We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Tüm hayvan prosedürleri Colorado Anschutz Tıbbi Campus Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır protokollere uygun olarak yapıldı. Standart protokol aşağıda yaşı 2-3 ay erkek C57BL / 6J fareler kullanılarak optimize edilmiştir. 1. Deneylerin Advance Çözüm Stoklar ve Malzemeleri hazırlayın NOT: Gerekli ekipman ve malzeme malzemeleri Tablo bakın. <ol><li> Komple Tyrode, Düşük Ca 2 + / Mg 2 + Tyrode en Modifiye Kraft-Brühe (KB) Çözüm ve Sığır Serum Albumin (BSA) Çözüm: Tablo 1&#39;de gösterildiği gibi 1 L aşağıdaki çözümlerden her hazırlayın. Kullanım ultra saf tüm çözümler için deiyonize su süzülür. en fazla altı ay boyunca 20 ° C&#39;de her biri 50 ml&#39;lik miktarlar halinde solüsyonu ve mağaza bölün. hemen deneyler önce bireysel alikotları çözülme ve bir haftaya kadar 4 de için saklamak6 ° C. </li><li> Ultra saf süzülmüş deiyonize edilmiş su (Tablo 1) NaCI ve CaCl2 çözülmesiyle, 10 mM NaCl ve 1.8 mM CaCl2 İntibak çözeltisinin 50 ml hazırlayın. altı aya kadar oda sıcaklığında saklayınız. </li><li> mikrofüj tüplerine pipetleme elastaz 4.75 enzim aktivitesi birimi (U) alikotları hazırlayın. en fazla üç ay süreyle 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Mikrofuge&#39;de tüpler içine pipetleme kollajenaz-proteaz enzim karışımının (ultra saf H 2 O) 375 mg alikotları hazırlayın. üç aya kadar -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> (Şekil 1Aiv ve Şekil 1C ~ 1.5 mm nihai açılış çap) ve ayrışma için bir (~ 2 mm çap; Şekil 1Aiii ve Şekil 1C) iki yangın cilalı Pasteur pipet, doku transferi için bir hazırlayın. <ol><li> Skor Pasteur, bir cam kesici ile pipetler ve istenen boyuttan biraz daha büyük bir açıklık üretmek için skor boyunca oturtun. Ateşkalın cilalı duvar ve istenen çapta bir açılış üretmek için Bunsen beki üzerinde Kısık ateşte ~ 30-60 saniye boyunca her pipet kesik ucunu -Lehçe. yangın cilalı açılış herhangi bir çatlak veya pürüzlü kenarlara serbest olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Ekleyerek iki diseksiyon yemekleri hazırlamak ~ 25 ml silikon elastomer her 100 mm Petri kabı üreticinin talimatlarına (Şekil 1Ai ve Şekil 1B) göre karışık. 48 saat oda sıcaklığında bekletilmelidir. </li><li> Kültür için sadece: ml&#39;lik 25-50 hazırlamak her Kaplama Orta ve Tablo 2&#39;de göre Kültür Orta Mağaza iki haftaya kadar 4 ° C.. </li></ol> 2. hazırlayın Çözümleri Hücre İzolasyon günü Kullanılacak NOT: Aşağıdaki tutarlar bir fareden sinoatriyal miyositler izolasyonu için vardır. <ol><li> Ekle 2.5 Düşük Ca mi 2+ üç küçük, yuvarlak tabanlı kültür tüpü her bir / Mg2 + Tyrode (pH 6.9)s. 35 ± 1 ° C su banyosunda yerleştirin borular. </li><li> Düşük Ca 2 + / Mg 2 + Tyrode için büyük bir yuvarlak dipli bir kültür tüp 2.5 ml ekleyin. Bu tüp, 1 kısım (4.75 U) elastaz ve bir kısım (375 ug), kolajenaz-proteaz enzimi karışımını ekleyin. karıştırmak için girdap. 35 ± 1 ° C su banyosunda yer tüpü. </li><li> Üç ilave küçük, yuvarlak dipli bir kültür tüpleri ve ek büyük, yuvarlak tabanlı kültür tüpüne KB aracı maddesi içinde 2.5 ml. 35 ± 1 ° C su banyosunda yerleştirin borular. </li><li> büyük bir yuvarlak tabanlı kültür tüpü BSA çözeltisi ~ 7 ml ekleyin. Oda sıcaklığında bu tüp tutun. </li><li> 50 ml&#39;lik bir cam kaba (Şekil 1Aii) tam Tyrode çözeltisi 20-40 ml yerleştirin. karıştırmak için 10 USP / ml heparin, girdap ekleyin ve 35 ± 1 ° C su banyosunda beher yerleştirin. </li></ol> Kültür Hücreler (Akut İzole Hücreler için bu adımlar atla) 3. Ek Çözümler ve Materyalleri hazırlayın <ol><li>steril doku kültürü kaputu, 24 oyuklu plakanın bireysel çukurlar halinde fare başına iki adet 12 mm yuvarlak cam lameller üzerine yerleştirin. NOT: Kuyular sonraki viral enfeksiyonlar için hacmini sınırlamaya yarar uygun bir boyut, çünkü 24 plaka kullanılır. </li><li> Pipet, her lamel üzerine steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde seyreltilmiş fare laminin bir 100 ng / ml çözelti, yaklaşık 200 ul. </li><li> 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde izolasyon (en az 1 saat) boyunca laminin ile lamelleri inkübe edin. </li><li> Pre-sıcak Kaplama Orta ve kültür ortamında 37 ° C (Kademe 1.7 ve Tablo 3&#39;ten). </li></ol> 4. Sinoatriyal Düğüm İzolasyon <ol><li> Kimyasal davlumbaz, iki odacık kutusunun bir odasında bir fare koyun ve diğer odasına bir pamuklu çubukla aracılığıyla tanıtıldı ~ 200 ul sıvı izofluran ile uyutmak. Bir ayak tutam (genellikle 30-60 sn ~ içinde) anestezi onaylayın. euthanizeservikal dislokasyon ile fare. Not: Boş 1 ml pipet ucu kutusu, iki odacık kutusunu oluşturmak için kullanılabilir; doğrudan temas fare önlemek için izofluran için ayrı bir bölme oluşturmak için kutuya ters raf çevirin. </li><li> Dış dokusu forseps (Şekil 1Aviii) ve diseksiyon makas (Şekil 1Avix) kullanarak göğüs boşluğuna maruz makas ve transect göğüs kafesine göğüs kürk çıkarın. ~ 2 ml Heparin bir transfer pipet kullanarak komple Tyrode en ısındı ile göğüs boşluğunu yıkayın. NOT: Gerektiğinde hazırlık kurumasına izin vermeyin, deniz göğüs boşluğunu devam edin. </li><li> Bir mikroskop altında dikkatle akciğerleri kaldırmak ve iç makas (Şekil 1Avi) ve diseksiyon forseps (Şekil 1Avii) kullanarak timüs. </li><li> yavaşça iç diseksiyon forseps ile kalbin apeks tutarken dikkatli inferior vena kava ve a kestiİç makas ile orta göğüs boşluğunda kalp kaldırmak için. Silikon diseksiyon yemekleri birine kalbini aktarın ve ~ 4 ml Komple Tyrode transfer pipet kullanarak heparinize ısıtılan ile yıkanmak. </li><li> Orient kalp posterior damarları görünür ve deneycinin soldaki hayvanın deneycinin sağda sağ atrium ve sol atrium ile yukarı bakacak olduğunu. odaklı sonra, silikon diseksiyon çanak içine apeks ile iğneleyerek kalbi hareketsiz. </li><li> Ventriküller ve kulakçıklar (ventriküllerin yukarıda açık halka) arasındaki oluk bulun. </li><li> İç diseksiyon makas kullanarak, kulakçıklar daha ventriküllere yakın tutarak oluk bir kesi yapmak. Ek ısındı heparinize Komple Tyrode olarak kulakçıklar ve vanalar net bir görüş sağlamak için gerekli en oluk ve kesi yıkayın. ventriküllerden gelen atrial ayırmak için oluk boyunca kesmeye devam. </li><li>İkinci silikon diseksiyon çanak atriyal doku transferi ve ~ 3 ml Komple Tyrode en heparinize ısıtılan ile yıkanmak. </li><li> Orient hayvanın sağ atrium deneycinin solda şimdi doku böylece, ve sol atrium sağ açık. NOT: Sol atriyum koyu kırmızı tonu daha sahipken sağ atrium, daha şeffaftır. </li><li> yavaşça hazırlık germe, alt ve üst vena kava inferior ve sağ ve sol atriyal uzantıları aracılığıyla doku sabitleyin. hazırlık (sinoatriyal düğüm oldukça hassas ve kolayca zarar görebilir olarak, atriyal duvar oyulmuş için dikkatli olun) net bir görüş sağlamak için kalan yağ veya diğer doku çıkarın. </li><li> ana toplardamarlar aracılığıyla keserek atriyum ön duvarını açın. İnteratriyal septum görselleştirmek için gerekli işaretçilerine yeniden konumlandırmak. </li><li> Sol atrium kaldırmak için septumun boyunca kesilir. nazikçe germe, hazırlık yeniden pin. </li><li> t kaldırsağ kulakçık o ve atriyal apendiks çevreleyen koyu turuncu çizgi olarak görünür kristalarında terminalisin boyunca keserek sinoatriyal düğüm özgür. </li><li> düğüm doku yeniden pin ve üç eşit büyüklükteki şerit üretmek için (krista terminalisin dik) yanal kesti. </li></ol> 5. Sinoatriyal Düğüm Sindirim <ol><li> Dar ateş cilalı bir pipet (Şekil 1Aiv) kullanılarak, düşük Ca 2.5 mL içeren üç küçük, yuvarlak dipli tüp, ilk olarak sinoatriyal düğüm dokusunun üç şerit aktarma 2 + / Mg2 + Tyrode 35 ± 1 ° &#39;de C su banyosu. 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 2.5 ml düşük Ca içeren ikinci küçük, yuvarlak dipli tüp doku transferi şeritleri 2+ aynı dar pipet kullanarak / Mg 2+ Tyrode en 35 ± 1 ° C su banyosunda. Nazik tüp dönen ya da hafifçe dar pipet ile pipetleme doku şeritleri yıkayın. Do not invertüp t. </li><li> 2.5 ml düşük Ca içeren üçüncü küçük, yuvarlak dipli tüp doku transferi şeritler 2+ / Mg 2+ Tyrode en ve adım 5.2&#39;de açıklanan yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> Düşük Ca 2.5 ml su ihtiva eden büyük bir yuvarlak tabanlı tüp içine aktarın şeritleri 2 + / Mg2 + Tyrode 35 ° C su banyosu içinde enzimler (elastaz artı kolajenaz-proteaz karışımı) ile. Her üç doku şeritleri mevcut olduğundan emin olun. 35 ± 1 ° C&#39;de 10-15 dakika inkübe edilir. tüp hafifçe dönen her 5 dakikada bir karıştırın. tüp ters etmeyin. </li></ol> 6. Sinoatriyal Düğüm miyosit Ayrılma <ol><li> enzim sindirimi takiben yavaşça 35 ± 1 ° C &#39;de 2.5 ml KB çözeltisi içeren ilk küçük, yuvarlak dipli tüp, doku şerit aktarma dar yangın parlatılmış pipet kullanın. tüp hafifçe dönen dokuyu yıkayın. Not: Doku şeritleri biraz saydam görünür ve inci de bir araya gelme olabilirnoktasıdır. hücreleri kaybetmemek için enzimatik sindirim sonra çok nazikçe anlaştım. </li><li> 35 ± 1 ° C &#39;de 2.5 ml KB ihtiva eden ikinci bir küçük yuvarlak tabanlı tüp doku aktarın. yıkamak için hafifçe karıştırılır. </li><li> 35 ± 1 ° C &#39;de 2.5 ml KB ihtiva eden üçüncü bir küçük yuvarlak tabanlı tüp doku aktarın. yıkamak için hafifçe karıştırılır. </li><li> 35 ± 1 ° C &#39;de 2.5 ml KB içeren büyük yuvarlak tabanlı tüp doku aktarın. </li><li> Bakımı, yaklaşık 0.5-1 Hz 5-10 dakika sabit toz haline getirilerek büyük yuvarlak dipli tüp içinde hücreleri ayırmak, büyük yangın cilalı pipet (Şekil 1Aiii ve Şekil 1C) kullanarak batmış ayrışma tüp tutmak için 35 ± 1 ° C su banyosu çözeltiye baloncuklarının oluşumunu ortadan kaldırmak için. Not: tritürasyon süresi ayrışma pipet çapı ve pipetleme kuvvetine bağlı olarak değişir. doku parçaları t kalan böylece Zaman ayarlanabilir olmalıdıro ayrışma sonunda, ince şeffaf ve incecik görünür. Doku herhangi bir renk elde tutarsa, ayrışma eksik olması muhtemeldir. Frekans (0.5-1 Hz) elle tespit edilir. </li><li> Su banyosu ayrışmış SAMs ihtiva eden yuvarlak tabanlı tüp çıkarın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında dengelenmeye. </li></ol> 7. Sinoatriyal Düğüm Kalsiyum yeniden adaptasyon (oda sıcaklığında gerçekleştirilir) Not: SAMs kültürü deneyleri için tahsis edilmiş, aşağıdaki bölümde prosedürü steril doku kültürü kaputu yapılmalıdır. SAMs akut deneyler için kullanılacak ise, steril bir ortamda aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için gerek yoktur. <ol><li> NaCI / CaCl2 adaptasyon çözeltisi (Tablo 2) 75 ul ekle. karıştırmak ve 5 dakika boyunca inkübasyona hafifçe karıştırılır. </li><li> NaCI / CaCl2 adaptasyon çözeltisi 160 ul ekle. karıştırmak ve 5 dakika boyunca inkübasyona hafifçe karıştırılır. </li><li> BSA sol 390 ul ekleyinKatkı (Tablo 2). karıştırmak ve 4 dakika boyunca inkübasyona hafifçe karıştırılır. </li><li> BSA çözeltisi, 1.25 ml ilave edilir. karıştırmak ve 4 dakika boyunca inkübasyona hafifçe karıştırılır. </li><li> BSA çözeltisi 4.37 ml ilave edilir. karıştırmak ve 4 dakika boyunca inkübasyona hafifçe karıştırılır. Not: kalsiyum nihai konsantrasyon 1.8 mM olacaktır. </li><li> Kalsiyum yeniden adaptasyonu sonra 3 dakika boyunca ~ 2,000 x g&#39;de 10 dakika ~ ya da santrifüjleme ile yerçekimi ile yerleşmeye izin vererek SAMs toplar. <ol><li> akut izole hücreler için, hafifçe yaklaşık 2 ml&#39;lik bir hacme hücreleri bırakarak çıkarın ve bir cam Pasteur pipet kullanılarak süpernatan, yaklaşık 5 ml atın. yama kelepçe kayıtları için 8 ° &#39;ye kadar saat oda sıcaklığında bu hücreleri saklayın. </li><li> kültürlenmiş hücreler için, steril bir cam Pasteur pipet kullanılarak mümkün süpernatan kadar çıkarın. Önceden ısıtılmış 1 ml içinde süspanse hücre topağı (37 ° C) Kaplama Orta (Tablo 2). </li></ol></li></ol> Sinoatriyal Myo 8. Kaplama ve Kültürlenfositler (akut olarak izole edilmiş hücreleri için yap) <ol><li> Pasteur pipeti ile Adım 3,3 lamelleri gelen laminin çözüm çıkarın. Hemen (adım 3), her bir laminin kaplı lamel üzerine 500 ul (~ 50-100 hücre) tohum. Not: Kontraktil inhibitörü 2,3-bütandion monoxime (DGM), hücrelerin 9 yıpratma neden kasılmasını önlemek için kaplama ve kültür ortamı dahildir. </li><li> Inkübatör yeni ekilmiş SAMs ihtiva eden 24 oyuklu plaka geri dönün ve% 95 hava /% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de muhafaza. Hücreler kaplama medyada 4-6 saat (Tablo 2) lamelleri uymak için izin verin. </li><li> Yavaşça steril bir Pasteur pipeti kullanarak Kaplama Orta kaldırın. Önceden ısıtılmış (37 ° C) kültür Orta oyuk başına 500 ul (Tablo 2) ile değiştirin. </li></ol> Yetişkin Sinoatriyal miyosit Kültürlerin 9. adenoviral İletimi (Akut İzole Hücreler için atla) <ol><li> ce sayısını tahminhemen büyütme için düzeltme, bir mikroskop altında bir görüş alanı hücreleri sayılarak adenovirüs uygulamadan önce lamel başına rf. tüm hücreleri değil, sadece SAMs güvenin. </li><li> Ortama 199 adenovirüs seyreltilir ve 1-10 ul bu uygulama, hücre başına 100, viral birimlerinin enfeksiyonun nihai çok sayıda (İB) elde etmek için gerekli olan şekilde, viral titresi için seyreltme ayarlayın. doğrudan kaplamalı SAM üzerine damla damla adenoviral solüsyonu ekleyin. </li><li> virüs içeren ortam gece boyunca (~ 12-14 saat) kuluçkaya bırakılır. Sonra taze kültür ortamı ile değiş tokuş. istenilen protein ifadesi elde edilene kadar, kültür ortamı, her 48 saat değişen inkübatör hücreleri korumak. </li></ol> Akut İzole veya Kültür SAMs 10. Fonksiyonel Değerlendirme NOT: Aşağıdaki protokol spontan AP ve ben hem kayıt delikli yama tekniği amfoterisin kullanılarak izole SAMs fonksiyonel değerlendirmelerin bir örnektir <sub&gt; aynı hücreden f (referans 9 bakınız). <ol><li> Tablo 3&#39;te tarif edildiği gibi bir kayıt çözelti hazırlayın. </li><li> kayıt gününde taze DMSO içinde 20 mg / ml amfoterisin B bir stok çözelti hazırlayın. Oda sıcaklığında stok tutmak ve ışıktan korumak. 200 ug bir son konsantrasyona kadar, hücre içi çözelti içerisinde bir grup amfoterisin B stokunu / kullanımdan hemen önce ml. Buz üzerinde nihai bir pipet çözeltisi muhafaza etmek ve ışıktan koruyunuz. Not: deneyler için amfoterisin içeren pipet çözeltisi, en az 1 dakika boyunca hücre içi çözeltisi ve vorteks içine stok çözeltisinin bir tam kısmı seyreltilmesiyle saat taze hazırlanmalıdır. </li><li> bir kısım transfer akut SAM hücre süspansiyonu veya 35 ± 1 ° C &#39;de Tyrode çözeltisini ihtiva eden bir kayıt odasına kültürlenmiş SAMs taşıyan cam lamel bir fragmanını ayrıştırılır. en az 2 dakika önce elektrofizyolojik recordin için Tyrode çözeltisi ile hücrelerin serpmekGS kültür ortamından geri kalan herhangi bir artık BDM kaldırın. NOT: Spontan kasılmalar hemen Tyrode çözümü transfer üzerine belirgin olmalıdır. Kayıt için SAMs spontan kasılma aktivitesi, karakteristik morfolojisi (örneğin., Şekil 2), şeritlerin eksikliği HCN4 proteininin ekspresyonu, bir ön akımın varlığı, membran kapasitans &lt;50 pF ve kendiliğinden APS gibi özelliklerin bir kombinasyonu ile tespit edilebilir bir diyastolik depolarizasyon fazı ve yavaş upstroke içeren dalga ile. </li><li> 1.5-3.0 M? Dirençleri ile borosilikat cam pipetler kullanılarak, hücre içi çözelti ile ucu doldurmak 10-30 saniye daldırma tarafından amfoterisin yetersizdi. Sonra amfoterisin içeren çözelti ile pipet geri doldurun. Bir GΩ hücre bağlı mühür mümkün olduğunca çabuk alınmalıdır. mühür oluşumu zor ise, uç-dolgu süresini artırın. NOT: Erişim direnci sürekli olmalıdırHücre-conta takılı oluşumu takip izlenir ve kayıtları sadece &lt;10 M? istikrarlı bir erişim direncini alındıktan sonra başlanmalıdır. </li><li> spontan AP kaydetmek için, hiçbir geçerli enjeksiyonu ile hızlı akım kelepçe moduna amplifikatörün. Not: Daha önce 10 belirtildiği gibi, ateşleme hızı kararlı hale APS kaydederken 1 nM izoproterenol hücre dışı Tyrode çözeltisi dahildir. </li></ol>

<ol>
	<li>Irisawa, H., Noma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+currents+in+mammalian+nodal+cells.">Pacemaker currents in mammalian nodal cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).</li><li>DiFrancesco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+mechanisms+in+cardiac+tissue.">Pacemaker mechanisms in cardiac tissue.</a> Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).</li><li>Mangoni, M., Nargeot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+regulation+of+the+heart+automaticity.">Genesis and regulation of the heart automaticity.</a> Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).</li><li>Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+keeps+us+ticking:+a+funny+current,+a+calcium+clock,+or+both.">What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both.</a> J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).</li><li>Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+modulation+of+hyperpolarization-activated+HCN4+channels+by+protein+kinase+A+in+the+mouse+sinoatrial+node.">Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node.</a> J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).</li><li>Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myristoylated+peptides+potentiate+the+funny+current+(I(f))+in+sinoatrial+myocytes.">Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes.</a> Channels. 5 (2), 115-119 (2011).</li><li>Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressed+pacemaker+activity+of+sinoatrial+node+myocytes+contributes+to+the+age-dependent+decline+in+maximum+heart+rate.">Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate.</a> Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).</li><li>St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA-independent+activation+of+I(f)+by+cAMP+in+mouse+sinoatrial+myocytes.">PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes.</a> Channels. 7 (4), 318-321 (2013).</li><li>St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+adenoviral+infection+of+sinoatrial+node+myocytes+from+adult+mice.">Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).</li><li>Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapidly+activating+delayed+rectifier+K++current+regulates+pacemaker+activity+in+adult+mouse+sinoatrial+node+cells.">A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).</li><li>Mangoni, M., Nargeot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+hyperpolarization-activated+current+(I(f))+in+isolated+mouse+sino-atrial+cells.">Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells.</a> Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).</li><li>Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrophysiological+properties+of+spontaneously+beating+pacemaker+cells+isolated+from+mouse+sinoatrial+node.">The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node.</a> J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).</li><li>Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+C-type+natriuretic+peptide+on+ionic+currents+in+mouse+sinoatrial+node:+a+role+for+the+NPR-C+receptor.">Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).</li><li>Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Heart+Rate+and+Sinoatrial+Node+Function+in+Mice+Lacking+the+cAMP+Regulator+Phosphoinositide+3-Kinase-\gamma\.">Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-\gamma\.</a> Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).</li><li>Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+constitutive+phosphodiesterase+activity+in+mouse+sinoatrial+node+and+atrial+myocardium.">Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium.</a> PloS ONE. 7 (10), e47652 (2012).</li><li>Groenke, S., Larson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+atrial-specific+knockout+of+sodium-calcium+exchange+eliminates+sinoatrial+node+pacemaker+activity.">Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity.</a> PloS ONE. 8 (11), e81633 (2013).</li><li>Torrente, A. G., Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice.">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li><li>Denyer, J. C., Brown, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+sino-atrial+node+cells:+isolation+and+electrophysiological+properties.">Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties.</a> J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).</li><li>Thum, T., Borlak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butanedione+monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures.">Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).</li><li>Borlak, J., Zwadlo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+ATPase+inhibitor+2,3-butanedione+monoxime+dictates+transcriptional+activation+of+ion+channels+and+Ca(2+)-handling+proteins.">The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins.</a> Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).</li></ol>

Bu kağıt yetişkin farelerin tamamen farklılaşmış sinoatriyal düğüm miyosit izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı protokoller sunar. yalıtım protokolü güvenilir anında elektrofizyolojik analizi ya da sonraki kültür ya da uygun kendiliğinden aktif fare SAMs üretir. Benzer protokolleri (örneğin, 11,12,10,13-17 referanslara bakın) birçok diğer gruplar tarafından rapor edilmiştir. Bununla birlikte, in vitro olarak yetişkin fare SAMs muhafaza edilmesi için protokol karakteristik morfolojisi, spontan aktivite ve hücrelerin elektrofizyolojik özellikleri korur ve proteinlerin 9 adenoviral sağlamaya imkan verir. modifikasyon ve protokollerin sorun giderme için, bir kaç kritik adımlar dikkat edilmelidir. İlk kritik bir faktör belirli bir HAZIRLIK izole önemli ölçüde sayısı ve SAM kalitesini değiştirebilir sindirici enzimler (1.4 adım) aktivitesinde önemli bir partiden partiye değişkenlik olantirme. Bu değişkenlik, tipik olarak, hücre sayısı ve sağlık en üst düzeye çıkarmak için çok spesifik optimizasyon, burada konsantrasyonu ve uygulama zamanı (genellikle paralel olarak yapılabilir) birçok preparasyonların boyunca braketi olmalıdır gerektirir elastaz için geçerlidir. Çeşitli türlerden SAM izolasyonu için bazı protokoller yerine, bu protokolde kolajenaz-proteaz enzimi karışımının tek tek kolajenaz ve proteaz enzimlerini kullanmaktadır. Bununla birlikte, bu enzimlerin her biri için çok partiye değişkenlik eş optimizasyonu tekrar tur gerektiren oldukça yüksek (elastaz benzer) &#39;dir. Enzim harman birçok genelinde daha tutarlılık sağlar ve daha az optimizasyon adımları gerektirir. SAM izolasyon gidermek için kritik ikinci ve açık olmayan bir faktör yangın cilalı cam ayrışma pipet (Şekil 1C) bütünlüğüdür. pipet jant keskin kenarları, çatlak ya da birikmiş c içeriyorsaellular enkaz, mekanik toz haline getirme adımı kalsiyum toksisite sonuçlanan hücrelerine zarar verebilir. yangın cilalı ayrışma pipet düzenli kullanım 2 ay en az her veya hücre verim ve kalite birkaç hazırlıkları boyunca belirgin azaldığı herhangi bir zamanda değiştirilmesi gerekir. zamanlama ve mekanik ayrışma kuvvet izolasyon protokolü gidermek için üçüncü bir kritik bir adımdır. tritürasyon yavaş (yaklaşık 0.5-1 Hz) ancak 5-10 dakika güçlü türbülans gerektirir. Daha hızlı oranları ve azaltılmış süreleri de kullanılabilir, ancak baloncuklarının oluşumunu ya da çözelti içinde köpük üreten önlemek için önemlidir. sinoatriyal düğüm örnekleri tamamen ayrışmış edildiğinde, kalan doku şeritleri renkli incecik beyaz görünmelidir; ince pembe-ish boyama eksik öğütme gösterir. 200-400x&#39;te büyütmede bakıldığında, optimum hazırlanan numunelerden hücreler, hücre memb ise yumuşak hücre zarları vardijeste-ya da aşırı toz haline numunelerden ranes bir kraterli ve çizgili bir görünüme sahiptir. Sağlıklı hücrelerde, kasılmalar hücrelerin uçlarının öncelikle olarak ince seğirmesi görülür. kasılma dalgaları balling-up önce, kısa bir süre için şiddetle sözleşme görülebilir hasarlı hücrelerin bir göstergesidir. Bir kırık ayrışma pipet gibi hücre hasarının en yaygın nedenidir. dijeste-veya düşük-tritüre edilmiş örneklerde, hücre kümeleri olarak mevcut olan ya da bunun yerine tek hücre agregatlar ve sözleşme SAM önemli sayıda kalan doku parçaları görülebilir. Her kullanıcı ayrı ayrı ayrışma optimize etmek gerekir. enzimatik sindirim ve mekanik ayrışma iki kere ayarlanması gerekir rağmen, ayrışma zamanı değiştirirken başlangıçta sabit enzimatik sindirim zaman tutmak için tavsiye edilir. Ek ince ayar a tanımak için kullanıcının yeteneğini esas dayanırtoz haline tamamlanmasından sonra kalan doku parçalarının ppearance - adet tutam ve beyazımsı, o zaman toz haline getirme durdurulmalıdır. Optimizasyon farelerin yaş, cinsiyet, ya da zorlanma farklılıkları eşlik sinoatriyal düğüm varyasyonları karşılamak için de gereklidir. Örneğin, daha yaşlı hayvanlarda 7 hücreleri ayrışma enzimatik sindirim ve mekanik ayrılma sürelerine hem de azaltılması gerekmektedir. belki 5-10 başarıyla yama-kenetlenmiş, iyi bir gün oturumunda deneyleri bağlı olabilen genel bir kılavuz, bir 2-3 aylık erkek C57BL / 6 fare verimleri kabaca 50-200 canlı SAMs tipik bir hazırlık olarak . Verim yaşlı farelerin 7 kullanıldığında önemli ölçüde (% 30), daha düşüktür. kültür protokolü başarısı birkaç önemli adımlar dayanır. Yukarıda ele alındığı gibi en önemlisi, birincil hücre kültürünün başarısı, yüksek kaliteli bir ayrışma gerektirir. Bu inci önerilirakut izole hücre hazırlama kültüre hücreleri korumak için çalışmadan önce optimize edilebilir. kültürlenmiş hücreler için ikinci bir kritik faktör, elektrofizyolojik kayıtları için hücrelerin seçiminde yatmaktadır. En iyi sonuçlar için, kayıt için seçilmiş kültürlenmiş SAMs hemen BDM içeren kültür ortamının yıkanması sırasında spontan kontraksiyonları göstermelidir. BDM yıkama-out sırasında spontan kasılma yavaş başlangıçlı sağlıksız hücrelerin bir işaretidir. SAM kültür sistemi bazı sınırlamalar, fare SAN en önemlisi çok küçük boyutu var. Burada gösterilen yöntemler elektrofizyolojik ve görüntüleme çalışmaları için yeterli hücre sayıları için izin verirken, doku sınırlı miktarda kültürlü SAMs biyokimyasal analizler engellemektedir. tekniğin bir başka sınırlaması SAMs geri miyozin ATPase inhibitörü BDM mevcudiyetinde kültürlenmiş olmasıdır. BDM dahil olmak üzere diğer hücresel etkileri vardır, çünkü bu potansiyel endişeSpesifik olmayan fosfataz aktivitesi, kardiyak transkripsiyon inhibisyonu 19 faktörleri ve sodyum kanallarının, kalsiyum kanalları ve riyanodin reseptörleri 20 inhibisyonu. Ancak, veri BDM burada tahlil SAM morfolojik ve elektrofizyolojik özellikleri üzerinde çok az etkisi olduğunu göstermektedir. Gelecekteki uygulamalarda, burada açıklanan yöntemler, daha büyük memelilerde SAM kültürleri hazırlamak için kolayca adapte edilebilir gibi görünmektedir. adenoviral gen transferi ile birlikte, bu kültürler büyük hayvan modellerinde kalp vurusu genetik manipülasyonlar izin verebilir. ilgi konusu proteinleri tanıtmak yeteneği aynı zamanda genetik olarak kodlanmış raportör moleküller SAM hücre içi sinyal yollarını araştırmak için kullanılabilecek gelecek uygulamalar için içerir.

Kalp pili, kalbin sinoatriyal düğüm miyositler (sinoatriyal miyositler, &quot;SAMs&quot;) her kalp atışı başlatmak için miyokardın yayılması spontan ritmik aksiyon potansiyelleri (AP) oluşturur. Birçok türlerden akut izole SAMs kullanarak deneyler pacemaker aktivitesi oluşturulmasına katkıda mekanizmaların aydınlatılması için gerekli olmuştur. SAMs morfolojisi, fonksiyon ve protein ifade bakımından atriyal ve ventriküler miyokardın kendi muadilleri önemli ölçüde farklılık çok özel kardiyomiyositlerde vardır. SAMs spontan AP damgasını sonraki AP 1,2 tetiklemek için eşik membran potansiyeli sürücüler diyastol sırasında bir spontan depolarizasyon olduğunu. Bu, &quot;kalp pili potansiyeli&quot; farklı &quot;komik Geçerli&quot; (I f) de dahil olmak üzere membran akımları, T ve L-tipi kalsiyum akımları ve sodyum-kalsiyum değiştirici Curr koordineli aktivitesine bağlısarkoplazmik retikulum 3,4 Ca 2+ salınımı tarafından yönlendirilen ent (I NCX). akut izole fare SAMs kalp vurusu çalışmaları için önemli bir deneysel hazırlık iken fare SAN belirsiz anatomi ve küçük boyutlu bir nüanslı mikrodiseksiyon ve kombine enzimatik ve mekanik gerektirdiğinden, farelerden alınan SAMs izolasyonu benimsemeye zor bir yöntem olabilir hücre ayrışma dikkat optimizasyon gerektirir. Biz burada başarılı yama kelepçe kayıtları 5-8 yetişkin farelerin SAMs izole etmek için kullanılan bir protokol ayrıntılı bir video gösteri sunar. Bildiğimiz kadarıyla, başka bir kaynaktan temin böyle bir görsel gösteri var. Buna ek olarak, yeni bir yöntem olup, burada gösterilmiştir erişkin farelerden böylece genetik olarak kodlanmış proteinlerin giriş izin, birkaç gün, in vitro olarak korunabilir SAMs izoleAdenoviral enfeksiyon 9 vasıtasıyla haberci moleküllerin veya RNAi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="649">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sylgruard/Elastomer Kit</td>
			<td style="width:167px;">Dow Corning</td>
			<td colspan="2" style="width:237px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Borosilicate 9&#34; pasteur pipettes</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Small, round bottomed culture tubes</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Large, round bottomed culture tubes</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Elastase</td>
			<td style="width:167px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:175px;">LS002279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Liberase TM</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:175px;">5401119001</td>
			<td>&#160;Tissue dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heparin</td>
			<td style="width:167px;">SAGENT Pharmaceuticals&#160;</td>
			<td style="width:175px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">CB-354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">12 mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:167px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:175px;">12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">24-well culture plate</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:175px;">08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Ad-mCherry</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Ad-eGFP</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Plastic, disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Micro scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">17-467-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Roboz Instruments</td>
			<td style="width:175px;">RS-4904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Tissue Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Roboz Instruments</td>
			<td style="width:175px;">RS-8164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Dissecting Iris Scissors</td>
			<td style="width:167px;">WPI, Inc.</td>
			<td style="width:175px;">501264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Dissecting Pins</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:175px;">26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0350500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K-glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K-aspartate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">creatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Amphotericin-B</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Isoproterenol</td>
			<td style="width:167px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:175px;">420355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Media199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">2,3-butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">A5611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Insulin&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Selenium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:175px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:175px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice

spontan aksiyon potansiyelleri (AP) oluşturarak yendi her kalbin başlatan kalbin doğal kalp pili olarak Sinoatriyal düğüm miyositler (SAMs) hareket. Bu kalp pili APs çok sayıda membran akımları ve hücre içi kalsiyum bisiklet koordineli etkinliğini yansıtır. Ancak SAMs spontan pacemaker aktivitesi sürücü kesin mekanizmalar halen mevcuttur. Akut izole SAMs deneyler kalp kalp vurusu moleküler temelini incelemek için önemli bir hazırlık vardır. Ancak, belirsiz anatomi, karmaşık mikrodisseksiyon ve titiz enzimatik sindirim koşulları akut izole SAMs yaygın kullanımını engellemiştir. Buna ek olarak, yöntemler, protein ekspresyon çalışmaları için SAM uzun dönemli kültür izin vermek için, yakın zamana kadar mevcut değildi. Burada erişkin farelerden SAM izolasyonu için adım adım protokolü ve video gösterimi sağlar. Bir yöntem olup, aynı zamanda in vitro ve in expressi yetişkin fare SAMs muhafaza etmek için gösterilmiştirAdenoviral enfeksiyon yoluyla ekzojen proteinlerin ilgili. Akut izole edilmiş ve bu yöntemlerle elde kültürlenmiş SAMs elektrofizyolojik ve görüntüleme çalışmaları çeşitli için uygundur.

Burada anlatılan protokoller daha önce farklı yama kelepçe çalışmalarının 5-8 çeşitli için uygundur yetişkin farelerin kendiliğinden aktif SAMs izole etmek istihdam edilmiştir. Buna ek olarak, Protokoller, bir hafta süreyle kültür içinde muhafaza edilebilir izole SAM izin verir. Kültürlenmiş hücreler içine gene aktarılması adenoviral enfeksiyon 9 vasıtasıyla gerçekleştirilebilir. Bu bölümde sunulan sonuçlar önceki çalışmalarından elde ve akut izole ve kültürlü SAMs özellikleri örnek olarak burada gösterilir. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, kendiliğinden aktif SAMs fazla 6 gün boyunca kültür içinde muhafaza edilebilir. kültürlenmiş hücreler önemli ortalama uzunluk, genişlik değişim, kesit alanı, veya kültür membran kapasitans, akut bir şekilde izole SAM verilene benzer bir genel morfolojisi muhafazaHücreler akut izole hücreler (- E Şekil 2B) karşılaştırıldı. kültür içinde, zaman içinde uygulanabilir SAM sayısı aşınma Ancak oluştu. Bu nedenle, deney tasarımı geniş gerçekleştirmede gerektiriyorsa kültürleri çok hayvandan alınan hücrelerden hazırlanabilir önerilir. yetişkin farelerin sinoatriyal miyositlerin kültürü için protokol geliştirilmesinde önemli bir hedef yetişkin SAMs yerli hücresel bağlamında eksojen proteinlerin ifadesini sağlayacak bir sistem oluşturmak oldu. Protein ekspresyonu Bu tür bir örnek, hücreleri durumunda, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir, floresan markör proteinler GFP ve MCherry ifade virüs ile birlikte enfekte edilmiştir. Protein ekspresyonu adenoviral enfeksiyon, 24 saat içinde açıkça belirgin olduğu bulundu, ve 48 saat (Şekil 3) içinde test proteinleri için maksimum olmuştur. 100 viral İçişleri Bakanlığı neredeyse% 100 inf sonuçlandıHücresel toksisite kanıtı ection verim. Bunun aksine, lipid bazlı reaktifler kullanılarak transfeksiyon da 72 saat sonra 9, yetişkin SAM herhangi tespit gen aktarımı elde edilememişti. Patch-kelepçe elektrofizyoloji üzerinden fonksiyonel karakterizasyonu hem akut izole ve kültürlü SAMs. Şekil 4A değerlendirilmesi için kritik amfoterisin delikli yama kayıt yapılandırmasını kullanarak akut izole veya kültür SAMs kaydedilen spontan aksiyon potansiyelleri tipik akım kelepçe kayıtları gösterir. Aksiyon potansiyeli dalga akut izole ve kültürlü SAMs benzerdi ve ortalama AP ateş oranı (Şekil 4B) hiçbir fark yoktu. Ben f sinoatriyal düğüm immunositokimyasal belirteç olarak kullanılan SAMs ve ben f üreten HCN4 kanallarının bir özelliğidir. dolayısıyla pryama kelepçe kayıtları I f esence hücreleri aslında SAMs içinde olduğu fikrini desteklemek için kullanılabilir. Kendiliğinden aktif akut ve kültürlenmiş SAM hepsi burada da, -120 mV&#39;ye 1 sn voltaj aşamasına karşılık olarak bir F&gt; 100 Pa sergilemişlerdir. Burada gösterilen temsili sonuçlar için, hücreler, -60 ° C ile -160 3 sn hiperpolarize kademeye ile tahlil edilmiştir K + akımları (Tablo 3) ve f etkinleşmenin voltaja bağımlılığı engellemek için 1 mM BaCl 2 içeren Tyrode çözeltisi ile perfüze edilmiştir -50 mV tutma potansiyelinden mV olarak daha önce 5-8 tarif var. akım yoğunluğu -50 mV bir tutma potansiyelinden -150 mV&#39;ye hiperpolarize 3 sn test darbelerinin yanıt olarak değerlendirildi. F I aktivasyon voltaj bağımlılığı ya da akut izole ve kültürlü SAMs (Şekil 4 arasında akım yoğunluğu f I ya anlamlı bir fark saptanmadıC - D). Bireysel SAMs f Bunlar kendiliğinden AP co-kayıtları ve ben 2 dk ilk yıkama dahil olmak üzere toplam yaklaşık 9 dakika (mevcut kelepçe modunda spontan AP 30-60 saniye, 2 dk çözüm değişikliği gerektirir ve yaklaşık 5 dk için I f) aktivasyonu voltaj bağımlılığı tanımlamak için yeterli gerilim kelepçe verileri toplar. Dolayısıyla Şekil 4C&#39;de gösterilen veriler, hücre hazırlama sağlamlığını örnekler. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54555/54555fig1.jpg" /> Şekil 1: Fare SAM izolasyonu ve ayrılması için tahlil (A) -L silikon elastomer vulkanize 25 ml ihtiva eden iki adet 10 cm petri tabaklarına konulur... Her yemeğin dokusu hareketsiz tutmak için 6-10 küçük diseksiyon pimleri ile yüklü olarak gelir. Ii. 100 ml&#39;lik beher 35 &amp; Komple Tyrode en tutmak için# 176;... C su banyosu iii Geniş (~ 2 mm çapında), yangın cilalı ayrışma pipet iv Dar (~ 1.5 mm çap) Tam Tyrode en ile birlikte deniz hazırlanması için yangın cilalı transferi pipet v Plastik transferi pipet... iç doku manipülasyonu için heparin. vi. iç kesim işlemleri için mikro makas açılış Kendinden. vii. İnce forseps (uç boyutu 0.06 x 0.02 mm). viii. doku forseps, 5.5, dış doku manipülasyonu için 1 x 2 diş. ix. kavisli iris makas dış kesme işlemleri için 4.3. Diseksiyon çanak yerleştirilen küçük diseksiyon işaretçilerine vurgulayarak (B) Close-up fotoğraf. Yakın çekim fotoğraf mekanik öğütüldükten (sağda). Için yangın cilalı dar transfer pipet (solda) ve yangın cilalı geniş ağızlı bir pipet vurgulayarak (C) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54555/54555fig1large.jpg" target="_blank">tıklayınız daha büyük bir versio görmek için</a>Bu rakamın n. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54555/54555fig2.jpg" /> . Şekil 2: Akut izole ve kültürlü SAMs morfolojik olarak ayırt edilemez A:. Temsilci SAMs Parlak alan görüntüleri ya hemen izolasyon (akut) veya sonra 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat, ya da in vitro 6 gün sonra B - D : Ortalama (± SEM) maksimum uzunluğu, akut 48 saat karşı izole kültür SAMs E genişlik ve kesit alanı:. (± SEM) Ortalama akut izole veya kültür SAMs gerilim-kelepçe kayıtları membran kapasitans. Tüm karşılaştırmalar anlamlı değildir: p&gt; 0.05 vs akut. Referans 9 uyarlanmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54555/54555fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 3:. EGFP (yeşil) ve mCherry (kırmızı) eksprese eden adenovirüs için 100 MOl&#39;de enfekte edilmiştir kültürlenmiş SAMs Parlak alan ve Örnek kültürlenmiş SAM bölgesinin epifluorescent görüntüleri eksojen protein adenoviral sentezleme, ya 24 ya da 48 saat sonra çift ​​enfeksiyon. Ölçek çubuğu 20 mikron =. Referans 9 çoğaltılamaz. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54555/54555fig4.jpg" /> Şekil 4: 1 nM izoproterenol içeren Tyrode çözeltisi içinde akut izole (siyah) Örnek akımı kelepçe kayıtları veya kültür (gri) SAM. Kültürlenmiş SAMs A elektrofizyolojik karakterizasyon. Ölçek çubukları: 40 mV, 100 milisaniye B:. Ortalama (± SEM) anlıkakut izole frekansı ateş (siyah, n = 6) veya 48 saat kültüre (gri; n = 14) SAMs C:. I normalize (± SEM) ortalama iletkenlik-voltaj ilişkileri akut izole f (siyah, n = 8) veya kültür (gri; n = 14) SAMs Insets.:. 10 mV artışlarla -60 ila -160 mV 3 sn hiperpolarizan testi bakliyat tarafından ortaya çıkarılan akut (siyah) ya da kültür (gri) SAMs temsili akım aileleri D: Ortalama ( ± SEM) akut (izole siyah -150 mV ben f akım yoğunluğu; n = 7) ve (kültürlü gri; n = 8) SAMs. Referans 9 uyarlanmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54555/54555fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Tam Tyrode en </td><td> Düşük Ca 2 + / Mg 2 + Tyrode en </td><td> KB Orta </td><td> BSA çözeltisi </td><td> NaCl / CaCl2 Uyarlama Çözüm </td></tr><tr><td> NaCI </td><td> 140 </td><td> 140 </td><td></td><td> 140 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 5.4 </td><td> 5.4 </td><td> 25 </td><td> 5.4 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td></td></tr><tr><td> glikoz </td><td> 5.55 </td><td> 18.5 </td><td> 20 </td><td> 5.55 </td><td></td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> 1 </td><td></td><td></td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1.8 </td&gt; <td> 0.066 </td><td></td><td> 1.8 </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> boğa </td><td></td><td> 50 </td><td> 20 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td></td><td> 1 mg / ml </td><td> 1 mg / ml </td><td> 1 mg / ml </td><td></td></tr><tr><td> K-glutamat </td><td></td><td></td><td> 100 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> K-aspartat </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td></td><td></td><td> 2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> kreatin </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 0.5 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> pH değeri ayarlanmıştır </td><td> NaOH ile 7.4 </td><td> NaOH ile 6.9 </td><td> KOH ile 7.2 </td><td> NaOH ile 7.4 </td><td></td></tr></tbody></table>Tablo 1:. Disosiyasyon çözümleri sinoatriyal düğüm miyosit ayrışma kullanılan çözümlerin kompozisyonlar. Konsantrasyonları belirtilen yerler dışında mM verilmiştir. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> kaplama Orta </td><td> Kültür orta </td></tr><tr><td> Media199 </td><td> baz </td><td> baz </td></tr><tr><td> 2,3-bütandion monoxime (DGM) </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Fetal Sığır Serumu (FBS) </td><td> % 5 </td><td> - </td></tr><tr><td> Sığır serum albümini (BSA) </td><td></td><td> 0.1 mg / ml </td></tr><tr><td> ensülin </td><td></td><td> 10 ug / ml </td></tr><tr><td> transferrin </td><td></td><td> 5.5 ug / ml </td></tr><tr><td> Selenyum </td><td></td><td> 5 ng / ml </td></tr><tr><td> Penisilin </td><td> 100 U / ml </td><td> 100 U / ml </td></tr><tr><td> Streptomisin </td><td> 100 mg / ml </td><td> 100 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Kaplama ve kültür çözümleri sinoatriyal düğüm miyosit kaplama ve kültürü için kullanılan çözümlerin kompozisyonlar.. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Tyrode en </td><td> PP Hücre içi </td></tr><tr><td> NaCI </td><td> 140 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 5.4 </td><td> 135 </td></tr><tr><td> Kh 2 PO 4 </td><td> 1.2 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> glikoz </td><td> 5.55 </td><td></td></tr><tr><td> MgCI2 </td&gt; <td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 10 </td></tr><tr><td> Mg-ATP </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Amfoterisin-B </td><td></td><td> / Ml gerektiği gibi 200 mikrogram </td></tr><tr><td> isoproterenol </td><td colspan="2"> 1 nM gerektiğinde </td></tr><tr><td> pH değeri ayarlanmıştır </td><td> NaOH ile 7.4 </td><td> KOH ile 7.2 </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Elektrofizyoloji kayıt çözümleri dışı kompozisyonları sinoatriyal düğüm miyositlerden amfoterisin delikli yama kayıtları için kullanılan (Tyrode) ve hücre içi (PP) çözümleri..

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice at JoVE.com

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Yöntemler yama kelepçe elektrofizyoloji veya görüntüleme çalışmaları için yetişkin farelerin sinoatriyal düğüm miyosit (SAMs) izolasyonu için gösterilmiştir. İzole edilmiş hücreler, doğrudan kullanılabilir ya da bu tür genetik olarak kodlanmış muhabir olarak ilgi proteinlerin ekspresyonuna izin vermek için kültür içinde muhafaza edilebilir.

Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

methods-for-isolation-culture-functional-characterization-sinoatrial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Görüntüleme.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Yöntemler yama kelepçe elektrofizyoloji veya görüntüleme çalışmaları için yetişkin farelerin sinoatriyal düğüm miyosit (SAMs) izolasyonu için gösterilmiştir. İzole edilmiş hücreler, doğrudan kullanılabilir ya da bu tür genetik olarak kodlanmış muhabir olarak ilgi proteinlerin ekspresyonuna izin vermek için kültür içinde muhafaza edilebilir. 

Video: Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Yetişkin Sıçan Kalp miyositler İlköğretim Kültür

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Biyoloji

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...