Name: systems biology of metabolic regulation by estrogen receptor signaling in breast cancer
Uploaded: 2016-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, concessão ILLU-698-909 (ZME) e Pfizer, Inc (ZME). O seu conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Departamento de Agricultura dos EUA.

1. Preparação de amostras de RNA-Seq <ol><li> Cultura Celular e Tratamento <ol><li> Cultura das células MCF-7 em MEM melhorado (IMEM) mais meio de vermelho de fenol com calor a 10% de FBS inactivo, 1% de penicilina / estreptomicina a 37 ° C em humidificada com 5% de CO2. Nota: A mesma linha de células e condições de cultura de células é utilizado ao longo do estudo. </li><li> Semente de 100.000 células MCF7 por poço em placas de 6 poços. Tem triplicado para cada tratamento. No dia três, remover o meio e adicionar 2 ml de meio fresco com ou sem 10 -8 M E2 a cada poço. Incubar as placas durante 24 h em 37 ° C em humidificada com 5% de CO2. </li><li> Para colher as células, adicionar 1 ml de reagente de isolamento de ARN (ácido tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio) para cada poço e incubar durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Em seguida, recolher o reagente ligado celular por pipetagem e depósito em tubos de 1,5 ml </li></ol></li><li> Isolamento RNA <ol><li> Adicionar 200 ul chloroform para 1 ml de reagente de lisado celular (1.1.3) e agitar com vortex durante 10 seg. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Após a centrifugação, transferir a fase aquosa (superior) para um novo tubo, sem perturbar as outras fases. </li><li> Adicionar 500 ul de isopropanol a 100% para um novo tubo com a fase aquosa transferida-, e misturar por inversão. Incubar a -20 ° C durante a noite. Centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Observar um sedimento no fundo do tubo. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com 750 ul de ARNase isento de 70% de etanol por breve vórtice. </li><li> Centrifugar as amostras a 6000 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante, e centrifuga-se a amostra a 16000 x g durante 1 min a 4 ° C para recolher todo o etanol remanescente. Remover o etanol remanescente por pipetagem com uma ponta de gel de carregamento e definir os tubos up-side para baixo para secarem naturalmente durante 10 min. Dissolver o sedimento em 20-50 DEPC água tratada ul depenDing do tamanho dos peletes. </li></ol></li><li> Purificar o RNA usando RNA kit de limpeza seguindo o protocolo 4. Medir a concentração de ARN utilizando um kit de ensaio de fluorometria com base na sequência do protocolo 9. NOTA: DO a 260 nm é feita para determinar a concentração de ARN e proporção de DO a 260 nm e 280 nm são utilizadas para determinar a pureza da amostra. Recomenda-se a verificação da qualidade RNA utilizando o ensaio Bio-analisador. </li><li> Tomar cerca de 0,5 a 1 ug de ARN purificados para sequenciação. NOTA: Centro de Biotecnologia prepara as bibliotecas de sequenciamento e executa emparelhado-end ler sequenciamento usando métodos detalhados anteriormente 2. </li></ol> 2. Preparação da amostra ChIP-Seq <ol><li> Cultura Celular e Tratamento <ol><li> Semente 500.000 células MCF-7 por placa de 10 cm em meio de crescimento. NOTA: Para cada puxar para baixo foram utilizados 16 placas. No dia 3, remover o meio e adicionar 5 ml de meio fresco com ou sem 10 -8 M E2 a cadaprato. Tratar as células durante 45 min (37 ° C em atmosfera humidificada de 5% CO 2). </li></ol></li><li> Crosslink e celular Colheita <ol><li> Adicionar 250 ul de formaldeído a 37% em 5 mL de meio para reticular cromatina, incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Pare de reticulação por lavar as células com 5 ml de gelo frio 1x MEM. </li><li> Colher as células em 250 ul de tampão de lise celular (EDTA 10 mM, Tri HCl a 50, 1% de SDS, N, óxido de 0,5% de N-dimethyldodecan-1-amina) por placa. </li></ol></li><li> A fragmentação da cromatina <ol><li> Sonicar as células durante 30 seg x 8 pelo amplificador de 30 a atingir tamanhos de cromatina necessários. Arrefecer cada amostra em gelo após uma sonicação de 30 segundos. </li><li> Centrifugar a 16, 000 xg durante 10 min a 4 ° C, e cuidadosamente pipeta o sobrenadante sem perturbar o sedimento no fundo. </li><li> Tomar uma alíquota de 5 ul do sobrenadante e verificar o tamanho do DNA por electroforese através de 1,5% em gel de agarose como descrito anteriormente 10. O tamanho idealde ADN deverá estar entre 200-500 pb. </li></ol></li><li> imunoprecipitação da cromatina <ol><li> Economize 25 ul de lisado celular como entrada. Num tubo de 50 mL, misturar 4 ml de lisado celular com 20 ml de tampão IP (EDTA a 2 mM, NaCl 100 mM, Tris-HCl a 20, e 0,5% de Triton X), Anticorpo ERa (F10 500 ul e 500 ul HC- 20), e proteína e prota ProtG 500 ul revestimento de esferas magnéticas. Incubar a mistura por rotação a 4 ° C durante a noite para permitir a formação do complexo anticorpo chromatin-. </li></ol></li><li> Lavagens e Reverso-reticulação <ol><li> Usar um suporte magnético para recolher as esferas magnéticas no lado magnetizadas para remover o tampão de lavagem. </li><li> Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão de lavagem I (2 mM de EDTA, 20 mM de Tris HCl, 01% de SDS, 1% de Triton X, e NaCl 150 mM). Para lavar bem as esferas magnéticas, sem perturbar os complexos DNA-proteína, adicionar 25 ml de tampão de lavagem lentamente ao tubo ao longo do lado, em seguida, inverter os tubos até que todas as esferas magnéticas são bem misturado with o tampão de lavagem sem parecer como um pellet. Como uma alternativa, usar o rotador para inverter o tubo. Não vortex das amostras. Lavam-se as esferas magnéticas, utilizando o mesmo método nos passos seguintes. </li><li> Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão II-lavagem (EDTA 2 mM, Tris HCl 20 mM, 01% de SDS, 1% de Triton X, e NaCl 500 mM). </li><li> Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão Wash-III (EDTA 1,6 mM, Tris HCl 10 mM, 1% de NP-40, 1% Dexycholate e 250 mM de LiCl). </li><li> Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão 1x TE (EDTA 1 mM e Tris HCl 10 mM) duas vezes. </li><li> Elui-se o ADN em 500 ul de tampão de eluição (SDS a 1%, e NaHCO 3 10 mM) e depois atribuir a eluição de 500 ul de ADN em 4 tubos. Para o ADN a partir de entradas, eluir o DNA em 125 ul de tampão de eluição. </li><li> Incubar os tubos a 65 ° C durante a noite num bloco de aquecimento. Cubra os tubos no bloco de aquecimento com folha de alumínio para manter o calor mesmo em todos os tubos. Coloque um peso sobre os tubos para mantê-los de abertura. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Isolamento de DNA <ol><li> Arrefecer os tubos à TA durante 5 min. Isolar o DNA dos puxar para baixo amostras utilizando o kit de isolamento de DNA Chip. Siga as instruções do fabricante. <ol><li> Aqueça o tampão de eluição a 65 ° C. Adicionar 625 ul de tampão de ligação a cada tubo. Se os precipitado, adicionar outro tampão de ligação 250 ul até que a solução é clara. </li><li> Carregar a amostra na coluna e centrifugar a 16000 xg durante 30 seg. Lavar a amostra com 250 mL de tampão de lavagem. Lembre-se de adicionar etanol para o tampão de lavagem quando a primeira hora de usá-lo. Repetir a lavagem. </li><li> Elui-se o ADN em 15 ul de tampão de eluição. Combine o DNA da mesma puxar para baixo a partir de 4 tubos para atingir cerca de 55 ADN ul. </li></ol></li><li> Isolar o DNA de entrada usando um Kit de Purificação de DNA. <ol><li> Aqueça o tampão de eluição a 65 ° C. Adicionar 625 ul de tampão de ligação em cada tubo e incubar durante 10 min. Carregar a amostra na coluna de 2 ml em collectino tubo. </li><li> Lava-se a amostra com 750 ul de tampão de lavagem, centrifugar a 16000 xg durante 1 min. Repetir a centrifugação para remover qualquer tampão restante. Elui-se o ADN em 30 ul de EB. </li></ol></li><li> Medir a concentração de DNA Usando um comercial Fluorocromo Ensaio com Modificação 11. <ol><li> Diluir o tampão 20x em TE 1X TE como o tampão de ensaio para diluir as amostras de ADN e reagentes. Aqui 5 ul de DNA isolada e diluir com 50 ul em TE 1X. </li><li> A partir de solução de estoque / ml de DNA de 2 ug fazer um padrão de ADN que vão desde branco para 1, 10, 100, 1000 ug / ml. Numa placa de 96 poços, alocar 25 ul de cada padrão, bem como diluição em duplicado de DNA. (Triplicate para o padrão é recomendado.) </li><li> Prepara-se o reagente de trabalho, fazendo uma diluição de 200 vezes de reagente de dsDNA em tampão 1x TE em tubos de plástico. Cubra a solução reagente de trabalho com papel alumínio para evitar a luz. Adicionar 200 mL de reagente de trabalho em cada amostra. DentroCubate à temperatura ambiente durante 5 min. Cubra o prato com papel alumínio para evitar a luz. </li><li> Medir a fluorescência das amostras utilizando um leitor de placas de fluorescência (excitação a 480 nm, emissão 520 nm). Gerar a curva padrão de ADN de fluorescência em função da concentração de ADN. Determinar as concentrações das amostras com base na curva padrão de ADN gerada. </li></ol></li></ol></li><li> Verificação da Experiência chip, utilizando qPCR <ol><li> Tome 2 ul isoladas DNA e diluído em 20 mL de água. Configurar a reação qPCR em triplicado pela mistura de 2,5 diluição ul DNA, 5 jul Green I PCR master mix, 1 ul primer, e 1,5 mL de água livre de nuclease. </li><li> Executar o qPCR com o sistema rápido PCR em tempo real utilizando o seguinte programa: Passo 1: 95 ° C durante 60 seg, Passo 2: 95 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 60 seg, repita a etapa 2 39 vezes. </li></ol></li><li> Enviar amostra de DNA de 10 ng do centro Biotech para a sequenciação. NOTA: A Biotech centro prepara o DNA ChIP em bibliotecas de acordo com a instrução, e realiza sequenciamento single-lidos usando métodos detalhados anteriormente 2. </li></ol> 3. Metabolomics Ensaio Preparação de Amostras <ol><li> Cultura Celular e Tratamento <ol><li> Semente 400.000 células MCF-7 por placa de 10 cm em meio de crescimento. Para cada tratamento preparar três amostras. Use duas placas em cada amostra para receber células suficientes para a detecção. No dia três, remover o meio e adicionam-se 5 ml de meio fresco com ou sem 10 -8 M E2 às células. Tratar as células durante 24 h (37 ° C em atmosfera humidificada de 5% CO 2). </li></ol></li><li> Coleta de Amostras <ol><li> Adicionar 5 ml gelada 1x PBS para o prato, aspirar o PBS depois inclinando brevemente a placa várias vezes. Repita duas vezes, e remover tanto quanto possível PBS após a última lavagem. </li><li> Adicionar 750 ul de acetona pré-frio a cada placa e raspar as células. Combinam-se as células em acetona a partir de duas placas empara um tubo de 2 mL em gelo. </li><li> contagem de células para a normalização <ol><li> Para cada tratamento, usar duas placas extras para quantificação de células. Para de-anexar as células da placa, adicionar 2 ml de HE tampão (1x HBSS, HEPES 10 mM, 0,075% de NaHCO3, e EDTA 1 mM) em cada placa e incubar por 5 min. </li><li> Recolha e misturar bem as células por pipetagem de células no tampão de HE. Utilize total de solução de células ul 20 para contar o número de células usando um hemocitômetro. </li></ol></li></ol></li><li> Armazenar as amostras a -80 ° C antes de a enviar para o centro de Metabolómica para identificar e quantificar os metabolitos usando análise por espectrometria de massa por cromatograf ia gasosa (GC-MS). </li></ol> 4. Análise integrativa <ol><li> ARN-SEQ de Análise de Dados: <ol><li> Faça a verificação da qualidade dos arquivos FASTQ usando FastQC: Leia QC (http://galaxy.illinois.edu) <ol><li> Selecione FastQC: Leia sob a ferramenta de NGS: QC e manipulação. Faça o upload do arquivo de dados brutos de histor atualy. NOTA: Recomenda-se para dar um título para o arquivo de saída para lembrá-lo que o trabalho foi para uma vez que pode haver várias saídas. </li></ol></li><li> Executar e o arquivo de saída aparecerá sob a História. Repita o mesmo procedimento para cada arquivo sequência. adaptadores guarnição usando clip sob NGS: FASTX Toolkit. </li><li> Alinhar lê para hg19 usando Tophat2 com anotação da referência RefSeq genoma 12 (valores padrão). <ol><li> Selecione Tophat2 sob ferramenta de NGS: análise de RNA. Indique a biblioteca emparelhado tipo (single-end vs emparelhado-end). </li><li> Faça o upload do arquivo de entrada FASTQ da história atual. Selecione o genoma de referência. Escolha configurações padrão. Ou utilize a lista de parâmetros completa para modificar. </li><li> Executar e ele vai produzir dois arquivos de saída: uma é UCSC trilha leito de entroncamentos; outro é uma lista de alinhamentos de leitura em formato BAM. </li></ol></li><li> Fazer upload de arquivos BAM ao seqüenciamento ferramenta de análise de dados. Calcular os valores de expressão utilizando QuantFerramenta ification. </li><li> Identificar genes diferencialmente up-regulamentados usando Expression Analysis Tool usando os valores padrão e dobre mudança&gt; 2 e valor de p &lt;0,05. Da mesma forma, identificar os genes diferencialmente regulada para baixo usando Expression Analysis Tool usando os valores padrão e dobre mudança &lt;0,5 e valor de p &lt;0,05. </li></ol></li><li> ChIP-Seq Análise de Dados: <ol><li> Alinhar FASTQ Lê até o hg19 usando Bowtie2 13 (valores padrão) no Galaxy. <ol><li> Selecione Bowtie2 sob a ferramenta de NSC: Mapping. Verifique se a biblioteca é emparelhado-mate (single-end vs emparelhado-end). O upload do arquivo FASTQ da história atual. </li><li> Selecione o genoma de referência. Use os parâmetros predefinidos. Executar e que irá produzir arquivo de saída com a sequência mapeada lê como arquivo BAM. Repita o procedimento para cada arquivo sequência. </li></ol></li><li> Identificar picos usando MACS 14 um p-valor de corte de 6.0E-7 e FDR de 0,01, conforme descrito anteriormente 2. </li></ol&gt; </li><li> Metabolómica Análise de Dados: <ol><li> Converter nomes químicos dos metabolitos para KEGG_IDs. </li><li> Identificar metabolitos regulados diferencialmente comparando os níveis detectados em Veículo vs. E2 amostras tratadas (um de 2 vezes de corte foi utilizada neste estudo). </li></ol></li><li> Análise integrativa: <ol><li> Identificar genes que têm sítios de ligação ERa utilizando a ferramenta de análise de dados de sequenciamento. Traduzir Regiões a função de genes utilizando 20 kb como a distância de corte. </li><li> Identificar genes diferencialmente cima e para baixo-regulado de análise de dados RNA-Seq usando mudança vezes&gt; 2 e dobre mudança &lt;0,5, respectivamente, com o valor de p &lt;0,05 como cortadas. Compare com a lista de ERa local de ligação contendo genes utilizando comparação diagrama de Venn. </li><li> Use esta lista para identificar E2 vias metabólicas modulados usando Metscape 15 módulo de Cytoscape. <ol><li> Ao selecionar módulo Metscape a partir de aplicativos, escolha Construir rede e depois via-basopção ed. </li><li> Selecione o organismo (humano). Selecione o arquivo de dados de E2 lista composto regulamentada (KEGG ID), bem E2 lista gene-regulada. </li><li> Escolha Composto -Reaction -Enzyme-Gene como o tipo de rede. Escolha compostos / genes como a consulta. </li><li> Construir uma rede. Repita usando o E2 composto e genes regulados negativamente. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+hormone+physiology:+reproductive+findings+from+estrogen+receptor+mutant+mice.">Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice.</a> Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).</li><li>Madak-Erdogan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+of+gene+and+metabolic+regulation+by+estrogen+receptors+alpha+and+beta,+and+their+coregulators.">Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators.</a> Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).</li><li>Gong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+identifies+gene+networks+regulated+by+estrogen+receptor+alpha+(ERalpha)+and+ERbeta+that+control+distinct+effects+of+different+botanical+estrogens.">Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens.</a> Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).</li><li>Bergamaschi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forkhead+transcription+factor+FOXM1+promotes+endocrine+resistance+and+invasiveness+in+estrogen+receptor-positive+breast+cancer+by+expansion+of+stem-like+cancer+cells.">The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).</li><li>Madak-Erdogan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+extranuclear+pathway+inputs+in+the+regulation+of+global+gene+expression+by+estrogen+receptors.">Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors.</a> Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).</li><li>Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+collaboration+of+estrogen+receptor+alpha+and+extracellular+signal-regulated+kinase+2+in+regulating+gene+and+proliferation+programs.">Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs.</a> Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).</li><li>Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+roles+for+ERK5+and+cofilin+as+critical+mediators+linking+ERalpha-driven+transcription,+actin+reorganization,+and+invasiveness+in+breast+cancer.">Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer.</a> Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quant-iT&#8482; PicoGreen &#174; dsDNA Reagent and Kits. , (2008).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quant-iT&#8482; Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , (2006).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).</li><li>Langdon, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+genetic+programming+optimised+Bowtie2+on+genome+comparison+and+analytic+testing+(GCAT)+benchmarks.">Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks.</a> BioData Min. 8, (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metscape:+a+Cytoscape+plug-in+for+visualizing+and+interpreting+metabolomic+data+in+the+context+of+human+metabolic+networks.">Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks.</a> Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).</li><li>Mokry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+double+fragmentation+ChIP-seq+provides+nucleotide+resolution+protein-DNA+binding+profiles.">Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles.</a> PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Hah, N., Kraus, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-regulated+transcriptomes:+lessons+learned+from+estrogen+signaling+pathways+in+breast+cancer+cells.">Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells.</a> Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).</li></ol>

Universidade de Illinois recebeu uma subvenção de Investigator iniciada a partir de Pfizer Inc. ZME e YCZ recebeu apoio salarial a partir desta concessão.

Neste trabalho, nós descrevemos geração e análise integrativa da RNA-Seq, Chip-Seq e os dados de metabolômica de células MCF-7 que são tratadas com E2. Desenvolvemos um conjunto de protocolos strategizing para utilizar os métodos mais eficientes e usuário soft wares amigáveis ​​que produzem descoberta biologicamente relevante. Para o nosso conhecimento, o nosso é o primeiro estudo para integrar -ómicas dados de três diferentes análises e identificadas novas vias metabólicas que ERa diretamente regulados em células de câncer de mama. transcriptomics É crítico para começar com ARN de elevada qualidade para uma análise do transcriptoma de sucesso. A boa prática irão eliminar a possibilidade de degradação de ARN, incluindo a criação de banco isenta de RNase, mudando luvas frequentemente, armazenar em -80 ° C e mantendo-se em gelo em utilização. A adição de incubação durante a noite a -20 ºC, melhora a recuperação de ARN. Para evitar congelamento e descongelamento RNA repetidamente, pode-se atribuir as RNAs para procedur jusanteES sobre o isolamento e purificação. Para a existência de erros de sequenciação, qRT-PCR utilizando o ADNc a partir das amostras é frequentemente realizada para verificar os genes diferencialmente expressos identificados no RNA-Seq. Portanto, RNA suficiente deve ser reservado para esta finalidade. Nós executamos emparelhado-end-seqüenciamento que nos permite analisar variantes de processamento, RNAs não-codificantes e miRNAs. Para evitar os custos de alta sequenciamento, sequenciamento single-final pode ser realizada também. Em comparação com micromatrizes, RNA-Seq é mais sensível e não está limitado às sondas previstas no chip. Obtemos informação não só sobre as sequências de codificação, mas também em genes não-codificantes e transcritos diferencialmente excisadas. No momento, estamos usando esta técnica para analisar transcriptomes de várias linhas celulares após os tratamentos ligando, bem como os tecidos obtidos a partir de experiências com ratos. Cistromics O método ultra-alto rendimento seqüenciamento requer DNA ChIP 5 ng mínimo para a construção da biblioteca. Em Ch padrãoProtocolo IP-18 Seq, recomenda-se ter pelo menos 10 ng. Quantificação com fluorometria é crítica. Neste protocolo, utilizado ensaio de detecção de DNA de fita dupla para determinar a concentração de DNA. Pode-se também usar ensaio fluorómetro para quantificação de DNA precisa. Para as diferenças de equipamentos e materiais, é muito importante para cada laboratório para estabelecer o seu próprio protocolo de ultra-sons, que gera tamanhos fragmentos de DNA desejáveis. Over-cortar o DNA ChIP pode causar perda de enriquecimento de DNAs alvo, enquanto DNA ChIP de tamanhos grandes criar problema para sequenciamento eficiente. Antes de submeter o DNA para sequenciamento, é sempre importante verificar o enriquecimento de algumas regiões conhecidas por qPCR. A técnica é ainda limitada pela eficiência e especificidade do anticorpo usado para a imunoprecipi tacões. Para obter informações sítio de ligação que poderia ser usado de forma confiável em análises comparativas, nós validar os nossos reagentes seguintes normas Chip-Seq ENCODE, 19 e utilização standarprotocolos dized que nos fornecem conjuntos de dados consistentes. Juntamente com o sítio de ligação análise de fator de enriquecimento pós transcrição, ChIP-Seq ainda é um dos melhores métodos para determinar a ligação direta de fatores de transcrição de cromatina. No momento, estamos usando esse protocolo para estudar cinases de recrutamento, coregulators e outros fatores de transcrição para cromatina em outras linhas celulares, bem como tecidos de camundongos respondem estrogênio. Metabolomics Para um perfil metabólico sucesso em células de câncer de mama humano, a preparação da amostra cuidadosa é crítica. A quantidade de células em utilização e as condições de cultura de células na presente protocolo é óptima para as células MCF-7. Outras linhas de células podem exigir mais ou menos células para a detecção de um número significativo de metabolitos. Obtemos cerca de 100 metabólitos em cada experimento. Este método é limitado para a detecção de metabolitos de vida curta ou metabolitos que estão presentes em baixas concentrações. Este método oferece a facilidade de using uma única preparação de amostras para identificar vários metabolitos. No momento, estamos usando esta técnica para identificar estrogênio metabolitos regulamentados no soro e vários tecidos de rato. Integração de dados Numerosos transcriptomics e estudos cistromics foram realizados para investigar a sinalização estrogênio e regulação de genes em células de câncer de mama, incluindo as células MCF7 2,5-7,20. Neste estudo, pela primeira vez, nós adicionamos dados metabolômica e tentou inferir redes metabólicas que estão diretamente regulados por ERa após a adição do ligando. Esta nova abordagem permitiu-nos fixar circuitos moleculares ponto regulado pelo estrogénios que afetam o metabolismo celular. No geral, nossos resultados suportam o papel de ERa como um regulador mestre da biologia do câncer de mama. Em resumo, nós fornecemos um compêndio detalhado de protocolos para geração de RNA-Seq, amostras de chip-Seq e metabolômica de células de câncer de mama após estrogênio tratamentos e integroperatória análise dos dados obtidos a partir destes -ómicas abordagens. Estes protocolos permitirá que os investigadores a fazer análise semelhante para outros fatores de transcrição, ligantes de receptores nucleares e condições nutricionais.

Os estrogênios são importantes reguladores de muitos processos fisiológicos em ambos os sexos, incluindo tecidos reprodutivos, tecidos metabólicos, cérebro e ossos 1. Em adição aos efeitos benéficos nestes tecidos, os estrogénios também conduzir cancros que surgem da mama e tecidos reprodutivos. Estrógenos trabalhar principalmente através ERs para induzir efeitos específicos do tipo de célula. sequenciamento profundo de transcritos regulados por ERa usando RNA-Seq e de todo o genoma DNA ERa análise de sítios de ligação usando o chip-Seq provou ser útil para entender como ERa trabalha em diferentes tecidos e tipos de câncer que surgem a partir deles. Nós e outros publicaram perfis da expressão de genes associados com receptores diferentes (ERa vs ERP) 2,3, diferentes ligantes 3-5 e diferentes coregulators 2,4,6,7. RNA-Seq é o principal método para analisar o transcriptoma, oferecendo maior precisão e eficiência em comparação com ba microarrayanálise de expressão gênica sed 8. ARN obtido a partir de linhas celulares de 2-4,7, tecidos ou amostras de tumor são sequenciados, mapeados para montagens genómico disponíveis e genes diferencialmente regulados são identificados. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) é empregada para dissecar o fator de transcrição e coregulator ligação a locais de ligação reguladoras conhecidas cromatina. ChIP-Seq (CHIP seguido de alta sequenciamento rendimento) fornece detecção imparcial de sítios de ligação globais. Metabolômica é uma outra abordagem da biologia sistema cada vez mais usado, que mede quantitativamente, a resposta multiparamétrico dinâmica dos sistemas vivos a vários estímulos, incluindo produtos químicos e perturbações genéticas. Ao realizar perfil metabólico global, uma leitura funcional pode ser obtido a partir de células, tecidos e sangue. Além disso, as informações a partir de experimentos transcriptoma nem sempre refletem mudanças reais no nível de enzimas que contribuem para vias bioquímicas. Combinadoanálise de dados de transcriptoma e metaboloma nos permite identificar e correlacionar mudanças na expressão gênica com alterações de metabolitos reais. Aproveitando a informação de todos esses conjuntos de dados de grande escala fornecer os detalhes mecanicistas para compreender o papel de fatores de transcrição que regulam sistemas biológicos complexos, especialmente os que dizem respeito ao desenvolvimento humano e doenças como câncer e diabetes. A natureza complexa do genoma dos mamíferos torna difícil para integrar e totalmente interpretar os dados obtidos a partir do transcriptoma, cistrome e metaboloma experimentos. Identificar eventos de ligação funcionais que levariam a alterações na expressão de genes-alvo é importante porque os locais de ligação, uma vez funcionais são identificados; análise subsequente, incluindo transcrição de ligação (TF) análise motivo, pode ser realizado com maior precisão. Isto leva à identificação de cascatas TF biologicamente significativas e mecanismos. comparis também diretosem experimentos de RNA-Seq e chip-Seq nem sempre são possíveis desde que os dados de cada experimento têm diferentes escalas e ruídos e, em alguns casos, sinais significativos são obscurecidos pelo ruído população. Não temos conhecimento de qualquer estudo que integrou informações dessas três abordagens independentes, mas relacionados para entender a regulação metabólica direta por ERa no cancro da mama. Portanto, nosso objetivo geral neste trabalho é relacionar eventos de ligação produtivas para a expressão do gene e alterações de metabolitos. Para atingir este objetivo, integrada dados de RNA-Seq, Chip-seq e metabolômica experiências e identificou aqueles estrogênio induzida ERa eventos que levariam a mudanças de expressão de genes em vias metabólicas vinculativo. Pela primeira vez, nós fornecemos um conjunto completo de protocolos (Figura 1) para gerar ChIP-Seq, RNA-Seq e metabolômica perfis e executar a análise integrada dos dados para descobrir circuitos novo gene que regulam o metabolismo da mamalinhas celulares de cancro.

<table><tbody><tr><td>Triglyceride Mix</td><td>Sigma</td><td>17810-1AMP-S</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O1257-10MG</td><td>Oleic Acid-Water Soluble powder&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>10006D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>10007D</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td>DNA isolation of input sample&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ZYMO ChIP-DNA Isolation kit&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research&amp;nbsp;</td><td>D5205</td><td>ChIP DNA Clean &amp;amp; Concentrator</td></tr><tr><td>Quant-iT&amp;ordf; PicoGreen&amp;uml; dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>P7589</td><td>DNA Quantitation</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>RNA purification</td></tr><tr><td>DEPC Treated Water&amp;nbsp;</td><td>LIFE TECH</td><td>462224</td><td>Dnase/Rnase Free</td></tr><tr><td>Model 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>FB120110</td><td>With 1/8 probe&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Fisher Scientific Sound Enclosure</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>FB-432-A</td><td>For sound reduction</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Eppendorf Tubes 5.0 ml</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>0030 119.401</td><td>200 tubes (2 bags of 100 ea.)</td></tr><tr><td>Random Primer Mix&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>DNTP MIX</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td><td>NEB</td><td>M0253S</td><td></td></tr><tr><td>FastStart SYBR Green Master</td><td>ROCHE</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP160100</td><td>1.5% agarose gel&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>Q32852</td><td>RNA quantification (100 assays)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor tablets&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>4693116001</td><td>Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer</td></tr><tr><td>PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>4906845001</td><td>Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer</td></tr><tr><td>Qubit Assay Kits</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>Q32850</td><td>For 100 assays</td></tr><tr><td>Automated cell counter</td><td>ORFLO</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>tube Rotator&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5 Multilple plate reader&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Diagenode</td><td>B04000001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fast Real-time PCR system</td><td>Applied Science&amp;nbsp;</td><td>4351405</td><td></td></tr></tbody></table>

systems biology of metabolic regulation by estrogen receptor signaling in breast cancer

Com o advento das -ómicas se aproxima de nossa compreensão das doenças crônicas como câncer e síndrome metabólica melhorou. No entanto, a mineração eficaz da informação nas bases de dados de grande escala que são obtidas a partir de microarrays de expressão genética, experimentos de seqüenciamento profundas ou perfil metabólico é essencial para descobrir e, em seguida, efetivamente alvo os reguladores críticos de fenótipos celulares doentes. Receptor de estrogênio α (ERa) é um dos fatores mestre de transcrição que regulam os programas de genes que são importantes para estrogênio cancros da mama responsivos. A fim de compreender o papel de ERa sinalização no metabolismo do cancro da mama que utilizaram dados transcriptomic, cistromic e metabolômica de células MCF-7 tratadas com estradiol. Neste relatório nós descrevemos a geração de amostras para RNA-Seq, Chip-Seq e experiências metabolômica e análise computacional integrativa dos dados obtidos. Essa abordagem é útil em delinear nova toupeiramecanismos cular e circuitos gene regulador que são regulados por um fator de transcrição especial que impacta metabolismo das células normais ou doentes.

transcriptomics Para analisar genes diferencialmente expressos por tratamento E2, optamos por realizar um experimento RNA-Seq. Para além de fornecer informação sobre os níveis de mRNA, os dados de RNA-Seq também pode ser utilizado para monitorizar alterações na (RNAs longos não-codificantes, microRNAs) RNA não codificante e eventos de splicing alternativo. Nós não fornecem informações sobre a análise de genes não-codificantes ou RNAs transcritos alternativamente, desde âmbito do nosso estudo é a identificação de genes codificadores de proteínas que são importantes para a regulação metabólica. No entanto, o RNA-Seq é uma excelente maneira de obter informações sobre eventos de expressão diferencial de genes. A fim de obter alta qualidade lê, é importante para obter alta RNA pureza. Após o isolamento de ARN que o ARN purificado utilizando um kit de ARN limpar. Infelizmente, cerca de 50% do ARN é perdida durante este processo e a quantidade de ARN de partida deve ser tomado em Consideration para se obter a quantidade necessária (100-500 ng) no final da etapa de purificação. Foram quantificados os rendimentos de ARN utilizando ARN HS fluorómetro ensaio, o que é muito preciso e constitui o método preferido para a quantificação de ARN de baixa abundância. Em seguida, a integridade e a qualidade global das amostras de ARN foram examinadas utilizando bioanlayzer, que é uma alternativa viável para a electroforese em gel, utilizando uma quantidade mínima de ARN. A análise mostra todas as amostras têm bandas afiadas e limpas de 18S e 28S rRNAs indicando a integridade ea pureza das amostras (Figura 2B). ARN Integridade Número (NIR) foi utilizado como um padrão para controlo de qualidade de ARN. RIN 10 indica ARN intacto, RIN 6 parcialmente degradadas e RIN3 fortemente degradado 16. Recomenda-se que o NIR para ser pelo menos 7 por experiência de sequenciação. Todas as nossas amostras de RNA recebeu valor RIN entre 9,6-9,9 &lt;forte&gt; (Figura 2A). Bibliotecas de sequenciação foram construídos a partir de 500 ng de ARN de alta qualidade a partir de cada amostra utilizando o sistema de sequenciação de ultra-high-throughput tais como Ilumina 2500. Em média 18000000 sequenciação de alta qualidade leituras foram obtidas para cada amostra (Tabela 1), que estava pronto para jusante análise. Para verificar a qualidade geral dos dados brutos sequência de alto rendimento, FastQC foi executado por de cada amostra lê. Um relatório FastQC representante para os dados de um veículo RNA-Seq foi mostrado (Figura 3). O comprimento da sequência da maioria lê foi de cerca de 100 pb (Figura 3A). Para cada leitura, o índice de qualidade foi 32-34 para a primeira 5 pb e 36-38 de 6-100bp (Figura 3B). Entre 17.990.863 lê gerado a partir desta amostra, a maioria deles teve pontuação maior qualidade do que 34 (Figura 3C). O conteúdo GC por leitura na sequência também seguiram a distribuição normal com uma média de 48% GC. No geral, a qualidadepontuação das leituras era muito alta. análise Cistromic de sítios de ligação ERa Para atingir o sequenciamento eficiente de profundidade, obtendo-se fragmentos de ADN com o tamanho desejável é um dos factores importantes. Abordagens de sequenciamento atuais podem ter diferentes requisitos sobre os fragmentos de DNA, por exemplo 300-600 pb para o sistema de sequenciamento de ultra-alto rendimento, 100-200 pb para AB / SOLiD 17. Nesta experiência, a maioria dos fragmentos de ADN estão entre 300 pb e 600 pb como mostrado em gel (Figura 4). Como alternativa, os leitores podem escolheu para preparar a sua cromatina utilizando MNase digestão, no entanto, sentir o nosso protocolo estabelecido fornece as amostras necessárias com alta qualidade e fornece resultados reprodutíveis. Dez ng de DNA de cada tratamento e a sua amostra de entrada correspondente foi preparado em tampão de EB. O DNA chip foi leitura única sequenciado utilizando o sistema de sequenciação de ultra-alto rendimento. Amostras de DNA ChIP rendeu cerca de20000000 lê enquanto o ADN de entrada produziu mais de 35.000,000 lê-se (Tabela 1). Metabolomics Para quantificar os metabolitos em células de mamíferos usando GCMS, pelo menos 10? G de massa celular são necessárias. Começamos com 400.000 células MCF7 com os experimentos. No momento da colheita, havia cerca de 500000 células em cada placa. A visão geral dos metabólitos representados por picos foram comparadas entre o controle e a amostra tratada Estradiol (Figura 5). Cerca de 100 metabolitos foram identificados, os quais contam para 60% do total conhecido em mamíferos. Aqui apresentamos uma lista dos 10 melhores metabólitos, que mostram alterações significativas no tratamento E2 (Tabela 2). Em geral, E2 upregulated vias incluindo a frutose e manose metabolismo, metabolismo histidina, metabolismo da purina, a biossíntese do colesterol e o metabolismo da vitamina B3. As vias foram regulados negativamente butanoato metabolism, biossíntese de ácido gordo de novo, via das pentoses fosfato, do ciclo da ureia e do metabolismo de arginina (Tabela 3). A análise dos dados e integração Os dados de RNA-Seq, Chip-Seq e GC-MS foram processados ​​e analisados ​​por meio de uma série de etapas (Figura 6). Após a comparação entre genes identificados no RNA-Seq e chip-Seq, um conjunto de up-regulada e um conjunto de genes regulados por baixo de Estradiol foram extraídos. A partir dos dados metabólicas, obteve-se dois conjuntos de compostos para cima e para baixo regulamentados pelo tratamento Estradiol. Em seguida usamos Metscape, um aplicativo para Cytoscape, para visualizar e interpretar a expressão do gene e dados metabólicos no contexto do metabolismo humano 15. Primeiro nós escolhemos a incluir elementos de composto, reação, enzima, e gene na rede. Nós selecionamos os compostos / genes como consulta e duas redes da E2-regulação (Figura 7a) e baixo-regulação (Figura 7B) foram mostrados. O Metscape também fornece uma opção para construir redes em vias seletivas. Por exemplo, utilizando o mesmo conjunto de dados como a construção da rede global regulada para baixo, uma sub-rede de biossíntese e metabolismo via androgénio-estrogénio foi gerado por interrupção da consulta a partir do composto / gene a via específica. Os genes ou compostos com mudanças significativas foram destaque na cor mais brilhante. Além de selecionar uma via específica da janela drop-down como descrito, pode-se também criar uma sub-rede, aplicando a função &quot;criar sub-rede&quot; para a área escolhida. Como mostrado na Figura 6A e B, ERa de activação e de ligação directa para as regiões reguladoras de genes impactado muitas vias metabólicas em células de cancro da mama. A análise indicou que integrativa, ERa liga-se directamente para e regula a expressão do gene FASN, o que é importante para de novo a biossíntese de ácidos gordos via (Figura 7C). Além disso tratamento E2 subregulado vias de biossíntese de andrógenos-estrogénio reprimindo expressão de CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, TPO, GSTA4 e GSTM2 nestas vias. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig1.jpg" /> Figura 1: Fluxo de trabalho da preparação de amostras de RNA, DNA e lisados ​​celulares para o RNA-Seq, Chip-Seq, e análise metabolômica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig2.jpg" /> Figura 2:. Um representante electroferograma dos ARN analisados ​​com Agilent Bioanalyzer 2100 Número de Integridade de ARN (NIR), indicador da qualidade do ARN, foi determinado pela análise de 9,9. (A) Em um retrato gel virtual do RNA provar ambas as bandas de 26S e 18S são nítidas. (B) Os sinais fluorescentes de rastreio indivíduo em tele RNA mostra que a intensidade do 28S pico é maior do que 18S de pico e nenhuma contaminação é visto. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig3.jpg" /> Figura 3:. Um representante verificação de qualidade sobre os dados brutos de RNA-Seq Um dos dados de sequência da amostra foi analisada utilizando veículo FastQC. (A) A distribuição do comprimento de sequência da biblioteca que é 100 pb. (B) O escore de qualidade ao longo da posição na leitura. (C) O escore de qualidade por sequência mostrou o universal de alta qualidade de todas as sequências. (D) O conteúdo GC per leitura combinava com a distribuição teórica. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver a la</a>versão rger desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig4.jpg" /> Figura 4: A electroforese em gel dos fragmentos de cromatina sonicadas 5 ul de lisado de células de cada amostra foi corrida num gel de agarose a 1,5% com uma pb 1000 acrescido de escada na primeira pista.. A maioria dos fragmentos são entre 300 e 600 pb. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig5.jpg" /> Figura 5:. A visão geral de picos que representam metabolitos da GC-MS O painel superior mostra os picos identificados nas amostras tratadas E2 enquanto o painel inferior do controle. A área delimitada foi acomodados em mostrar o metabolito exata representada por cada p<html> eak. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig6.jpg" /> Figura 6: Fluxograma do método de agrupamento Integrativa. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig7.jpg" /> Figura 7: A visualização dos dados de genes-metabolito integrados em Metscape (A) A rede de caminhos-regulada por E2.. (B) A rede de caminhos sub-regulada por E2. (C) E2 estimulou o recrutamento ERa para a região vizinha de FASN, que se encontra a ser regulamentada no de novo rede biossíntese do ácido graxo gerado pela aplicação de função de sub-rede.3832fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/53832/53832table1.jpg" /> Tabela 1: Resumo do sequenciamento ultra-alta taxa de transferência de RNA-Seq e chip-Seq. <img alt="mesa 2" src="/files/ftp_upload/53832/53832table2.jpg" /> Tabela 2: Lista dos 10 melhores metabolitos com alterações significativas com o tratamento E2. <img alt="tabela 3" src="/files/ftp_upload/53832/53832table3.jpg" /> Tabela 3: Caminhos para cima e para baixo-regulado por tratamento E2.

Watch this Scientific Journal Video about Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer at JoVE.com

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

Biologia de sistemas de regulação metabólica pelo receptor de estrogênio sinalização no cancro da mama

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

systems-biology-metabolic-regulation-estrogen-receptor-signaling

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.3K visualizações.  University of Illinois, Urbana-Champaign. Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol. 

Vídeo: Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning display increased atherosclerotic lesions in the aorta compared with female mice with intact ovarian function. However, laboratory models involving estrogen-deficient mice with atherosclerosis-prone status are lacking. This deficit is crucial because clinical estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of pre-existing or ongoing lipid disruption and atherosclerosis. In this study, we establish an in vivo estrogen-deficient mouse model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apolipoprotein E (apoE)-/- mice. We then compare the effects of 17&#946;-estradiol and pseudoprotodioscin (PPD) (a phytoestrogen) perorally administered via hazelnut spread. We find that although PPD exerts some effect on reducing final body weight and plasma TG in OVX apoE-/- mice, it has anti-atherosclerotic and cardiac-protective capacities comparable with its 17&#946;-estradiol counterpart. PPD is a phytoestrogen that has been reported to exert anti-tumor properties. Thus, the proposed method is applicable for screening phytoestrogens via peroral administration to substitute for traditional hormone replacement therapy in postmenopausal women, which has been reported to have potentially deleterious tumorigenetic capacity. Peroral administration via hazelnut spread is noninvasive, rendering it widely applicable to many patients. This article contains step-by-step demonstrations of bilateral ovariectomy via the double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice and peroral 17&#946;-estradiol or phytoestrogen hormone replacement via hazelnut spread. Plasma lipid and cardiovascular function analyses using echocardiography follow.

Clinically, estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of lipid disruption and atherosclerosis. We established an in vivo estrogen deficiency model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice. The mouse model is applicable for screening exogenous estrogen treatments of cardiovascular dysfunction after menopause.

Um modelo in vivo de deficiência de estrogênio mouse para triagem tratamentos de estrogênio exógeno de disfunção cardiovascular após a menopausa

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Bioquímica

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

Modelando o câncer de mama no tecido mamário humano usando um sistema microfisiológico

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Pesquisa do câncer

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in the vertebrates that consume them, such as endocrine function. Phytoestrogens, the most well studied endocrine-active phytochemicals, directly interact with the hypothalamo-pituitary gonadal axis of the vertebrate endocrine system. Here we present the novel use of a cell-based assay to screen plant extracts for the presence of compounds that have estrogenic biological activity. This assay uses mammalian cells engineered to highly express estrogen receptor beta (ER&#946;) and that have been transfected with a luciferase gene. Exposure to compounds with estrogenic activity results in the cells producing light. This assay is a reliable and simple way to test for biological estrogenic activity. It has several improvements over transient transfection assays, most notably, ease of use, the stability of the cells, and the sensitivity of the assay.

We have optimized a commercially available estrogen receptor &#946; reporter assay for screening human and nonhuman primate foods for estrogenic activity. We validated this assay by showing that the known estrogenic human food soy registers high, while other foods show no activity.

Triagem para Fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Medicina

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

A modificação<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Ensaio para determinar o possível papel dos hormônios, citocinas e / ou fatores de crescimento na Cancer Mediating Invasion celular

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudar a ação do hormônio no peito humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Using 16&#945;-[18F]-Fluoro-17&#946;-Estradiol PET to Visualize Estrogen Receptor &#945; Expression in Human Breast Cancer Xenografts in Female Ovariectomized Mice

To demonstrate how estrogen receptor alpha (ER&#945;) positive breast cancer xenografts may be visualized in BALB/c nude mice using 16&#945;-[18F]-fluoro-17&#946;-estradiol (18F-FES) positron emission tomography (PET), ovariectomized BALB/c nude mice were injected with ER&#945;-positive breast cancer cells (MCF-7, 3 &#215; 106 cells; shoulder [n = 10] or 4th inguinal mammary fat pad [n = 10]) or ER&#945;-negative breast cancer cells (MDA-MB-231, 1 &#215; 106 cells; mammary fat pad [n = 5]). Mice harboring MCF-7 cells received subcutaneous injections of 20 &#181;g of 17&#946;-estradiol (20 &#181;g/20 &#181;L; corn oil:ethanol, 9:1) in the nape of their necks 2 days prior to cell injection, followed by daily injections five times per week for 5 weeks. Tumor volumes were measured according to the formula: (L*W2)/2 (L; length, W; width). Once tumor volumes reached approximately 100 mm3, 17&#946;-estradiol injections were halted 2 days prior to mice receiving 18F-FES for PET imaging to avoid competitive binding with ER&#945;. Upon 18F-FES administration via the lateral tail vein, PET/MRI was performed for 15 min at 1 h to 1.5 h post-injection. 18F-FES uptake was not observed in ER&#945;-negative, MDA-MB-231 tumor-bearing mice. 18F-FES uptake was most pronounced in mice harboring MCF-7 tumors in the shoulder. In MCF-7 tumors grown in the inguinal mammary fat pad, 18F-FES uptake was less visible, as the intestinal excretion pattern of 18F-FES obscured the radioactivity detectable in these tumors. To use 18F-FES PET as a tool to visualize ER&#945; expression in ER&#945;-positive breast xenografts, we demonstrate that the visibility of 18F-FES uptake is clear in tumors located away from the abdominal region of mice, such as in the shoulder.

Here, we demonstrate a protocol to use 16&#945;-[18F]-fluoro-17&#946;-estradiol (18F-FES) positron emission tomography (PET) as a tool to visualize ER&#945; expression in ER&#945;-positive breast xenografts.

Usando 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiol PET para visualizar a expressão do receptor de estrogênio α em xenoenxertos de câncer de mama humano em camundongos ovariectomizados fêmeas

To demonstrate how estrogen receptor alpha (ER&#945;) positive breast cancer xenografts may be visualized in BALB/c nude mice using ...

Mecanismo do salidrosídeo na supressão da migração e proliferação de células MCF-7

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer mechanisms have been only incompletely elucidated. Hence, this protocol intended to decode the potential of Sal in regulating the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway in the malignant proliferation of human breast cancer MCF-7 cells. First, the pharmacological activity of Sal against MCF-7 was evaluated by CCK-8 and cell scratch assays. Moreover, the resistance of MCF-7 cells was measured by migration and Matrigel invasion assays. For cell apoptosis and cycle assays, MCF-7 cells were processed in steps with annexin V-FITC/PI and cell cycle-staining detection kits for flow cytometry analyses, respectively. The levels of reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ were examined by DCFH-DA and Fluo-4 AM immunofluorescence staining. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were determined using the corresponding commercial kits. The protein and gene expression levels in apoptosis and the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway were further determined using western blot and qRT-PCR analyses, respectively. We found that Sal treatment significantly restricted the proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells with dose-dependent effects. Meanwhile, Sal administration also dramatically forced MCF-7 cells to undergo apoptosis and cell cycle arrest. The immunofluorescence tests showed that Sal observably stimulated ROS and Ca2+ production in MCF-7 cells. Further data confirmed that Sal promoted the expression levels of pro-apoptotic proteins, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, and their corresponding genes. Consistently, Sal intervention prominently reduced the expression of the Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1&#945;, and FoxO1 proteins and their corresponding genes. In conclusion, Sal can be used as a potential herb-derived compound for treating breast cancer, as it may reduce the malignant proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells by inhibiting the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway.

Autor em destaque: Explorando os mecanismos moleculares do salidrosídeo no tratamento do câncer de mama 

The present protocol describesa comprehensive strategy for evaluating the pharmacological action and mechanism of salidroside in inhibiting MCF-7 cell proliferation and migration.

Explorando a Ação Farmacológica e o Mecanismo Molecular do Salidrosídeo na Inibição da Proliferação e Migração de Células MCF-7

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

Biologia de sistemas de regulação metabólica pelo receptor de estrogênio sinalização no cancro da mama

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Um modelo in vivo de deficiência de estrogênio mouse para triagem tratamentos de estrogênio exógeno de disfunção cardiovascular após a menopausa

Modelando o câncer de mama no tecido mamário humano usando um sistema microfisiológico

Triagem para Fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β Reporter Assay

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

A modificação

Um

Usando 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiol PET para visualizar a expressão do receptor de estrogênio α em xenoenxertos de câncer de mama humano em camundongos ovariectomizados fêmeas

Explorando a Ação Farmacológica e o Mecanismo Molecular do Salidrosídeo na Inibição da Proliferação e Migração de Células MCF-7

Explorando a Ação Farmacológica e o Mecanismo Molecular do Salidrosídeo na Inibição da Proliferação e Migração de Células MCF-7

Explorando a Ação Farmacológica e o Mecanismo Molecular do Salidrosídeo na Inibição da Proliferação e Migração de Células MCF-7