This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke's Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.

Etik bildirimi: Bu çalışmada kullanılan tam kan örnekleri insan denekleri araştırma olarak kabul edilmez. örnekler memnun edildi klinik tanı amaçlar için elde edilmiş ve bu örneklerin kalan kısmı FINA araştırma deneyi için sağlanmıştır. Numuneler araştırmacılar kolayca bireylerin kimliğini tespit etmek mümkün değildi böyle kodlanmıştır. FINA Numune Hazırlama Modülü 1. Hazırlık <ol><li> A 2.6 mm 35 x 35 mm 2 kalınlığında% 100 pamuklu ped keserek pedi kurutma hazırlayın. örnek başına bir tane yastığı kesin. </li><li> ve daha sonra bir çekiç tahrik delik yumruk kullanarak bant merkezinde 7.14 mm çapında bir delik delme (50 (w) mm 25 mm (h)) parafin film kesme parça kağıt bant ile plastik parafin filmi hazırlayın. örnek başına bir bant hazırlayın. </li><li> Bir 8.35 mm çaplı daire delme bir bağlı cam kan ayırıcı membran (zar yakalama) diski hazırlayınBir çekiç tahrik delik kullanarak. örnek başına bir diski yumruk. Disk 2.3 um olan bir partikül tutma yeteneğine sahiptir. </li><li> forseps kullanarak lekeleme pad merkezinde yakalama diski koyarak FINA örnek hazırlama modülü monte edin. parafin bant delik maruz yakalama diskin merkezine bırakır, böylece yakalama disk üzerinde parafin filmi bandı yerleştirin. </li><li> lekeleme pedi kapsayacak şekilde hafifçe parafin bant germe ve diskin tüm kenarlarda blot pad sopa sıkıca parafin bant basarak disk ve lekeleme ped arasındaki maksimum temas sağlamak. </li><li> ileride kullanmak üzere deney ya da stoku için gerektiği kadar modülleri yapın. </li></ol> qPCR Tube 2. Hazırlık <ol><li> çift ​​kaplamalı Polye bir daire delme ile floresan algılama engelleme zarın önlemek için qPCR tüpün yanına hücre yakalama zarını demir atacak 5.1 mm&#39;lik bant diski hazırlayınbant sacdan bir çekiç tahrik yumrukla teşhis bant kayit yaptirilabilir. örnek başına bir bant diski hazırlayın. </li><li> Bandın etiket astarın bir tarafını kaldırın. bir yüzüne ve tüpün dibine doğru yapışmasını 200 ul PCR tüp içine bandı yerleştirin. İkinci etiket kaplamasını çıkartın. Tüp şimdi hazırlanmış diski almaya hazırdır. </li><li> ileride kullanmak üzere deney ya da stoku için gerektiği kadar tüpleri üretin. </li></ol> 3. contrive Kan Numune Not: gerçek bir test numunesi hazırlanmaktadır ediliyorsa, 4. adıma geçin. <ol><li> Viroloji Laboratuvarı Kalite Güvence elde edilen HIV-1 Provirüsün tek bir kopyasını barındıran Çözülme 8E5-LAV hücreleri 15 (MYK; Rush Presbyterian / St Luke Tıp Merkezi, Chicago, IL.). Not: / ml 4000 hücre konsantrasyonunda dondurulmuş hücre peletleri olarak depolanır. Daha önce tarif edildiği gibi, 9 hücre sayısı kontrol edildi. </li><li> ser hazırlayın/ Ul 1 400 hücre arasında değişen konsantrasyonlara ortamı (% 90 fetal sığır serumu,% 10 dimetil sülfoksit) donma ial dilüsyon. </li><li> mikrosantrifüj tüpü içine seri sulandırmaların her birinin arasında pipetleyin 10 ul hücre. 8E5-LAV kopya sayılarının 10-4,000 bir standart eğri oluşturmak için her bir tüpe, taze, HIV-1 negatif EDTA tedavi tam kan örneği 100 ul ekle. yavaşça tüpün 5 kez dibi hafifçe vurarak karıştırın. </li></ol> 4. FINA Ekstraksiyon gerçekleştirin <ol><li> 110 ul tam kan ve aşama 3,3 hücreler)% 1 (11 ul,% 10 Triton-X100 içinde bir son konsantrasyona kadar Triton-X100) eklenerek lize kan hücreleri. </li><li> yavaşça tüpün 5 kez dibi hafifçe vurarak karıştırın. Kan saydam kırmızı renkte olmalıdır. </li><li> Pipetleyin yakalama diske kan örneğinin tüm. Not: parafin bant ve yakalama membranı arasında bir su geçirmez mühür kan zarından akan sağlar ve yakalama m arasında iyi temaszarı böylesine ve kurutma ped montaj hızlı numune fitilleme sağlar. </li><li> Örnek filtresinden bekletin. Not: kılcal eylemi lekeleme pedine kan lizatı fitilleri, yakalama diskin yüzeyi üzerinde genomik DNA yakalama. o mat göründüğünde lizat disk içine batırılmış gelmiştir. </li><li> yakalama diske 600-1,000 ul 10 mM NaOH damla damla ekleyin. Not: Yıkama tamponu, 600 ul bir hacim ilave olarak eklenebilir. tampon hidrofobik parafin kasete bir damlacık oluşturur ve yaklaşık 20 saniye içinde diske delikten fitil olacak. Filtre hemoglobin beyaz belirten temizlenmesi için kırmızı değişecektir. </li><li> forseps ile lekeleme pedi disketi ayırın ve hazırlanan PCR tüpünde bant diski uygulayın. Filtre üzerinde kalan herhangi bir kırmızı varsa tüp içinde yerleştirmeden önce filtreyi temizlemek için yıkama tamponu 50-100 ul ekleyin. Not: Nadiren, aşırı basınç hazırlanmasında kullanılanlekeleme pad ayrılma sırasında zar katmanlarının bölümleme FINA modülleri sonuçları. Bu diskleri atın ve taze bir örnek hazırlamak. </li><li> Filtre PCR tüpünde yerleştirildikten sonra, hemen numuneleri analiz. Alternatif olarak, bir kutu içeren kalsiyum sülfat kurutucu kuru bir gecede, daha sonra analiz için hazır olana kadar silis kurutucu ve mağaza ile bir folyo kese içinde kap ve yer. </li></ol> 5. qPCR Reaksiyon <ol><li> Daha önce 9,11 açıklandığı gibi HIV spesifik primer ve problar kullanılarak reaksiyon başına 100 ul qPCR master karışımı hazırlayın. Bir iç amplifikasyon kontrolü amplifikasyon inhibitörlerinin varlığı izlemek için ve negatif örnek bir gerçek negatif olduğunu doğrulamak için ekleyin. Filtre tamamen ana karışımı ile ve filtre reaksiyon boyunca tüpün yanına sabitlenmiş kalmasını kaplı olduğundan emin olun. </li><li> Daha önce 9 tarif edilen bir gerçek-zamanlı PCR cihazı kullanılarak amplifikasyon gerçekleştirin. </li></ol>

<ol>
	<li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications.">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li><li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Paper+Machine"+for+Molecular+Diagnostics.">"Paper Machine" for Molecular Diagnostics.</a> Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li><li>Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost+point-of-care+viscous+sample+preparation+device+for+molecular+diagnosis+in+the+developing+world;+an+example+of+microfluidic+origami.">A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami.</a> Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).</li><li>Linnes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+molecular+diagnostic+for.">Paper-based molecular diagnostic for.</a> RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).</li><li>Rodriguez, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+RNA+Extraction,+in+Situ+Isothermal+Amplification,+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost,+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+(H1N1)+from+Clinical+Specimens.">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li><li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+(STIs):+the+way+forward.">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).</li><li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+the+developing+world.">Diagnostics for the developing world.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).</li><li>Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point-of-care+PCR+test+for+HIV-1+detection+in+resource-limited+settings.">A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings.</a> Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).</li><li>Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point-of-care+extraction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+proviral+DNA+from+whole+blood+for+detection+by+real-time+PCR.">Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).</li><li>Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (2012).</li><li>McFall, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+DNA+Extraction+Method+from+Whole+Blood+for+Highly+Sensitive+Detection+and+Quantitation+of+HIV-1+Proviral+DNA+by+Real-Time+PCR.">A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-PCR+processing:+strategies+to+generate+PCR-compatible+samples.">Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples.</a> Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li><li>Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (1991).</li><li>Violari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Antiretroviral+Therapy+and+Mortality+among+HIV-Infected+Infants.">Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants.</a> N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization. , (2010).</li><li>Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dried+blood+spots--preparing+and+processing+for+use+in+immunoassays+and+in+molecular+techniques.">Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa.">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hızlı tedavi erişimine bağlı EID nedeniyle HIV enfeksiyonuna 16 bebek ölümlerini azaltmak için ortaya konmuştur. Çünkü bir bebeğin kanında anne antikorların kalıcılığı, hızlı HIV antikor testleri, HIV-maruz kalan bebeklerin durumunu belirlemede yarar sınırlıdır. DSÖ, HIV-1 pozitif annelerden doğan tüm bebeklerin bir virolojik testi 17 kullanılarak, yaş 4-6 hafta test edilmelidir önerir. Biz 61 Güney Afrikalı bebekler 11 küçük alan değerlendirmesinde göstermiştir% 100 duyarlılık ve özgüllük ile tek kopya algılama yeteneğine sahiptir tam kan örneklerinde HIV-1 proviral DNA tespiti ve miktar tayini için bir tahlilin gelişimini bildirmişlerdir. Yüz mikrolitre ya da bütün kan daha parmak veya topuk çubuk yoluyla toplanmış ve FINA modülleri 18,19 ile işlenebilir. Bu kan örnekleri daha sonra amplifikasyon bu yöntem ide yapmadan önce, en az bir ay depolanabiliral laboratuvarlar uzak bebekleri test etmek için. Şekil 3 HIV-1 Negatif tam kandan zoraki örneklerin standart bir eğri sunulan çalışmada Eritilen hücreler, tasvir edilmiştir, HIV-1 proviral DNA barındıran ile arttı. Bu çalışmaya bir uyarı örnek eklenir bazı hücreler nedeniyle zaten potansiyel hedef algılama düzeyini gelişmiş olabilirdi donma / çözülme, için parçalanmış olabilir olduğunu. Daha sıkı deneysel tasarım daha doğru tam kan taklit olurdu taze kültür hücreleri kullanarak örnek yapmacık olması olurdu. FINA örnek hazırlık yöntemi sınırlı kaynak ayarlarını 8 kullanılmak üzere (geliştirilme aşamasındadır) bir EID POC qPCR cihazın içine dahil edilmek üzere dizayn edilmiştir; Ancak, burada açıklanan manuel biçimi de bir laboratuvarın örnek hazırlık portföyüne yararlı bir ek olabilir. FINA yıkamak, bağlama kullanmak ve Kurutucuyla kullanılan stratejiyi Zehir değilAyıklanan nükleik asitleri sulandırır ed kan lekeleri ve diğer kağıt tabanlı emiş sistemleri muhtemelen sub-optimal algılama hassasiyeti 5 yol açar. FINA sistemi son derece esnek ve kolayca proviral HIV DNA tespiti yanında başka genetik testleri için uyarlanabilir. kan veya diğer biyolojik örneklerin alt hacimleri daha az bol olanlar için bol hedefler ve daha yüksek miktarlar için işlenebilir. FINA sistemi orijinal düzenlemede, bir kan ayırma membranı kullanılarak, tam kan hücreleri yakalama ve daha sonra 10 mM NaOH 9 eklenerek bunları lize. Bu sürüm, bir az sayıda kullanıcı adım avantajına sahiptir, fakat işlenebilir hücre sayısı / kan hacmi daha küçüktür. Bu raporda kullanılan ilişkili bir cam membran ek olarak, diğer kan ayrılması ya da kan toplama filtre kağıtları, bu yöntem ile başarılı bir şekilde kullanılmıştır ve çeşitli kantitatif PCR araçları da F gömülü şablonu amplifiye gösterilmiştirilter diski 9. tek şart filtresi real-time PCR aracının floresan okuma bloke olmamasıdır. FINA ekstre önemli bir sınırlama, yakalama membran çapına bir boyut kısıtlaması olmasıdır. 9 mm &#39;den daha büyük bir zar olan bir disk, reaksiyon karışımına maruz kalan yüzey alanı sınırlandıran bir tüp içinde membran üst üste olmayan bir 200 ul qPCR tüpü içerisine yerleştirilmiş olamaz. Ayrıca, disk çapı daha büyük, daha qPCR reaksiyon hacmi maliyetini artırır filtreyi karşılamak ve dönüş etrafında zamanı testinin için gereklidir. Filtre verimli numune DNA yakalamak için çok küçükse, verimli yıkama engelliyor tıkayabilir. Bağlı cam yakalama membranı kullanılarak, bütün kan örneklerinden, HIV-1 proviral DNA olup, viral RNA yakalamak mümkün olmuştur (veriler gösterilmemiştir). Alternatif membranlar veya tamponlar t kullanılabilir eğer biz bilmiyoruzO RNA&#39;nın izolasyonu yerine veya DNA ilave olarak teşvik eder. okuyucu yalnızca örnekten DNA izole etmek istiyorsanız bu protokol bazı protokoller ile gerekli RNA enzimatik kaldırılmasını gerektirmez. EID hassasiyetini ve RNA tespiti bu eksikliği artıracak klinik örneklerde HIV-1 RNA ve DNA hem algılama tanı testi bir sınırlama yoktur. Yeni bir tahlile FINA işlemi uyum en önemli nokta, örnekte, örneğin, DNA, hücre sayısı miktarını karşılamak için test edilecek olan filtre büyüklüğü kontrol etmektir. Daha küçük yakalama diskler kullanılabilir, böylece genel FINA çıkarma hücrelerin küçük sayılarla örnekleri ile en iyi şekilde çalışır. Filtrenin bağlama kapasitesini belirlemek için, sadece toplama membran altında yığılmış FINA modüle ikinci bir filtre diski ekleyin. örnek ekleyin ve adım 4,1-4,5 gibi membranları yıkamak. Ayrı qPCR tüpleri ve amp içine DNA yakalama disklerin her koyunlify. bir standart eğri kullanılarak, her bir filtre üzerinde tutulur giriş DNA oranında belirler. filtre büyüklüğü tahlilinde ihtiyaçlarına optimize edilebilir. Hücre lizatı filtre üstün tespit özellikleri sağlayan (yayınlanmamış gözlemler) ilave edilir Burada tarif edilen FINA proviral DNA testi için, insan genomik DNA&#39;sından fazlasını% 99 yakalanır. EID ek olarak, FINA gelecek uygulamalar bağlı anti-retroviral tedavi, viral bastırma elde hastaların HIV-1 hastalığı izlenmesi için bir belirteç olarak algılama ve proviral DNA kantitatif içerebilir. HIV eradikasyonu amacıyla tedavi izleme, HIV-1 ile enfekte hücrelerin rezervuarlar için periferik kan dışında diğer girdileri tarama tarafından da yapılabilmektedir. HIV Proviral testi de doğrudur enfeksiyon için aşı deneme konularını taramak için kullanılabilir. Kan örnekleri FINA modüllerde depolama sırasında stabil ve ce daha sonra sevkiyat için tarla koşullarında alınabilirepidemiyolojik çalışmalar için bu yöntem idealdir PCR analizi için ntral laboratuarlar. HIV-1 tespit ek olarak, bu son derece esnek bir yöntem, aynı zamanda farmakogenetik tarama ya da başka bir SNP tespiti veya hayvan modellerinde hızlı genotipleme için biyolojik örneklerinde bulunan hassas ilaç hedefleri amplifiye etmek için kullanılabilir. Ayrıca, FINA ile kullanılabilir örneğin helikaz göre amplifikasyonu (HDA) ya da döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP), izotermal amplifikasyon yöntemleri şablon ekstre ya da DNA-gömülü filtre üzerinde, geleneksel PCR amplifikasyonu için bir şablon olarak kullanılabilir.

Çeşitli raporlar, herkes için ulaşılabilir zarif duyarlılığı ve moleküler tanı özgüllüğünün yapma hedefiyle noktası-bakım (POC) aygıtları 1-5 kullanım için, kağıt veya membran bazlı ekstraksiyon yöntemleri geliştirilmesini ele aldık. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Cinsel Yolla Bulaşan Hastalıklar Tanı Girişimi POC (Ekonomik, Hassas, Özgül, kullanıcı dostu, hızlı ve sağlam, Ekipman-özgür ve ihtiyacı olanlara teslim) tanımlamak için idealdir özellikleri ASSURED terim icat Test 6. Bu yönergelerin, ekipman gerektirmeyen karakteristik moleküler teşhis için elde etmek özellikle zordur. Bununla birlikte, sahada her yenilik en çok ihtiyacı olanlara ulaşma hedefine ilerlemek olacak ve umut mevcut teknoloji 7 adapte test performansında yakın vadeli iyileştirmeler için vardır. Burada kandan DNA ayıklamak için basit bir protokol açıklarkarmaşık kimya veya laboratuar aletleri gerekli değildir. FINA (nükleik asitlerin filtrasyon izolasyon) örnek hazırlama yöntemi ilk olarak, bir örnek-yanıt noktası bakım (POC) bir parçası nicel PCR HIV-1 provirüsü tespit etmek için tam kan lökosit DNA elde etmek için geliştirilmiştir sınırlı kaynak ayarlarını 8-11 kullanılmak üzere (qPCR) erken bebek teşhis (EID) platformu. FINA ekstraksiyon tersine çevrilebilir kaotropik ajanların 12 varlığında DNA bağlama silika membranlar veya silis kaplı paramanyetik parçacıkları kullanan geleneksel saflaştırma yöntemleri farklıdır. Bunun yerine, FINA doğrudan tam kandan, hücresel DNA elde etmek için, bir ayırma membranı üzerinden dikey filtrasyon kullanır. Yakalanmış DNA içeren zar bir PCR tüpü içinde doğrudan yerleştirilmiş ve ya hemen sonraki amplifikasyon 9 kurutuldu bir PCR reaksiyonunda veya hava da kullanılabilir. Resim kaotropik maddeler, fenol ya da alkoller, numûne alma kullanılır, Eliminating çıkarma işlemi 13,14 türetilen güçlü qPCR inhibitörleri kaldırmak için gerekli geniş yıkama adımları. FINA Membran örneği, zara ilave edilmeden önce, hücre lizizi 11 tarafından serbest ya hücrelerinin 9 ya da genomik DNA yakalayabilir. hücre yakalama için, tam kan membranına doğrudan ilave edilir. Hücreler daha sonra 10 mM NaOH eklenerek zarda lizlenir. Bu yöntemin avantajı, sadece 3 etapları kapsar: 1) Örnek ilave; qPCR tüpünde 2) hücre parçalama / yıkama ve 3) filtre diski yerleştirme. Bu yöntemin dezavantajı, membran yalnızca membran diskin çapı ile doğrudan orantılı bir hücre belirli sayıda basılı olabilir. Eid gerekli saptama limitini ulaşmak için, tam kan, 100 ul qPCR tüp yerleştirilmesi için çok büyük bir filtre gerektirir Örnek girişi için gereklidir. koleksiyonuna örneğini uygulamadan önce bir deterjanla kan hücrelerinin lizeMembran, bir işlem adımını ekler, aynı numune boyutu için daha küçük bir filtre kullanımına izin verir. Biz yüksek tekrarlanabilirlik, tek kopya algılama ve bu test konfigürasyonu 11 kullanılarak kanın 100 ul HIV-1 proviral DNA kadar az 10 kopya ölçümünü göstermek başardık. Bu yazıda, başlangıçta laboratuar kullanımı için geliştirilen FINA protokol açıklar. FINA örnek hazırlama modülü olarak bilinen membran / filtre sandviç büyük gruplar halinde hazırlanmış ve daha sonra kullanılmak üzere stoklanmış edilebilir. örnekler, bu işlem 2 dakika sürer ve boyut toplu değişen gerçekleştirilebilir ekstre edilmesi. qPCR hemen çalıştırılabilir veya qPCR gerçekleştirmek için uygun kadar gömülü DNA içeren filtreler saklanabilir. Bu yöntem, düşük ve yüksek kaynak ayarlarında hem numunelerin rutin analizler için çok uygundur.

<table><tbody><tr><td>Fusion 5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>8151-9915</td><td></td></tr><tr><td>707 blotting pad</td><td>VWR International</td><td>28298-014</td><td></td></tr><tr><td>PARAFILM M</td><td>VWR International</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape&amp;nbsp;</td><td>3M Medical Specialties</td><td>9965</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l qPCR strip tubes</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>optical strip caps</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005p qPCR System</td><td>Agilent</td><td>401456</td><td></td></tr><tr><td>sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>A.C.S. Reagent</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>for molecular biology</td></tr><tr><td>fetal bovine serum, certified, U.S. origin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Hammer driven small hole punch 3/16&quot; hole diameter (5.1 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A16</td><td></td></tr><tr><td>Hammer driven small hole punch 1/4&quot; hole diameter (7.14 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A19</td><td></td></tr><tr><td>Hammer driven small hole punch 5/16&quot; hole diameter (8.35 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A23</td><td></td></tr></tbody></table>

filtration isolation of nucleic acids:  a simple and rapid dna extraction method

FINA, nükleik asitlerin filtrasyon izolasyonu, en az 2 dakika içinde tam kandan, hücresel DNA elde etmek için, bir ayırma membranı emici ped vasıtasıyla dikey filtrasyon kullanan yeni bir ekstraksiyon yöntemi. Kan numunesi deterjan, kısa bir süre karıştırıldı ile muamele edilmiş ve ayırma membranı şekilde kamış ile uygulanır. Lizat ayırma membranı yüzeyinde genomik DNA yakalama, kılcal eylemi lekeleme pedine fitilleri. Ekstre edilen DNA, PCR inhibitörleri, emici lekeleme pedine kötü burada basit bir yıkama aşaması sırasında zar üzerinde muhafaza edilir. yakalanmış DNA içeren zar daha sonra daha fazla arıtılmadan PCR reaksiyonuna ilave edildi. Bu basit yöntem laboratuvar ekipmanı gerektirmeyen ve kolayca ucuz laboratuar malzemeleri ile uygulanabilir. Burada erken için bir model olarak, 100 ul tam kandan, HIV-1 proviral DNA&#39;nın son derece hassas algılama ve miktar tayini için bir protokol açıklarkolayca diğer genetik hedeflere adapte olabilir HIV fant tanı.

8E5-LAV hücreleri ile çivili tam kandan proviral DNA çıkarmak için iş akışı, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 2 FINA örnek modülü göstermektedir qPCR tüp hazırlanır Şekil. Zoraki örnekleri (Şekil 3) standart eğride gösterildiği gibi bu yöntem, farklı kopya numaraları de 8E5-LAV hücrelerinden, HIV-1 provirüs verimli amplifikasyonu için izin verir. PCR Verimliliği = -1 + 10 (-1 / eğim) hesaplanan,% 103 bir etkinliği vardı. Doğrunun denklemi r² = 0,996 bir korelasyon ile = -3.25x + 27.95 y oldu. HIV proviral DNA standart eğri Tablo 1 &#39;de görüldüğü gibi, aynı zamanda, yüksek ölçüde tekrarlanabilir amplifikasyon sahip çoğaltır. Buna ek olarak, hidroksipiruvat Redüktaz sayısından bağımsız FINA ile kan ekstrakte bir sonucu olarak ortaya PCR inhibisyonu olduğunu göstermek için mevcut olan 500 kopya bir iç kontrol mevcut HIV-1 provirüsün kopya (Şekil 4). IC amplifikasyonu verimli 21.92 ± 0.25 ortalama Cq ve% 1 bir CV ile, test edilen tüm 18 numune elde edildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig1.jpg" /> Şekil 1: tam kandan proviral DNA tespiti için iş akışı qPCR için 8E5-LAV hücreleri ile çivili. Kan yakalama zara ve yıkama tamponu ilave edildikten sonra ilave edildikten sonra (A), sağdaki hazırlanan FINA modülü yaptı. QPCR Master karışımı ile çift kaplamalı bant yapışmış yakalama disklerle (B) qPCR tüpleri eklendi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54289/54289fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54289/54289fig2.jpg" /> Şekil 2: FINA içi modülü ve qPCR tüp hazırlanması. </stRong&gt; (A) Bir 8.35 mm çaplı yakalama membran disk kare 707 lekeleme pedi ve merkezi bir 7.14 mm çapında bir delik içeren parafin bant ince bir tabaka arasında sıkışmış olan bu tür parafin bant delik merkezli olduğunu pipet ile parçalanmış kan doğrudan uygulama için yakalama diski. (B) 5,1 mm çift kaplamalı polyester tanı bant 200 ul qPCR tüp tarafında kalmış. Bandın ikinci astar hazır olduğunda yakalama diski uygulamak için yapışkan yüzeyi açığa çıkarılır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54289/54289fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54289/54289fig3.jpg" /> Şekil 3:., HIV-1 proviral DNA uydurulmasının örneklerin standart eğrisi 4 100 ul elde edilen (A), amplifikasyon çizimini, HIV-1 KD çoğaltır500 kopya / iç kontrol Katı hatlar = amplifikasyon araziler reaksiyonu ile 4,000, 400, 40 ve 10 8E5-LAV hücreleri ile çivili tam kan gatif; Noktalı çizgi eşiğini =. Y ekseni floresans birimleri ve X ekseni qPCR döngü sayısı. Cq değerleri (B), standart eğriler 100 ul tam kan başına 8E5-LAV hücre günlük kopya sayısı karşısında amplifikasyon grafiğinden hesaplanmıştır. Doğrunun denklemi: y = -3.25x + 27,95; R² = 0,996; PCR verimi = 103,23% Verimliliği hesaplanan = -1 + 10 (-1 / eğim) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54289/54289fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54289/54289fig4.jpg" /> Şekil 4:. İç kontrol hidroksipiruvat Redüktaz Amplifikasyon kontrol plazmid reaksiyon başına eklenmiş qPCR inhibisyonu 500 kopya gösterir. Katıçizgiler = amplifikasyon araziler; Noktalı çizgi eşiğini =. IC Ortalama Cq 21.92 ± 0.25 =. CQS 21.21 den 22.32 arasında değişmektedir. varyasyon (% CV) katsayısı% 1 =; N = 18. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54289/54289fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 8E5-LAV hücre / </td></tr><tr><td> 100 ul DB </td><td> Ave. cq </td><td> SD </td><td> ÖZGEÇMİŞ (%) </td></tr><tr><td> 4.000 </td><td> 16.27 </td><td> 0.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 19.54 </td><td> 0.15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 22.56 </td><td> 0.3 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 24.83 </td><td> 0.15 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>4000 Ortalama Cq, standart sapma (SD) ve değişim katsayısı (% CV), 400, 40 ve FINA çıkarma ve HIV-1 spesifik primerler ile 8E5-LAV standart eğrinin 10 kopya: ge = &quot;1&quot;&gt; Tablo 1 sondalar. N = 4 WB = tam kan.

Watch this Scientific Journal Video about Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method at JoVE.com

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Burada nicel PCR ile tespit tam kan HIV proviral DNA için basit ve hızlı bir kağıt bazlı DNA ekstraksiyon yöntemini tarif etmektedir. Bu protokol için diğer genetik işaretleyiciler saptanması veya alternatif yükseltme yöntemleri kullanılarak kullanılmak için uzatılabilir.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

filtration-isolation-nucleic-acids-simple-rapid-dna-extraction

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K Görüntüleme.  Northwestern University.  Burada nicel PCR ile tespit tam kan HIV proviral DNA için basit ve hızlı bir kağıt bazlı DNA ekstraksiyon yöntemini tarif etmektedir. Bu protokol için diğer genetik işaretleyiciler saptanması veya alternatif yükseltme yöntemleri kullanılarak kullanılmak için uzatılabilir. 

Video: Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Genetik

Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil and gas. This process revolutionized the U.S. energy industry, as it gives access to resources that were previously unobtainable and now produces two-thirds of the total natural gas in the United States. Although fracking has had a positive impact on the U.S. economy, several studies have highlighted its detrimental environmental effects. Of particular concern is the effect of fracking on headwater streams, which are especially important due to their disproportionately large impact on the health of the entire watershed. The bacteria within those streams can be used as indicators of stream health, as the bacteria present and their abundance in a disturbed stream would be expected to differ from those in an otherwise comparable but undisturbed stream. Therefore, this protocol aims to use the bacterial community to determine if streams have been impacted by fracking. To this end, sediment, and water samples, from streams near fracking (potentially impacted) and upstream or in a different watershed of fracking activity (unimpacted) must be collected. Those samples are then subjected to nucleic acid extraction, library preparation, and sequencing to investigate microbial community composition. Correlational analysis and machine learning models can subsequently be employed to identify which features are explanative of variation in the community, as well as identification of predictive biomarkers for fracking&#39;s impact. These methods can reveal a variety of differences in the microbial communities among headwater streams, based on the proximity to fracking, and serve as a foundation for future investigations on the environmental impact of fracking activities.

Here, we present a protocol to investigate the impacts of hydraulic fracturing on nearby streams by analyzing their water and sediment microbial communities.

Hidrolik Çatlatmanın Akışlar Üzerindeki Etkisini Mikrobiyal Moleküler İmzalar Kullanarak Değerlendirmek

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil ...

Çevre

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been treated with storage/lysis buffer and archived at -80&deg;C, and to purify this DNA using a cesium chloride density gradient.  The protocol begins with two one-hour incubation steps to liberate DNA from cells and remove RNA.  Next, a series of Phenol:Chloroform and Chloroform extractions are performed followed by centrifugation to remove proteins and cell membrane components, collection of the aqueous DNA extract, and several buffer exchange steps to wash and concentrate the extract.  Part Five describes the optional purification via cesium chloride density gradient.  It is recommended to work with less than 15 samples at one time to avoid confusion and cut down protocol time. The total time required for this protocol depends on the number of samples to be extracted. For 10-15 samples and assuming the proper centrifugation equipment is available, this entire protocol should take 3 days. Make sure you have the hybridization ovens set to temperature at the outset of the process.

We describe a method for extraction of high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;m Sterivex filters, followed by cesium chloride density gradient centrifugation for purification.

0.22 mcM Sterivex Filtreler ve Sezyum Klorür Yoğunluk Gradient Santrifüj DNA Ekstraksiyon

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Biyoloji

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both with and without preexisting conditions. Rapid processing of these samples is essential to avoid degradation of key cellular components. Included here are methods for simultaneous peripheral blood mononuclear cell (PBMC), DNA, RNA and serum isolation from a single blood draw performed in the homes of consenting participants across a metropolitan area, with processing initiated within 2 hr of collection. We have used these techniques to process over 1,600 blood specimens yielding consistent, high quality material, which has subsequently been used in successful DNA methylation, genotyping, gene expression and flow cytometry analyses. Some of the methods employed are standard; however, when combined in the described manner, they enable efficient processing of samples from participants of population- and/or community-based studies who would not normally be evaluated in a clinical setting. Therefore, this protocol has the potential to obtain samples (and subsequently data) that are more representative of the general population.

We outline a methodology for the processing of whole blood to obtain a variety of components for further analysis. We have optimized a streamlined protocol that enables rapid, high-throughput simultaneous processing of whole blood samples in a non-clinical setting.

Topluluk tabanlı Ayar Elde Edilen Örneklerin hızlı Fraksiyonlama ve Tam Kan Bileşenlerinin İzolasyonu

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Tıp

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Düşük MW'lı DNA'yı Zenginleştirerek Çevresel AMR'yi Değerlendirmek için Etkili Teknik

Enhanced Extraction of Low-Molecular Weight DNA from Wastewater for Comprehensive Assessment of Antimicrobial Resistance

Environmental surveillance is recognized as an important tool for assessing public health in the post-pandemic era. Water, in particular wastewater, has emerged as the source of choice to sample pathogen burdens in the environment. Wastewater from open drains and community water treatment plants is a reservoir of both pathogens and antimicrobial resistance (AMR) genes, and frequently comes in contact with humans. While there are many methods of tracking AMR from water,&#160;isolating good-quality DNA at high yields from heterogeneous samples remains a challenge. To compensate, sample volumes often need to be high, creating practical constraints. Additionally, environmental DNA is frequently fragmented, and the sources of AMR (plasmids, phages, linear DNA) consist of low-molecular-weight DNA. Yet, few extraction processes have focused on methods for high-yield extraction of linear and low-molecular-weight DNA. Here, a simple method for high-yield linear DNA extraction from small volumes of wastewater using the precipitation properties of polyethylene glycol (PEG) is reported. This study makes a case for increasing overall DNA yields from water samples collected for metagenomic analyses by enriching the proportion of linear DNA. In addition, enhancing low-molecular-weight DNA overcomes the current problem of under-sampling environmental AMR due to a focus on high-molecular-weight and intracellular DNA. This method is expected to be particularly useful when extracellular DNA exists but at low concentrations, such as with effluents from treatment plants. It should also enhance the environmental sampling of AMR gene fragments that spread through horizontal gene transfer.

Yazar Spotlight: Kültür Tabanlı Teknikleri ve Genomiği Birleştirerek Çevresel Antimikrobiyal Direnci Anlama ve Tespit Etme

Here, we present a simple technique to assess environmental antimicrobial resistance (AMR) by enhancing the proportion of low-molecular-weight extracellular DNA. Prior treatment with 20%-30% PEG and 1.2 M NaCl allows detection of both genomic and horizontally transferred AMR genes. The protocol lends itself to a kit-free process with additional optimization.

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu 

Environmental surveillance is recognized as an important tool for assessing public health in the post-pandemic era. Water, in particular wastewater, has ...

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi

Hidrolik Çatlatmanın Akışlar Üzerindeki Etkisini Mikrobiyal Moleküler İmzalar Kullanarak Değerlendirmek

0.22 mcM Sterivex Filtreler ve Sezyum Klorür Yoğunluk Gradient Santrifüj DNA Ekstraksiyon

Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

Topluluk tabanlı Ayar Elde Edilen Örneklerin hızlı Fraksiyonlama ve Tam Kan Bileşenlerinin İzolasyonu

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu