This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.

Tüm protokoller gözden ve Teksas A &amp; Diş Hekimliği M University College&#39;da Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Hayvan Yetiştiriciliği <ol><li> Bu çalışmada, üç hayvan modelleri kullanarak. İlk kullanım Col10a1-CRE 15 fareler kondil oluşumunda embriyonik kondrositlerin kaderi araştırmak ve Rosa26 tdTomato onları geçmeye (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor tm9 (CAG-tdTomato) Hze / J) farelerde Col10a1- elde etmek için Cre ve Rosa26 tdTomato fareler. Daha sonra, 2.3Col1a1-GFP uygulanan farelerden 16 bu fareler çapraz. Col10a1-Cre kullanın; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP fareler hücre soyu izleme deneyleri (Şekil 1B) gerçekleştirmek için. </li><li> Doğum sonrası kondrosit kaderini incelemek için, adım 1.1 gibi aynı prosedürü izleyin, ama Agrekanın-CRE ERT2 (Agg-Cre ERT2 kullanmak) 17,18 hattı ve Agg-Cre ERT2 tutmak; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP fareler hücre soyu izleme deneyleri (Şekil 1C) gerçekleştirmek için. doğum sonrası 14. günde tamoksifen enjekte edilir. </li><li> Immünofloresan ile teknik izleme hücre soyu birleştirmek için, Agg-Cre ERT2 fareler ve Rosa26 tdTomato fareler çapraz. Deneyde her iki geni taşıyan fareler kullanın ve doğum sonrası 3. günde (Şekil 1D) üzerine tamoksifen enjekte edilir. </li></ol> 2. Malzeme hazırlanması <ol><li> 10 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyonda% 10 etanol ve% 90 mısır yağı içinde tamoksifen toz eritilir. Enjeksiyon için bir dozaj, 75 mg / kg&#39;dır. </li><li> 7.4 pH değerini ayarlamak için 2M sodyum hidrat kullanılarak,% 4&#39;lük bir konsantrasyona PBS içinde paraformaldehit (PFA) toz içinde çözülür. Kurban sonra doku (mandibular kondil ve arka bacak burada kullanılan) düzeltmek için% 4 PFA çözüm kullanın. Çünkü onuntoksisite, eldiven ve yüz maskesi ile kaputun içindeki PFA anlaştım. </li><li> 7.4 pH değerini ayarlamak için 2M sodyum hidrat kullanılarak,% 10 bir konsantrasyona damıtılmış su içinde EDTA toz eritilir. Mandibular kondil ve arka bacak kirecini% 10 EDTA kullanın. </li><li> % 15 ve% 30 arasında konsantrasyonlarda PBS içinde sükroz toz eritilir. yumuşatma sonra doku kurutmak için sukroz çözümü kullanın. </li><li> 2 mg / ml, pH 5.0 bir konsantrasyonda PBS içinde hyaluronidaz toz eritilir. Bu çözüm immünofloresan antijen alımı içindir. </li><li> Runx2 ya DMP1ve immünofloresan boyama PBS içinde% 3 sığır serum albümini (BSA) ve% 20 keçi serumu içeren bir bloklama solüsyonu hazırlamak için, 1.5 ml tüp kullanın. </li><li> Runx2 ya DMP1ve immünofloresan boyama PBS içinde% 2 keçi serumu ihtiva eden bir birincil antikor bir çözelti hazırlamak için 1.5 ml tüp kullanın. Runx2 400 ve 1: 100 DMP1ve için primer antikor konsantrasyonu, 1&#39;dir. </li><li> hazırlamak için, 1.5 ml tüp kullanarakYanlış pozitif sonuçlardan kaçınmak için immunofluorescent boyama kontrol olarak tavşan IgG çözüm. Çözelti PBS içinde% 2 keçi serumu içerir. Runx2 kontrolü için tavşan IgG konsantrasyonu 1: 400; 100: DMP1ve, 1. Aynı anda deney ve kontrol boyama yapın. </li><li> Runx2 ya DMP1ve immünofloresan boyama PBS içinde% 2 keçi serumu ihtiva eden bir ikincil antikor çözeltisi hazırlamak için, 1.5 ml tüp kullanın. 500: 1 bir seyreltmede ikincil antikor kullanın. </li></ol> 3. Slayt Konfokal Mikroskopi Hazırlık (Sadece izleme Hücre Lineage, İmmünofloresan ile hiçbir Kombinasyon) <ol><li> Olumlu bir zaman noktasında Agg-CRE ERT2 farelerde tamoksifen enjekte edilir. <ol><li> İlk olarak, kafes fare kaldırın. Ardından, karın açığa farenin arkasındaki deriyi kapmak ve ters çevirin sol başparmak ve işaret parmağınızı kullanın. şırıngayı tutmak için sağ elinizi kullanın. Enjeksiyon için uygun bir giriş noktası L verildieft veya hypogastrium sağ tarafında, karaciğer ve mesane kaçınarak. </li><li> fare arka ayakları şırınga paralel tutun ve intraperitoneal enjekte. Enjeksiyon için bir dozaj, 75 mg / kg&#39;dır. sırasıyla 18 g - 9 g, 11 - - 13 g, 16 2 hafta, 3 hafta, ve eski 4 haftalık yaşlarda faresinin ağırlıkları yaklaşık 7&#39;dir. </li></ol></li><li> Bir Xylazine / Ketaset kombinasyonu ile fareler anestezi. <ol><li> çalışma çözeltisi hazırlamak için, ilk olarak sırası ile, 1 mg / ml ve 5 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar damıtılmış su ile iksilazin ve Ketaset seyreltin. 2 oranında: Sonraki, bir 1 ketamin ve Ketaset karıştırın. Enjeksiyon için bir dozaj 30 ul / g&#39;dır. </li><li> Adım 3.1 olarak enjekte edilir. Farenin bileğini kısma anesthetization onaylayın. o hiçbir tepki varsa fare bilinçsiz olduğunu. </li></ol></li><li> anesthetization sonra% 4 PFA ile fareler serpmek. <ol><li> Fare bilincini kaybeder sonra entirel bir gemide fare dört bacağı düzeltmeky karın maruz kalmaktadır. </li><li> % 70 etanol ile karın doyurmak ve orta hat boyunca boyun alt karın bir eksizyonu yapmak. periton zarı ortaya çıkarmak için yan taraflarına cilt çekin aynı anda çimdik ve. uzunlamasına eksizyon yapmak için diseksiyon makas kullanın. </li><li> kesiniz ve kalp maruz ön kaburga kaldırın. Sağ kulak kepçesi bir yuvayı kesmek aynı zamanda, bir 22 G şırınga ile sol ventrikül kalbi delinme şırıngayı tutun ve. </li><li> Yavaş yavaş kardiyovasküler sistem üzerinde perfüze% 4 PFA, enjekte ederken sağ kulak kepçesi gelen kesme dışında kan basması. perfüzyon için PFA hacmi 1 ml / gramdır. Sert-Kanallı bina egzoz sistemine bir Sınıf I biyogüvenlik kabini içinde bu adımı gerçekleştirin. </li></ol></li><li> fare deri soyulabilir ve 4 ° C&#39;de gece boyunca düzeltmek için% 4 PFA içinde 40 ml içeren 50 ml&#39;lik polipropilen santrifüj tüpü içine bütün vücudu koydu. </li><li>dikkatle vücuttan çene ve arka bacak kaldırmak için diseksiyon makas ve # 3 ve # 5 forseps kullanabilir ve yüzeyde kasları ve tendonları kaldırmak için. Sert-Kanallı bina egzoz sistemine bir Sınıf I biyogüvenlik kabini içinde bu adımı gerçekleştirin. </li><li> Üçüncü molar distal bölgede iki parçaya mandibula kesin. Benzer şekilde, decalcification hızlandırmak amacıyla kemik iliği boşluğuna maruz orta cisim olarak femur ve tibia kesti. kondil ve kondiler işlemi kapsamaktadır parçası koymak ve% 10 EDTA, 40 ml arka bacak ile birlikte 2, 4 ° C&#39;de kirecini göre - 50-ml polipropilen santrifüj tüpüne 4 gün. </li><li> 50 ml polipropilen santrifüj tüpüne 4 ° C&#39;de kondil ve gece boyunca arka bacak kurutmak için% 15 sakroz, 50 ml kullanın. </li><li> 50 ml polipropilen santrifüj tüpü içinde gece boyunca 4 ° C&#39;de kondil ve arka bacak kurutmak için% 30 sakroz kullanın. </li><li> sagital düzlem boyunca, örnek ile gömmekcryosection makinesinde kesici plaka Ekim <ol><li> Yatay kondili veya montaj kalıp içinde arka bacak yatıyordu. OCT doku Batmak ve Ekim donuyor kadar cryosection makinede bırakın. </li><li> Kesme plaka üzerinde Ekim bloğu monte edin. Ekim tamamen donmuş olduğundan emin olmak için kesme işleminden önce yaklaşık 15 dakika boyunca bekleyin. </li></ol></li><li> 10 mikron bölüme kondili ve arka bacak kesti. -20 ° C&#39;de slaytlar ve mağaza bölümleri toplayın. </li><li> boyama önce suyu çıkarmak için 37 ° C&#39;lik bir oda içinde slayt inkübe edin. </li><li> 5 dakika için damıtılmış su ile iki kez slaytlar yıkayın. </li><li> Her bölümde etrafında suyu siliniz. bölümleri daire ve çember içine DAPI veya non-floresan anti-solmaya montaj çözümü düşmesi hidrofobik bir bariyer kalem kullanın. Dikkatle kapak kayma uzandı. </li></ol> Runx2 ve DMP1ve 4. İmmünohistokimyasal Boyama NOT: IgG conimmünohistokimyasal yanlış pozitif sinyaller önlemek için kumanda gereklidir. Deney ve kontrol grupları için boyama aynı anda yapılması gerekmektedir. <ol><li> boyama önce suyu çıkarmak için 37 ° C&#39;lik bir oda içinde slaytlar inkübe edin. </li><li> damıtılmış su ile iki kez slaytlar yıkayın. </li><li> slayt tüm bölümleri daire için hidrofobik bariyer kalem kullanın. Bu adımdan itibaren, tamamen bölümleri kapsayacak şekilde daire içine hazırlanmış çözümün bütün ekleyin. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de nemli bir oda içinde hyalüronidaz bölümleri tedavi edin. (Adım 4.5 - 4.8) çözeltisinin hacmi bölümün boyutuna bağlıdır. Uzun kemik kondilin için çözelti 50 ul ve 100 ul kullanın. (% 0.1 içeren PBS Tween 20) ile PBST ile üç kez yıkanır. </li><li> Hazırlama ve her bölüm için engelleme çözeltisi uygulanır ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle nemli bir oda içinde inkübe. </li><li> Primer ile bölümleri inkübegece boyunca 4 ° C &#39;de antikor çözeltisi (tavşan anti-fare Runx2 ya tavşan anti-fare DMP1ve). PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 2 st için ikincil antikor çözeltisinin (keçi anti-tavşan, Alexa Fluor 488) sahip olan kısımlar inkübe edin. PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> bölümünde etrafında suyu siliniz ve slayt bölümü kapsayacak şekilde çember içine DAPI bırakın. Dikkatle kapak kayma uzandı. </li></ol> 5. Konfokal Mikroskop <ol><li> 488 mikron (yeşil) den 561 um (kırmızı) arasında değişen dalga boylarında bir konfokal mikroskop kullanılarak floresan hücre görüntüleri yakalayabilir. 10X, 20X ve 63X lensler kullanarak 19 200 Hz birden yığılmış görüntü almak (1.024 × 1.024 boyutları). </li></ol>

<ol>
	<li>Gibson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+role+of+chondrocyte+apoptosis+in+endochondral+ossification.">Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification.</a> Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).</li><li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+the+growth+plate.">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li><li>Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+hypertrophic+chondrocyte:+microenvironmental+perspectives+on+apoptosis+and+survival+in+the+epiphyseal+growth+plate.">Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).</li><li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte-to-osteocyte+transformation+in+grafts+of+perichondrium-free+epiphyseal+cartilage.">Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage.</a> Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).</li><li>Roach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-differentiation+of+hypertrophic+chondrocytes+into+cells+capable+of+producing+a+mineralized+bone+matrix.">Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix.</a> Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pathways+to+endochondral+osteoblasts:+a+novel+chondrocyte-derived+osteoprogenitor+cell+identified+in+hypertrophic+cartilage.">Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage.</a> Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).</li><li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing.">Lineage tracing.</a> Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).</li><li>Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-tracing+methods+and+the+kidney.">Lineage-tracing methods and the kidney.</a> Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).</li><li>Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lineage+tracing+to+study+kidney+injury+and+regeneration.">The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration.</a> Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+fate+of+hypertrophic+chondrocytes.">Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes.</a> Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).</li><li>Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+chondrocytes+can+become+osteoblasts+and+osteocytes+in+endochondral+bone+formation.">Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).</li><li>Jing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+Directly+Transform+into+Bone+Cells+in+Mandibular+Condyle+Growth.">Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth.</a> J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).</li><li>Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+transdifferentiate+into+osteoblasts+in+endochondral+bone+during+development,+postnatal+growth+and+fracture+healing+in+mice.">Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice.</a> PLoS Genet. 10 (12), (2014).</li><li>Purcell, P., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mighty+Chondrocyte:+No+Bones+about+It.">The Mighty Chondrocyte: No Bones about It.</a> J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).</li><li>Gebhard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+expression+of+Cre+recombinase+in+hypertrophic+cartilage+under+the+control+of+a+BAC-Col10a1+promoter.">Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter.</a> Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).</li><li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+the+expression+of+a+green+fluorescent+protein+transgene+in+differentiated+osteoblasts:+comparison+between+rat+type+I+collagen+and+rat+osteocalcin+promoters.">Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters.</a> Bone. 31 (6), 654-660 (2002).</li><li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteo-chondroprogenitor+cells+are+derived+from+Sox9+expressing+precursors.">Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).</li><li>Henry, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+aggrecan-CreERT2+knockin+mice+for+inducible+Cre+activity+in+adult+cartilage.">Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage.</a> Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).</li><li>Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+way+to+statistically+analyze+morphologic+changes+in+Dmp1-null+osteocytes.">A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes.</a> Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).</li><li>Pest, M. A., Beier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology:+Is+there+such+a+thing+as+a+cartilage-specific+knockout+mouse?.">Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?.</a> Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).</li><li>Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+growth+plate+hypertrophic+chondrocytes:+death+or+lineage+extension?.">Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?.</a> Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).</li><li>Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+ScxCre+transgenic+mice.">Generation and characterization of ScxCre transgenic mice.</a> Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+conditional+null+allele+for+Dmp1+in+mouse.">Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse.</a> Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).</li><li>Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMP1-targeted+Cre+expression+in+odontoblasts+and+osteocytes.">DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes.</a> J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).</li><li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland.">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).</li><li>Blanpain, C., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+stem+cell+dynamics+by+lineage+tracing.">Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).</li><li>Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+induces+rapid,+reversible+atrophy,+and+metaplasia+in+mouse+stomach.">Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach.</a> Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).</li><li>Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+murine+hepatic+steatosis+induced+by+tamoxifen.">Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen.</a> Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).</li><li>Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+tamoxifen-regulated+Cre+activity+in+mice+using+a+cartilage-specific+CreER(T)+to+assay+temporal+activity+windows+along+the+proximodistal+limb+skeleton.">Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton.</a> Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests or other conflicts of interest.

Teknolojik sınırlamalar nedeniyle, in vivo hücre davranışlarını araştırmak için her zaman zordur. Ancak, hücre soyu izleme tekniği hücre biyolojisi 7-9 çalışmak için güçlü bir araç olduğunu gösteriyor. Bu çalışmada, biz daha fazla immünofloresan ile birleştirerek bu protokolü geliştirmek. Bu şekilde, hücre kaderi soyu izleme uygulaması genişletmektedir birden çok ilişkili markörler tarafından tanımlanabilir. Ayrıca, immünofloresan ve domates sinyalinin bu co-lokalizasyon aynı anda yalnız izleme hücre soyu daha fazla bilgi sağlayan, kurucu hücresi, konumlarını ve onların farklılaşma durumunu döl sayısını gösterir. Buna ek olarak, hücreye özel markörlerin kullanımı araştırma hızlandırılması bileşik farelerin oluşturulması basitleştirebilir. Cre özgünlüğü soyunun kesin atıf ve sonuçları 20,21 doğruluğu için çok önemlidir. Çok imHücre kaderi doğrulamak için uygun Cre satırları seçmek için nem li. Ayrıca, kondrositler 18 için iyi bilinen markör olduğu için, hipertrofik kondrosit 10,11 ve agrekan için spesifik bir işaretçi olduğu düşünülür, bu çalışmada, Col10a1 seçtik. diğer alanlarda kullanılan iyi Cre modelleri de vardır. Scleraxis tendon ve bağ hücre soyu 22 için bir gösterge olan bir temel Heliks-halka-helis transkripsiyon faktörü olduğu Scleraxis-Cre (SCX-Cre) hattı, örneğin, tendon ve bağ araştırmaları faydalıdır. Başka Cre DMP1ve yüksek odontoblast ifade ve 23,24 osteositlerde çünkü DMP1ve-Cre yaygın skeleton- ve diş ile ilgili çalışmalarda kullanılan çağırdı. Olmayan uyarılabilir Cre sistemlerle karşılaştırıldığında, uyarılabilir Cre aktivasyonu mekansal ve zamansal 20 kısıtlanabilir. sonuçlarını deney tasarımı ve yorumlama Ancak, bazı sınırlamalar dikkate alınmalıdıruyarılabilir Cre modelleri. İlk olarak, tamoksifen dozu Cre aktivasyon verimliliği ve işaretli hücrelerin sayısı değişebilir. Düşük dozlar klonal yoğunlukta 25 de ilgi nüfusu etiketleyecektir; yüksek dozlarda tüm progenitör havuzu 7,26 etiket olabilir. Bu durumda, doz deneyinin amacına bağlı olarak seçilmelidir. İkinci olarak, tamoksifen, özellikle yüksek dozlarda 27,28 potansiyel toksisitesi vardır. Bu nedenle, gebelikte 29 sırasında enjekte ederken geç dönem kürtaj önlemek için doz azaltmak için daha iyidir. Sonuç olarak, hücre soyu takip teknikleri ve immünofloresan birlikte uygulamaya in vivo olarak, hücre biyolojisi araştırmak için güçlü bir araçtır. Gelecekte, araştırmacılar aynı anda domates sinyal arka plan üzerinde iki farklı antikorları ile immünofloresan gerçekleştirmek için deneyebilirsiniz. Bu yöntem daha kolay hale bir bölümünde iki belirteçleri için ifade desenini gösterebilirAraştırmacı karşılaştırmak ve sonuçlarını analiz etmek. Ayrıca, bu yardımcı uygulaması daha geleneksel immüno-floresan yoluyla bulunabilir özel olmayan renklenme azaltmak için in situ imünofloresansta iyileştirilebilir.

gelişimi sırasında, endokondral kemik oluşumu iskelet hacmi% 80&#39;inden sorumludur. Yaygın olarak hipertrofik kondrositlerin apoptozu ile başlar inanılmaktadır. Daha sonra, altta yatan kemik iliği hücreleri istila ve kemik iliği ve periost kökenli hücreler 1,2 yeni kemik birikimi ile takip anjiyogenezi başlatmak. Hipertrofik kondrositlerin hücre kaderi (HC), ancak, yıllardır 3 tartışma konusu olmuştur. Başlangıçta, HCS kondrosit farklılaşması yolunun sonu olarak kabul edildi ve apoptoz genellikle HCS nihai kaderi olduğu düşünülmüştür. Şimdi, bazı araştırmacılar en azından bazı HCS hayatta olabilir ve endokondral kemik oluşumuna katkıda bulunduğunu göstermektedir. O büyümeyi önerdi rağmen plaka kondrositler ultrastrüktürdeki, immünohistokimyasal dayalı osteoblast içine transdifferentiate yeteneği vardı ve in vitro, 46 bu yöntemlerin w hiçbiri çalışmalarıosteoblast soy kondrosit katkı gösteren kesin ere. Hücre soyu izleme tekniği hücre kaderi incelemek için daha titiz bir yol sağlar. Kısaca söylemek gerekirse, sadece spesifik bir hücre türü ifade edilen bir yeniden bağlayıcı enzim, bildirici genin ekspresyonunu uyarır. Bu şekilde, bu hücrenin tipi ve onların soyundan kalıcı 7 etiketlenir. Cre-loxP sistemi yaygın soy izleme kullanılır. Cre (rekombinaz enzim) iki loxP siteleri arasında DUR dizisi tüketim ve belirli bir hücre hattı (Şekil 1A) &#39;de muhabir aktive eder. Bazı durumlarda, araştırmacı, östrojen reseptörü (Cre ERT2) 8 modifiye edilmiş bir formu kaynaşmaya Cre neden tamoksifen gibi bir ilaç ile Cre aktif hale getirmek için uygun bir zaman noktası seçebilir. Floresan gazeteciler onlar dramatik karmaşıklığını azaltmak için deneyler izleme soy standart haline gelmiştirve 8,9 izleme hücre kaderinin doğruluğunu ve verimliliğini artırmak. bunun kolayca 7 (Şekil 1A) görüntülenmiştir yapma, parlak floresan proteini ve güçlü Epifloresans beri tdTomato floresan gazetecilere arasında en iyi seçenek haline geliyor. Sistem izleme Rosa26 tdTomato soy kullanarak, grubumuz ve diğer araştırmacılar HCS gelişimi 10-14 esnasında kemik hücreleri içine fenotip değiştirebilir göstermiştir. 2.3Col1a1-GFP (osteoblastlar özgü) ile bağışıklık fluorışıması (kemik hücrelere özgü): Bunu yapmak için, Rosa26 tdTomato (her yerde ifade, tüm hücrelerde) / Cre (kondrosit özgü) fareler ile kombinasyonlar izleme iki set geliştirdi. Veri iki yolun in vivo hücre kaderine çalışma uygulanabilir yollar olduğunu göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1099">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tamoxifen&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">T5648</td>
			<td style="width:496px;">activate the Cre event&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td>fix the sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10713</td>
			<td>decalcify the hard tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td>dehydrate the tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyaluronidase from bovine testes&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>retrieve antigen for immunochemical staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A3059</td>
			<td>blocking solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">primary antibody for Runx2&#160;</td>
			<td>Cell Signal</td>
			<td>D1L7F</td>
			<td>primary antibody for immunochemical staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">primary antibody for DMP1</td>
			<td style="width:220px;">provided by Dr. Chunlin Qin</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>primary antibody for immunochemical staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">18140</td>
			<td>control for immunochemical staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">secondary antibody&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>second antibody for immunochemical staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>embed the sample for frozen section</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>PBST</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">non-fluorescing antifade mountant</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td>mounting slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td>nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>circle the section on the slide for for immunochemical staining&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine</td>
			<td style="width:220px;">AnaSed</td>
			<td></td>
			<td>anesthetization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketaset&#160;</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>anesthetization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">cryosection machine</td>
			<td style="width:220px;">Leica</td>
			<td style="width:136px;">CM1860 UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">confocal microscope</td>
			<td style="width:220px;">Leica</td>
			<td>DM6000 CFS&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-localization of cell lineage markers and the tomato signal

Hücre soyu izleme sistemi gelişim biyolojisi çalışmalarında ağırlıklı olarak kullanılmıştır. Cre rekombinazın kullanımı belirli bir hücre çizgisi ve döl muhabir aktivasyonu için izin verir. Burada, kondrositler doğrudan uzun kemik ve Cre, Col10a1-Cre ve Agrekanın-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) iki çeşit kullanarak mandibular kondil gelişimi sırasında osteoblast ve osteositleri dönüşme olduğunu göstermek için teknik izleme hücre soyu kullanılan Rosa26 ile geçti tdTomato. Col10 ve Agrekanın Hem kondrositlerin için belirteçleri iyi tanınmaktadır. Bu temelde, belirli hücre belirteçleri ifadesini analiz ederek floresan immünohistokimya-tanımlamak hücre kaderi ile birlikte izleme yeni bir yöntem hücre soyu geliştirdi. Runx2 (erken evre osteojenik hücreler için bir işaret) ve dentin matrisi protein1 (DMP1ve, geç evre osteojenik hücreler için bir işaret) idikondrosit türetilmiş kemik hücreleri ve bunların farklılaşma durumunu tanımlamak için kullanılan. Bu kombinasyon, hücre soyu izleme uygulaması genişletir, ama aynı zamanda bileşik farelerin nesil kolaylaştırır sadece. Daha da önemlisi, ana hücre döl sayısı, yeri ve farklılaşma durumları yalnız izleme hücre soyu daha fazla bilgi sağlayan, aynı anda görüntülenir. Sonuç olarak, hücre soyu takip teknikleri ve immünofloresan birlikte uygulamaya in vivo olarak, hücre biyolojisi araştırmak için güçlü bir araçtır.

Kondrositler Doğrudan mandibular ve Uzun Kemik Kemik Hücrelerinin (Osteobalstlar ve osteositlerde) içine Transform. Agrekan, kondrojenez için kritik bir geni, ağırlıklı olarak, erken ve olgun kondrositler 18 olarak ifade edilir. Bunun bir sonucu olarak, Agg-Cre ERT2 bölgesindeki 2 haftalık tamoksifen enjeksiyonu; Rosa26 tdTomato fareler tüm kondrosit ve kızları hücrelerinde kırmızı domates muhabiri aktif. 2.3Col1a1-GFP hattı kemik hücrelerini, özellikle osteoblast ve ön osteosit 1 eksprese eden kolajen bir yeşil floresanlama renge yol açmıştır. Sarı renk (yeşil ile birlikte kırmızı), kolajen 1 genini ifade kondrosit türetilmiş kemik hücrelerinin mevcudiyetine işaret etmiştir. Şekil 2A, kıkırdak altındaki kondiler sürecinde kemik hücrelerinin çoğu kırmızı ya da y edildiellow (COL1A1 yeşil fluoresan iki fluorophores üst üste zaman bu suretle sarı görünen salgılamak başlamıştı bir alyuvar). Bu sonuçlar kemik hücreleri kondrosit elde edilmiştir dair güçlü kanıtlar sunmuştur. Benzer sonuçlar, ayrıca, kemik hücrelerinin çoğunluğunun epifiz (Şekil 2B) ve metafiz (Şekil 2C), hem de kondrositler elde edilmiştir uzun kemik gelişimi sırasında gözlenmemiştir. Ayrıca bu sonuçları araştırmak için, Rosa26 tdTomato ile Col10al-Cre fareler geçti; 2.3Col1a1-GFP uygulanan farelerden. Col10a1 HCS oldukça spesifik bir işaretleyici sadece HCS ve soyundan gelenler olarak ifade edilir. Ayrıca, Col10a1-Cre (E14.5 at) Col10a1 ifade başından itibaren hücre farklılaşması yansıtan, sigara indüklenebilir. 3 haftalık fareler, kırmızı ve s kıkırdak-kemik arayüzü (üstün seviye) yakın trabeküllerindeyeşil fluoresan hücreler kıt iken ome sarı floresan hücreleri, baskın idi. biraz daha alt alana (orta seviye), hücrelerin çoğunluğu biraz daha az fluoresan kırmızı, sarı fluoresan idi. Yeşil fluoresan hücreler eğilim kondiler büyüme çoğunlukla HCS&#39;den dönüştürülmüş kemik hücreleri tarafından katkıda olduğunu gösterir .Bu sadece kondiler süreci (alt seviye) (Şekil 3) en alt bölgesinde hakim olduğu ortaya çıktı. kondiler işleminde kırmızı ve yeşil floresanlama hücreleri dağılımı da kondiler büyüme alt-to-üstün bir yönü ile tutarlıdır. Hücre soyu izleme tekniği açıkça apoptoz HCS sadece kader olmadığını göstermektedir. Hem Agg-Cre ERT2 ve Col10a1-Cre hatları kondrosit kaynaklı kemik hücreleri kondiler sürecinde kemik gelişimi için ve epifiz önemli bir kaynak olduğunu göstermektedirve uzun kemikte metafiz. Immunofluorescent Boyama ve Hücre Lineage Takip Eş-başvuru Hücre Farklılaşma Takip sağlar. Hücre soyu takip teknik, hücreye özel markörün saptanması hücre tipini belirlemek için flüoresan immünohistokimya ile kombine edilebilir. Bu yöntem, hücre kaderin çalışma için birçok avantajı vardır. İlk olarak, araştırmacı dahi tekniği izleme hücre soyu için uygulamayı genişleten özel GFP fare hattı olmadan, uygun belirteçler seçerek hücre özelliklerini tanımlayabilirsiniz. İkinci olarak, bu bileşik, farelerin oluşturulması kolaylaştırır. Örneğin, sadece Agg-Cre ERT2 üretmek gerekiyor; Rosa26 tdTomato bileşik fareler yerine Agg-Cre oluşturma, (doğum sonrası 3. günde) Cre etkinleştirdikten sonra kırmızı renk elde etmekERT2; 2.3Col1a1-GFP; Daha fazla haç gerektirir Rosa26 tdTomato fareler. Bu çalışmada, immünofloresan boyama için iki antikor seçtik. Bir Runx2, osteoblast olgunlaşması sırasında kritik bir transkripsiyon faktörü (osteojenik hücrelerin erken evre) karşıydı; Diğer, DMP1ve karşı olduğunu olgun osteositleri (osteojenik hücrelerin geç evrede) olarak ifade edilmiştir. Şekil 4&#39;te, yeşil floresan 2 haftalık kondil işlemde Runx2 ya DMP1ve antikor ekspresyonunu temsil eder. Şekil 4A&#39;da, subkondral kemiğe renkli üç hücre tipi mevcuttur. çekirdeğinde san renkli (kırmızı ve yeşil flöresan üst üste binmesi) kondrosit türetilmiş kemik hücrelerini, Runx2 eksprese Bu hücreler kemik yüzeyi üzerinde, olgunlaşmamış osteoblastlar olduğunu gösteren temsil eder. Buna ek olarak, kırmızı-floresanlama Runx2 ifade vermedi kemik hücreleri (kırmızı f vardıüst üste yeşil olmadan luorescence). Bu hücreler kemik matriks içinde olgun kondrosit türetilmiş kemik hücreleri temsil etmektedir. En yaygın hücreler Runx2 ifadesi veya Cre aktivasyon önce meydana gelen bir dönüşüm olmayan kondrosit türetilmiş kemik hücrelerini gösteren sadece yeşil-fluoresan çekirdekleri olanlar vardı. görüntü kırmızı kemik hücreleri ve sarı çekirdekleri olan kondil subkondral kemik oluşumuna katkıda çoğunluk hücre popülasyonları olduğunu göstermektedir. Öte yandan, kemik matriks içinde hemen hemen her kırmızı, kondrosit türetilmiş kemik hücresi kendi hücre gövdeleri etrafında DMP1ve boyama vardı. Birkaç osteositlerde DMP1ve pozitifti ancak kırmızı hücre gövdeleri (Şekil 4B) yoktu. Orada, bu hücreler için iki olası açıklama, aynı zamanda: ya da olmayan, kondrosit türetilmiş kemik hücreleri, ya da tamoksifen enjeksiyondan önce dönüştürülmüş kondrosit türetilmiş kemik hücrelerdir. Buna ek olarak, hiç bir kırmızı kemik hücrelerikemik yüzeyi üzerinde de osteosit olgun olmayan belirten, DMP1ve ifade edilmiştir. Birlikte ele alındığında, her iki başları (Runx2) ve geç evre belirteçleri (DMP1ve) osteojenik hücre için ekspresyon modelleri veri 2.3Col1a1-GFP ile birlikte Cre kullanarak önceki sonuçlarla uyumluydu. Bu veriler immunfloresan ve Rosa26 tdTomato izleme kombinasyonu hücre kaderi incelemek için iyi bir yol olduğunu göstermektedir. Daha da önemlisi, araştırmacılar, hücre tipini ayırt farklılaşma aşamasını tanımlamak ve Rosa26 tdTomato yalnız izleme daha fazla bilgi sağlar farklı belirteçleri ile immünofloresan kullanarak aynı anda dönüştürülmüş hücre sayıları gözlemleyebilirsiniz. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54982/54982fig1.jpg" /> Şekil 1. Hücre Lineage İzleme ve inci için MekanizmasıBileşik Fare e Üretimi. A) Cre-loxP sistemi yaygın soy izleme kullanılır. Cre, iki loxP siteleri arasında DUR sekansı ve kalıcı belirli bir hücre hattı içinde ilave edilir tdTomato proteini (kırmızı fluoresan) özel Tüketim vergisi. B) Üç hayvan modelleri bu yazıda belirtilmiştir. Biz 2.3 COL1A1-GFP kullanılan; Rosa26 tdTomato fareler ve Col10a1-Cre fare ile onları geçti. Col10a1-Cre (E14.5 at) Col10a1 ifade başından itibaren hücre farklılaşması yansıtan, sigara indüklenebilir. C)-Agrekanın Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) da 2.3Col1a1-GFP ile geçti başka Cre çizgidir; Rosa26 tdTomato fareler. (: Tamoksifen Tm) Cre bir tamoksifen enjeksiyon ile 2 haftalık aktive edildi. Hücre soyu izleme ile immünofloresan birleştirmek amacıyla D), biz Agg-Cre ERT2 oluşturulan; &lt;em&gt; Rosa26 tdTomato fareler, doğum sonrası 3. günde Cre aktive ve Runx2 ve DMP1ve immünofloresan gerçekleştirilen (Tm: tamoksifen). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54982/54982fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54982/54982fig2.jpg" /> Şekil 2. Agg-Cre ERT2 kullanma Mandibular Kondilin ve Uzun Kemik Kemik Hücrelerinin (Osteobalstlar ve osteositlerde) için kondrosit dan Dönüşüm; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Bileşik fareler. A) Cre doğum sonrası 14. günde, tamoksifen ile aktive edildi ve fareler 4 haftalıkken kurban edildi. Üç renkli hücreler vardı<html> kondiler süreci: saf kırmızı (kondrosit kaynaklı kemik hücreleri), sarı (yeşil ile kombine kırmızı, kollajen 1 genini ifade kondrosit türetilmiş kemik hücrelerini gösteren) ve saf yeşil (kolajen 1 geni olmayan kondrosit türetilmiş kemik hücreleri) . Birkaç kemik hücreleri yeşil (mavi oklar) iken kıkırdak altındaki kondiler sürecinde kemik hücrelerinin çoğu, sarı ya da saf kırmızı (beyaz oklar) idi. (:; C tamoksifen: kıkırdak, B: Kemik Tm) Bu veriler, güçlü doğrudan gelişimi sırasında kondil sürecin oluşmasında kemik hücrelerine dönüştürmek ve katkı kondrositler kanıt sağlar. B, C) epifiz ve metafiz kemik hücrelerinin çoğunluğu (beyaz ok kondrosit-elde edildi: sarı veya kırmızı saf kondrosit-dönüştürülmüş kemik hücreleri, mavi ok: yeşil saf olmayan kondrosit kökenli kemik hücreleri; AC: artiküler kıkırdak; GP: büyüme plağı).&quot;Blank&gt; Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Figure3" src="/files/ftp_upload/54982/54982fig3.jpg" /> Col10al-Cre kullanarak mandibular kemik hücreler için kondrosit dan Dönüşüm 3. Şekil; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Bileşik fareler. A) 3 haftalık farelerden alınan kondiler sürecinde, yeşil kemik hücreleri ayrı bir kıkırdak-kemik arayüzü yakın trabeküllerinde azınlık (üstün seviye, a1), kırmızı ve bazı sarı hücreler baskın oysa idi. Orta düzeyde (a2) &#39;de, sarı hücreler hafifçe daha az kırmızı hücreleri ile, çoğunluk vardı. Yeşil hücreler sadece en alt bölgede çoğunluk olduğu ortaya çıktı (a3). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54982/54982fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54982/54982fig4.jpg" /> Şekil 4. 2 haftalık Agg-Cre ERT2 kullanma Kondiler Sürecinde Lineage-tracing arka plan ile osteojenik hücreler için iki belirteçlerinin Eş-lokalizasyonu; Rosa26 tdTomato Bileşik fareler. A) çekirdeklerinde san renkli kondil kıkırdak altındaki trabeküler kemik yüzeyindeki Runx2 (beyaz oklar) ifade kondrosit türetilmiş kemik hücreleri temsil eder. Runx2 ifade olmadan saf kırmızı kemik hücreleri kemik matriksi (sarı oklar) olgun kondrosit türetilmiş kemik hücreleri temsil etmektedir. fewest hücreleri Cre aktivasyonu (: tamoksifen Tm) önce kondrosit gelen ya non-kondrosit türetilmiş kemik hücreleri ya da dönüştürülmüş kemik hücrelerini temsil eden tek yeşil çekirdekleri taşıyan olanlar vardı. B) kondil kıkırdağının altındaki trabeküler kemik kemik matrisinde hemen hemen her kırmızı kondrosit türetilmiş kemik hücresi hücre gövdeleri (beyaz oklar) etrafında DMP1ve boyama taşıdı. osteositleri Sadece birkaç DMP1ve için pozitif ama onların hücre gövdeleri (sarı oklar) kırmızı renk yoktu. Tamoksifen enjeksiyonundan önce ortaya çıkan olmayan kondrosit türetilmiş kemik hücreleri veya kondrosit kökenli kemik hücreleri: Bu hücreler için iki olasılık vardır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54982/54982fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal at JoVE.com

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

Immünofloresan ile (osteoblastlar özgü) 2.3Col1a1-GFP ile diğeri (kemik hücrelere özgü): İki / Cre fareler (özellikle kondrosit olarak ifade edilmiştir) (her yerde her zaman bütün hücrelerde ifade edilmiştir) Rosa26 tdTomato kombinasyonları izleme grupları geliştirdi. veri kemik hücrelerine kondrosit doğrudan dönüşümünü göstermektedir.

Hücre Lineage belirteçlerinin Eş-lokalizasyonu ve Domates Sinyali

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

co-localization-of-cell-lineage-markers-and-the-tomato-signal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K Görüntüleme.  Texas A&M University College of Dentistry.  Immünofloresan ile (osteoblastlar özgü) 2.3Col1a1-GFP ile diğeri (kemik hücrelere özgü): İki / Cre fareler (özellikle kondrosit olarak ifade edilmiştir) (her yerde her zaman bütün hücrelerde ifade edilmiştir) Rosa26 tdTomato kombinasyonları izleme grupları geliştirdi. veri kemik hücrelerine kondrosit doğrudan dönüşümünü göstermektedir. 

Video: Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

HiPSC Sinir Lineage Özgül Knockin Muhabirleri Verimli Nesil kullanma CRISPR / Cas9 ve Cas9 Çift Nickase Sistemi

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Gelişim Biyolojisi

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

SH-SY5Y İnsan Nöroblastom Hücre Hattı Farklılaşma

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological studies to depict intricate morphologies and to manipulate the function of genes in subsets of neurons within otherwise unmarked and unperturbed organisms. Genetic mosaics generated in the MARCM system are mediated through site-specific recombination between homologous chromosomes within dividing precursor cells to produce both marked (MARCM clones) and unmarked daughter cells during mitosis. An extension of the MARCM method, called twin-spot MARCM (tsMARCM), labels both of the twin cells derived from a common progenitor with two distinct colors. This technique was developed to enable the retrieval of useful information from both hemi-lineages. By comprehensively analyzing different pairs of tsMARCM clones, the tsMARCM system permits high-resolution neural lineage mapping to reveal the exact birth-order of the labeled neurons produced from common progenitor cells. Furthermore, the tsMARCM system also extends gene function studies by permitting the phenotypic analysis of identical neurons of different animals. Here, we describe how to apply the tsMARCM system to facilitate studies of neural development in Drosophila.

Here, we present a protocol for a mosaic labeling technique that permits the visualization of neurons derived from a common progenitor cell in two distinct colors. This facilitates neural lineage analysis with the capability of birth-dating individual neurons and studying gene function in the same neurons of different individuals.

Çift nokta MARCM kullanılması Hücre Lineage Analizleri ve Gen Fonksiyonu Çalışmaları

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These interactions are provided by junctional proteins that form nexuses between adjacent cells. Junctional protein mislocalization and reduced physical associations with their binding partners can result in the loss of function and, consequently, to organ dysfunction. Thus, identifying protein localization and protein-protein interactions (PPIs) in normal and disease-related tissues is essential to finding new evidences and mechanisms leading to the progression of diseases or alterations in developmental status. This manuscript presents a two-step method to evaluate PPIs in murine mammary glands. In protocol section 1, a method to perform co-immunofluorescence (co-IF) using antibodies raised against the proteins of interest, followed by secondary antibodies labeled with fluorochromes, is described. Although co-IF allows for the demonstration of the proximity of the proteins, it does make it possible to study their physical interactions. Therefore, a detailed protocol for co-immunoprecipitation (co-IP) is provided in protocol section 2. This method is used to determine the physical interactions between proteins, without confirming whether these interactions are direct or indirect. In the last few years, co-IF and co-IP techniques have demonstrated that certain components of intercellular junctions co-localize and interact together, creating stage-dependent junctional nexuses that vary during mammary gland development.

Intercellular junctions are requisites for mammary gland stage-specific functions and development. This manuscript provides a detailed protocol for the study of protein-protein interactions (PPIs) and co-localization using murine mammary glands. These techniques allow for the investigation of the dynamics of the physical association between intercellular junctions at different developmental stages.

Murin Makat Boğazlarında Gap, Sıkı ve Aderans Bağlantılarının Bileşenleri Arasındaki Protein-Protein Etkileşimlerinin ve Ortak Lokalizasyon Analizleri

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...