Name: systems biology of metabolic regulation by estrogen receptor signaling in breast cancer
Uploaded: 2016-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, ABD Tarım Bakanlığı, ödül Illu-698-909 (ZME) ve Pfizer, Inc (ZME) hibe tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka ABD Tarım Bakanlığı resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

RNA-Seq Örneklerin hazırlanması 1. <ol><li> Hücre Kültürü ve İşlem <ol><li> Kültür Geliştirilmiş MEM (IMEM) artı% 10 ısıl aktif olmayan FBS,% 1 penisilin / nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C &#39;de streptomisin ile fenol-kırmızısı bir ortam içinde MCF7 hücreleri. Not: Aynı hücre dizisi ve hücre kültürü durum çalışma boyunca kullanılır. </li><li> 6-delikli plakalardaki oyuk başına tohum 100,000 MCF7 hücreleri. Her tedavi için triplicates var. 3 gün, orta kaldırmak ve ya her kuyuya 10 -8 M E2 olmadan 2 ml taze orta ekleyin. Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de 24 saat boyunca inkübe edin. </li><li> hücreleri hasat etmek için, her bir 1 ml RNA izolasyonu reaktifi (asit guanidinyum thiosiyanat-fenol-kloroform) ilave edilir ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (RT) enkübe edilir. Sonra 1.5 ml tüpler içine pipetle ve mevduat hücre lizatı reaktifi toplamak </li></ol></li><li> RNA izolasyonu <ol><li> 200 ul chlorofo ekleme10 saniye boyunca, 1 ml hücre lizatı reaktifi (1.1.3) ve vorteks RM. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüj örnekleri. Santrifüj işleminin ardından, diğer fazlar bozmadan yeni bir tüpe sulu fazın (üst) aktarın. </li><li> transfer sulu faz yeni bir tüpe 500 ul% 100 izopropanol ekleyin ve üst edilerek karıştırılır. -20 ° C sıcaklıkta gece boyunca inkübe edilir. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin örnekleri. tüpün alt kısmında bir pelet gözlemleyin. Süpernatantı atın ve kısa girdap tarafından 750 ul RNaz ücretsiz% 70 etanol ile pelet yıkayın. </li><li> Santrifüj örnekler 4 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca 6,000 x g&#39;de. Süpernatantı, ve geriye kalan etanolü toplamak için 4 ° C&#39;de 1 dakika için 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin. 10 dakika boyunca kurumaya aşağı yukarı tarafı tüpleri bir jel yükleme ucu ile pipetleme kalan etanol çıkarın ve ayarlayın. bağımlılığındaki 20-50 ul DEPC arıtılmış su pelet çözülürpelet boyutuna ding. </li></ol></li><li> Protokolü 4 Aşağıdaki RNA temizleme kiti kullanılarak RNA arındırın. 9 protokolü izlenerek fluorometri bazlı analiz kiti kullanılarak RNA konsantrasyonu ölçümü. Not: 260 nm&#39;de OD, 260 nm&#39;de OD RNA konsantrasyonu ve oranı tayin edilir ve 280 nm Örnek saflığını belirlemek için kullanılır. Bu Biyo-analizör analizi kullanılarak RNA kalitesini kontrol tavsiye edilir. </li><li> sekanslama için yaklaşık 0,5-1 ug saflaştırılmış RNA al. NOT: Biyoteknoloji merkezi sıralama kütüphaneleri hazırlar ve paired-end önceden 2 detaylı yöntemler kullanılarak sıralama okuma gerçekleştirir. </li></ol> ChIP-Seq Numune 2. Hazırlık <ol><li> Hücre Kültürü ve İşlem <ol><li> Tohum büyüme ortamında 10 cm plaka başına 500.000 MCF7 hücreleri. NOT: Her aşağı çekme için 16 tabak kullanıldı. 3 gün, orta kaldırmak ve ya her 10 -8 M E2 olmadan 5 ml taze orta ekleyinplaka. 45 dakika (nemlendirilmiş bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C) için hücreleri tedavi. </li></ol></li><li> Çapraz bağ ve Hücre Hasat <ol><li> Kromatine çapraz bağlanması, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe 5 ml ortam içine 250 ul% 37 formaldehid ekleyin. 5 ml buz 1x MEM ile hücrelerin yıkayarak çapraz bağlanması durdurun. </li><li> plaka başına 250 ul hücre lisis tamponu (10 mM EDTA, 50 mM Tris HCI,% 1 SDS,% 0.5 N, N-dimethyldodecan-1-amin oksit) hücreleri hasat. </li></ol></li><li> Kromatin parçalanması <ol><li> Gerekli kromatin boyutlarını ulaşmak için 30 amp 30 sn x 8 hücreleri sonikasyon. 30 saniyelik bir Sonikasyon sonrasında, buz üzerinde her bir örnek soğutun. </li><li> Santrifüj 16 °, 000, 4 ° C&#39;de 10 dakika süre ile xg, ve dikkatli bir şekilde alt pelet bozmadan üstte yüzen madde pipet. </li><li> Süpernatan 5 ul tablet alın ve daha önce tarif edildiği gibi 10,% 1.5 agaroz jeli içinden elektroforez ile DNA boyutunu kontrol edin. ideal boyutDNA 200-500 bp arasında olmalıdır. </li></ol></li><li> kromatin immünopresipitasyon <ol><li> giriş olarak hücre lizatı 25 ul kaydedin. 50 ml&#39;lik bir tüp içinde, 20 mi, IP tampon maddesi (2 mM EDTA, 100 mM NaCI, 20 mM Tris-HCl ve% 0.5 Triton X), ÖRa antikoru (500 ul F10 ve 500 ul hücre lisatı 4 ml karıştırın HC- 20) ve 500 ul PROTA ve ProtG proteini manyetik boncuklar kaplanması. chromatin- antikor kompleksinin oluşumuna izin vermek için 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca dönmesi ile inkübe karışımı. </li></ol></li><li> Yıkar ve Ters çapraz <ol><li> yıkama tamponu çıkarmak için manyetize tarafında manyetik boncuk toplamak için manyetik standı kullanın. </li><li> 25 ml yıkama tampon maddesi içinde manyetik boncuklar yıkayın I (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCI,% 01 SDS,% 1 Triton X ve 150 mM NaCI). iyice 25ml tüm manyetik boncuk karışık kuyu wi kadar sonra tüpler ters tarafı boyunca tüp yavaşça yıkama tamponu ekleyin DNA Protein kompleksleri bozmadan manyetik boncuk yıkamak içinBir pelet olarak görünmeden yıkama tamponu th. Bir alternatif olarak, tüp ters için rotator kullanımı. örnekleri vorteks etmeyin. aşağıdaki adımları aynı yöntem kullanılarak, manyetik boncuk yıkayın. </li><li> 25 ml yıkama tamponu II (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCI,% 01 SDS,% 1 Triton X, 500 mM NaCİ) içinde manyetik boncuk yıkayın. </li><li> 25 ml yıkama tampon III manyetik boncuk yıkayın (1.6 mM EDTA, 10 mM Tris HCI,% 1 NP-40,% 1 Dexycholate 250 mM LiCİ). </li><li> iki kez 25 mi 1X TE tampon maddesi (1 mM EDTA, 10 mM Tris HCI) manyetik boncuk yıkayın. </li><li> 500 ul Elüsyon tamponunda DNA Zehir (% 1 SDS ve 10 mM NaHCO3) ve daha sonra 4 tüpler içine 500 ul DNA elüsyon tahsis. girişlerden DNA için, 125 ul Elüsyon tamponunda DNA Zehir. </li><li> bir ısıtma bloğu üzerinde gece boyunca 65 ° C&#39;de inkübe edin. hatta tüm tüpleri üzerinde ısı tutmak için alüminyum folyo ile ısıtma bloğu tüpleri örtün. açılış onları tutmak için borular üzerinde bir ağırlık koyun. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> DNA izolasyonu <ol><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında tüpler soğutun. ChIP DNA izolasyon kiti kullanılarak aşağı çekme örneklerinden DNA izole. üreticiden yönergeleri izleyin. <ol><li> 65 ° C&#39;de elüsyon tamponu ısıtın. Her tüpe bağlayıcı tampon 625 ul ekle. Çözelti berraklaşıncaya kadar çökelti oluşmazsa, başka bir 250 ul bağlayıcı tampon eklemek. </li><li> 30 saniye boyunca 16.000 xg&#39;de sütun ve santrifüj üzerine örnek yükleyin. 250 ul yıkama tamponu ile örnek yıkayın. İlk kez ne zaman kullanılacağını yıkama tamponu etanol eklemeyi unutmayın. yıkama tekrarlayın. </li><li> 15 ul Elüsyon tamponunda DNA Zehir. Aynı DNA yaklaşık 55 ul DNA elde etmek için 4 tüpler aşağı çekme birleştirin. </li></ol></li><li> DNA izolasyon kiti kullanılarak Girdi DNA izole. <ol><li> 65 ° C&#39;de elüsyon tamponu ısıtın. Her bir tüp içinde 625 ul bağlayıcı tampon ilave edin ve 10 dakika boyunca inkübe edin. 2 ml collecti kolona örnek yükleyintüp. </li><li> 1 dakika boyunca 16,000 xg&#39;de 750 ul yıkama tamponu, santrifüj ile örnek yıkayın. herhangi bir geri kalan tampon çıkarmak için santrifüj tekrarlanır. EB 30 ul içine DNA Zehir. </li></ol></li><li> Modifikasyon 11 ile Ticari Florokrom Test kullanma DNA Konsantrasyon ölçün. <ol><li> reaktif ve DNA örneklerinin seyreltilmesi için tahlil tamponu olarak 1x TE içine 20x TE tampon sulandırmak. 5 ul izole edilen DNA almak ve 1X TE 50 ul içinde seyreltin. </li><li> 2 ug / ml DNA stok solüsyonundan boş 1, 10, 100, 1000 ug / ml arasında değişen bir DNA standart hale. 96 oyuklu bir plaka içerisinde, 25 her bir standart ul olarak kopya DNA seyreltme ayırmaktadır. (Standart Triplicate tavsiye edilir.) </li><li> Plastik tüp içinde 1X TE tamponu içinde dsDNA reaktif bir 200-kat seyreltme yapılarak çalışma reaktifi hazırlayın. ışık önlemek için alüminyum folyo ile çalışan reaktif çözümü örtün. Her numune içine reaktifi çalışan 200 ul ekleyin. İçinde5 dakika boyunca oda sıcaklığında cubate. ışık önlemek için alüminyum folyo ile plaka örtün. </li><li> (480 nm, emisyon 520 nm uyarma), bir floresan plaka okuyucu kullanarak örneklerin floresans ölçün. DNA konsantrasyonuna karşı çiçeklenme DNA standart eğri oluşturmak. oluşturulan DNA, standart eğrisine göre numune konsantrasyonları belirlenir. </li></ol></li></ol></li><li> qPCR kullanarak ChIP Deney doğrulanması <ol><li> DNA izole edilmiş ve su içinde 20 ul seyreltilmiş 2 ul alır. 2.5 ul DNA seyreltme, 5 ul Green I PCR master karışımı, 1 ul astar ve 1.5 ul nükleaz ücretsiz su karıştırılarak üç nüsha olarak qPCR reaksiyonu ayarlayın. </li><li> Aşağıdaki programı kullanarak Hızlı Real-Time PCR sistemi ile qPCR çalıştırın: Adım 1: 95 ° C 60 saniye, Adım 2: 60 saniye tekrarlayın Adım 2 39 kez 10 saniye süreyle 95 ° C, 60 ° C. </li></ol></li><li> sıralama için Biotech merkezine 10 ng DNA örneği gönderin. NOT: Biotech merkezi talimatına göre kütüphaneler içine ChIP DNA hazırlar ve daha önce 2 detaylı yöntemler kullanılarak tek okunan sıralama yapar. </li></ol> 3. Metabolomik Deneyi Numune Hazırlama <ol><li> Hücre Kültürü ve İşlem <ol><li> Tohum büyüme ortamında 10 cm plaka başına 400.000 MCF7 hücreleri. Her tedavi için üç numune hazırlamak. tespiti için yeterli hücre almak için her bir örnek iki tabak kullanın. 3 gün, orta kaldırmak ve hücrelere veya 10 -8 M E2 olmadan 5 ml taze orta ekleyin. 24 saat (nemlendirilmiş bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C) için hücreleri tedavi. </li></ol></li><li> Örnek koleksiyon <ol><li> , Plaka PBS 1x 5 ml buz soğuk ekle kısaca plaka birkaç kez devirme sonra PBS aspire. İki kez tekrarlayın ve son yıkamadan sonra mümkün olduğunca PBS kaldırmak. </li><li> Her bir plaka için önceden soğuk aseton 750 ul ilave edin ve hücreleri kazıyın. iki plakalardan aseton hücreleri birleştirmekBuz üzerinde 2 ml tüp. </li><li> normalleşmesi için hücre sayımı <ol><li> Her bir muamele için, hücre ölçümü için fazladan iki tabak kullanın. Için, hücreleri plakadan de takmak O, her plaka (1 x HBSS, 10 mM HEPES,% 0.075 NaHCO 3 ve 1 mM EDTA) tampon ve 5 dakika için inkübe 2 ml ekleyin. </li><li> Toplayın ve HE tampon hücreleri pipetleme iyice hücreleri karıştırın. hemasitometre kullanarak hücre sayısını saymak için 20 ul hücre çözüm toplam kullanın. </li></ol></li></ol></li><li> belirlemek ve gaz kromatografisi kütle spektrometrisi (GC-MS) analizi kullanılarak metabolitleri ölçmek için Metabolomik merkezine göndermeden önce -80 ° C&#39;de örnekleri saklayın. </li></ol> 4. Bütünleştirici Analizi <ol><li> RNA Dizi veri analizi: <ol><li> FastQC kullanarak fastq dosyalarının Kalite kontrolü yapın: Okuma QC (http://galaxy.illinois.edu) <ol><li> FastQC seçin: NGS ve aracı altında Oku: QC ve manipülasyon. Geçerli histor gelen ham veri dosyası yükleY. NOT: Çıktı dosyası işi birden çıkışları olabilir çünkü için ne hatırlatmak için bir başlık vermek için tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Yürütme ve çıktı dosya Tarih altında görünecektir. Her dizi dosya için aynı işlemi tekrarlayın. FASTX Toolkit: NGS altında Clip kullanarak Trim adaptörler. </li><li> Hizala RefSeq genom referans açıklama 12 (varsayılan değerler) ile Tophat2 kullanarak hg19 için okur. <ol><li> NGS bir aracı altında Tophat2 seçin: RNA analizi. kütüphane eşleştirilmiş tipini (eşleştirilmiş sonu vs tek uçlu) belirtiniz. </li><li> Geçerli tarihin giriş fastq dosyasını yükleyin. Referans genomunu seçin. varsayılan ayarları seçin. Ya da değiştirmek için tam parametre listesini kullanın. </li><li> Yürütme ve iki çıkış dosyaları üretecek: Bir kavşak UCSC YATAK pist; Başka bir BAM formatında okuma güzergahlarının bir listesidir. </li></ol></li><li> dizi veri analizi aracı BAM dosyalarını yükleyin. Quant kullanarak ifade değerlerini hesaplamakification Aracı. </li><li> Varsayılan değerleri kullanarak İfade Analizi Aracı&#39;nı kullanarak farklı şekilde yukarı regüle genleri tanımlamak ve değişim&gt; 2 ve p-değeri &lt;0.05 katlayın. Aynı şekilde, varsayılan değerleri kullanarak İfade Analizi Aracı&#39;nı kullanarak farklı şekilde aşağı regüle genleri tanımlamak ve değişim &lt;0,5 ve p-değeri &lt;0.05 katlayın. </li></ol></li><li> ChIP-Seq Veri Analizi: <ol><li> Align fastq Galaxy Bowtie2 13 (Varsayılan Değerler) kullanarak hg19 okur. <ol><li> MGK aracı altında Bowtie2 seçin: Mapping. kütüphane arkadaşı-eşleştirilmiş (eşleştirilmiş sonu vs tek uçlu) ise doğrulayın. Geçerli tarihinin fastq dosyasını yükleyin. </li><li> Referans genomunu seçin. varsayılan parametre ayarları kullanın. Yürütme ve eşlenen dizisi BAM dosya olarak okur ile çıkış dosyası üretecektir. Her dizi dosyası için aynı işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> Daha önce 2 açıklandığı gibi, MACS 14 6.0E-7 bir p değeri kesme ve 0.01 FDR kullanarak doruklarına tanımlayın. </li></ol&gt; </li><li> Metabolomik Veri Analizi: <ol><li> KEGG_IDs metabolitlerin kimyasal isimleri dönüştürün. </li><li> V. E2 Araç tespit seviyeleri karşılaştırılarak ayrı düzenlenmiş metabolitleri kısmını (2 kat kesme bu çalışmada kullanılmıştır) örnekleri işlemden geçirildi. </li></ol></li><li> Bütünleştirici analiz: <ol><li> dizi veri analizi aracını kullanarak ÖRa bağlama siteleri genleri belirlemek. mesafe cut-off olarak 20 kb kullanarak genler işlev Bölgeler çevirin. </li><li> Kesilmiş sırasıyla p değeri &lt;0.05 olan katlık değişime&gt; 2 kullanılarak RNA Seq veri analizinden farklı olarak yukarı ve aşağı düzenlenen genleri tanımlamak ve değişim &lt;0,5 kat. Venn şeması karşılaştırma kullanılarak ÖRa bağlanma yeri içeren genlerin listesine karşılaştırın. </li><li> Cytoscape ve Metscape 15 modülünü kullanarak E2 modüle metabolik yolları belirlemek için bu listeyi kullanın. <ol><li> apps Metscape modülü seçerek, ağ ve ardından yolu-bas oluşturun seçined seçeneği. </li><li> Organizma (Insan) seçin. E2 düzensiz bileşik listesinin seç veri dosyası (KEGG ID) yanı sıra E2 gen listesi up-regüle. </li><li> Ağ türü olarak -Reaction Enzim-Gene Bileşik seçin. sorgu olarak bileşik / genleri seçin. </li><li> ağ kurmak. E2 aşağı regüle bileşik ve genler kullanılarak tekrarlayın. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+hormone+physiology:+reproductive+findings+from+estrogen+receptor+mutant+mice.">Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice.</a> Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).</li><li>Madak-Erdogan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+of+gene+and+metabolic+regulation+by+estrogen+receptors+alpha+and+beta,+and+their+coregulators.">Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators.</a> Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).</li><li>Gong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+identifies+gene+networks+regulated+by+estrogen+receptor+alpha+(ERalpha)+and+ERbeta+that+control+distinct+effects+of+different+botanical+estrogens.">Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens.</a> Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).</li><li>Bergamaschi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forkhead+transcription+factor+FOXM1+promotes+endocrine+resistance+and+invasiveness+in+estrogen+receptor-positive+breast+cancer+by+expansion+of+stem-like+cancer+cells.">The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).</li><li>Madak-Erdogan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+extranuclear+pathway+inputs+in+the+regulation+of+global+gene+expression+by+estrogen+receptors.">Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors.</a> Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).</li><li>Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+collaboration+of+estrogen+receptor+alpha+and+extracellular+signal-regulated+kinase+2+in+regulating+gene+and+proliferation+programs.">Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs.</a> Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).</li><li>Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+roles+for+ERK5+and+cofilin+as+critical+mediators+linking+ERalpha-driven+transcription,+actin+reorganization,+and+invasiveness+in+breast+cancer.">Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer.</a> Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quant-iT&#8482; PicoGreen &#174; dsDNA Reagent and Kits. , (2008).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quant-iT&#8482; Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , (2006).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).</li><li>Langdon, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+genetic+programming+optimised+Bowtie2+on+genome+comparison+and+analytic+testing+(GCAT)+benchmarks.">Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks.</a> BioData Min. 8, (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metscape:+a+Cytoscape+plug-in+for+visualizing+and+interpreting+metabolomic+data+in+the+context+of+human+metabolic+networks.">Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks.</a> Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).</li><li>Mokry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+double+fragmentation+ChIP-seq+provides+nucleotide+resolution+protein-DNA+binding+profiles.">Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles.</a> PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Hah, N., Kraus, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-regulated+transcriptomes:+lessons+learned+from+estrogen+signaling+pathways+in+breast+cancer+cells.">Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells.</a> Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).</li></ol>

Illinois Üniversitesi Pfizer Inc. ZME bir Araştırmacı başlatılan hibe aldı ve YCZ bu hibe maaş destek aldı.

Bu yazıda, E2 ile tedavi edilir MCF-7 hücrelerinden üretimini ve RNA-Sek, ChIP-Sek ve metabolomikler verilerinin bütünleştirici analizini nitelendirdi. Biz biyolojik ilgili keşif üretmek en etkin yöntem ve kullanıcı dostu yumuşak mallar kullanmak için strateji protokoller bir dizi geliştirdi. Bildiğimiz kadarıyla, bizim üç farklı analiz ve ÖRa doğrudan meme kanseri hücrelerinde düzenlenmiş belirlenen yeni metabolik yollar dan -omics verileri entegre etmek ilk çalışmadır. transkriptomik Başarılı transkriptomik analizi için, yüksek kaliteli RNA&#39;lar ile başlamak için kritik öneme sahiptir. İyi uygulama, RNaz ücretsiz tezgah oluşturarak sık sık eldiven değiştirilmesi, ° C -80 depolama ve kullanımda buz üzerinde tutarak dahil RNA bozulması olasılığını ortadan kaldırmak olacaktır. -20 ºC gecede inkübasyon eklenmesi RNA kurtarma geliştirir. defalarca donma ve çözülme RNA önlemek için, bir aşağı prosedüründe için RNA&#39;lar ayırabilirsinizizolasyon ve saflaştırma sırasında es. dizi hatalarının varlığı için, örneklerden cDNA kullanılarak QRT-PCR genellikle RNA Sek tanımlanan farklı şekilde eksprese edilmiş genlerin doğrulamak için gerçekleştirilir. Bu nedenle, yeterli RNA bu amaç için ayrılmış olmalıdır. Biz splice varyantları, kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar ve miRNA&#39;lar analiz etmemizi sağlar paired-end-sıralama yapar. yüksek sıralama maliyetlerinden kaçınmak için, tek-uçlu sıralama da yapılabilir. mikrodizileri karşılaştırıldığında, RNA Seq daha hassas ve çip üzerinde temin problar ile sınırlı değildir. Bu kodlama dizileri üzerinde değil, aynı zamanda non-kodlayan genlerin ve diferansiyel eklenmiş transkript üzerinde sadece bilgi temin edilir. Şu anda, fare deneylerinde elde edilen ligand tedaviler gibi dokularda sonra çeşitli hücre çizgilerinin transcriptomes analiz etmek için bu tekniği kullanmaktadır. Cistromics Ultra yüksek verimli sekanslama yöntemi kütüphane yapımı için en az 5 ng yonga DNA gerektirir. Standart ChIP-Seq protokol 18, en az 10 ng olması tavsiye edilir. fluorometri ile miktar tayini çok önemlidir. Bu protokolde, DNA konsantrasyonu belirlemek için çift iplikli DNA tespiti deneyi kullanıldı. Bir de hassas DNA ölçümü için florimetre tahlil kullanabilirsiniz. Her laboratuar arzu DNA fragmanları boyutları üretir kendi sonikasyon protokolünü kurmak için ekipman ve malzeme farklılıkları, bu çok önemlidir. Aşırı makaslama büyük boyutlarda ChIP DNA verimli sıralama için problem oluştururken hedef DNA&#39;ların zenginleştirilmesi kaybına neden olabilir ChIP DNA. sıralama DNA göndermeden önce, qPCR bilinen bazı bölgelerin zenginleştirme doğrulamak için her zaman önemlidir. tekniği hala İmmüno için kullanılan antikor verimi ve özgüllük ile sınırlıdır. Güvenilir karşılaştırmalı analizlerde kullanılabilecek bağlama site bilgilerini elde etmek için, biz ENCODE ChIP-Seq standartları takip eden reaktifler doğrulamak, 19 ve kullanımı standartutarlı veri setleri ile bize dized protokolleri. sonrası transkripsiyon faktörü bağlanma sahası zenginleştirme analizi ile birleştiğinde, ChIP-Seq hala Kromatine transkripsiyon faktörlerinin doğrudan bağlanma belirlemek için en iyi yöntemlerden biridir. Şu anda diğer hücre hatları yanı sıra östrojen duyarlı fare dokularda kromatin için işe kinazlar, koregülatörleri ve diğer transkripsiyon faktörlerini incelemek için bu protokolü kullanıyor. metabolomik insan göğüs kanseri hücrelerinin başarılı bir metabolik profil için, dikkatli bir numune hazırlama kritik önem taşır. Bu protokolde kullanılmak üzere, hücre kültürü durumda hücre miktarı, MCF7 hücreleri için en uygunudur. Diğer hücre çizgileri metabolitlerin önemli sayıda saptanması için daha fazla veya daha az hücre gerektirebilir. Her deneyde 100 metabolitleri etrafında edinin. Bu yöntem, düşük konsantrasyonlarda mevcut olduğu kısa ömürlü metabolitleri ve metabolitlerin tespiti için sınırlıdır. Bu yöntem usi kolaylığı sunuyorTek bir örnek hazırlık ng birden metabolitleri tespit etmek bakabilirsiniz. Şu anda serum ve fare çeşitli dokularda östrojen düzenlenmiş metabolitleri tanımlamak için bu tekniği kullanıyor. veri Entegrasyonu Çok sayıda transkriptomiks ve cistromics çalışmaları MCF7 hücrelerinde 2,5-7,20 de dahil olmak üzere meme kanseri hücrelerindeki östrojen sinyal ve gen düzenlenişinde araştırmak için gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, ilk kez, biz metabolomik verileri eklendi ve doğrudan ligand eklenmesi üzerine ÖRa tarafından düzenlenir metabolik ağları anlaması için çalıştı. Bu yeni yaklaşım, hücresel metabolizmayı etkileyen östrojenler tarafından düzenlenen nokta moleküler devreler pin etmemizi sağladı. Genel olarak, bizim bulgularımız meme kanseri biyolojisinin ana düzenleyicisi olarak ÖRa rolünü desteklemektedir. Özetle, Integr tedavi östrojen ve ardından RNA seq, göğüs kanseri hücreleri, yonga Dizi ve metabolomikler numunelerin üretilmesi için protokoller detaylı özet ResimBu -omics yaklaşımlardan elde edilen verilerin ative analizi. Bu protokoller, diğer transkripsiyon faktörleri, nükleer reseptör ligandları ve besin koşulları için benzer bir analiz yapmak için araştırmacılar sağlayacaktır.

Östrojenler, üreme organı dokularında metabolik dokular, beyin ve kemik 1 de dahil olmak üzere, her iki kadın ve erkeklerde çok sayıda fizyolojik süreçte önemli regülatörleridir. bu dokularda yararlı etkilerine ek olarak, östrojenler meme ve yeniden üretici dokulara ortaya çıkan kanserlerin sürücü. Östrojenler esas hücre tipi özel etkilere neden Erler ile çalışmak. ChIP-Seq kullanarak RNA Seq ve genom ÖRa DNA bağlayıcı siteleri analizi kullanılarak ÖRa tarafından düzenlenen transkript derin sıralama ÖRa bunlardan kaynaklanan farklı dokularda ve kanserlerde nasıl çalıştığını anlamak için yararlı olduğunu kanıtladı. Biz ve diğerleri gen ifadesi (ÖRP vs ÖRa) farklı reseptörler ile ilişkili profilleri 2,3, farklı ligandlar 3-5 ve farklı koregülatörleri 2,4,6,7 yayınladı. RNA Seq mikroarray ba göre daha yüksek hassasiyet ve verimlilik sunan transcriptome incelemek için ana yöntemsed gen ekspresyon analizi 8. Hücre hatları 2-4,7, doku veya tümör örneklerinden elde edilen RNA mevcut genomik meclisleri eşleştirilir, dizilir ve ayrı düzenlenmiş genler tanımlanmıştır. Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) bilinen düzenleme bağlanma sitelerinin bağlanma transkripsiyon faktörü ve coregulator kromatin incelemek için kullanılır. ChIP-Seq (yüksek verimlilik sıralaması takip ChIP) Küresel bağlama siteleri tarafsız algılanmasını sağlar. Metabolomik başka giderek kullanılan sistem biyolojisi yaklaşımı, nicel önlemler, kimyasallar ve genetik perturbations dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara canlı sistemlerin dinamik multiparametrik yanıttır. Genel metabolik profil gerçekleştirilerek etkin bir okuma hücre, doku, kan elde edilebilir. Buna ek olarak, transcriptome deneyler bilgi her zaman biyokimyasal yollar katkı enzim seviyesinde gerçek değişiklikleri yansıtmıyor. kombinetranskriptom ve metabolome verilerinin analizi, tespit ve gerçek metabolit değişikliklerle gen ifadesinde bir değişiklik ilişkili olanak sağlamaktadır. Bu büyük ölçekli veri setleri mekanistik ayrıntıları tüm bilgileri Harnessing kompleks biyolojik sistemler, insan gelişimi ve kanser ve diyabet gibi hastalıklara ilgilendirmeyen özellikle olanları düzenleyen transkripsiyon faktörlerinin rolünü anlamak için. memeli genomunun karmaşık doğası zorlu entegre ve tam transcriptome, cistrome ve metabolome deneylerden elde edilen verileri yorumlamak için yapar. bir zamanlar işlevsel bağlanma siteleri tanımlanır çünkü hedef genlerin ifadesi önemlidir değişikliklere yol açacak fonksiyonel bağlayıcı olayları belirlenmesi; transkripsiyon bağlanma (TF) motif analizi de dahil olmak üzere, analiz takip eden, yüksek hassasiyetle gerçekleştirilebilir. Bu biyolojik olarak anlamlı TF basamak ve mekanizmaların tanımlanmasına yol açar. Ayrıca doğrudan comparisHer bir deneyden alınan veriler terazi ve sesler farklı ve bazı durumlarda anlamlı sinyalleri popülasyon gürültü ile gizlenmiş olan RNA-Seq ve yonga-Seq deneylerin her zaman mümkün değildir. Biz meme kanseri ÖRa doğrudan metabolik düzenleme anlamak için bu üç bağımsız ancak ilgili yaklaşımlardan bilgi entegre herhangi çalışmanın farkında değildir. Bu nedenle, bu yazıda bizim genel amacı gen ifadesi ve metabolit değişikliklere üretken bağlayıcı olayları ilişkilendirmek olduğunu. Bu hedefe ulaşmak için, biz RNA Sek, ChIP-Seq ve metabolomikler deneylerden elde edilen verilerin entegre ve metabolik yollar gen ifadesi değişikliklere yol açacak olayları bağlama ÖRa kaynaklı olanlar östrojen belirledi. İlk kez, biz meme metabolizmasını düzenleyen yeni gen devreleri ortaya çıkarmak için ChIP-Seq, RNA Seq ve metabolomik profil üreten ve veri bütünleştirici analizini gerçekleştirmek için protokoller (Şekil 1) komple bir set sağlamakkanser hücre çizgileri.

<table><tbody><tr><td>Triglyceride Mix</td><td>Sigma</td><td>17810-1AMP-S</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O1257-10MG</td><td>Oleic Acid-Water Soluble powder&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>10006D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>10007D</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td>DNA isolation of input sample&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ZYMO ChIP-DNA Isolation kit&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research&amp;nbsp;</td><td>D5205</td><td>ChIP DNA Clean &amp;amp; Concentrator</td></tr><tr><td>Quant-iT&amp;ordf; PicoGreen&amp;uml; dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>P7589</td><td>DNA Quantitation</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>RNA purification</td></tr><tr><td>DEPC Treated Water&amp;nbsp;</td><td>LIFE TECH</td><td>462224</td><td>Dnase/Rnase Free</td></tr><tr><td>Model 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>FB120110</td><td>With 1/8 probe&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Fisher Scientific Sound Enclosure</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>FB-432-A</td><td>For sound reduction</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Eppendorf Tubes 5.0 ml</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>0030 119.401</td><td>200 tubes (2 bags of 100 ea.)</td></tr><tr><td>Random Primer Mix&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>DNTP MIX</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td><td>NEB</td><td>M0253S</td><td></td></tr><tr><td>FastStart SYBR Green Master</td><td>ROCHE</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP160100</td><td>1.5% agarose gel&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>Q32852</td><td>RNA quantification (100 assays)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor tablets&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>4693116001</td><td>Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer</td></tr><tr><td>PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>4906845001</td><td>Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer</td></tr><tr><td>Qubit Assay Kits</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>Q32850</td><td>For 100 assays</td></tr><tr><td>Automated cell counter</td><td>ORFLO</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>tube Rotator&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5 Multilple plate reader&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Diagenode</td><td>B04000001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fast Real-time PCR system</td><td>Applied Science&amp;nbsp;</td><td>4351405</td><td></td></tr></tbody></table>

systems biology of metabolic regulation by estrogen receptor signaling in breast cancer

-omics gelişine kanser ve metabolik sendrom gibi kronik hastalıkların anlayışımız geliştirdi yaklaşır. Ancak, gen ifade mikroarrayler, derin sıralama deneyleri veya metabolik profil elde edilen büyük ölçekli veri kümelerinde bilginin etkin madencilik ortaya çıkarmak önemlidir ve daha sonra etkili bir şekilde hastalıklı hücre fenotipleri kritik düzenleyiciler hedef. Östrojen Reseptör α (ÖRa) östrojen duyarlı meme kanseri için önemli olan gen programları düzenleyen ana transkripsiyon faktörlerinin biri. ÖRa meme kanseri metabolizmasında sinyalleme rolünü anlamak için, biz estradiol ile tedavi edilmiş MCF-7 hücrelerinden, transkriptomik cistromic ve metabolomic verilerini kullanarak. Bu yazıda RNA Sek, ChIP-Sek ve metabolomikler deneyleri ve elde edilen verilerin bütünleştirici hesaplama analizi için numune nesil nitelendirdi. Bu yaklaşım, yeni köstebek ortaya koymaya yararlıdırnormal veya hastalıklı hücrelerin etkileri metabolizması, belirli bir transkripsiyon faktörü ile düzenlenmiştir vasküler mekanizmaları ve gen düzenleyici devre.

transkriptomik E2 tedavisi ile farklı ifade genleri analiz etmek, biz bir RNA-Seq deney gerçekleştirmek için seçti. mRNA seviyeleri ile ilgili bilgilerin yanı sıra, RNA-Seq veriler, kodlayıcı olmayan RNA (uzun kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar, mikroRNAlar) ve alternatif bağlayıcı olayları değişiklikleri izlemek için de kullanılabilir. Çalışmamızın kapsamı metabolik düzenlenmesi için önemli olan protein kodlama genleri tanımlamak için olduğundan biz, RNA kodlama olmayan veya alternatif transkripsiyonu genlerin analizi hakkında bilgi vermedi. Ancak, RNA Seq diferansiyel gen ifadesi olaylar hakkında bilgi edinme mükemmel bir yoldur. Yüksek kaliteli okuma elde etmek için, yüksek saflıkta RNA almak önemlidir. RNA izole sonra biz bir RNA temizlemek kiti kullanılarak RNA saflaştırılmış. Ne yazık ki RNA yaklaşık% 50 bu işlem sırasında kaybolur ve RNA başlangıç ​​miktarı, c alınmalıdıronsideration saflaştırma adımının sonunda gereken miktar (100-500 ng) elde edilmiştir. Çok hassas ve düşük yoğunluklu RNA ölçümü için tercih edilen bir yöntemdir florimetre RNA HS deneyi kullanılarak RNA kazançları, ölçülebilir. Daha sonra, RNA numunelerinin bütünlüğünü ve genel kalite RNA çok az bir miktarı kullanılarak jel elektroforezi için uygun bir alternatif bioanlayzer kullanılarak incelenmiştir. Analiz tüm Numuneler (Şekil 2B) bütünlüğünü ve saflığını gösteren 18S ve 28S rRNA keskin ve temiz bantları gösterir. RNA bütünlüğü numarası (RIN) RNA kalite kontrol, bir standart olarak kullanılmıştır. RIN 10 bozulmamış RNA gösterir RIN 6 kısmen bozulmuş ve RIN3 kuvvetle 16 bozulmuş. RIN dizi deney için en az 7 olduğu önerilir. Bizim RNA örneklerinin tamamı 9.6-9.9 arasında RIN değer aldığımız &lt;strong&gt; (Şekil 2A). Ardışık kütüphaneleri örneğin alt için hazır her bir örnek (Tablo 1), elde edilmiştir okuma ortalama 18.000.000 yüksek kaliteli dizilimi üzerinde Illumina 2500 ultra yüksek verim sıralama sistemi kullanılarak her numune yüksek kaliteli RNA 500ng inşa edildi analiz. yüksek verimli dizisi ham verilerin genel kalitesini kontrol etmek için, FastQC her numune en okur için çalıştırıldı. Bir araç RNA Seq verileri için Örnek FastQC rapor (Şekil 3) gösterilmiştir. En okur dizi uzunluğu yaklaşık 100 bp (Şekil 3A) idi. Her okuma, kalite puanı, ilk 5 bp için 32-34 ve 6-100bp (Şekil 3B) 36-38 oldu. 17990863 Bu örnekten üretilen okur arasında, çoğu kalite daha yüksek 34 (Şekil 3C) puanı vardı. sırayla okuma başına GC içeriği de% 48 GC ortalama ile normal dağılıma izledi. Genel kaliteokur puan çok yüksek oldu. ÖRa bağlanma sitelerinin Cistromic analizi istenen boyutta DNA parçalarını elde etmek, etkin derin sıralama elde etmek için önemli faktörlerden biridir. Geçerli sıralama yaklaşımlar, örneğin, ultra-yüksek verim sıralama sistemi için 300-600 bp, katı AB / 17 için 100-200 bp DNA parçalarının farklı gereksinimleri olabilir. Bu deneyde, DNA fragmanlarının en fazla 300 baz çiftlik ve 600 bp jeli üzerinde gösterildiği gibi (Şekil 4) arasında değişmektedir. Alternatif olarak, okuyucuların ancak biz bizim kurulan protokol yüksek kalite ile gerekli örnekleri sağlar ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar hissediyorum, MNase sindirim kullanarak kromatin hazırlamak için tercih olabilir. Her bir tedavi DNA ve karşılık gelen giriş numunenin on ng EB tamponu içinde hazırlanmıştır. Yonga DNA, ultra-yüksek verimli sekanslama sistemi kullanılarak dizilenmiştir tek okundu. Yonga DNA Numuneler vermiştirGiriş DNA 35.000,000 (Tablo 1) okur fazla tespit edilirken 20.000.000 okur. metabolomik GCMS kullanılarak memeli hücrelerinde metabolitleri ölçmek için, hücre kütlesinin en az 10 ug gerekmektedir. Biz deneylerle 400.000 MCF7 hücreleri ile başladı. Hasat zamanında, her bir plaka yaklaşık 500,000 hücre vardı. Zirveleri tarafından temsil metabolitlerin genel kontrol ve östradiol tedavi örnek (Şekil 5) arasında karşılaştırıldı. memelilerde bilinen toplam% 60 saymak belirlenmiştir yaklaşık 100 metabolitleri. Burada E2 tedavisi (Tablo 2) önemli değişiklikler gösteren ilk 10 metabolitleri, bir listesini sunuyoruz. Genel olarak, E2 fruktoz ve mannoz metabolizması, histidin metabolizması, pürin metabolizmasının, kolesterol biyosentezi ve B3 vitamini metabolizması dahil yollar regüle. downregüle yollar vardı butanoat metabolism, de novo yağlı asit biyosentezi, pentoz fosfat yolu, üre döngüsü ve arginin metabolizması (Tablo 3). Veri analizi ve entegrasyon RNA Sek, ChIP-Sek ve GC-MS verileri, RNA Sek ve ChIP-Sek tanımlanan genler arasında karşılaştırma sonra. Adımlar (Şekil 6) bir dizi işlenmiş ve analiz edilmiştir up-regüle bir dizi ve Estradiol aşağı-düzenlenen genlerin bir set ekstre edildi. Metabolik verilere göre, biz Estradiol tedavisi ile yukarı ve aşağı düzenlenmiş bileşiklerin iki takım aldı. Sonraki biz görselleştirmek ve insan metabolizmasının 15 kapsamında gen ifadesini ve metabolik verileri yorumlama, Metscape, Cytoscape için bir uygulama kullanılır. İlk olarak ağda bileşiğin elemanları, reaksiyon, enzim ve gen dahil etmeyi tercih ettik. Biz bileşikleri / sorgu gibi genleri ve iki E2 up-regülasyonu (Şekil 7A) ağları ve aşağı seçilmişZiraî (Şekil 7B) gösterildi. Metscape da seçici yollar üzerinde ağları kurmak için bir seçenek sunar. Örneğin, aşağı-regüle genel ağ yapı olarak aynı veri seti kullanarak, androjen östrojen biyosentezi ve metabolizma yolunun bir alt ağ belirli yoluna bileşik / genden sorgu geçerek üretilmiştir. önemli değişiklikler ile genler ya da bileşiklerin parlak renkli vurgulanmıştır. açıklandığı gibi açılan pencereden belirli bir yolu seçmenin yanı sıra, bir de seçilen alana &quot;altağı oluşturmak&quot; işlevini uygulayarak bir alt ağ oluşturabilirsiniz. Şekil 6A ve B, ÖRa aktivasyonu ve gen düzenleyici bölümlerin bağlanmada direkt olarak gösterildiği gibi, meme kanseri hücreleri içinde birçok metabolik etki etmektedir. Bizim bütünleştirici analizi, ÖRa doğrudan (F bağlanır ve de novo yağlı asit biyosentez yolunun önemlidir FASN geninin ekspresyonunu düzenleyen olduğunu göstermiştirŞEKIL 7C). Buna ek olarak E2 tedavisi bu yollarda CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, TPO, GSTA4 ve GSTM2 ifadesini bastırmak yoluyla androjen-östrojen biyosentez yolları downregüle. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig1.jpg" /> Şekil 1: RNA seq, yonga-Sek ve metabolomic analizi için RNA, DNA numuneleri ve hücre lizatları hazırlanması iş akışı. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig2.jpg" /> Şekil 2:. Agilent 2100 Bioanalyzer RNA Bütünlük sayısı (RIN), RNA kalitesi göstergesi ile analiz RNA&#39;ların bir temsilci Elektroferogram, 9.9 olarak analiz tarafından verildi. RNA sanal jel resimde (A) 26S ve 18S hem bantlar keskindir örnek. (B) t bireysel iz Floresan sinyalleriO RNA 28S doruk şiddeti daha büyük 18S zirve olduğunu gösterir ve herhangi bir kontaminasyon görülmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53832/53832fig3.jpg" /> Şekil 3:. RNA Sıra ham verilere bir temsilci kalite kontrolü, araç numunenin dizi verilerinin biri FastQC kullanılarak analiz edildi. (A) 100 bp kütüphanenin dizi uzunluğu dağılımı. (B) okuma pozisyon boyunca kalite puanı. (C) dizisi başına kalite puanı tüm dizilerin evrensel kaliteli gösterdi. (D) teorik dağılımı eşleşti okuma başına GC içeriği. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig3large.jpg" target="_blank">La görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın rger sürümü. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53832/53832fig4.jpg" /> Şekil 4: sonike kromatin parçalarının jel elektroforezi her bir örnek hücre lizatının 5 ul birinci şeritli 1000 bp artı merdiven ile% 1.5 agaroz jeli üzerinde çalıştırıldı.. Fragmanlarının çoğunluğu bp 300 ila 600. Olan <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53832/53832fig5.jpg" /> Şekil 5:. GC-MS metabolitleri temsil tepe genel üst panel kontrolünden alt panel E2 ile muamele edilmiş örneklerde tanımlanan piklerini göstermektedir. konutların edildi kapalı alan her p tarafından temsil kesin metaboliti göstermek için<html> eak. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53832/53832fig6.jpg" /> Şekil 6: Bütünleştirici kümeleme yöntemi Akış Şeması. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/53832/53832fig7.jpg" /> Şekil 7: Metscape entegre gen-metabolit veri görselleştirme (A) E2 tarafından düzenlenen yukarı yollarının ağ.. (B) E2 aşağı-regüle yolların ağı. (C) E2 alt ağ fonksiyonun uygulanması yoluyla üretilmesi de novo yağlı asit biyosentez ağda düzenlenmiş olduğu bulunmuştur FASN yakın bölgesi için ÖRa işe uyarmıştır.3832fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/53832/53832table1.jpg" /> Tablo 1: RNA Sek ve ChIP-Sek ultra-yüksek verimlilik sıralaması Özeti. <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/53832/53832table2.jpg" /> Tablo 2: E2 tedavi ile önemli değişiklikler ile ilk 10 metabolitleri listesi. <img alt="Tablo 3" src="/files/ftp_upload/53832/53832table3.jpg" /> Tablo 3: Mesleki yukarı ve aşağı regüle E2 tedavisi ile.

Watch this Scientific Journal Video about Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer at JoVE.com

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

Meme Kanserinde Östrojen Reseptör Sinyali tarafından Metabolik Yönetmelik Sistem Biyolojisi

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

systems-biology-metabolic-regulation-estrogen-receptor-signaling

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.3K Görüntüleme.  University of Illinois, Urbana-Champaign. Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol. 

Video: Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning display increased atherosclerotic lesions in the aorta compared with female mice with intact ovarian function. However, laboratory models involving estrogen-deficient mice with atherosclerosis-prone status are lacking. This deficit is crucial because clinical estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of pre-existing or ongoing lipid disruption and atherosclerosis. In this study, we establish an in vivo estrogen-deficient mouse model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apolipoprotein E (apoE)-/- mice. We then compare the effects of 17&#946;-estradiol and pseudoprotodioscin (PPD) (a phytoestrogen) perorally administered via hazelnut spread. We find that although PPD exerts some effect on reducing final body weight and plasma TG in OVX apoE-/- mice, it has anti-atherosclerotic and cardiac-protective capacities comparable with its 17&#946;-estradiol counterpart. PPD is a phytoestrogen that has been reported to exert anti-tumor properties. Thus, the proposed method is applicable for screening phytoestrogens via peroral administration to substitute for traditional hormone replacement therapy in postmenopausal women, which has been reported to have potentially deleterious tumorigenetic capacity. Peroral administration via hazelnut spread is noninvasive, rendering it widely applicable to many patients. This article contains step-by-step demonstrations of bilateral ovariectomy via the double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice and peroral 17&#946;-estradiol or phytoestrogen hormone replacement via hazelnut spread. Plasma lipid and cardiovascular function analyses using echocardiography follow.

Clinically, estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of lipid disruption and atherosclerosis. We established an in vivo estrogen deficiency model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice. The mouse model is applicable for screening exogenous estrogen treatments of cardiovascular dysfunction after menopause.

Menopoz Sonrası Kardiyovasküler Disfonksiyon Exogenous Östrojen Tedaviler Tarama için Bir In Vivo Östrojen Eksikliği Fare Modeli

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Biyokimya

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

Mikrofizyolojik Sistem Kullanarak İnsan Meme Dokusunda Meme Kanseri Modellemesi

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Kanser Araştırmaları

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in the vertebrates that consume them, such as endocrine function. Phytoestrogens, the most well studied endocrine-active phytochemicals, directly interact with the hypothalamo-pituitary gonadal axis of the vertebrate endocrine system. Here we present the novel use of a cell-based assay to screen plant extracts for the presence of compounds that have estrogenic biological activity. This assay uses mammalian cells engineered to highly express estrogen receptor beta (ER&#946;) and that have been transfected with a luciferase gene. Exposure to compounds with estrogenic activity results in the cells producing light. This assay is a reliable and simple way to test for biological estrogenic activity. It has several improvements over transient transfection assays, most notably, ease of use, the stability of the cells, and the sensitivity of the assay.

We have optimized a commercially available estrogen receptor &#946; reporter assay for screening human and nonhuman primate foods for estrogenic activity. We validated this assay by showing that the known estrogenic human food soy registers high, while other foods show no activity.

Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Tıp

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Bir Modifiye<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Deneyi Hormonlar, Açan Kanser Hücre Invasion Sitokinlerin ve / veya Büyüme Faktörleri Potansiyel Rolü belirlemek için

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model İnsan Meme Hormon Eylem Eğitim için

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Using 16&#945;-[18F]-Fluoro-17&#946;-Estradiol PET to Visualize Estrogen Receptor &#945; Expression in Human Breast Cancer Xenografts in Female Ovariectomized Mice

To demonstrate how estrogen receptor alpha (ER&#945;) positive breast cancer xenografts may be visualized in BALB/c nude mice using 16&#945;-[18F]-fluoro-17&#946;-estradiol (18F-FES) positron emission tomography (PET), ovariectomized BALB/c nude mice were injected with ER&#945;-positive breast cancer cells (MCF-7, 3 &#215; 106 cells; shoulder [n = 10] or 4th inguinal mammary fat pad [n = 10]) or ER&#945;-negative breast cancer cells (MDA-MB-231, 1 &#215; 106 cells; mammary fat pad [n = 5]). Mice harboring MCF-7 cells received subcutaneous injections of 20 &#181;g of 17&#946;-estradiol (20 &#181;g/20 &#181;L; corn oil:ethanol, 9:1) in the nape of their necks 2 days prior to cell injection, followed by daily injections five times per week for 5 weeks. Tumor volumes were measured according to the formula: (L*W2)/2 (L; length, W; width). Once tumor volumes reached approximately 100 mm3, 17&#946;-estradiol injections were halted 2 days prior to mice receiving 18F-FES for PET imaging to avoid competitive binding with ER&#945;. Upon 18F-FES administration via the lateral tail vein, PET/MRI was performed for 15 min at 1 h to 1.5 h post-injection. 18F-FES uptake was not observed in ER&#945;-negative, MDA-MB-231 tumor-bearing mice. 18F-FES uptake was most pronounced in mice harboring MCF-7 tumors in the shoulder. In MCF-7 tumors grown in the inguinal mammary fat pad, 18F-FES uptake was less visible, as the intestinal excretion pattern of 18F-FES obscured the radioactivity detectable in these tumors. To use 18F-FES PET as a tool to visualize ER&#945; expression in ER&#945;-positive breast xenografts, we demonstrate that the visibility of 18F-FES uptake is clear in tumors located away from the abdominal region of mice, such as in the shoulder.

Here, we demonstrate a protocol to use 16&#945;-[18F]-fluoro-17&#946;-estradiol (18F-FES) positron emission tomography (PET) as a tool to visualize ER&#945; expression in ER&#945;-positive breast xenografts.

Dişi Yumurtalıklı Farelerde İnsan Meme Kanseri Ksenogreftlerinde Östrojen Reseptörü α Ekspresyonunu Görselleştirmek için 16α-[18F]-Floro-17β-Estradiol PET Kullanımı

To demonstrate how estrogen receptor alpha (ER&#945;) positive breast cancer xenografts may be visualized in BALB/c nude mice using ...

Salidrosid'in MCF-7 Hücre Göçünü ve Proliferasyonunu Baskılama Mekanizması

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer mechanisms have been only incompletely elucidated. Hence, this protocol intended to decode the potential of Sal in regulating the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway in the malignant proliferation of human breast cancer MCF-7 cells. First, the pharmacological activity of Sal against MCF-7 was evaluated by CCK-8 and cell scratch assays. Moreover, the resistance of MCF-7 cells was measured by migration and Matrigel invasion assays. For cell apoptosis and cycle assays, MCF-7 cells were processed in steps with annexin V-FITC/PI and cell cycle-staining detection kits for flow cytometry analyses, respectively. The levels of reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ were examined by DCFH-DA and Fluo-4 AM immunofluorescence staining. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were determined using the corresponding commercial kits. The protein and gene expression levels in apoptosis and the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway were further determined using western blot and qRT-PCR analyses, respectively. We found that Sal treatment significantly restricted the proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells with dose-dependent effects. Meanwhile, Sal administration also dramatically forced MCF-7 cells to undergo apoptosis and cell cycle arrest. The immunofluorescence tests showed that Sal observably stimulated ROS and Ca2+ production in MCF-7 cells. Further data confirmed that Sal promoted the expression levels of pro-apoptotic proteins, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, and their corresponding genes. Consistently, Sal intervention prominently reduced the expression of the Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1&#945;, and FoxO1 proteins and their corresponding genes. In conclusion, Sal can be used as a potential herb-derived compound for treating breast cancer, as it may reduce the malignant proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells by inhibiting the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway.

Yazar Spotlight: Meme Kanseri Tedavisinde Salidrosid'in Moleküler Mekanizmalarını Keşfetmek 

The present protocol describesa comprehensive strategy for evaluating the pharmacological action and mechanism of salidroside in inhibiting MCF-7 cell proliferation and migration.

MCF-7 Hücre Proliferasyonunu ve Migrasyonunu İnhibe Etmede Salidrosidin Farmakolojik Etkisinin ve Moleküler Mekanizmasının Araştırılması

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

Meme Kanserinde Östrojen Reseptör Sinyali tarafından Metabolik Yönetmelik Sistem Biyolojisi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Menopoz Sonrası Kardiyovasküler Disfonksiyon Exogenous Östrojen Tedaviler Tarama için Bir In Vivo Östrojen Eksikliği Fare Modeli

Mikrofizyolojik Sistem Kullanarak İnsan Meme Dokusunda Meme Kanseri Modellemesi

Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

Bir Modifiye

Bir

Dişi Yumurtalıklı Farelerde İnsan Meme Kanseri Ksenogreftlerinde Östrojen Reseptörü α Ekspresyonunu Görselleştirmek için 16α-[18F]-Floro-17β-Estradiol PET Kullanımı

MCF-7 Hücre Proliferasyonunu ve Migrasyonunu İnhibe Etmede Salidrosidin Farmakolojik Etkisinin ve Moleküler Mekanizmasının Araştırılması

MCF-7 Hücre Proliferasyonunu ve Migrasyonunu İnhibe Etmede Salidrosidin Farmakolojik Etkisinin ve Moleküler Mekanizmasının Araştırılması

MCF-7 Hücre Proliferasyonunu ve Migrasyonunu İnhibe Etmede Salidrosidin Farmakolojik Etkisinin ve Moleküler Mekanizmasının Araştırılması