Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından desteklenen (EN 104-2311-B-001-034) ve Hücresel Enstitüsü ve Organismic Biyoloji, Academia Sinica, Tayvan.

1. Gerekli Transgenlerin 11, 13 kullanılarak tsMARCM hazır Sinekler oluşturun <ol><li> Bireysel sinekler 11 tarafından yapılmaktadır transgenlerin gelen tsMARCM hazır sinekler özgün sürümünü oluşturun (bakınız Tablo 1). Aynı sinek stoklarının 13 çoklu transgenler koyarak, daha önce tarif edilmiştir standart sinek genetik geçiş şemaları, Davranış. <ol><li> Bir ebeveyn doğrultusunda, FRT 40A, UAS-mCD8 :: GFP (ilk muhabir, mCD8 :: GFP transgenlerin araya; transgen ifadesi bir zar-gergin muhabiri üreten yukarı aktivasyon dizisi promoter kontrolü altındadır sıçan küme o ifadesi karşı RNAi, yeşil flüoresan protein ile kaynaşmış farklılaşma 8 proteininin fare küme) ve UAS-rCD2RNAi (ikinci muhabiri ifadesini inhibe baskılayıcıf farklılaşma 2, rcd2) 2. kromozomun sol kolunda. yer dokuya özgü eğer mümkünse, X veya 3. kromozom üzerinde -GAL4 sürücüsü. </li><li> Diğer ebeveyn doğrultusunda, FRT 40A, UAS-rCD2 :: RFP transgenlerin araya (ikinci muhabiri, rCD2 :: RFP, diğer zar-gergin muhabir kırmızı floresan proteini ile kaynaşmış rCD2 proteini oluşan) ve UAS-GFPRNAi (mCD8 :: GFP ekspresyonunu inhibe baskılayıcı, GFP ifadesi karşı RNAi) 2. kromozomun sol kolunda. X veya 3. kromozomun, mümkünse ısı-şok (hs) -FLP veya doku-Seçicilik FLP yerleştirin. </li></ol></li><li> Bireysel sinekler 14 tarafından yapılmaktadır transgenlerin gelen tsMARCM hazır sineklerin yeni sürümü oluşturun (bakınız Tablo 1). s tarif edilmiştir standart sinek genetik geçiş şemaları, Davranışreviously, aynı sinek stoklarının 13 çoklu transgenlerin koyarak. <ol><li> Bir ebeveyn doğrultusunda, aynı kolunda birlikte bir FRT site ve UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (mCD8 :: GFP ve rCD2 ifadesini :: RFP inhibe bastırıcı bir kombine transgen) arasında transgenlerin araya 2. veya 3. kromozomu (STT ve UAS mCD8.GFP.UAS-rCD2i bölgesinin transgenlerin uygun çift Tablo 1 &#39;de belirtilmiştir). Mümkünse, seçilen FRT sitenin kromozomu dışındaki kromozomlar üzerinde doku-spesifik-GAL4 sürücüsü yerleştirin. </li><li> Diğer ebeveyn doğrultusunda, bir FRT site ve UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (diğer kombine rCD2 bir transgen :: RFP ve mCD8 :: GFP ekspresyonunu inhibe baskılayıcı) aynı kolun içinde transgenlerin araya STT transgenlerin 2. veya 3. kromozom (uygun çiftlerinin </em&gt; ve UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi) Tablo 1&#39;de gösterilmiştir. Yeri hs-FLP veya mümkünse, seçilen FRT sitenin kromozomu dışındaki kromozomlar üzerinde doku-spesifik-FLP. </li></ol></li></ol> 2. Çapraz tsMARCM hazır Onların Döl içinde tsMARCM klonlarının oluşturmak için Sinekler <ol><li> Birlikte Çapraz tsMARCM hazır sinekler taze bir sinek gıda şişede (örneğin, birlikte adım 1.1.2 veya 1.2.2 uçar adım 1.1.1 ya da 1.2.1 ve 20-30 bakire kadın 10-15 erkek sinekler koymak) şişenin duvarda -yapılan maya yapıştırın. </li><li> döllenmiş yumurta toplama önce çiftleşme şansı artırmak için 2 gün boyunca 25 ° C&#39;de geçti tsMARCM hazır sinekler koruyun. </li><li> Sık transferini kolaylaştırmak için (boğmakta önlemek sinekler aşağı dokunun veya sinekler uyutmak için karbondioksit kullanmak için taze mayalı şişeleri içine geçti tsMARCM hazır sinekler aktarmak; aracılığı ile 10 ml sinek gıda 80-100 döllenmiş yumurta daha fazla tutmakl) çok fazla yumurtadan larva önlemek için. </li><li> Kültür tsMARCM hayvanlar (örneğin, döllenmiş yumurtalar, tsMARCM hayvan genotipinin bir örneği, Şekil 3&#39;te kullanılan şekliyle, HS-FLP [22], a / a; UAS mCD8 :: GFP, UAS rCD2RNAi, FRT 40A GAL4-GH146 / UAS rCD2 :: RFP UAS GFPRNAi, FRT 40A +; arzu edilen aşamada (embriyo, larvalarına karşı geliştirmek kadar 25 ° C &#39;de seri olarak transfer şişelerde atılmıştır +), veya pupa). </li><li> oluşturmak için FLP ekspresyonunu indükleyen ısı şok uygun zamanı belirlemek aktarılır 10 için 37 ° C su banyosu, 20, 30, 40, aynı gelişim aşamasında tsMARCM hayvan içerir şişe ve 50 dakika yerleştirin Çevrede tsMARCM klonları. Doku Seçicilik FLP tsMARCM deneyde kullanılan ediliyor bu adımı atlayın (hs-FLP sinir soy tercih edilir analizleri bu tercihin nedenleri daha önce 15 tarif edilmiştir). NOT: ilgi daha fazla tsMARCM klonları istedi eğer gelecekte tsMARCM deneylerinde ısı şoku optimal zamanı kullanarak adımı yineleyin 2.5; Genellikle, daha FLP ifade ile kıyaslandığında, hs-FLP [22] indüklenir hs-FLP [1] Aynı ısı-şok süresi. </li><li> Kültür onlar 25 ° C&#39;de ısı şok tsMARCM hayvanlar uygun gelişim aşamasına ulaştı ve ardından 3. adıma geçin kadar. </li></ol> 3. Leke hazırlayın ve Dağı Fly Brain tsMARCM klonlarının İçeren <ol><li> forseps koruma yemekleri hazırlayın. A bileşenini (30 g) ve aktive edilmiş mangal kömürü (0.25 g) ile Silikon Elastomer Kit B bölümünde (3 g) karıştırın. Uygun yemekleri içine karışımı dökün. </li><li> Diseksiyon mikroskobu ile görüntülenen bir forseps koruma çanak forseps kullanarak 1x fosfat tamponlu tuzlu su içinde tsMARCM hayvanlar (PBS) üzerinden larva, pupa veya ergin beyinleri teşrih. NOT: sinek beyin diseksiyon için bir protokol azalan olmuşturDaha önce 16 belirlemiş. </li><li> 1X PBS, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 formaldehit içeren bir cam Noktası plaka uçucu beyinleri düzeltildi. adımların geri kalanı için bu cam nokta plakasında sinek beyinleri işleyin. </li><li> Kaldırmak PBT:; yıkama PBT çıkarın ve hızlı bir şekilde yeni PBT ekleyin: sinek beyinleri% 1 PBT (1 x PBS,% 1 Triton X-100 ihtiva eden) ve% 1 PBT (durulamada 30 dakika boyunca her biri üç kez yıkama ile üç kez yıkayın yeni PBT eklemek ve bir orbital karıştırıcı kullanılarak yeni PBT sinek beyinleri) kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> gece boyunca 4 ° C&#39;de ya da oda sıcaklığında 4 saat için birincil antikor karışımı ile uçucu beyinleri inkübe edin. ihtiva eden ve fare anti-Bruchpilot (BRP) antikoru (1:50),% 1 PBT: tavşan anti-DsRed antikoru (800 1): Primer antikor karışımının bir örneği, sıçan anti-CD8 antikoru (1: 100) olan % 5 normal keçi serumu (NGS). </li><li> Uçucu beyinleri% 1 PBT ile üç kez durulanır ve daha sonra,% 1 PBT 30 dakika her biri için uygun üç kez yıkayın. </li><li&gt; gece boyunca 4 ° C&#39;de ya da oda sıcaklığında 4 saat için ikincil antikor karışımı ile uçucu beyinleri inkübe edin. Ve keçi anti-fare: sarı floresan boya (800 1) ile konjuge keçi anti-tavşan IgG antikoru: sekonder antikor karışımının bir örneği, yeşil floresan boya (800 1) ile konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG antikoru olan % 5 NGS içeren% 1 PBT: IgG antikoru uzak-kırmızı-floresan boya (800 1) ile konjuge. </li><li> Uçucu beyinleri% 1 PBT ile üç kez durulanır ve daha sonra,% 1 PBT 30 dakika her biri için uygun üç kez yıkayın. Bir anti-söndürme maddesi ile mikro lam üzerine monte edin. sinek beyinleri kapsayacak ve korumak için mikro slaytta bir mikro cam kapak koyun. net oje kullanarak mikro kapak camı ve mikro slayt kenarları mühür. Bu monte edilir ve 4 ° C&#39;de beyin numuneleri sinek kapalı saklayın. </li></ol> 4. Süreç alın ve tsMARCM Klonların Floresan Görüntüler analiz <ol><li> tsMARCM klonları fr floresan görüntüler yakalayınom numuneler tercih konfokal mikroskopi sistemini kullanarak adım 3.8 oluşturulan. </li><li> Iki boyutlu içine tsMARCM konfokal floresan görüntülerin proje yığınlar, seçim konfokal mikroskopi sistemi ile birlikte verilen görüntü işleme yazılımı kullanarak görüntüleri düzleştirilmiş (Şekil 3B bakınız - basık örnekleri için 3T - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O ve 3Ç konfokal floresan görüntüler). </li><li> Uygun bir görüntü işleme yazılımı (ImageJ 17, örneğin, &quot;Hücre Sayaç&quot; fonksiyonunu kullanarak tsMARCM klonlarının çoklu hücresel NB iki hücre sayısını, hücre örnekleri için Şekil 3E, 3j, 3O ve 3T bakınız nöronların organları). </li></ol>

<ol>
	<li>Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+neural+projections+reveals+clonal+composition+of+the+Drosophila+brain.">Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).</li><li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+development+and+organization+of+the+adult+Drosophila+central+brain.">Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).</li><li>Goodman, C. S., Doe, C. Q., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies:+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast.">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li><li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+requirement+of+the+USP/EcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li><li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution.">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).</li><li>Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+neuron+prespecification+in+the+olfactory+map+of+Drosophila.">Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila.</a> Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).</li><li>Hong, W., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+wiring+specificity+in+the+fly+olfactory+system.">Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system.</a> Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+the+Drosophila+Chinmo+BTB-zinc+finger+protein+govern+neuronal+temporal+identity.">Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity.</a> Cell. 127 (2), 409-422 (2006).</li><li>Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twin-spot+MARCM+to+reveal+the+developmental+origin+and+identity+of+neurons.">Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons.</a> Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).</li><li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+developmental+sequence+of+a+Drosophila+neuronal+lineage+as+revealed+by+twin-spot+MARCM.">A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM.</a> PLoS Biol. 8 (8), (2010).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , (1997).</li><li>Awasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+Drosophila+lineage-restricted+drivers+via+patterned+recombination+in+neuroblasts.">Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts.</a> Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).</li><li>Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+mosaics+for+lineage+analysis+in+flies.">Generating mosaics for lineage analysis in flies.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+analysis+of+Drosophila+lateral+antennal+lobe+neurons+reveals+notch-dependent+binary+temporal+fate+decisions.">Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions.</a> PLoS Biol. 10 (11), e1001425 (2012).</li><li>Zhan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Dscam+diversity+in+regulating+axon+guidance+in+Drosophila+mushroom+bodies.">Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).</li><li>Griffin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+twin+spot+generator+for+differential+Drosophila+lineage+analysis.">The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis.</a> Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+deployment+of+factors+regulating+temporal+fate+in+a+diverse+neuronal+lineage+of+the+Drosophila+central+brain.">Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain.</a> Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar 2.5, 2.3, 1.2.1, 1.1.1 Adımlar ve 3.2 iyi tsMARCM sonuçları elde etmek için kritik öneme sahiptir. Sinir atalarda GAL4 ifade etmez, dokuya-özgü -GAL4 sürücüler adımları 1.1.1 ve 1.2.1 için tercih edilir. Adım 2.3 sinek gıda şişeleri yetiştirilen hayvanların aşırı kalabalık kaçının. Indüksiyon gecikme, ısı şoku üzerine FLP ifade seviyesi, ve sinir atalarıdır (yani, Onaylanmış ve GOK değerleri) ortalama bölen süresi bilinmemektedir, çünkü ısı-şok süresini değiştirmek için en iyisidir (10, 20, 30 aşama 2.5 aynı genotip ve gelişim aşamasında farklı örnekleri üzerinde, 40 ve 50 dakika). Bu ilgi tsMARCM klonlarının en iyi oranı elde etmek için en uygun ısı-şok süresi belirlenmesi için izin verir. Buna ek olarak, bozulmamış beyin örnekleri elde etmek için adım 3.2 sinek beyin diseksiyonu sırasında dikkatli olun; Bu doğru nöronal hücre sayıları sayma için çok önemlidir. rese için(örneğin, 2R, 3L ve 3R), tsMARCM hazır sinekler STT, UAS- ve transgenlerin uygun çiftleri seçerek adım 1.2 olarak monte edilmelidir, diğer kromozom kollarında genlerin işlevini incelemek için tsMARCM kullanarak ilgilenen okçu mCD8.GFP.UAS-rCD2i ve Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir UAS rCD2.RFP.UAS-GFPi. Biz de dişi tsMARCM hazır sinekler X kromozomu (; UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT 40A +, örneğin, hs-FLP [22], w +) üzerindeki hs-FLP taşımak öneririz hangi tekrar tsMARCM deneyleri kolaylaştırır. Tekniğin Değişiklikler, sorun giderme ve Sınırlamalar RNAi bastırıcı ve gazetecilere verimliliği ve perdurance sinir soy analizleri ve gen fonksiyon çalışmaları başarıyla tsMARCM deneylerde yapılabilir olup olmadığını ana belirleyiciler. Genel olarak, RNAi baskılayıcılar düşük perdurance kombinasyonuBirlikte post-mitotik nöronlar RNAi bastırıcı ve gazetecilere yüksek ifadesi ile, sinir atalarıdır türetilen gazetecilere, daha iyi tsMARCM sonuçları verir. RNAi bastırıcı ve gazetecilere ifadesi GAL4 sürücüleri tarafından denetlendiği için, araştırmacılar sinir atalarıdır farklılaştırılmış nöronlarda GAL4 ifade değil güçlü GAL4 sürücüleri seçmelisiniz. Örneğin, GAL4 OK107 mantar gövdenin (MB) progenitörler ve bunların türevleri, MB y, α &#39;/ p&#39; ve α / β nöronlar 11, 19 GAL4 ifade güçlü GAL4 sürücüdür. MB y olan nöronların unfaithful markalama iki klon desen gözlemlenmiştir (örneğin, çok hücreli-NB klonları ile bağlantılı tek hücre klonları ve iki hücre GMC ile bağlantılı tek hücreli) GAL4 OK107 tsMARCM deneylerde 11 kullanılmıştır . Şaşırtıcı, yukarıdaki konu MB247-GAL4, farklı bir MB GAL4 sürücüsü kullanılarak çözülebilirBu farklılaşmış MB nöronların 11 GAL4 ifade eder. Tüm GAL4 sürücüler tsMARCM sistemi ya da başka bir mozaik etiketleme sistemleri kullanılabilir değildir (ör MARCM Q-MARCM ve çift Noktası jeneratörü) sürücüsü ilgi nöronların ifade değilse 4, 20, 21. Bu nedenle, nöral soy için tsMARCM kullanmadan önce, GAL4 sürücüleri bir pan-hücre sürücüsü ile çift ifadesi kontrol MARCM ilgi nöronların kendi kapsama alanı için test edilmelidir analizleri (örneğin, tubulin promotör-LexA :: GAD) 22 . Biz tsMARCM klonlar bazen karmaşık bir sinir ifade deseni ile bir GAL4 sürücüsü kullanıldığında, özellikle açıkça analiz edilemez unutmayın (örneğin, yeşil yanal boynuz (LH) nöronlar Şekil 3B VL2p adPN aksonal özen desen açıkça görüntülenmesini önlemek ve <strong&gt; 3C). Ancak, belirsiz desen yukarıdaki sorunu da diğer mozaik etiketleme sistemleri oluşur (örneğin, MARCM, Q-MARCM ve ikiz nokta jeneratör) 4, 20, 21 sınırlama GAL4 sürücüsü ile kaynaklanır çünkü. Ayrıca, gen fonksiyonlarının kimlik doğrulaması için bir kurtarma deneyler, dikkat, kurtarma transgenler, hedef RNAi bastırıcı dizileri 5&#39;te &#39;veya 3&#39; transgen kurtarma yapıları tercüme edilmemiş bölgeleri, ya da alternatif bir çift nokta ile tasarlanmış olmalıdır etiketleme sistemi (örneğin, birleştiğinde MARCM, Q-MARCM ve konvansiyonel MARCM bir kombinasyonu) 21 kabul edilmelidir. Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi tsMARCM, ikiz nokta jeneratör ve birleştirilmiş MARCM yanısıra, teoride en azından görselleştirilmesi için izin verecekiki ayrı renkte ortak sinir atalarıdır türetilen nöronlar (bu üç mozaik etiketleme teknolojileri bir karşılaştırma daha önce 15 sunulmuştur). ikiz nokta jeneratör, tsMARCM özgün sürümü (ya da tsMARCM yeni sürümü) montaj için gerekli transgenlerin minimum sayıda ve birleştirilmiş MARCM sırasıyla 4, 8 (veya 6), ve 9 olduğunu. Bununla birlikte, tsMARCM kapsamlı bir nöral nesilli 12, 15, 18, 23 analizleri yapmak için kullanılan tek bir sistemdir. Site-spesifik rekombinasyon çift nokta jeneratör sisteminde olmayan mitotik hücrelerde meydana gelir, ve bu zorlu merkezi gelişimini incelemek için bu sistemi kullanmak için yapım, aynı hücrede iki gazetecilere birlikte ifadesi yol açar sinir sistemi 15. Bunun aksine, tsMARCM elde edilen mozaik klonlar ve bağlanmış MARCM sistemlerimitotik hücrelerden köken yeniden. birleştiğinde MARCM sistemi Q-MARCM ve konvansiyonel MARCM sistemlerinde farklı gazetecilere ifadesini kontrol etmek için iki bağımsız sürücüler gerektirdiğinden iki bağımsız sürücüler sadakatle yoksa Ancak, bu ortak sinir atalarıdır türetilen nöron etiketleme hakkında kaygı uyandırmaktadır ilgi 15 nöral soy aynı nöronlar etiket. Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi Yüksek çözünürlüklü sinir soy analizleri yapmak için tsMARCM kullanma 82 nöronların toplam sistemli tsMARCM adPNs klonlar, adPNs 40 tür analiz için Şekil 3&#39;te kullanılan yaklaşım uygulayarak, önceki bir çalışmada 12 tespit edilmiştir. AdPNs Bu 40 türleri arasında, 35 tek-glomerüler adPNs rel, (yani, antennal lob (AL) tek bir glomerul innerve) idiay Drosophila beynin 12 diğer bölgelerine koku bilgi (bkz Yu ve ark Şekil 2-4., 2010). AdPNs diğer beş tip AL gelen koku bilgiyi entegre ve Şekiller 3E-3H (bkz koku alma sistemi 12 fonksiyonel karmaşıklık ek bir düzeyde sağlamak olabilir ve poli-glomerüler adPNs (yani, AL birden glomerül innerve) idi Yu 4Z ve ark., 2010). Larva doğumlu adPNs tipine göre birden fazla nöronlar tarafından temsil edilmektedir, oysa embriyonik doğumlu adPNs (Şekiller Yu 2-4 koku alma sistemi 12 özgünlük ve fazlalık arasındaki karşılıklı etkileşim olduğunu düşündüren, türü başına yalnızca bir nöron var ve diğ., 2010). İlginçtir, bazı gelişimsel pencere içinde üretilen nöronlar ölmeye mahkûmdur ve adPNs birçok türü numbe düşündüren, ALad1 sinir soy nöronların sabit bir sayı ile bulunurkoku sistemi monte edilmesi için R ve adPNs türleri sıkı bir şekilde düzenlenmiş 12 (Yu ve arkadaşları, 2010 Şekiller 2H, 4V, ve 5 bkz., ayrıca Şekil 3P bakınız - 3T). Doğru gen fonksiyonlarını incelemek için tsMARCM kullanma doğum tanışma adPNs yanı sıra, tsMARCM da GAL4-OK107 etiketli altı merkezi kompleks nöronların doğum sırasını belirlemek için uygulanmıştır. Bu altı nöronlar 2, 11 karmaşık motorlu modellerini kontrol etmek için Drosophila merkezi kompleksinin devresi katkıda LALv1 sinir soy nöronların küçük bir alt kümesini oluşturan (Yu Şekil 4a ve 4b bakın ve ark., 2009). İlginç bir şekilde, bu altı merkez, karmaşık nöronların her biri (Yu 4d-4H ve 4o Şekil et al., 2009) ayrı bir nöronal morfoloji 11 sahiptir. Hepsi geç belirgin aksonal desenleri taşımakral aksesuar lob (LAL). Geri kalan iki nöron elipsoid gövdesinin merkezinden kompleksin diğer bir alt yapıya da dendrit çıkıntı ise ilk dört nöronlar, noduli, merkezi karmaşık bir alt yapının alt bölmelere da dendrit dağıtın. 4. doğumlu orta karmaşık nöron dorsal noduli onun dendrit dağıtır oysa Özellikle, 3 rd doğumlu orta karmaşık nöron geniş bir akson desen ile, LAL kompakt aksonal desenli, ventral noduli onun dendrit projeler LAL 11 (Yu Şekil 4f ve 4g bakın ve ark., 2009). tsMARCM sistemi farklı hayvanlarda aynı nöronların incelenmesini sağlayarak analizleri daha iyi fenotipik izin beri kapsamlı tanımlayan nöronlar ötesinde, tsMARCM gücü, ilgi nöronlarda gen fonksiyonlarını inceleyerek daha iyi örneklenen olurdu. Örneğin, tsMARCM tek zamansal yağ tespit3 rd doğumlu orta karmaşık nöronlar 11 kronolojik uygunsuz morfolojilerinden gerektiren e değişikliği (chinmo, bir BTB-çinko parmak nükleer protein) (Yu Şekil 4i, 4p ve 4W bkz ark., 2009). Chinmo mutasyonu, orijinal MARCM sisteminde, özelliği edilmiştir (yani, tek bir yeşil-etiketli nöronlar, referans olarak yataklı hücre ilişkili iki türetilen nöron etiketsiz) chinmo -açıklı nöron Şekil 4i gösterilen Yu ve diğ. 2009 4. doğumlu, yerine 3. doğumlu, merkezi karmaşık nöron olarak tanımlanıyordu olurdu. Bu aksonal rehberlik kontrol ziyade geçici kaderi 11 belirterek olarak chinmo fonksiyonunun yanlış yorumlanmasına neden olurdu (Yu&#39;dan Şekil 4i çift ok ve ark., 2009). Ancak, inci gibi tsMARCM klonlarının kırmızı çok hücreli-NB tarafı kullanılarakhücre sayıları sayma üzerinden e referans ( Şekil 4m, 4N, ve Yu ve ark 4p. , 2009), Yu ve ark Şekil 4i gösterilen chinmo -açıklı nöron. , 2009), bu nedenle merkezi kompleks nöronlar 11 zamansal kaderi şartname işlevleri chinmo doğru sonuca yol açan 3 rd doğumlu merkezi karmaşık nöron, olduğu kanıtlanmıştır. Birlikte ele alındığında, yukarıdaki sonuçlar, gelecekteki nöral gelişim çalışmaları için yüksek çözünürlüklü (varsa, ya da diğer hücre tipleri) fenotipik ve böylece doğru nöronlarda gen fonksiyonlarını ifşa analizleri için tsMARCM sisteminin önemli avantajlar (ya da diğer gelişimsel çalışmaları vurgulamak doku).

Bir çok sayıda ve nöronların farklı türde oluşan beyin, algılama, süreç ve dış dünyadan sorunlara yanıt yeteneği ile hayvanları endows. Yetişkin Drosophila merkezi beynindeki nöronlar, nöral kök hücrelerin sınırlı sayıda türetilen gelişim 1, 2 sırasında çağrılan Nöroblastlar (Onaylanmış). Onaylanmış Drosophila beyin nöron katılan çoğu kendini yenileyen Onaylanmış Kuruluşlarının ve ganglion anne hücreleri (GOK değerleri) oluşturmak için asimetrik bölünme geçmesi ve GOK değerleri daha sonra (Şekil 1A nöronlar 3 içine ayırt iki kızı hücreleri üretmek için bölünme bir tur geçmesi ). Çünkü nöronal morfoloji karışıklık ve spesifik nöronlar, pozitif bir mozaik etiketleme teknolojisi, bir bastırılabilir hücre markeri (MARCM) ile mozaik analizlerinde ile ilişkili zorluklar, visualizat sağlamak için icat edildiTek bir nöron veya çevre, etiketsiz nöronların 4 nüfusun dışında nöronların küçük bir alt iyon. MARCM Flippase (FLP) tanımı, normal olarak, bir raportör geninin 4 ekspresyonunu önleyen bir represör genin bir heterozigot aleli taşıyan bir bölme ön-hücre içinde homolog kromozomlar arasındaki site-spesifik rekombinasyon aracılık etme / FLP tanıma hedef (STT) sistemi kullanmaktadır. mitotik bölünmesinden sonra, rekombinant kromozom artık bir hücre homozigot represör genin alelleri ve diğer hücre Resim represör genini-o hücrenin (ve onun soyundan) Raportör ekspresyonu sahip içerecek şekilde, çift hücrelere ayrılmış olan 4 engellendi. FLP stokastik Onaylanmış ve GMC&#39;ler indüklenir sonucunda üç klonal desenler genellikle MARCM deneyde bulunan: tek hücreli çözünürlük nöronal morfoloji tasvir tek hücreli ve iki hücre GMC klonlar,ortak bir NB (Şekil 1B) türetilen nöron bütün morfolojik desenler ortaya n ve çok hücreli-NB klon. MARCM tekniği yaygın beyin çapında kablo ağlarını yeniden nöronal tip tanımlama dahil olmak üzere, Drosophila nörobiyolojik çalışmalarda uygulanmıştır, nöral soy nöronlar, hücre kaderi şartnamede yer alan gen fonksiyonlarının fenotipik karakterizasyonu gelişim tarihini ifşa analizleri ve nöronal morfonogenezi ve farklılaşma 5, 6, 7, 8, 9, 10 inceler. Geleneksel MARCM sadece uyarılmış mitoz rekombinasyon olayından sonra iki yavru hücreye (ve soy) birini etiketler, çünkü işaretsiz taraftan potansiyel olarak yararlı bilgiler kaybolur. Bu sınırlama, temel M uygulanmasını engellerYüksek çözünürlüklü ARCM sistemi hızlı tempoda hücre kaderi değiştirmek çok sinir soy analizleri veya hassas farklı hayvanların 11, 12 özdeş nöronlarda gen fonksiyonlarının analiz eder. İkiz-spot MARCM (tsMARCM) böylece orijinal MARCM sisteminin 11 sınırlama (üstesinden ikiz hücrelerin her iki tarafın yararlı bilgi kurtarma sağlayan iki ayrı renk ile ortak bir progenitör türetilmiş nöronlar etiketleri gelişmiş bir sistemdir Şekil 2A - 2C). TsMARCM sisteminde, iki RNA interferans (RNAi) baskılayıcılar, bir ön-madde, hücre içindeki homolog kromozom trans-sitesi bulunmaktadır tabanlı ve bu baskılayıcılar ifadesi bağımsız olarak, ilgili muhabir (Şekil 2B) ekspresyonunu inhibe eder. FLP / FRT sisteminin aracılık site-spesifik rekombinasyon mitotik sonra, twhaline O RNAi tabanlı baskılayıcılar tat muhabir (Şekil 2B) ekspresyonuna izin vermek için tek kişilik hücrelere ayrılmış. İki klon desenler çok hücreli-NB klonları ile bağlantılı tek hücre klonları ve iki hücre GMC ile bağlantılı tek hücre tipik olarak bir tsMARCM deneyi (Şekil 2C) görülür. Gibi bilgiler doğum kalma etiketli nöronlar gibi nöral nesilli analiz yüksek çözünürlükte, etkinleştirme diğer taraf için referans olarak kullanılabilir çift yataklı hücrelerin bir taraftan elde edilen ve fenotipik hassas araştırma için farklı hayvan özdeş nöronların analizleri sinir gen fonksiyonu 11, 12 arasında. Burada, (varsa, yanı sıra diğer dokuların gelişimini) Drosophila nöral gelişim çalışmalarını genişletmek için diğer laboratuvarlar tarafından kullanılan bir tsMARCM deney, yapmak için nasıl açıklayan bir adım-adım protokol mevcut.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide (CO2)</td>
			<td>Local vendor</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Local vendor</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Sort, cross and transfer flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.4</td>
			<td>Uniregion Bio-Tech (or other vendors)</td>
			<td>PBS001</td>
			<td>Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>Fix fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat</td>
			<td rowspan="2">Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td rowspan="2">005-000-121</td>
			<td rowspan="2">Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD8 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MCD0800</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DsRed antibody</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>632496</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Brp antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21236</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade gold antifade reagent</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S36936</td>
			<td>Mount fly brains and protect quenching of fluorescence&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX 9 depression glass spot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td>Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242276-250G</td>
			<td>Make black Sylgard dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dissect and mount fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro slide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td>Mount fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass No.1.5</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48366-205</td>
			<td>Mount fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Local vendor</td>
			<td>not available</td>
			<td>Seal micro cover glass on micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Incubator&#160;</td>
			<td>Kansin Instruments</td>
			<td rowspan="2">LTI603</td>
			<td rowspan="2">culture flies at 25&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(or other vendors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Water bath</td>
			<td>Kansin Instruments</td>
			<td rowspan="2">WB212-B2</td>
			<td rowspan="2">Induce heat-shock in flies at 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(or other vendors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Orbital shaker</td>
			<td>Kansin Instruments</td>
			<td rowspan="2">OS701</td>
			<td rowspan="2">Wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(or other vendors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EZ4</td>
			<td>Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss (or other vendors)</td>
			<td>LSM 700 (or other models)</td>
			<td>Image tsMARCM clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image-processing software 1 
			(e.g., Zeiss LSM image browser)&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>not available</td>
			<td>Project stacks of confocal images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image-processing software 2 
			(e.g., Image-J)&#160;</td>
			<td>not available</td>
			<td>not available</td>
			<td>Count cell number of tsMARCM clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell lineage analyses and gene function studies using twin-spot marcm

M r epressible c ell m arker bir nalysis (MARCM) yaygın karmaşık morfolojileri tasvir ve aksi takdirde işaretlenmemiş ve soğukkanlı içinde nöronların alt kümelerinin genlerin işlevini işlemek için Drosophila nörobiyolojik çalışmalarda uygulanan bir pozitif mozaik etiketleme sistemi osaic organizmalardır. MARCM sisteminde üretilen genetik mozaik mitoz sırasında her iki işaretlenmiş (MARCM klonları) ve işaretlenmemiş yavru hücrelere üretilmesi için ön-madde bölünen hücreler içindeki homolog kromozomlar arasındaki yere özgü rekombinasyon yoluyla aracılık edilir. MARCM yönteminin bir uzantısıdır, adı çift Noktası MARCM (tsMARCM), iki ayrı renk ile ortak bir progenitör türetilen yataklı hücrelerin hem de etiketler. Bu teknik, hem hemi-soydan gelen yararlı bilgi alınmasını sağlamak için geliştirilmiştir. kapsamlı tsMARCM klonlarının farklı çiftleri analiz ederek, tsMARCM sistemi, yüksek çözünürlüklü sinir soy Mappin izing ortak progenitör hücrelerden üretilen etiketli nöronların tam doğum sırasını ortaya çıkarmak için. Ayrıca, tsMARCM sistemi, farklı hayvan aynı nöronların fenotipik analizi izin gen fonksiyon çalışmalarını uzanır. Burada, Drosophila nöral gelişim çalışmalarını kolaylaştırmak için tsMARCM sisteminin nasıl uygulanacağını açıklar.

tsMARCM sistemi ortak Onaylanmış türetilen nöronlar üzerinde önemli bilgiler alarak sinir soy analizleri ve gen fonksiyon çalışmaları kolaylaştırmak için kullanılır olmuştur. Sistem, nöronal türleri (hepsi değilse de) çoğu belirlemek her nöronal tip hücre sayısını belirlemek, ve tsMARCM kullanarak bu nöronların doğum sırası 11, 12, 18 (detaylar için Tartışma Bölüm bakın tespit etmek için kullanılır olmuştur nöral soyunu yürütmek) analizleri veya gen fonksiyon çalışmaları. Burada, bir tsMARCM deney 1, 2 yapmak için nasıl göstermek için örnek olarak GAL4 GH146 ile etiketlenmiş anterodorsal koku projeksiyon nöronları (Drosophila koku sistemi ALad1 nöral soy adPNs) dört tsMARCM klonları kullanılmıştır. FLP ifade embriyonik aşamada, bir si indüklenen sonra45 kırmızı adPNs ilişkili ngle yeşil VL2p adPN bir tsMARCM klon (- 3E Şekil 3A) &#39;de tespit edilmiştir. FLP diğer üç gözlendi farklı larva aşamasında, tek, yeşil adPNs (DL1 adPN veya DC3 adPN) ya da eflatun adPNs farklı sayıda (31, 21 ya da 15) ile ilişkili-GH146 + adPNs de, sonradan oluşturuldu aksine, tsMARCM klonlar (Şekil 3F - 3T). DL1-, DC3- ve hiçbir GH146 + -adPNs doğum öncesinde VL2p adPNs doğum, tsMARCM klonlar (45, 31, 21, ilişkili çoklu hücresel NB kenarlarında adPNs hücre sayıları sayılarak belirlendi ve 15 sırasıyla Şekil 3E, 3J, 3O ve 3T, içinde). tsMARCM klonlarının çok hücreli-NB iki hücre sayıları, akson karmaşıklığı ve dendritik kalıpları sayımı ek olarak kendi ilgili iki hücre GMC iki göreli doğum sırasını belirlemek için kullanılabilirtsMARCM klonlar. Erken gelişim aşamalarında oluşturulan mozaik klonlar normalde daha nöronlar içerirler ve geç gelişim aşamalarında oluşturulan mozaik klonlar daha az nöron içeren ve bu nedenle daha az karmaşık akson ve dendritik desenleri (Şekil 3C sahipken, böylece daha karmaşık aksonal ve dendritik desenleri - 3D, 3H - 3I 3M - 3N ve 3R - 3 S). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55278/55278fig1.jpg" /> Şekil 1: Şematik Drosophila nöron çizimler ve MARCM deneyde bulunan klonal desen üç tip. (A), Drosophila merkezi beyin en nöral soy şematik bir diyagramdır nöron: Nöro-blastlar (NBS) kendini yenileyen onaylanmış kuruluşu ve gangliyon ana hücrelerinin (üretmek için bir asimetrik bölünmesi geçmesiGOK değerleri) ve GOK değerleri iki kızı nöronlar (Ns) üretmek için bir kez daha bölmek. (B) üç klonal desen MARCM deneyde gözlenen: tek hücre klonları, (a), flippase (FLP) GMC&#39;ler olarak indüklenen ve genellikle, iki hücre GMC klon (b) ve çok hücreli-NB klon (Cı ), FLP Onaylanmış indüklenir olduğunda. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55278/55278fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55278/55278fig2.jpg" /> Şekil 2: tsMARCM sisteminin şematik diyagramlar. (A) tsMARCM hazır sinek: Bir ebeveyn uçucu bir FRT bölgesini ve UAS mCD8 :: GFP (birinci haberci), UAS rCD2RNAi (ikinci haberci ekspresyonunu inhibe ilk baskılayıcı) ve bir dokunun transgenleri ihtiva -GAL4 -özel; diğer ebeveyn sinek bir FRT içeriyor </em&gt; site UAS-rCD2 :: RFP (ikinci haberci), UAS-GFPRNAi (ilk muhabiri ekspresyonunu inhibe ikinci baskılayıcı) ve hs-FLP. (B) çapraz tsMARCM hazır sineklerin döl iki RNAi tabanlı bastırıcı varlığı gazetecilere (yani, mCD8 :: GFP ve rCD2 :: paneli B G1 ve G2 fazlarında RFP) salınımını inhibe eder. FLP ekspresyonu ısı şoku ile indüklenir ve FLP ardından FLP tanıma hedef (FRTS) bağlandıktan sonra bir ayırma ön-hücre içinde homolog kromozomların belirgin rekombinasyon aracılık eder. Bu tat muhabir ekspresyonuna izin vermek için mitotik bölünmesinden sonra, tek kişilik hücrelerde RNAi tabanlı baskılayıcılar ayrılması ile sonuçlanır. (C), iki klon desen tsMARCM deneyinde gözlemlenen: tek hücre klonlarının ile ilişkili tek bir hücre: (a) FLP GMC&#39;ler indüklenen ve zaman çok hücreli-NB klonları ile bağlantılı iki hücre GMC(B) FLP Onaylanmış indüklenen zaman. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55278/55278fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55278/55278fig3.jpg" /> Şekil 3: bir sinir soy analizinde bir tsMARCM deney yapmak için nasıl örnekleri olarak adPNs dört tsMARCM klonlar kullanma. AdPNs dört tsMARCM klon nöron kalıpları (A, F, K, ve P) diyagramları ile, gösterilmiştir; genel beyin konfokal görüntüleri (B, G, L ve Q) lateral boynuz gösteren (LH, C, H, E ve K), anten lob (AL, D, I, K, ve G) ve soma(E, J, O ve T); ve nöronal morfolojileri desenleri. Tek adPNs (VL2p, DL1, DC3 ve no-GH146 + adPNs; yeşil) tsMARCM klonlarının çoklu-hücresel-NB adPNs (Eflatun) ile ilişkili embriyonik de adPN NB mitotik rekombinasyon aracılık etmek FLP indüksiyonla elde edilmiştir (A - E) ve larva (F - T) aşamaları. AdPNs ALad1 nöral diğer yarı-soydan kırmızı bilinmeyen nedenlerle Şekil 3&#39;te adPNs (nöronlar ile ilişkili tek bir yeşil adPN arasında tsMARCM klonları ile sonuçlanır ALad1 nöral soyu içinde yarı-soylarından biri olduğuna dikkat soy die). VL2p, DL1, DC3 ve no-GH146 + adPNs doğum dereceden kesik olan tsMARCM klonlar (45, 31, 21 kırmızı çok hücreli-NB kenarlarında adPNs hücre sayıları sayılması ile tespit ve 15 oldu panel E, J çizgileri, O ve T). Nörit desenleri genellikle tsMARCM klonlar erken gelişim aşamalarında uyarılan zaman eflatun çok hücreli-NB tarafı daha karmaşıktır (örn dendritik desen panelleri I, N, S ile karşılaştırıldığında paneli E daha karmaşıktır). tsMARCM bazen diğer nöral soy nöronlar da aynı GAL4 sürücüsü tarafından etiketli zaman kafa karıştırıcı analizleri (örneğin, çift oklarla gösterilen yeşil LH nöronlar, paneller B ve C VL2p adPNs aksonal özen desen görselleştirme engel) . (Mavi ile gösterilir) Beyin neuropiles Bruchpilot (BRP) karşı antikor ile boyandı. Isı şoku süresi: 12 dakika (panel A - D), 15 dakika (panel F - J) ve 35 dakika (panel K - Ti). Paneller B ölçekli bar - <strong&gt; E, G - J, L - O ve Q - S = 10 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55278/55278fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM at JoVE.com

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Burada, iki ayrı renk ortak bir progenitör hücreden türetilen nöron görselleştirme izin veren bir mozaik etiketleme tekniği için bir protokol mevcut. Bu, farklı bireylerin aynı nöronlarda doğum kalma bireysel nöronların kapasitesi ve eğitim gen fonksiyonu ile sinir soy analizi kolaylaştırır.

Çift nokta MARCM kullanılması Hücre Lineage Analizleri ve Gen Fonksiyonu Çalışmaları

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

cell-lineage-analyses-and-gene-function-studies-using-twin-spot-marcm

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K Görüntüleme.  Academia Sinica.  Burada, iki ayrı renk ortak bir progenitör hücreden türetilen nöron görselleştirme izin veren bir mozaik etiketleme tekniği için bir protokol mevcut. Bu, farklı bireylerin aynı nöronlarda doğum kalma bireysel nöronların kapasitesi ve eğitim gen fonksiyonu ile sinir soy analizi kolaylaştırır. 

Video: Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir<em&gt; Eski-ovo</em&gt; Elektroporasyon Yaklaşımı

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Gelişim Biyolojisi

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

HiPSC Sinir Lineage Özgül Knockin Muhabirleri Verimli Nesil kullanma CRISPR / Cas9 ve Cas9 Çift Nickase Sistemi

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the reporter in a specific cell line and all progeny. Here, we used the cell lineage tracing technique to demonstrate that chondrocytes directly transform into osteoblasts and osteocytes during long bone and mandibular condyle development using two kinds of Cre, Col10a1-Cre and Aggrecan-CreERT2 (Agg-CreERT2), crossed with Rosa26tdTomato. Both Col10 and aggrecan are well-recognized markers for chondrocytes.
On this basis, we developed a new method-cell lineage tracing in conjunction with fluorescent immunohistochemistry-to define cell fate by analyzing the expression of specific cell markers. Runx2 (a marker for early-stage osteogenic cells) and Dentin matrix protein1 (DMP1; a marker for late-stage osteogenic cells) were used to identify chondrocyte-derived bone cells and their differentiation status. This combination not only broadens the application of cell lineage tracing, but also simplifies the generation of compound mice. More importantly, the number, location, and differentiation statuses of parent cell progeny are displayed simultaneously, providing more information than cell lineage tracing alone. In conclusion, the co-application of cell lineage tracing techniques and immunofluorescence is a powerful tool for investigating cell biology in vivo.

We developed two sets of tracing combinations in Rosa26tdtomato (ubiquitously expressed in all cells)/Cre (specifically expressed in chondrocytes) mice: one with 2.3Col1a1-GFP (specific to osteoblasts) and one with immunofluorescence (specific to bone cells). The data demonstrate the direct transformation of chondrocytes into bone cells.

Hücre Lineage belirteçlerinin Eş-lokalizasyonu ve Domates Sinyali

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

Kullanılması Anne Gen Ürünlerinin Fonksiyonel Manipülasyonu<em&gt; İn Vitro</emZebra balığı&gt; Oosit Olgunlaştırma

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. The classical histochemical reaction is based on the hydrolysis of the substrate X-gal in combination with ferric and ferrous ions, which produces an insoluble blue precipitate that is easy to visualize. Therefore, &#946;-galactosidase activity serves as a marker for the expression pattern of the gene of interest as the development proceeds. Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the subsequent method for paraffin sectioning and counterstaining. Additionally, a procedure for clarifying whole embryos is provided to better visualize X-gal staining in deeper regions of the embryo. Consistent results are obtained by performing this procedure, although optimization of reaction conditions is needed to minimize background activity. Limitations in the assay should be also considered, particularly regarding the size of the embryo in whole mount staining. Our protocol provides a sensitive and a reliable method for &#946;-galactosidase detection during the mouse development that can be further applied to the cryostat sections as well as whole organs. Thus, the dynamic gene expression patterns throughout development can be easily analyzed by using this protocol in whole embryos, but also detailed expression at the cellular level can be assessed after paraffin sectioning.

Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the method for paraffin sectioning and counterstaining. This is an easy and quick procedure to monitor gene expression during development that can also be applied to tissue sections, organs or cultured cells.

Tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla Gen ifadesinin izleme

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...