وقدم الدعم المالي لهذه الدراسة من قبل البرنامج الوطني للبحوث والتنمية الرئيسية (2016YFC1200601) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31390421).

1. الذبابة البيضاء وتربية الأنواع الخفي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على أنواع الذبابة البيضاء على القطن غوسيبيوم هيرسوتم (مالفاسي) (كف زهي-ميان 1973) في أقفاص تحت ظروف قياسية من 27 ± 1 درجة مئوية، و 70 ± 10٪ الرطوبة و 14 ساعة ضوء: 10 ساعة النظام المظلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الذبابة البيضاء الفردية والتجانس في 30 ميكرولتر من العازلة تحلل (10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.4، 50 ملي بوكل، 0.45٪ [الوزن بالوزن / فول] توين 20، 0.2٪ [وت / فول] الجيلاتين، 0.45٪ [المجلد / فول] نونيديت P 40، 60 جم ​​/ مل بروتين K). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان جناسة في 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: يمكن زيادة وقت الحضانة عند 65 درجة مئوية إذا لزم الأمر. وينبغي أن يكون حاضنة الوقت في 100 درجة مئوية تسيطر عليها بشكل حاسم لإيقاف كاف K البروتين وتجنب تلف الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء تفاعل البوليميراز سلسلة (ير) باستخدام الحمض النووي الذبابة البيضاء (المكتسبة في القسم 1.3) على أساس الميتوكوندريا السيتوكروم أوكسيديز الأول الاشعال. كوي-F: 5&#39;-تغاتغتكاتساغاغت-3 &#39; كوي-R: 5&#39;-تاتاتغكاغاتغتكاتغا-3 &#39; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء تفاعلات ير في الحجم النهائي من 25 ميكرولتر تحتوي على 1 U من البلمرة دنا طق ، 2.5 ميكرولتر العازلة 10X، 0.2 ملي دنتب، 0.2 ملم من كل التمهيدي و 2 ميكرولتر من الحمض النووي الذبابة البيضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شروط الإجراء ير التالية: تمسخ الأولي 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق تليها 35 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (تمسخ)، 50 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (الصلب) و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (التمديد) و آخر 10 دقيقة في 72 درجة مئوية لمزيد من التمديد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف ير تضخيم المنتج باستخدام مجموعة استخراج هلام الحمض النووي مع البروتوكول الموصى بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسلسل عينات الحمض النووي المنقى مع نظام تسلسل عينة الحمض النووي بعد تعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل تسلسل باستخدام أداة البحث المحاذاة المحلية الأساسية (بلاست) لتحديد أنواع خفية من الذبابة البيضاء وتجنب تلوث غيرها من سبيسيوفاق. </li></ol> 2. إندوسيمبيونت تحديد والتعريب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء ير على الحمض النووي الذبابة البيضاء (المكتسبة في الخطوة 1.3) لتضخيم جينات محددة من كل إندوسيمبيونت داخل الذبابة البيضاء (وصفت وصفة ير في القسم 1.4، وترد إجراءات ير والبادئات في الجدول 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موضوع العينة تضخيم إلى أغاروس هلام الكهربائي وفقا لبروتوكول نشرت سابقا 20 (1٪ هلام الاغاروز، تريس-أسيتات-إدتا كما العازلة تشغيل، والجهد 5 V / سم) لتحديد الجينات محددة من كل بكتيريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعادة وتسلسل كل فرقة لتحديد الأنواع البكتيرية داخل الذبابة البيضاء (انظر الأقسام 1.5-1.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء مضان في التهجين الموضعي (فيش) على وايتفليز لتحديد موقع إندوسيمبيونتس وفقا للبروتوكول المنشورة سابقا 19 . ملاحظة: زيادة تركيز تحقيقات الفلورسنت إذا لزم الأمر. </li></oل&gt; 3. انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج وتثبيت ويتفليز في الفوسفات العازلة (0.1 M، ودرجة الحموضة 7.0) التي تحتوي على 2.5٪ [فول / فول] غلوتارالدهيد لمدة 4 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات في الفوسفات العازلة (0.1 M، ودرجة الحموضة 7.0) ثلاث مرات، 15 دقيقة في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج وإصلاح العينات مرة أخرى في العازلة الفوسفات (0.1 M، ودرجة الحموضة 7.0) تحتوي على 1٪ [وت / فول] أوسو 4 لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف العينات من قبل سلسلة متدرجة من الايثانول (30٪، 50٪، 70٪، 80٪، 90٪، 95٪ و 100٪)، 15 دقيقة في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل وتزج العينات في الأسيتون 100٪ لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينات في خليط من الأسيتون 100٪ و 100٪ راتنج سبور (1: 1) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينات إلى خليط من الأسيتون 100٪ و 100٪ راتنج سبور (1: 3) لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل وتزج العينات في 100٪ الراتنج سبور (المحتضنة في 70 درجة مئوية) لأكثر من 9 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسم عينات الذبابة البيضاء باستخدام مايكروإلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار الأفلام رقيقة جدا (المكتسبة في القسم 3.9) عن طريق الغمر في خلات اليورانيل المطلق لمدة 5-10 دقيقة، تليها الغمر في 50٪ القلوية الرصاص سيترات لمدة 5-10 دقيقة أخرى. ملاحظة: أحجام الكواشف المستخدمة في القسم 3.1-3.10 تعتمد على العينات. تأكد من أن مغمورة العينات في الكواشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة العينات تحت المجهر الإلكتروني انتقال (15،000X) لتحديد توطين وشكل وحجم البكتيريا لمزيد من الاستخدام (انظر القسم 4.6). </li></ol> 4. الذبابة البيضاء بكتيريوم تشريح وتنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من حل برنامج تلفزيوني 1X على شريحة المجهر. اختيار بعض الحوريات 3 أو 4 ال إنستار من أوراق القطن وتزجها في حل برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الإبر حشري غرامة تحت ستيريوميكروسكوب وسحب البكتيريا من الجسم الذبابة البيضاء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع بلطف حفرة على جانب واحد من الحورية، والضغط قليلا على الآخرالجانب للسماح للبكتريوميس بها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل 20 ميكرولتر ميكرولتر (مع قطع نهاية الرائدة لتلبية حجم البكتيريا) على ماصة 0.5-10 ميكرولتر. استخراج البكتيريا الفردية من حل برنامج تلفزيوني في ميكرولودر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البكتيريا للقضاء على تلوث أنسجة الذبابة البيضاء الأخرى عن طريق بيبتينغ البكتيريا في حل برنامج تلفزيوني واستخراج البكتيريا. كرر ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة على الفور البكتيريا غسلها في أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على 60 ميكرولتر من حل بس 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المحقنة تصفية البكتيريا تجميعها من خلال غشاء فلتر 5 ميكرون (تحددها أحجام البكتيريا ونواة البكتيريا في الذبابة البيضاء). كرر عدة مرات لنقل السائل المختلط من خلال غشاء فلتر بدقة. ملاحظة: لتحقيق نتيجة أفضل من التضخيم والتسلسل، وتجميع أكثر من 100 بكتيريوميس. الرطب غشاء فلتر أولا باستخدام 1X حل برنامج تلفزيوني لتقليل فقدان البكتيرياملزمة للغشاء. </li></ol> 5. التضخيم من جينوميس إندوسيمبيونت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم الترشيح (التي تحتوي أساسا على إندوسيمبيونتس الذبابة البيضاء) باستخدام مجموعة تضخيم الحمض النووي من قبل بروتوكول الموصى بها مع بعض التعديل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار بروتوكول الموصى بها من التضخيم من الحمض النووي الجيني من الدم أو الخلايا وإعداد D2 العازلة لتجربة لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مباشرة 1.5 ميكرولتر من الترشيح (انظر القسم 4.6) إلى أنبوب الطرد المركزي، تليها 1.5 ميكرولتر من العازلة D2 وتخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة وإضافة 1.5 ميكرولتر من حل التوقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت التفاعل و 1 ميكرولتر من البلمرة الحمض النووي وتخلط بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخليط في 30 درجة مئوية لمدة 16 ساعة، تليها 3 دقائق عند 65 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء ير مباشرة على الترشيح تضخيم (تمييع عينات تضخيم إذا لزم الأمر) باستخدام الاشعال محددة مصممة ل باكتيريا لتأكيد أنواع البكتيريا (انظر القسم 2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء ير لتأكيد ما إذا كان هناك تلوث الجينوم المضيف باستخدام الجين الذبابة البيضاء بيتا أكتين و EF1 الاشعال وفقا لطريقة نشرت سابقا 21 (وصف وصف ير في القسم 1.4). </li></ol> 6. إندوسيمبيونت ميتاجينوم التسلسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخضع الترشيح المضخم إلى مقياس الطيف وفلورومتر (وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) قبل التسلسل لاختبار جودة العينات وعما إذا كانت العينات تستوفي معايير التسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قم بتصنيع المضخم إلى جهاز الجينوم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li></ol>

<ol>
	<li>Buchner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosymbiosis+of+animals+with+plant+microorganisms.">Endosymbiosis of animals with plant microorganisms.</a> J. Basic Microbiol. 7 (2), (1967).</li><li>Sloan, D. B., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosymbiotic+bacteria+as+a+source+of+carotenoids+in+whiteflies.">Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies.</a> Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).</li><li>Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+pipientis:+microbial+manipulator+of+arthropod+reproduction.">Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction.</a> Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).</li><li>Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+influences+thermotolerance+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci+B+biotype.">Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype.</a> Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).</li><li>Hansen, A. K., Degnan, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+expression+of+conserved+small+RNAs+in+small+symbiont+genomes.">Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes.</a> ISME J. 8, 2490-2502 (2014).</li><li>Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+evolution+of+heritable+bacterial+symbionts.">Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).</li><li>Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+endocellular+bacterial+symbiont+of+aphids+Buchnera+sp.+APS.">Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS.</a> Nature. 407, 81-86 (2000).</li><li>Nikoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origin+of+insect-Wolbachia+nutritional+mutualism.">Evolutionary origin of insect-Wolbachia nutritional mutualism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (28), 10257-10262 (2014).</li><li>Sloan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+histories+of+horizontal+gene+transfer+facilitated+extreme+reduction+of+endosymbiont+genomes+in+sap-feeding+insects.">Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects.</a> Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).</li><li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomes+of+the+rice+pest+brown+planthopper+and+its+endosymbionts+reveal+complex+complementary+contributions+for+host+adaptation.">Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation.</a> Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).</li><li>Campbell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+expansion+via+lineage+splitting+and+genomereduction+in+the+cicada+endosymbiont+Hodgkinia.">Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).</li><li>Wilson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+insight+into+the+amino+acid+relations+of+the+pea+aphid,+Acyrthosiphon+pisum,+with+its+symbiotic+bacterium+Buchnera+aphidicola.">Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola.</a> Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).</li><li>Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+conservation+and+functional+constraint+on+intergenic+spacers+in+reduced+genomes+of+the+obligate+symbiont+Buchnera.">Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera.</a> PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).</li><li>Nakabachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+160-kilobase+genome+of+the+bacterial+endosymbiont+Carsonella.">The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella.</a> Science. 314 (5797), 267 (2006).</li><li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bemisia+tabaci:+a+statement+of+species+status.">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).</li><li>Himler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+a+bacterial+symbiont+in+an+invasive+whitefly+is+driven+by+fitness+benefits+and+female+bias.">Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias.</a> Science. 332 (6026), 254-256 (2011).</li><li>Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+secondary+endosymbionts+among+different+putative+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).</li><li>Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+newly+discovered+symbiont+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).</li><li>Kliot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridizations+(FISH)+for+the+localization+of+viruses+and+endosymbiotic+bacteria+in+plant+and+insect+tissues.">Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues.</a> J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Rao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+reduction+and+potential+metabolic+complementation+of+the+dual+endosymbionts+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci.</a> BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).</li><li>Thao, L. L., Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+relationships+of+primary+prokaryotic+endosymbionts+of+whiteflies+and+their+hosts.">Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).</li><li>Zhu, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+and+comparison+of+the+Rickettsia+genomes+from+the+whitefly+Bemisia+tabaci+Middle+East+Asia+Minor+I.">Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I.</a> Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).</li><li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+localization+of+a+Rickettsia+sp.+in+Bemisia+tabaci+(HomopteraAleyrodidae).">Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae).</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).</li><li>Zhang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+temporal+changes+of+primary+and+secondary+bacterial+symbionts+and+whitefly+host+fitness+following+antibiotic+treatments.">Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments.</a> Sci. Rep. 5, 15898 (2015).</li><li>Shan, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+changes+of+symbiont+density+and+host+fitness+after+rifampicin+treatment+in+a+whitefly+of+the+Bemisia+tabaci+species+complex.">Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex.</a> Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).</li><li>Zchori-Fein, E., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+prokaryotes+asscociated+with+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).</li><li>Thao, M. L., Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+relationships+of+primary+prokaryotic+endosymbionts+of+whiteflies+and+their+hosts.">Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).</li><li>Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+the+bacterial+symbiont+Cardinium+in+arthropods.">Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods.</a> Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).</li><li>O'Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=116S+rRNA+phylogenetic+analysis+of+the+bacterial+endosymbionts+associated+with+cytoplasmic+incompatibility+in+insects.">116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).</li><li>Nirgianaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).</li><li>Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chlamydiae+in+whiteflies+and+scale+insects:+endosymbionts+'Candidatus+Fritschea+bemisiae'+strain+Falk+and+'Candidatus+Fritschea+eriococci'+strain+Elm.">Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts 'Candidatus Fritschea bemisiae' strain Falk and 'Candidatus Fritschea eriococci' strain Elm.</a> Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obligate symbiont22, and secondary symbionts vary among species, even the individual whitefly17,21,23. Moreover, although many endosymbionts have been proven to be restrained within bacteriocytes, some may be distributed in the entire body of the whitefly24. Thus, analyzing the localization of different endosymbionts by FISH and TEM is necessary before bacteriome dissection. 
For bacteriome dissection and any subsequent operations, the utilized materials must be strictly sterile to eliminate possible contamination of other bacteria, particularly the PBS solution, the filtration equipment, and the centrifuge tubes. Special care should be taken when filtering the PBS solution containing the bacteriomes to avoid environmental contamination. It is best to use a relatively aseptic environment. In addition, whitefly nymphs can be stored in absolute ethanol at room temperature before dissection, which may be useful to send samples to other places. Nevertheless, dead or environmental stress treated insects should not be used because there would be declination of bacteria25,26. 
In this protocol, the 3rd or 4th instar nymphs were utilized to isolate bacteriome. Compared to other stages of the whitefly, there are several advantages of using the 3rd or 4th instar nymphs for dissection. Firstly, compared to the 1st and 2nd instar nymphs, whiteflies in this stage are obviously larger and not so fragile. Secondly, in the 3rd or 4th instar nymphs of whitefly, bacteriome can be easily distinguished from other tissues of the whitefly body with an obviously yellow color, and bacteriocytes always cluster firmly and can be conveniently separated from other tissues. For the bacteriome in adult whiteflies, once pulled out from the body, bacteriocytes would separate quite easily thus increasing the difficulty in assembly. Hence, the best choice for dissecting bacteriomes is the 3rd or 4th instar nymphs. Nevertheless, this protocol can be used with adult whiteflies for certain experiment needs, with more practice. 
Compared to a previously published method using a single bacteriocyte21, this protocol assembled more bacteriocytes used in the amplification, which contributed to the richness and diversity of bacteriocytes. Furthermore, we utilized filtration to separate symbiont cells from whitefly bacteriocytes, which is more convenient than another method using a micromanipulator and a microinjector. Nevertheless, there were some limitations of this protocol. Firstly, symbionts not confined to bacteriocytes cannot be separated by this method, since we only dissect the bacteriome of the whitefly. Secondly, this protocol cannot absolutely eliminate the contamination of the whitefly genome, since some fragments of whitefly tissues would pass through the filter membrane. Thirdly, clustered symbionts cannot be further separated into individual symbiont species. Hence, obtaining a single species of bacterium accurately and purely requires further study.
In summary, we reported a convenient method for the extraction and purification of endosymbionts from the whitefly B. tabaci that is suitable for subsequent sequencing and analysis. The protocol described here can be easily adapted for the isolation of endosymbionts from other insects for genome sequencing.

البكتيريا التي تشكل علاقة تكافلية حميمة مع المضيفين النسبية منتشرة على نطاق واسع في المفصليات 1 . وقد ثبت أن إندوسيمبيونتس تؤثر على جوانب المضيفين، مثل استقلاب التغذية، والاستنساخ، والاستجابات للضغوط البيئية 2 ، 3 ، 4 وما إلى ذلك ، في كل مرحلة تنموية تقريبا 5 . ومع ذلك، فإن الآلية التي تقوم عليها الجمعيات لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. علم الجينوم هو من الأولوية والأهمية عند دراسة الوظائف والأدوار المحتملة للبكتيريا. ويمكن الاستدلال على بعض المعلومات الأساسية، أي الحالة التصنيفية، والجينات الوظيفية، ومسارات الأيض، ونظم الإفراز، من تسلسل الجينوم، الذي يلقي الضوء على الأدوار المحتملة للروابط في التعايش. مع تطور تسلسل الإنتاجية العالية، وقد تم تسلسل عدد كبير من الجينومات البكتيرية ثإيث وظائف متنوعة كشفت 6 . إندوسيمبيونتس هي ذات أهمية حيوية في هيميبتيرانز، مثل المن 7 ، البق 8 ، بسيلدس 9 ، بلانثوبرز البني 10 و السيكادا 11 . على سبيل المثال، وقد أثبتت بوكنيرا في المن، باعتبارها التعاطف الملزم، للمشاركة في الحيوي الحيوي الأحماض الأمينية، جنبا إلى جنب مع الجينات من الجينوم المن 12 . وعلاوة على ذلك، يتم الكشف عن تنظيم النسخي بوكنيرا أيضا 13 . في بسيلديس ، كارسونيلا هو تسلسل وتصنيف أصغر الجينوم البكتيري وجدت من أي وقت مضى 14 . وتستند كل هذه السمات المميزة لل إندوسيمبيونتس وتستدل من تسلسل الجينوم. لأن هذه إندوسيمبيونتس لا يمكن أن تكون مثقف في المختبر ، وقد طبقت عدة نهج لعزل البكتيريا الكافية لمقترضةuencing. في المن، يتم استخراج إندوسيمبيونتس من خلال الطرد المركزي والترشيح، وتخضع لمزيد من التحليل الجيني و ترانسكريبتوميك 5 . في بنهوبرز البني، يتم تسلسل إندوسيمبيونتس جنبا إلى جنب مع الجينوم الحشرة كلها 10 . الذبابة البيضاء B. تاباسي هو مجمع الأنواع التي تحتوي على أكثر من 35 الأنواع المورفولوجية التي لا يمكن تمييزها (الأنواع الخفية)، من بينها، غزو نوعين الغازية في جميع أنحاء العالم وتسبب ضررا هائلا للإنتاج الزراعي 15 . وتجدر الإشارة إلى أن إندوسيمبيونتس ضمن الأنواع B. تاباسي أظهرت أهمية في تطوير الآفات 16 . حتى الآن، تم تحديد ثمانية إندوسيمبيونتس في الذبابة البيضاء، بما في ذلك التعاطف الملزم، كانديداتوس بورتيرا أيروديداروم، وسبعة تعاطف ثانوي هاميلتونيلا ، ريكيتسيا ، أرسينوفونوس ، كاردينيم ، &lt;<html> إم&gt; ولباشيا، فريتشيا و هيميبتيريفيلوس المعرفة 17 ، 18 . على عكس هيميبتيرانز وصفها سابقا، الذبابة البيضاء B. تاباسي هو حشرة صغيرة للغاية فقط 1 ملم في الطول. تقتصر معظم إندوسيمبيونتس إلى البكتيريا 19 (الخلايا المتخصصة التي تحتوي على سيمبيونتس، التي تشكل كذلك البكتيريا في B. تاباسي). وبالإضافة إلى ذلك، هذه إندوسيمبيونتس لا يمكن أن تكون مثقف في المختبر . الطريقة الوحيدة للحصول على إندوسيمبيونتس من B. تاباسي هو تشريح البكتيريا خارج. ومع ذلك، هناك صعوبة في تشريح. أولا، البكتيريا الهشة ترتبط دائما مع أنسجة أخرى من الذبابة البيضاء، والتي من الصعب فصل. ثانيا، حجم صغير من الذبابة البيضاء يحد من عزل ما يكفي من البكتيريا. ثالثا، إندوسيمبيونتس الكتلة في البكتيريا، مما يجعل من تعقيد للغاية للحصول على نوع واحد من البكتيريا. أس = &quot;jove_content&quot;&gt; هنا، نحن الإبلاغ عن بروتوكول بسيط وغير مكلف لعزل إندوسيمبيونتس الذبابة البيضاء لتسلسل ميتاجينوم لاحق. من خلال التشريح، والتنقية والتضخيم، ويمكن الحصول على الحمض النووي كافية إندوسيمبيونت ويمكن تأكيد أنواع البكتيريا. بروتوكول وصفها يمكن استخدامها على نحو مماثل في المفصليات الأخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="775">
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td style="width:107px;">Takara</td>
			<td style="width:129px;">R001A</td>
			<td style="width:296px;">including rTaq, 10&#215;Buffer and dNTP</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Gel DNA extraction kit</td>
			<td style="width:107px;">Qiagen</td>
			<td style="width:129px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">DNA sample sequencing system</td>
			<td style="width:107px;">ABI</td>
			<td style="width:129px;">ABI-3730XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Microtome</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:129px;">EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:107px;">Hitachi</td>
			<td style="width:129px;">H-7650 TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:107px;">Zeiss</td>
			<td style="width:129px;">Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">20 &#956;L microloader</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">F2771951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Filter holder</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:129px;">SX0001300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Filter membrane filter</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:129px;">SMWP001300</td>
			<td>5.0 &#956;m SMWP</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">REPLI-g UltraFast Mini Kit</td>
			<td style="width:107px;">Qiagen</td>
			<td style="width:129px;">150033</td>
			<td>DNA amlification kit</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">NanoDrop</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">NanoDrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:243px;">Genome Sequencer</td>
			<td style="width:107px;">Illumina</td>
			<td style="width:129px;">Hiseq 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the extraction of endosymbionts from the whitefly bemisia tabaci

تشكل الارتباطات البكتيرية علاقة حميمة مع مضيفيها وتقدم مزايا للمضيفين في معظم الحالات. المعلومات الجينومية أمر بالغ الأهمية لدراسة وظائف وتطور سيمبيونتس البكتيريا في مضيفهم. كما لا يمكن استزراع معظم التعاطف في المختبر ، وأساليب لعزل كمية كافية من البكتيريا لتسلسل الجينوم هي مهمة جدا. في الذبابة البيضاء بيميسيا تاباسي، تم تحديد عدد من إندوسيمبيونتس ويتوقع أن تكون ذات أهمية في تطوير وتكاثر الآفات من خلال نهج متعددة. ومع ذلك، فإن الآلية التي تقوم عليها الجمعيات لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. والعقبة تأتي جزئيا من حقيقة أن إندوسيمبيونتس في الذبابة البيضاء، ومعظمهم من ضبط النفس في البكتيريا، من الصعب فصل من الخلايا المضيفة. نحن هنا تقرير بروتوكول خطوة بخطوة لتحديد واستخراج وتنقية إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء B. تاباسي أساسا عن طريق تشريحعلى والترشيح. عينات إندوسيمبيونت أعدت من قبل هذه الطريقة، على الرغم من أن لا يزال خليط من الأنواع إندوسيمبيونت مختلفة، هي مناسبة لتسلسل الجينوم لاحق وتحليل الأدوار المحتملة لل إندوسيمبيونتس في B. تاباسي. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لعزل إندوسيمبيونتس من الحشرات الأخرى.

وقد أخذت أنواع الشرق الأوسط آسيا الصغرى 1 (MEAM1) من مجمع B. تاباسي كمثال هنا للتوصيف. ويظهر الشكل رقم 1 قطن لتربية ويتفليز وعدة مراحل تنموية للبيض الأبيض، بما في ذلك نبات القطن والذبابة البيضاء للكبار وحوريات الذبابة البيضاء الأولى والثانية والرابعة (تبدو الحورية الثالثة المستقيمة مشابهة للحوري الرابع من الحورية ). كان من الواضح أن الحورية 4th إنستار هو أكبر من الحوريات 1ST و 2nd إنستار ( الشكل 1 ). ويظهر تحليل فيش من بورتيرا و هاميلتونيلا ضمن MEAM1 في الشكل 2 . ويقتصر هذين إندوسيمبيونتس على البكتيريا من الذبابة البيضاء، ويلاحظ أيضا تداخل البكتيريا اثنين. ويبين الشكل 3 إرسال الكهرباء<html> ترون الصور المجهرية من إندوسيمبيونت بورتيرا من الذبابة البيضاء، مما يدل على أن بورتيرا قد تفقد جدار الخلية. للتسلسل، تم بناء مكتبتين، مع أحجام إدراج من 200 بي بي و 2،000 بي بي، على التوالي. وبعد التسلسل، ولدت المكتبتان 1،626 ميغابايت و 1،302 ميغابايت من البيانات الخام، على التوالي. بعد تنظيف بيانات التلوث للمهايئات والازدواجية، تم الحصول على 1،484 ميغابايت و 1،219 ميغابايت من البيانات النظيفة. نجحت الجمعية بنجاح في تسلسل الجينوم الكامل للالمتزامسة ، بورتيرا . وبالإضافة إلى ذلك، تم الحصول على مشروع الجينوم من هاميلتونيلا أيضا. وأسفرت الجمعية التي استندت إلى المكتبات التي يبلغ عددها 200 مكتبة ثانوية و 000 2 مكتبة ثانوية عن 138 مقالة. وفقا للعلاقات بين الزوجين، تم تجميع 138 كونتيغس كذلك في 89 السقالات ( الجدول 2 ). فيجيمج &quot;سرك =&quot; / فيليز / ftp_upload / 55809 / 55809fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1: نظرة عامة على نظام الحشرات النباتية المستخدمة في هذه الورقة. ( A ) يربيت النباتات البيضاء على نباتات القطن ( غوسيبيوم هيرسوتم كف . زهي-ميان 1793). ( ب ) عرض الذبابة البيضاء الكبار. ( C ) عدة مراحل إنمائية من الحورية إنستار في دورة الحياة الذبابة البيضاء. السهم الأحمر يشير إلى بيضة الذبابة البيضاء. السهم الأسود يشير إلى 1 حورية إنستار ست الذبابة البيضاء. السهم الأبيض يشير إلى الحورية الثانية 2 من الذبابة البيضاء. السهم الأزرق يشير إلى الحورية 4 إنستار من الذبابة البيضاء. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55809/55809fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55809/55809fig2.jpg" /> الشكل 2: تحليل الأسماك من بورتيرا ، هامإلتونيلا في الحورية 4 إنستار من MEAM1. تم استخدام مسبار خاص بورتيرا (أحمر) مترافق مع CY3، مسبار هاميلتونيلا (أخضر) ملحوظ ب CY5. مقياس الحانات = 100 ميكرون. ( A ) إشارات التهجين الحمراء تمثل بورتيرا تحت حقل مظلم. ( B ) إشارات التهجين الخضراء تمثل هاميلتونيلا تحت حقل مظلم. ( C ) بورتيرا و هاميلتونيلا دمج الإشارات تحت الحقل المظلم. ( D ) بورتيرا و هاميلتونيلا دمج الإشارات تحت حقل مشرق. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55809/55809fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55809/55809fig3.jpg" /> الشكل 3: ناقل الإلكترون الصغيرسكوبي صورة، بسبب، بورتيرا، إلى داخل، ويتيفلي . السهم يشير إلى موقع بورتيرا . شريط مقياس = 1 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55809/55809fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الهدف سيمبيونت </td><td> الجين المستهدف </td><td colspan="3"> تسلسل التمهيدي (5&#39;-3 &#39;) </td><td> إجراءات ير </td><td> المراجع </td></tr><tr><td> Portiera </td><td> 16S الريباسي </td><td colspan="3"> بور-F: تسكاغتكغغكاتكات </td><td> 95 درجة مئوية 1 دقيقة، 60 درجة مئوية 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 1 دقيقة، 5 دورات. </td><td> 27 </td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> بور-R: أاغتسكغكتاتغت </td><td colspan="2"> 9576؛ C 1 دقيقة، 58 درجة مئوية 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 1 دقيقة، 30 دورات. </td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="3"></td><td> 72 درجة مئوية 20 دقيقة </td><td></td></tr><tr><td> Hamiltonella </td><td> 16S الريباسي </td><td colspan="3"> هام-F: تغاغتاغكتغاتكتغ </td><td> 95 درجة مئوية 1 دقيقة، 60 درجة مئوية 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 1 دقيقة، 5 دورات. </td><td> 27 </td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> هام-R: كغغاكتاكاكغتاغ </td><td colspan="2"> 95 درجة مئوية 1 دقيقة، 58 درجة مئوية 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 1 دقيقة، 30 دورات. </td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="3"></td><td> 72 درجة مئوية 20 دقيقة </td><td></td></tr><tr><td> كساح </td><td> 16S الريباسي </td><td colspan="3"> ريك-F: غتكاغاساككتاتك </td><td> 95 درجة مئوية 2 دقيقة؛ </td><td> 24 </td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> ريك-R: غاغاغاكتكتكغ </td><td> 92 درجة مئوية 1 دقيقة، 58 °C 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 90 ثانية، 30 دورات. </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="3"></td><td> 72 درجة مئوية 5 دقائق </td><td></td></tr><tr><td> Arsenophonus </td><td> 23S الرنا الريباسي </td><td colspan="3"> أرس-F: غتغاتغاتكاتاغتساا </td><td> 95 درجة مئوية 5 دقائق؛ </td><td> 28 </td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> أرس-R: غتكتكتاغتغتاكاك </td><td> 95 و ديغ؛ c 30 s، 60.5 و ديغ؛ c 30 s، 72 و ديغ؛ c 45 s، دورات 30؛ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="3"></td><td> 72 درجة مئوية 10 دقيقة </td><td></td></tr><tr><td> Cardinium </td><td> 16S الريباسي </td><td colspan="3"> كار-F: تاكتتاغاتاغاكغك </td><td> 95 درجة مئوية 2 دقيقة </td><td> 29 </td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> كار-R: غغاتاكاكتاككتسغ </td><td> 92 ° C 1 دقيقة، 57 درجة مئوية 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 90 ثانية، 30 دورات. </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="3"></td><td> 72 درجة مئوية 5 دقائق </td><td></td></tr><tr><td> الولبخية </td><td> 16S الريباسي </td><td colspan="3"> ول-F: تغتاغكتاتغاتاتاكت </td><td> 94 درجة مئوية 5 دقائق؛ </td><td> 30، 31 </td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> ول-R: غاتاغاتغاتكاتغت </td><td colspan="2"> 94 درجة مئوية 1 دقيقة، 55 درجة مئوية 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 1 دقيقة، 35 دورات </td></tr><tr><td> Fritschea </td><td> 23S الرنا الريباسي </td><td colspan="3"> الجمعة-F: غاتككتغكاتغاتغاتغاغا </td><td> 95 درجة مئوية 5 دقائق؛ </td><td> 32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> الجمعة-R: تغتكاتكاتكاغاغا </td><td> 94 درجة مئوية 1 دقيقة، 64 درجة مئوية 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 90 ثانية، 35 دورات. </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="3"></td><td> 72 درجة مئوية 5 دقائق </td><td></td></tr><tr><td> Hemipteriphilus </م&gt; </td><td> groEL </td><td colspan="3"> أورغرويل -F: كاكواواتاكتاغاتغ </td><td> 94 درجة مئوية 3 دقائق؛ </td><td> 18 </td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> أورغرويل -R: تاجارتكاتوككاتوك </td><td> 94 درجة مئوية 30 ثانية، 52 درجة مئوية 30 ثانية، 72 درجة مئوية 2 دقيقة، 34 دورات. </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="3"></td><td> 72 درجة مئوية 10 دقيقة </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1: الاشعال ير والإجراءات من إندوسيمبيونتس في الذبابة البيضاء. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> Portiera </td><td> Hamiltonella </td></tr><tr><td> رقم كونتيغ </td><td> 1 </td><td> 138 </td></tr><tr><td> سقالة رقم أ </strأونج&gt; </td><td> 1 </td><td> 89 </td></tr><tr><td> الطول الإجمالي، بب </td><td> 358232 </td><td> 1711449 </td></tr><tr><td> N50، بب </td><td> / </td><td> 118802 </td></tr><tr><td> N90، بب </td><td> / </td><td> 16753 </td></tr><tr><td> أقصى طول، بب </td><td> / </td><td> 390511 </td></tr><tr><td> دقيقة طول، بب </td><td> / </td><td> 503 </td></tr><tr><td> محتوى غ،٪ </td><td> 26.18 </td><td> 39.89 </td></tr><tr><td colspan="3"> (أ) المعلومات الواردة أدناه تستند كلها إلى السقالات. </td></tr></tbody></table> الجدول 2: الملامح العامة ل بورتيرا وهاملتونيلا مشروع الجينوم.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci at JoVE.com

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

هنا، نقدم بروتوكول لعزل إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء بيميسيا تاباسي من خلال تشريح والترشيح. بعد التضخيم، عينات الحمض النووي هي مناسبة لتسلسل لاحق ودراسة التبادلية بين إندوسيمبيونتس والذبابة البيضاء.

طرق استخراج إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء<em&gt; بيميسيا تاباسي</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

methods-for-extraction-endosymbionts-from-whitefly-bemisia

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

9.8K Views.  Zhejiang University.  هنا، نقدم بروتوكول لعزل إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء بيميسيا تاباسي من خلال تشريح والترشيح. بعد التضخيم، عينات الحمض النووي هي مناسبة لتسلسل لاحق ودراسة التبادلية بين إندوسيمبيونتس والذبابة البيضاء. 

Video: Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

أساليب لتصحيح تسجيلات السعة المشبك من كاليكس

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

الجزئي تشريح الدماغ الجرذ لاستخراج الحمض النووي الريبي أو البروتينات من منطقة الدماغ الخاصة

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

استخراج خلايا الحمض النووي الريبي من Neuroprecursor باستخدام بيو راد إجمالي RNA كيت

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

الكهربية طرق تسجيل الإمكانيات متشابك من يرقات ذبابة الفاكهة من NMJ

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

طرق لدراسة بربل الفكين اسماك الزرد

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component which can be extracted with an appropriate signal filter. Two factors are important: the EMG must be recorded in monopolar fashion, and the recording must be done so the low frequency signal corresponding the EPP is not eliminated. This report explains how to extract the EPP component from the EMG of the masseter muscle in a human subject. The surface EMG is recorded from eight sites using traditional disc electrodes aligned along over the muscle, with equal inter-electrode distance from the zygomatic arch to the angle of mandible in response to quick gum clenching. A reference electrode is placed on the tip of the nose. The EPP component is extracted from the raw EMGs by applying a high-cut digital filter (2nd dimension Butterworth filter) with a range of 10-35 Hz. When the filter is set to 10 Hz, the extracted EPP wave deflects either negative or positive depending on the recording site. The difference in the polarity reflects the sink-source relation of the end plate current, with the site showing the most negative deflection corresponding to the neuromuscular junction. In the case of the masseter muscle, the neuromuscular junction is estimated to be located in the inferior portion close to the angle of mandible. The EPP component exhibits an interesting oscillation when the cut-off frequency of the high-cut digital filter is set to 30 Hz. The EPP oscillation indicates that muscle contraction is adjusted in an intermittent manner. Abnormal tremors accompanying various sorts of diseases may be substantially due to this EPP oscillation, which becomes slower and is difficult to cease.

The endplate potential (EPP) component can be extracted from the surface EMG using a digital filter. The extracted EPP shows oscillation with a frequency of about 30 Hz.

استخراج مكون من EPP EMG السطحي

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

تقنية تسلل الطرد المركزي لاستخراج Apoplastic السوائل من أوراق النبات عن طريق<em&gt; فاصيلوس الشائع</em&gt; كمثال

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

طرق لعزل والثقافة، وتوصيف الوظيفي للالجيبية الأذينية عقدة Myocytes من الفئران الكبار

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...