Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST 104-2311-B-001-034) e do Instituto de Biologia Celular e Organismic, Academia Sinica, Taiwan.

1. Construir tsMARCM pronto Flies Usando o Requerido transgenes 11, 13 <ol><li> Gerar a versão original de moscas tsMARCM-prontos de transgenes que são transportadas por moscas individuais 11 (ver Tabela 1). Realizar esquemas de passagem padrão mosca genéticos, que foram descritas anteriormente, colocando vários transgenes nas mesmas populações de moscas 13. <ol><li> Em uma linha progenitora, montar os transgenes de FRT 40A, UAS-mCD8 :: GFP (o primeiro repórter, mCD8 :: GFP; a expressão do transgene está sob o controlo do promotor da sequência de activação a montante, que produz um repórter membrana-tethered aglomerado de diferenciação de rato 8 proteína de fusão com a proteína verde fluorescente), e UAS-rCD2RNAi (o supressor que inibe a expressão do segundo repórter; o ARNi contra a expressão do cluster do rato of diferenciação 2, rcd2) no braço esquerdo do cromossoma 2 nd. Lugar, colocar -GAL4 condutor no X ou 3 rd cromossoma, se possível, específico do tecido. </li><li> No outro lado da linha parental, montar os transgenes de FRT 40A, UAS-rCD2 :: RFP (o segundo repórter, rCD2 :: RFP, o outro repórter membrana-tethered consistindo de proteína rCD2 fundida com a proteína fluorescente vermelha) e UAS-GFPRNAi (o supressor que inibe a expressão de GFP mCD8 ::; a de ARNi contra a expressão de GFP) no braço esquerdo do cromossoma 2 nd. Coloque-choque térmico (hs) -FLP ou FLP tecido especificidade no X ou 3 rd cromossomo, se possível. </li></ol></li><li> Gerar a nova versão de moscas tsMARCM-prontos de transgenes que são transportadas por moscas individuais 14 (ver Tabela 1). Realizar genética da mosca esquemas de passagem de padrão, que foram descritos Previously, colocando vários transgenes nas mesmas populações de moscas 13. <ol><li> Em uma linha progenitora, montar os transgenes de um local DRF e UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (um transgene combinada de mCD8 :: GFP e o supressor que inibe a expressão de rCD2 :: RFP) juntos no mesmo braço de 2º ou 3º cromossoma (pares apropriados de transgenes de FRT e UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i são indicados na Tabela 1). Coloque condutor tecido-específicos por GAL4 em outras do que o cromossoma do local DRF escolhido, se possível cromossomas. </li><li> No outro lado da linha parental, montar os transgenes de um local DRF e UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (o outro transgene combinada de rCD2 :: RFP e o supressor que inibe a expressão de mCD8 :: GFP) no mesmo braço do 2º ou 3º cromossómicas (pares apropriados de transgenes de FRT </em&gt; e UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi são indicados na Tabela 1). Coloque HS-FLP ou tecido-específicos de FLP em diferentes do cromossoma do local DRF escolhido, se possível cromossomas. </li></ol></li></ol> 2. Cruz tsMARCM pronto voa para gerar tsMARCM Clones na sua descendência <ol><li> Moscas Cruz tsMARCM-prontos juntos (por exemplo, colocar 10-15 moscas macho do passo 1.1.1 ou 1.2.1 e 20-30 fêmea virgem voa a partir do passo 1.1.2 ou 1.2.2 juntos) num frasco de fly-food com fresco pasta de levedura-made na parede do frasco. </li><li> Manter as moscas tsMARCM-prontos cruzadas a 25 ° C durante 2 dias para aumentar a probabilidade de acoplamento, antes de recolher ovos fertilizados. </li><li> transferir frequentes as moscas tsMARCM-prontos cruzados em frascos recém-Yeasted para evitar aglomeração (toque para baixo as moscas ou usar o dióxido de carbono para anestesiar as moscas para facilitar a transferência, manter não mais do que 80-100 ovos fertilizados em 10 mL fly-food vial para evitar demasiadas larvas eclodidas). </li><li> Culturas os animais tsMARCM (isto é, ovos fertilizados; um exemplo do genótipo de animais tsMARCM, como utilizados na Figura 3, é Hs-FLP [22], W / W; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT 40A , GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT 40A; +; +) que foram colocados em frascos transferidos em série a 25 ° C até que elas se desenvolvem para a fase desejada (por exemplo, embriões, larvas, ou pupas). </li><li> Colocar os tubos transferidos que contêm animais tsMARCM no mesmo estágio de desenvolvimento para uma temperatura de 37 ° de banho C água para 10, 20, 30, 40, e 50 minutos para determinar o tempo óptimo de choque térmico que induz a expressão de FLP para gerar o clones tsMARCM de interesse. Pule esta etapa se FLP tecido especificidade está sendo usado no experimento tsMARCM (é preferível hs-FLP para a linhagem neural analisa; as razões para esta preferência foram previamente descritos 15). NOTA: Repita o passo 2,5 utilizando o tempo ideal de choque térmico em futuras experiências tsMARCM se mais clones tsMARCM de interesse são procurados; Geralmente, mais de expressão de FLP é induzida em HS-FLP [22] em comparação com HS-FLP [1] com o mesmo tempo de choque de calor. </li><li> Cultura dos animais chocados ao calor tsMARCM a 25 ° C até que tenham atingido o estágio de desenvolvimento apropriado e, em seguida, vá para a etapa 3. </li></ol> 3. Prepare-se, Stain, e cérebros Mount Fly Contendo tsMARCM Clones <ol><li> Preparar pratos forceps de proteção. Misture parte A (30 g) e a parte B (3 g) do Kit de Elastómero de Silicone com carvão activado (0,25 g). Despeje a mistura em pratos adequados. </li><li> Dissecar larvas, pupas, ou cérebros adultos fora dos animais tsMARCM em 1X solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma pinça sobre um prato de pinças-protecção visto através de um microscópio de dissecção. NOTA: Um protocolo para dissecção mosca cérebro tem sido descRiBED anteriormente 16. </li><li> Fixar os cérebros voar em uma placa de ponto de vidro com 1x de PBS contendo 4% de formaldeído à temperatura ambiente durante 20 min. Processar os cérebros voar neste placa de ponto de vidro para o restante das etapas. </li><li> Lavar os cérebros mosca três vezes com 1% de PBT (1x PBS contendo 1% de Triton X-100) e lava-se três vezes durante 30 minutos cada um em 1% de PBT (enxaguar: remover PBT e adicionar novo PBT rapidamente; lavar: remover PBT, adicionar novos PBT, e incubar os cérebros da mosca no novo PBT utilizando um agitador orbital). </li><li> Incubar os cérebros voar com a mistura de anticorpos primários durante a noite a 4 ° C ou durante 4 h à temperatura ambiente. Um exemplo da mistura dos anticorpos primários é o anticorpo de rato anti-CD8 (1: 100), anticorpo de coelho anti-DsRed (1: 800), e o anti-anticorpo de ratinho Bruchpilot (Brp) (01:50) em 1% de PBT contendo soro de cabra normal a 5% (NGS). </li><li> Lavar os cérebros mosca três vezes com 1% de PBT e, em seguida lavar três vezes durante 30 minutos cada um com 1% de PBT. </li><li&gt; Incubar os cérebros voar com a mistura de anticorpos secundários durante a noite a 4 ° C ou durante 4 h à temperatura ambiente. Um exemplo da mistura de anticorpos secundários é o anticorpo IgG de cabra anti-rato conjugado com corante fluorescente verde (1: 800), anticorpo anti-IgG de coelho de cabra conjugado com corante amarelo-fluorescentes (1: 800), e de cabra anti-ratinho anticorpos IgG conjugado com corante vermelho-distante-fluorescente (1: 800) em PBT 1% contendo 5% de NGS. </li><li> Lavar os cérebros mosca três vezes com 1% de PBT e, em seguida lavar três vezes durante 30 minutos cada um com 1% de PBT. Montá-los em um micro de slides com um reagente anti-têmpera. Coloque uma tampa de vidro micro no micro slide para cobrir e proteger o cérebro da mosca. Selar as bordas da lâmina de vidro tampa e micro micro usando unha polonês claro. Armazená-los montados e selados voar espécimes cerebrais a 4 ° C. </li></ol> 4. Tome-se, processar e analisar imagens fluorescentes de tsMARCM Clones <ol><li> Capturar imagens fluorescentes de tsMARCM clones from as amostras criada no passo 3.8 utilizando o sistema de microscopia confocal de escolha. </li><li> Pilhas projeto de tsMARCM imagens fluorescentes confocal em bidimensional, achatada imagens usando o software de processamento de imagem fornecido com o sistema de microscopia confocal de escolha (ver Figura 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O e 3T - 3T para exemplos de achatada imagens fluorescentes confocal). </li><li> Contar o número de células dos lados multicelular-NB dos clones tsMARCM utilizando um software de processamento de imagem apropriado (por exemplo, a função &quot;celular counter&quot; no ImageJ 17; ver Figura 3E, 3J, 3O, e 3T para exemplos da célula corpos de neurônios). </li></ol>

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	<li>Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+neural+projections+reveals+clonal+composition+of+the+Drosophila+brain.">Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).</li><li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+development+and+organization+of+the+adult+Drosophila+central+brain.">Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).</li><li>Goodman, C. S., Doe, C. Q., Bate, M., Arias, A. 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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Passos críticos dentro do Protocolo Passos 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, e 3.2 são críticos para a obtenção de bons resultados tsMARCM. Condutores -GAL4 específicos de tecidos que não expressam GAL4 em progenitores neurais são preferidos para os passos 1.1.1 e 1.2.1. Evitar o excesso de aglomeração dos animais cultivadas em frascos fly-alimentares no passo 2.3. Porque a latência de indução, o nível de expressão de FLP após a choque térmico, e o tempo médio de divisão de progenitores neuronais (isto é, RN e gmcs) não são conhecidos, é melhor para variar o tempo de choque de calor (10, 20, 30 , 40, e 50 min) em diferentes amostras do mesmo genótipo e fase de desenvolvimento no passo 2.5. Isto irá permitir a determinação do tempo de choque de calor óptima, a fim de obter a melhor relação de clones tsMARCM de interesse. Além disso, tenha cuidado durante a dissecção mosca cérebro no passo 3.2, a fim de obter amostras cerebrais intactas; isto é crucial para contar com precisão o número de células neuronais. para researqueiros que estão interessados em usar tsMARCM para estudar a função de genes em outros braços cromossômicos (por exemplo, 2R, 3L e 3R), moscas tsMARCM-prontos deve ser montado como no passo 1.2, escolhendo os pares adequados de transgenes de FRT, UAS- mCD8.GFP.UAS-rCD2i, e UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi, que são indicados na Tabela 1. Também recomendamos que as moscas tsMARCM-pronto do sexo feminino realizar hs-FLP no cromossomo X (por exemplo, hs-FLP [22], w; UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT 40A; +; +), que facilita experiências tsMARCM repetidas. Modificações, solução de problemas e limitações da técnica A eficiência e perdurance de supressores e repórteres RNAi são os principais determinantes para se analisa linhagem neural e estudos da função do gene pode ser realizada com sucesso em experimentos tsMARCM. Em geral, a combinação de baixa perdurance de supressores de ARNi erepórteres derivados de progenitores neurais, juntamente com a elevada expressão de supressores e repórteres de RNAi em neurônios pós-mitóticas, permite melhores resultados tsMARCM. Porque a expressão de supressores e repórteres RNAi é controlado por motoristas GAL4, os pesquisadores devem selecionar os drivers GAL4 fortes que expressam GAL4 em neurônios diferenciados, mas não em células progenitoras neurais. Por exemplo, GAL4-OK107 é um condutor de GAL4 forte que expressa GAL4 no corpo de cogumelo (MB) progenitores e seus derivados, γ MB, α &#39;/ β&#39;, e a / p neurónios 11, 19. Rotulagem infiel do MB neurónios y tem sido observada em dois padrões clonais (ou seja, de uma única célula associada com os clones de uma única célula e dois de células-GMC associados com clones multicelular-NB) quando GAL4-OK107 foi usada em experimentos tsMARCM 11 . Curiosamente, o problema acima pode ser resolvido usando MB247-GAL4, um controlador MB GAL4 diferenteGAL4 que expressa em neurónios diferenciados MB 11. Nem todos os controladores de GAL4 pode ser utilizado no sistema de tsMARCM ou em outros sistemas de etiquetagem mosaico (por exemplo, marcm, Q-marcm, e gerador de duplo ponto) 4, 20, 21, se o condutor não é expressa nos neurónios de interesse. Portanto, antes de usar tsMARCM para a linhagem neural análises, os motoristas GAL4 devem ser testados para a sua cobertura dos neurônios de interesse na marcm-expressão dual-control com um motorista de células pan (por exemplo, promotor-LexA tubulina :: GAD) 22 . Notamos que clones tsMARCM, por vezes, não pode ser analisado de forma inequívoca, especialmente quando um driver GAL4 com um padrão complexo expressão neural é usada (por exemplo, corno lateral verde (LH) neurônios impedir a visualização clara do padrão de elaboração axonal do VL2p adPN na Figura 3B e <strong&gt; 3C). No entanto, o problema acima de padrões ambíguos também ocorre em outros sistemas de rotulagem mosaico (por exemplo, marcm, Q-marcm e gerador de twin-spot) 4, 20, 21, porque a limitação se origina com o driver GAL4. Observamos também que, para realizar experimentos de resgate para a autenticação de funções de genes, os transgenes de resgate deve ser projetado com as sequências alvo dos supressores de RNAi em 5 &#39;ou 3&#39; não traduzidas dos construtos de resgate transgênicos, ou um gêmeo local alternativo sistema de rotulagem (por exemplo, juntamente marcm, uma combinação de Q-marcm e marcm convencional) 21 devem ser adoptadas. Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos Além tsMARCM, gerador duplo-spot e marcm acoplado também, pelo menos em teoria, permitir a visualização deneurônios derivados de progenitores neurais comuns em duas cores distintas (uma comparação dessas três tecnologias de rotulagem mosaico foi apresentado anteriormente 15). O número mínimo de transgenes necessários para a montagem do gerador twin-ponto, a versão original do tsMARCM (ou a nova versão do tsMARCM) e marcm acoplado é de 4, 8 (ou 6), e 9, respectivamente. No entanto, tsMARCM é o único sistema que tem sido utilizado para realizar análises linhagem neuronal global 12, 15, 18, 23. a recombinação específica do local ocorrer em células não mitóticas no sistema gerador de duplo-ponto, e isto leva à co-expressão de dois repórteres na mesma célula, tornando-o difícil de usar este sistema para estudar o desenvolvimento do centro sistema nervoso 15. Em contraste, os clones obtidos de mosaico na tsMARCM e sistemas acoplados um marcmre derivada a partir de células mitóticas. No entanto, porque o sistema marcm acoplado requer dois pilotos independentes para controlar a expressão dos diferentes repórteres na sistemas marcm convencionais Q-marcm e, isto levanta preocupações sobre a rotulagem de neurônios derivados de progenitores neurais comuns se os dois motoristas independentes não fielmente rotular os mesmos neurônios em linhagens neuronais de interesse 15. Aplicações futuras ou chegar após dominar a técnica Usando tsMARCM para conduzir análises de linhagem neural de alta resolução Ao aplicar a abordagem utilizada na Figura 3 para analisar sistematicamente clones tsMARCM de adPNs, 40 tipos de adPNs, com um total de 82 neurônios, foram identificados em um estudo anterior 12. Entre estes 40 tipos de adPNs, 35 foram adPNs uni-glomerular (isto é, que inervam um único glomérulo no lobo antenal (AL)), que relay informação olfativa para outras regiões do cérebro Drosophila 12 (ver As Figuras 2-4 em Yu et al., 2010). Os outros cinco tipos de adPNs foram adPNs poli-glomerular (ou seja, que inervam múltipla glomérulos no AL), o que poderia integrar informação olfativa do AL e fornecer um nível adicional de complexidade funcional para o sistema olfativo 12 (ver Figuras 3E-3H e 4Z em Yu et al., 2010). AdPNs-nascido embrionárias tem apenas um neurônio por tipo, enquanto adPNs larvais-nascido são representados por vários neurônios por tipo, sugerindo que não há interação entre especificidade e redundância no sistema olfativo 12 (ver Figuras 2-4 em Yu et al., 2010). Curiosamente, os neurônios produzidos dentro de determinados janelas de desenvolvimento estão destinados a morrer, e muitos tipos de adPNs são encontrados com um número fixo de neurônios na linhagem neural ALad1, sugerindo que o number e tipos de adPNs para a montagem do sistema olfativo são fortemente regulamentadas 12 (ver Figuras 2H, 4V, e 5 em Yu et al, 2010;. Também veja a Figura 3P - 3T). Usando tsMARCM para um estudo minucioso funções de genes Além nascimento namoro adPNs, tsMARCM também tem sido aplicada para determinar a ordem de nascimento de seis neurônios complexas centrais rotulados por GAL4-OK107. Estes seis neurónios fazer-se um pequeno subconjunto de neurónios na linhagem neural LALv1 que contribuem para o circuito do complexo central de Drosophila para controlar os padrões intrincados de motor 2, 11 (ver Figura 4A e 4B, em Yu et al., 2009). Interessantemente, cada um destes seis neurónios centrais complexos possui uma distinta morfologia neuronal 11 (ver Figura 4D-4H 4o e em Yu et al., 2009). Todos eles transportar padrões distintos axonal no final dos anoslobo acessório ral (LAL). Os primeiros quatro neurónios distribuir suas dendrites de sub-compartimentos do noduli, uma sub-estrutura central, do complexo, ao passo que os restantes dois neurónios projectam as suas dendrites ao corpo elipsóide, um outro sub-estrutura do complexo central. Especificamente, o 3º -born neurônio complexo central, projeta suas dendrites aos noduli ventral, com um padrão axonal compacto na LAL, enquanto o 4º -born neurônio complexo central distribui seus dendritos ao noduli dorsal, com um padrão axonal amplo a LAL 11 (veja a Figura 4F e 4G no Yu et al., 2009). Além neurônios abrangente de identificação, o poder de tsMARCM seria melhor exemplificada através do estudo das funções dos genes em neurônios de interesse, uma vez que o sistema tsMARCM permite uma melhor fenotípica análises, permitindo o exame de neurônios idênticos em diferentes animais. Por exemplo, tsMARCM detecta uma única gordura temporaise mudança que requer cronologicamente inadequado morfogênese (chinmo, uma proteína nuclear dedo BTB-zinco) no 3º -born neurônios complexas centrais 11 (veja a Figura 4i, 4p, e 4W em Yu et al., 2009). Se a mutação chinmo tinha sido caracterizado por o sistema original marcm (isto é, neurónios simples marcado com verde, sem a rotulagem de neurónios derivados dos lados associados das células individuais como referência), o chinmo neurónio -deficient mostrado na Figura 4i de Yu et al. De 2009 teria sido identificado erroneamente como o 4º -born, ao invés do 3º -born, neurônio complexo central. Isso teria resultado na má interpretação da função chinmo como controlar a orientação axonal em vez de especificar o destino temporal, 11 (seta dupla na Figura 4i de Yu et al., 2009). No entanto, usando os lados magenta multicelular-NB de clones tsMARCM como the de referência (por contagem do número de células em Figura 4m, 4n, 4p e de Yu et al. , 2009), o neurónio -deficient chinmo mostrado na Figura 4i de Yu et al. , 2009) foi provado ser neurônio complexo central, o 3º -born, que, portanto, levou à conclusão correta que chinmo funções na especificação destino temporais para os neurônios complexas centrais 11. Tomados em conjunto, os resultados acima destacar as vantagens importantes do sistema tsMARCM para de alta resolução análises fenotípica, assim, revelar com precisão as funções dos genes em neurônios (ou outros tipos de células, se for o caso) para futuros estudos de desenvolvimento neural (ou os estudos de desenvolvimento de outros tecidos).

O cérebro, composta por um vasto número e diversos tipos de neurônios, dota animais com a capacidade de perceber, processar e responder aos desafios do mundo externo. Os neurónios do adulto de Drosophila cérebro central são derivados a partir de um número limitado de células estaminais neurais, chamados neuroblastos (RN), durante o desenvolvimento 1, 2. A maioria dos RN participando de neurogênese cerebral em Drosophila sofrem divisão assimétrica para gerar RN auto-renovação e células-mãe gânglio (GMCS), e os GMCs seguida, passar por outra rodada de divisão para produzir duas células-filhas que se diferenciam em neurónios 3 (Figura 1A ). Devido à complexidade da morfologia neuronal e os desafios associados com a identificação de neurônios específicos, uma tecnologia positiva rotulagem mosaico, análise de mosaico com um marcador de células reprimível (marcm), foi inventada para permitir que o visualizatião de um único neurónio, ou um pequeno subconjunto de neurónios para fora da população de neurónios não marcados circundantes, 4. Marcm utiliza o sistema / alvo de reconhecimento da FLP (FRT) para mediar a recombinação específica do local entre os cromossomas homólogos dentro de uma célula precursora divisória transportando um alelo heterozigoto de um gene repressor, cuja expressão normalmente inibe a expressão de um gene repórter 4 flipase (FLP). Após a divisão mitótica, os cromossomas recombinantes são segregadas em células individuais, de modo a que uma célula contenha alelos homozigóticos do gene repressor e a outra célula não tem gene do repressor de expressão do repórter em que a célula (e seus descendentes) não é mais bloqueadas 4. Três padrões clonais são normalmente encontrados em um experimento marcm quando FLP é estocasticamente induzida em RNs ou GMCs: clones de uma única célula e dois de células-GMC, que retratam a morfologia neuronal na Resolução de uma única célulan, e multi-celular-NB clones, que revelam padrões morfológicos inteiras de neurônios derivados de um NB comum (Figura 1B). A técnica marcm tem sido amplamente aplicado em estudos neurobiológicos Drosophila, inclusive na identificação do tipo neuronal para reconstruir redes de fiação em todo o cérebro, a linhagem neural análises para revelar a história do desenvolvimento dos neurônios, caracterização fenotípica das funções dos genes envolvidos na especificação do destino celular e morfogênese neuronal e diferenciação estuda 5, 6, 7, 8, 9, 10. Porque marcm convencional única de etiquetas uma das duas células filhas (e linhagens) após o evento mitótico recombinação induzida, informações potencialmente úteis a partir do lado não marcado está perdido. Esta limitação se opõe à aplicação do M básicaSistema ARCM a de alta resolução análises de muitas linhagens neuronais que mudar destinos celulares em tempo rápido ou precisão análises de funções de genes em neurônios idênticas de diferentes animais 11, 12. Cama local marcm (tsMARCM) é um sistema avançado que rotula neurónios derivados a partir de um antepassado comum com duas cores distintas, o que permite a recuperação de informação útil a partir de ambos os lados das células individuais, superando assim a limitação do sistema marcm inicial 11 ( Figura 2A - 2C). No sistema tsMARCM, dois interferência de RNA (RNAi) -based eliminadores estão situados em locais de trans-cromossomas homólogos dentro de uma célula precursora, e a expressão dessas supressores independentemente inibir a expressão dos respectivos repórteres (Figura 2B). Na sequência específica do local recombinações mitóticas mediada através do sistema FLP / FRT, a twsupressores S baseado em RNAi ser segregados em células individuais para permitir a expressão dos repórteres distintos (Figura 2B). Dois padrões clonais, de uma única célula associada a clones de uma única célula e de duas células-GMC associados com clones multi-celular-NB, são tipicamente vistos em um experimento tsMARCM (Figura 2C). Informação derivada a partir de um lado das células individuais podem ser utilizados como a referência para o outro lado, permitindo-alta resolução analisa linhagem neural, tais como-datado de nascimento os neurónios marcados, e analisa fenotípica de neurónios idênticas em diferentes animais para a investigação exacta da função do gene neural 11, 12. Aqui, nós apresentamos um protocolo passo-a-passo que descreve como realizar uma experiência tsMARCM, que pode ser utilizado por outros laboratórios para alargar os seus estudos de desenvolvimento neural (bem como o desenvolvimento de outros tecidos, se aplicável) em Drosophila.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide (CO2)</td>
			<td>Local vendor</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Local vendor</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Sort, cross and transfer flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.4</td>
			<td>Uniregion Bio-Tech (or other vendors)</td>
			<td>PBS001</td>
			<td>Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>Fix fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat</td>
			<td rowspan="2">Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td rowspan="2">005-000-121</td>
			<td rowspan="2">Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD8 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MCD0800</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DsRed antibody</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>632496</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Brp antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21236</td>
			<td>Immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade gold antifade reagent</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S36936</td>
			<td>Mount fly brains and protect quenching of fluorescence&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX 9 depression glass spot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td>Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242276-250G</td>
			<td>Make black Sylgard dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dissect and mount fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro slide</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td>Mount fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass No.1.5</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48366-205</td>
			<td>Mount fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Local vendor</td>
			<td>not available</td>
			<td>Seal micro cover glass on micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Incubator&#160;</td>
			<td>Kansin Instruments</td>
			<td rowspan="2">LTI603</td>
			<td rowspan="2">culture flies at 25&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(or other vendors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Water bath</td>
			<td>Kansin Instruments</td>
			<td rowspan="2">WB212-B2</td>
			<td rowspan="2">Induce heat-shock in flies at 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(or other vendors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Orbital shaker</td>
			<td>Kansin Instruments</td>
			<td rowspan="2">OS701</td>
			<td rowspan="2">Wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(or other vendors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EZ4</td>
			<td>Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss (or other vendors)</td>
			<td>LSM 700 (or other models)</td>
			<td>Image tsMARCM clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image-processing software 1 
			(e.g., Zeiss LSM image browser)&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>not available</td>
			<td>Project stacks of confocal images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image-processing software 2 
			(e.g., Image-J)&#160;</td>
			<td>not available</td>
			<td>not available</td>
			<td>Count cell number of tsMARCM clones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell lineage analyses and gene function studies using twin-spot marcm

M osaic uma nálise com um r epressible c ell m arker (marcm) é um sistema de rotulagem mosaico positivo que tem sido amplamente aplicado em estudos neurobiológicos Drosophila para descrever morfologias intrincadas e de manipular a função de genes em subconjuntos de neurônios dentro de outra forma não marcado e imperturbável organismos. mosaicos genéticos gerados no sistema marcm são mediadas através de recombinação específica do local entre os cromossomas homólogos dentro de divisão de células precursoras para produzir ambos os clones (marcm) marcados e não marcados células filhas durante a mitose. Uma extensão do método marcm, chamado duplo-spot marcm (tsMARCM), etiquetas, tanto das células individuais derivadas de um antepassado comum com duas cores distintas. Esta técnica foi desenvolvida para permitir a recuperação da informação útil a partir de ambos os hemi-linhagens. Por abrangente análise de diferentes pares de clones tsMARCM, o sistema permite tsMARCM de alta resolução mappin linhagem neuralg para revelar o nascimento-ordem exacta dos neurónios marcados produzidos a partir de células progenitoras comuns. Além disso, o sistema também se estende tsMARCM estudos de função do gene, permitindo a análise fenotípica de neurónios idênticas de diferentes animais. Aqui, descrevemos como aplicar o sistema tsMARCM para facilitar estudos sobre o desenvolvimento neural em Drosophila.

O sistema tsMARCM tem sido usado para facilitar a linhagem neural análises e estudos da função gênica por recuperar informações importantes sobre os neurônios derivados do RN comuns. O sistema tem sido utilizado para identificar a maioria (se não todos) os tipos neuronais, determinar o número de células de cada tipo neuronal, e determinar a ordem de nascimento desses neurônios 11, 12, 18 (ver a seção de discussão para mais detalhes sobre o uso tsMARCM para conduzir linhagem neural análises ou estudos da função do gene). Aqui, usamos quatro clones tsMARCM de neurônios olfativos ântero-dorsal de projeção (adPNs na linhagem neural ALad1 do sistema olfativo Drosophila) marcado com GAL4-GH146 como exemplos para ilustrar como conduzir um experimento de tsMARCM 1, 2. Após expressão de FLP foi induzida na fase embrionária, uma Single, verde VL2p adPN associada com 45 adPNs magenta foi detectado em um clone tsMARCM (Figura 3A - 3E). Em contraste, quando FLP foi induzida depois, em diferentes estágios larvais, adPNs individuais verdes (DL1 adPN ou DC3 adPN) ou no-GH146 + adPNs associado com diferentes números de adPNs Magenta (31, 21, ou 15) foram observados em três outros tsMARCM clones (Figura 3F - 3T). O nascimento de VL2p adPNs antes do nascimento de DL1-, DC3- e não-GH146 + -adPNs foi determinada por contagem dos números de células de adPNs nos seus lados multicelular-NB associadas dos clones tsMARCM (45, 31, 21, e 15 na Figura 3E, 3J, 3O, e 3T, respectivamente). Além disso a contagem do número de células, a complexidade do axonal e padrões dendríticas nos lados multicelular-NB dos clones tsMARCM pode ser utilizado para determinar a ordem de nascimento em relação dos seus lados associados de duas células-GMC daclones tsMARCM. Clones mosaico induzidos em estágios iniciais de desenvolvimento normalmente contêm mais neurônios e, portanto, têm axonal mais complexo e padrões dendríticas, enquanto clones mosaico induzidos em estágios de desenvolvimento final contêm menos neurônios e, portanto, têm padrões axonais e dendríticas menos complexos (Figura 3C - 3D, 3H - 3I , 3M - 3N, e 3R - 3S). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55278/55278fig1.jpg" /> Figura 1: ilustrações esquemáticas de Drosophila neurogénese e os três tipos de padrões clonais encontrados numa experiência marcm. (A) A ilustrando neurogênese diagrama esquemático em linhagens mais neurais do cérebro central Drosophila: neuroblastos (RN) submetidos a uma divisão assimétrica para gerar RN auto-renovação e células-mãe gânglio (As GMC), e GMCs dividem mais uma vez para produzir dois neurónios filha (NE). (B) três padrões clonais são observados numa experiência marcm: clones de uma única célula (a), quando flipase (FLP) é induzida em GMCs, e os clones de duas células-GMC (b) e os clones multicelular-NB (C ), quando FLP é induzida na RN. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55278/55278fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55278/55278fig2.jpg" /> Figura 2: Diagramas esquemáticos do sistema tsMARCM. (A) moscas tsMARCM-READY: uma mosca parental contém transgenes de um local DRF e UAS-mCD8 :: GFP (o primeiro repórter), UAS-rCD2RNAi (o primeiro supressor que inibe a expressão do segundo repórter), e um tecido especï¿½ico -GAL4; a outra mosca parental contém um FRT </em&gt; local, UAS-rCD2 :: RFP (o segundo repórter), UAS-GFPRNAi (o segundo supressor que inibe a expressão do primeiro repórter), e HS-FLP. (B) A presença dos dois supressores baseados em RNAi na descendência das moscas tsMARCM-prontos cruzados inibe a expressão de repórteres (ou seja, mCD8 :: GFP e rCD2 :: RFP nas fases G1 e G2 do painel B). A expressão de FLP é induzido por choque térmico, e em seguida, FLP medeia a recombinação específica do local de cromossomas homólogos dentro de uma célula precursora de divisão por ligação a alvos de reconhecimento da FLP (FRT). Isto resulta na segregação dos supressores baseados em RNAi nas células individuais após a divisão mitótica para permitir a expressão dos repórteres distintas. (C) Dois padrões clonais são observados numa experiência tsMARCM: de uma única célula, associado com os clones de uma única célula (um) quando é induzida em FLP GMCs, e de duas células-GMC, associada com os clones multicelular-NB(B) quando FLP é induzida na RN. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55278/55278fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55278/55278fig3.jpg" /> Figura 3: Usando quatro clones tsMARCM de adPNs como exemplos de como conduzir um experimento de tsMARCM em uma análise de linhagem neural. Quatro clones de tsMARCM adPNs são ilustrados, com diagramas dos seus padrões de neurogénese (A, F, K, P e); imagens confocais de cérebro total (B, G, L e Q), que mostra o corno lateral (LH; C, H, M, e R), o lobo antenal (AL; D, I, N, e S) e a soma(E, J, S e T); e os padrões de suas morfologias neuronais. adPNs individuais (VL2p, DL1, DC3, e não-GH146 + adPNs; verde) associados com multicelular-NB adPNs (magenta) dos clones tsMARCM foram derivados pela indução de FLP para mediar recombinação mitótica na adPN NB no embrionário (A - e) e larvas - fases (F T). Note-se que adPNs são um dos hemi-linhagens na linhagem neural ALad1, o que resulta em clones tsMARCM de um único adPN, verde associada com adPNs magenta na Figura 3 (por razões desconhecidas, os neurónios do outro hemi-linhagem da neural ALad1 linhagem de matriz). A ordem de nascimento de VL2p, DL1, DC3, e não-GH146 + adPNs foi determinada por contagem dos números de células de adPNs nos lados magenta multicelular-NB dos clones tsMARCM (45, 31, 21, e 15 no tracejado linhas de painéis E, J, O e T). Os padrões de neuritos são geralmente mais complexos nos lados magenta multicelular-NB quando os clones tsMARCM são induzidas nas fases iniciais do desenvolvimento (por exemplo, o padrão dendrítico é mais complexa no painel E em comparação com painéis de I, N, e S). analisa tsMARCM são por vezes confuso quando os neurônios de outras linhagens neurais também são rotulados pelo condutor mesma GAL4 (por exemplo, os neurônios LH verdes, mostradas por setas duplas, obstruir a visualização do padrão elaboração axonal dos adPNs VL2p em painéis B e C) . neuropiles cerebrais (em azul) foram coradas com anticorpo contra Bruchpilot (Brp). Tempo de choque térmico: 12 min (painéis A - E), 15 min (painéis F - J), e 35 min (painéis K - T). Barra de escala em painéis B - <strong&gt; E, G - J, L - Ó, e Q - S = 10 uM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55278/55278fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica de marcação de mosaico que permite a visualização dos neurónios derivados de uma célula progenitora comum em duas cores distintas. Isso facilita a análise de linhagem neural com a capacidade de neurônios individuais-datando de nascimento e função do gene estudar nos mesmos neurônios de diferentes indivíduos.

Análises celular linhagem e estudos da função de genes utilizando marcm Twin-ponto

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

cell-lineage-analyses-and-gene-function-studies-using-twin-spot-marcm

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K visualizações.  Academia Sinica.  Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica de marcação de mosaico que permite a visualização dos neurónios derivados de uma célula progenitora comum em duas cores distintas. Isso facilita a análise de linhagem neural com a capacidade de neurônios individuais-datando de nascimento e função do gene estudar nos mesmos neurônios de diferentes indivíduos. 

Vídeo: Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Eletroporação Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Biologia do Desenvolvimento

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

Cultures Organotípicas fatia de Estudos de Pós-natal Neurogênese

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

Geração eficiente de hiPSC Neurais Lineage Repórteres Knockin específica usando o CRISPR / Cas9 e Cas9 Duplo Nickase Sistema

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

Um método para Lineage Tracing de células da córnea Usando Multi-cor repórter fluorescente Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the reporter in a specific cell line and all progeny. Here, we used the cell lineage tracing technique to demonstrate that chondrocytes directly transform into osteoblasts and osteocytes during long bone and mandibular condyle development using two kinds of Cre, Col10a1-Cre and Aggrecan-CreERT2 (Agg-CreERT2), crossed with Rosa26tdTomato. Both Col10 and aggrecan are well-recognized markers for chondrocytes.
On this basis, we developed a new method-cell lineage tracing in conjunction with fluorescent immunohistochemistry-to define cell fate by analyzing the expression of specific cell markers. Runx2 (a marker for early-stage osteogenic cells) and Dentin matrix protein1 (DMP1; a marker for late-stage osteogenic cells) were used to identify chondrocyte-derived bone cells and their differentiation status. This combination not only broadens the application of cell lineage tracing, but also simplifies the generation of compound mice. More importantly, the number, location, and differentiation statuses of parent cell progeny are displayed simultaneously, providing more information than cell lineage tracing alone. In conclusion, the co-application of cell lineage tracing techniques and immunofluorescence is a powerful tool for investigating cell biology in vivo.

We developed two sets of tracing combinations in Rosa26tdtomato (ubiquitously expressed in all cells)/Cre (specifically expressed in chondrocytes) mice: one with 2.3Col1a1-GFP (specific to osteoblasts) and one with immunofluorescence (specific to bone cells). The data demonstrate the direct transformation of chondrocytes into bone cells.

Co-localização de marcadores de células de linhagem e o sinal de tomate

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

Manipulação funcional do gene materno produtos Usando<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação do oócito em Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

Estudos de estrutura e função em células-tronco embrionárias de camundongos usando troca de cassete mediada por recombinase

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

Mediada por CRISPR perda de função de análise no grânulo cerebelar células usando no Utero Electroporation Gene transferência baseada

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. The classical histochemical reaction is based on the hydrolysis of the substrate X-gal in combination with ferric and ferrous ions, which produces an insoluble blue precipitate that is easy to visualize. Therefore, &#946;-galactosidase activity serves as a marker for the expression pattern of the gene of interest as the development proceeds. Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the subsequent method for paraffin sectioning and counterstaining. Additionally, a procedure for clarifying whole embryos is provided to better visualize X-gal staining in deeper regions of the embryo. Consistent results are obtained by performing this procedure, although optimization of reaction conditions is needed to minimize background activity. Limitations in the assay should be also considered, particularly regarding the size of the embryo in whole mount staining. Our protocol provides a sensitive and a reliable method for &#946;-galactosidase detection during the mouse development that can be further applied to the cryostat sections as well as whole organs. Thus, the dynamic gene expression patterns throughout development can be easily analyzed by using this protocol in whole embryos, but also detailed expression at the cellular level can be assessed after paraffin sectioning.

Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the method for paraffin sectioning and counterstaining. This is an easy and quick procedure to monitor gene expression during development that can also be applied to tissue sections, organs or cultured cells.

Rastreamento de expressão gênica, através da detecção de atividade de β-galactosidase em embriões de rato inteiro

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...