., Degnan, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+expression+of+conserved+small+RNAs+in+small+symbiont+genomes.">Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes.</a> ISME J. 8, 2490-2502 (2014).</li><li>Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+evolution+of+heritable+bacterial+symbionts.">Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).</li><li>Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+endocellular+bacterial+symbiont+of+aphids+Buchnera+sp.+APS.">Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS.</a> Nature. 407, 81-86 (2000).</li><li>Nikoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origin+of+insect-Wolbachia+nutritional+mutualism.">Evolutionary origin of insect-Wolbachia nutritional mutualism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (28), 10257-10262 (2014).</li><li>Sloan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+histories+of+horizontal+gene+transfer+facilitated+extreme+reduction+of+endosymbiont+genomes+in+sap-feeding+insects.">Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects.</a> Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomes+of+the+rice+pest+brown+planthopper+and+its+endosymbionts+reveal+complex+complementary+contributions+for+host+adaptation.">Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation.</a> Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).</li><li>Campbell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+expansion+via+lineage+splitting+and+genomereduction+in+the+cicada+endosymbiont+Hodgkinia.">Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).</li><li>Wilson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+insight+into+the+amino+acid+relations+of+the+pea+aphid,+Acyrthosiphon+pisum,+with+its+symbiotic+bacterium+Buchnera+aphidicola.">Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola.</a> Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).</li><li>Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+conservation+and+functional+constraint+on+intergenic+spacers+in+reduced+genomes+of+the+obligate+symbiont+Buchnera.">Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera.</a> PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).</li><li>Nakabachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+160-kilobase+genome+of+the+bacterial+endosymbiont+Carsonella.">The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella.</a> Science. 314 (5797), 267 (2006).</li><li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bemisia+tabaci:+a+statement+of+species+status.">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).</li><li>Himler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+a+bacterial+symbiont+in+an+invasive+whitefly+is+driven+by+fitness+benefits+and+female+bias.">Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias.</a> Science. 332 (6026), 254-256 (2011).</li><li>Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+secondary+endosymbionts+among+different+putative+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).</li><li>Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+newly+discovered+symbiont+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).</li><li>Kliot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridizations+(FISH)+for+the+localization+of+viruses+and+endosymbiotic+bacteria+in+plant+and+insect+tissues.">Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues.</a> J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Rao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+reduction+and+potential+metabolic+complementation+of+the+dual+endosymbionts+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci.</a> BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).</li><li>Thao, L. L., Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+relationships+of+primary+prokaryotic+endosymbionts+of+whiteflies+and+their+hosts.">Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).</li><li>Zhu, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+and+comparison+of+the+Rickettsia+genomes+from+the+whitefly+Bemisia+tabaci+Middle+East+Asia+Minor+I.">Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I.</a> Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).</li><li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+localization+of+a+Rickettsia+sp.+in+Bemisia+tabaci+(HomopteraAleyrodidae).">Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae).</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).</li><li>Zhang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+temporal+changes+of+primary+and+secondary+bacterial+symbionts+and+whitefly+host+fitness+following+antibiotic+treatments.">Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments.</a> Sci. Rep. 5, 15898 (2015).</li><li>Shan, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+of+symbiont+density+and+host+fitness+after+rifampicin+treatment+in+a+whitefly+of+the+Bemisia+tabaci+species+complex.">Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex.</a> Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).</li><li>Zchori-Fein, E., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+prokaryotes+asscociated+with+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).</li><li>Thao, M. L., Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+relationships+of+primary+prokaryotic+endosymbionts+of+whiteflies+and+their+hosts.">Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).</li><li>Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+the+bacterial+symbiont+Cardinium+in+arthropods.">Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods.</a> Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).</li><li>O'Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=116S+rRNA+phylogenetic+analysis+of+the+bacterial+endosymbionts+associated+with+cytoplasmic+incompatibility+in+insects.">116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).</li><li>Nirgianaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).</li><li>Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chlamydiae+in+whiteflies+and+scale+insects:+endosymbionts+'Candidatus+Fritschea+bemisiae'+strain+Falk+and+'Candidatus+Fritschea+eriococci'+strain+Elm.">Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts 'Candidatus Fritschea bemisiae' strain Falk and 'Candidatus Fritschea eriococci' strain Elm.</a> Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga...

Nispeten konaklarla yakın bir simbiyotik ilişki oluşturan bakteriler eklembacaklılarda yaygın 1 . Beslenme metabolizması, reprodüksiyon, çevresel streslere verilen cevaplar 2 , 3 , 4 vb. Gibi neredeyse her gelişme evresindeki endosymbionların konukçuların özelliklerini etkilediği gösterilmiştir 5 . Bununla birlikte, derneklerin altında yatan mekanizma halen bilinmiyor. Bakterilerin potansiyel işlevleri ve rolleri incelendiğinde genomik öncelik ve önem taşır. Bazı temel bilgiler, yani taksonomik durum, fonksiyonel genler, metabolizma yolları, salgı sistemleri, simbiyozlarda sembiyonların potansiyel rollerini aydınlatan genom dizilerinden çıkarılabilir. Yüksek verimli sekanslama geliştirildiğinde, çok sayıda bakteri genomu dizilenmiştir.Çeşitli işlevler gösterdi 6 . Endosymbionts, hemipteranlarda yaprak bitleri 7 , bedbugs 8 , psyllids 9 , kahverengi planthoppers 10 ve cicadas 11 gibi hayati öneme sahiptir. Örneğin, zorunlu sembiyot olan yaprak bitleri içindeki Buchnera&#39;nın , yaprak biti genomundan genler ile birlikte gerekli amino asitler biyosentezine karıştığı gösterilmiştir. Dahası, 13 Buchnera&#39;nın transkripsiyonel düzenlenmesi de ortaya çıkarılmıştır 13 . Psyllids&#39;de, Carsonella sıralanır ve şimdiye kadar bulunan en küçük bakteri genomasına 14 puan yerleşmiştir. Endozimbiyonların tüm bu belirteçleri genom dizilerinden kaynaklanır ve çıkarılır. Bu endozimbiyonlar in vitro ortamda kültürlenemediğinden, sıra için yeterli bakteri izole etmek için çeşitli yaklaşımlar uygulanmıştıruencing. Yaprak bitlerinde, endozimbiyonlar santrifüjleme ve filtrasyon yoluyla ekstrakte edilir ve daha ileri genomik ve transkriptomik analizlere tabi tutulur 5 . Kahverengi plantopperlerde endozimbiyonlar bütün böcek genomu 10 ile birlikte dizilir. Whitefly B. tabaci , 35&#39;den fazla morfolojik olarak ayırt edilemez türü (kriptik türler) içeren bir tür kompleksidir ve bunların arasında iki istilacı tür tüm dünyayı işgal etti ve tarımsal üretime büyük zarar verdi 15 . Dikkat edin, B. tabaci türleri içerisindeki endosimiviyonlar zararlıların gelişiminde önem taşırlar 16 . Bugüne kadar, zorunlu sembiyot , Candidatus Portiera aleyrodidarum ve yedi sekonder sembiyot dahil olmak üzere , beyaz sinekte sekiz endonimviyon belirlendi Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium ,Em&gt; Wolbachia, Fritschea ve Hemipteriphilus 17 , 18&#39;i tanımladı . Daha önce tarif edilen hemipteranlardan farklı olarak, beyaz sinek B. tabaci sadece 1 mm uzunluğunda çok küçük bir böcektir. Çoğu endozimbiyon, bakteriositler 19 (B. tabaci&#39;de bakteri oluşturan simbiyon içeren özel hücreler) ile sınırlandırılmıştır. Buna ek olarak, bu endozimbiyonlar in vitro kültürlenemezler. B. tabaci&#39;den endozimbiyon elde etmenin tek yolu bakteriyi ayırmaktır. Bununla birlikte, diseksiyonda zorluk vardır. Öncelikle, kırılgan bakteriom her zaman whitefly&#39;un diğer dokuları ile birbirine bağlanır ve bu da ayrılması zor olur. İkincisi, beyaz sinekin küçük boyutu, yeterli bakteri oluşumunu sınırlar. Üçüncü olarak, endozimbiyonlar bakteride birleşir, tek bir bakteri türü edinmek son derece karmaşık hale gelir. <p clAss = &quot;jove_content&quot;&gt; Burada, whitefly endosimbiyonlarını izleyen metagenome dizilimi için basit ve ucuz bir protokol bildirdik. Diseksiyon, arıtma ve amplifikasyon yoluyla yeterli endozimivyon DNA elde edilebilir ve bakteri türleri teyit edilebilir. Tarif edilen protokol, diğer eklembacaklılarda benzer şekilde kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="775">
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td style="width:107px;">Takara</td>
			<td style="width:129px;">R001A</td>
			<td style="width:296px;">including rTaq, 10&#215;Buffer and dNTP</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Gel DNA extraction kit</td>
			<td style="width:107px;">Qiagen</td>
			<td style="width:129px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">DNA sample sequencing system</td>
			<td style="width:107px;">ABI</td>
			<td style="width:129px;">ABI-3730XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Microtome</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:129px;">EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:107px;">Hitachi</td>
			<td style="width:129px;">H-7650 TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:107px;">Zeiss</td>
			<td style="width:129px;">Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">20 &#956;L microloader</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">F2771951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Filter holder</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:129px;">SX0001300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Filter membrane filter</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:129px;">SMWP001300</td>
			<td>5.0 &#956;m SMWP</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">REPLI-g UltraFast Mini Kit</td>
			<td style="width:107px;">Qiagen</td>
			<td style="width:129px;">150033</td>
			<td>DNA amlification kit</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">NanoDrop</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">NanoDrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Genome Sequencer</td>
			<td style="width:107px;">Illumina</td>
			<td style="width:129px;">Hiseq 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the extraction of endosymbionts from the whitefly bemisia tabaci

Bakteriyel sembiyonlar ev sahipleri ile samimi bir ilişki kurarlar ve çoğu durumda ev sahiplerine avantaj sağlarlar. Genomik bilgi, konukçularındaki bakteri sembiyonlarının işlevlerini ve evrimini incelemek için kritik önem taşır. Çoğu simbiyon, in vitro ortamda kültürlenemediğinden, genom dizilimi için yeterli sayıda bakteri izole etme yöntemleri çok önemlidir. Beyaz sinek Bemisia tabaci&#39;de, çeşitli endozimbiyonlar tespit edilmiş ve zararlıların gelişimi ve çoğaltılmasında çoklu yaklaşımlarla önemi olması öngörülmüştür. Bununla birlikte, derneklerin altında yatan mekanizma halen bilinmiyor. Engel, kısmen bakteriositlerle sınırlandırılmış beyaz sinir hücrelerindeki endozimbiyonların konukçu hücrelerden ayrılması zor olmasından kaynaklanmaktadır. Burada beyaz sinek B. tabaci&#39;den başta dissekte olmak üzere endozimbiyonların tanımlanması, ekstraksiyonu ve saflaştırılması için bir adım adım protokol bildirilmektedirVe filtrasyon. Bu yöntemle hazırlanan endosymbiont örnekleri, yine de farklı endosimbit türünün bir karışımı olmasına rağmen, B. tabaci&#39;de endozimbiyonların olası rollerinin analizi ve izlenmesi için uygundur. Bu yöntem aynı zamanda endozimiviyonları diğer böceklerden ayırmak için de kullanılabilir.

B. tabaci kompleksinin Ortadoğu Küçük Asya 1 (MEAM1) türü, açıklama için bir örnek olarak alınmıştır. Beyaz sinekler ve beyazlatıcıların birkaç gelişme evresi için pamuk, bir pamuk bitkisi, yetişkin beyaz sinek ve beyaz sinekin 1., 2. ve 4. talaş nimfleri dahil olmak üzere Şekil 1&#39;de gösterilmektedir ( 3. yaş çiçekleri, 4. talaş perdesine benzer şekilde görünür ). 4. in...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci at JoVE.com

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Burada, beyaz sinek Bemisia tabaci&#39;den endosimiviyonları diseksiyon ve filtrasyon yoluyla izole etmek için bir protokol sunuyoruz. Büyütmeden sonra DNA örnekleri, endosimbiyonlar ile beyaz sinek arasındaki karşılıklı etkileşimin izlenmesi ve izlenmesi için uygundur.

Beyaz sinekten Endosimbonların Çıkarılması İçin Yöntemler<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

methods-for-extraction-endosymbionts-from-whitefly-bemisia

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

9.8K Görüntüleme.  Zhejiang University.  Burada, beyaz sinek Bemisia tabaci'den endosimiviyonları diseksiyon ve filtrasyon yoluyla izole etmek için bir protokol sunuyoruz. Büyütmeden sonra DNA örnekleri, endosimbiyonlar ile beyaz sinek arasındaki karşılıklı etkileşimin izlenmesi ve izlenmesi için uygundur. 

Video: Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Kaliks Patch Kelepçe Kapasitans Kayıtlar Yöntemleri

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Biyoloji

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

RNA veya Protein Ekstraksiyonu Özgül Beyin Bölgesi&#39;nden Rat Beyin Mikro-disseksiyon

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Bio-Rad Total RNA Kiti Kullanarak Neuroprecursor Hücreler RNA Ekstraksiyon

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

Drosophila Larva NMJ Synaptic Potansiyeller kayıt için Elektrofizyolojik Yöntemler

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Zebra balığı Maksiller Bärbel Çalışma Yöntemleri

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component which can be extracted with an appropriate signal filter. Two factors are important: the EMG must be recorded in monopolar fashion, and the recording must be done so the low frequency signal corresponding the EPP is not eliminated. This report explains how to extract the EPP component from the EMG of the masseter muscle in a human subject. The surface EMG is recorded from eight sites using traditional disc electrodes aligned along over the muscle, with equal inter-electrode distance from the zygomatic arch to the angle of mandible in response to quick gum clenching. A reference electrode is placed on the tip of the nose. The EPP component is extracted from the raw EMGs by applying a high-cut digital filter (2nd dimension Butterworth filter) with a range of 10-35 Hz. When the filter is set to 10 Hz, the extracted EPP wave deflects either negative or positive depending on the recording site. The difference in the polarity reflects the sink-source relation of the end plate current, with the site showing the most negative deflection corresponding to the neuromuscular junction. In the case of the masseter muscle, the neuromuscular junction is estimated to be located in the inferior portion close to the angle of mandible. The EPP component exhibits an interesting oscillation when the cut-off frequency of the high-cut digital filter is set to 30 Hz. The EPP oscillation indicates that muscle contraction is adjusted in an intermittent manner. Abnormal tremors accompanying various sorts of diseases may be substantially due to this EPP oscillation, which becomes slower and is difficult to cease.

The endplate potential (EPP) component can be extracted from the surface EMG using a digital filter. The extracted EPP shows oscillation with a frequency of about 30 Hz.

Yüzey EMG EPP Bileşeni çıkarımı

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

Tesisinden Akışkan apoplastik çıkarımı için infiltrasyonu-santrifüj Tekniği Kullanarak bırakır<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Bir örnek olarak

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...