Name: systems biology of metabolic regulation by estrogen receptor signaling in breast cancer
Uploaded: 2016-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של המכון הלאומי המזון והחקלאות, משרד החקלאות של ארה&quot;ב, פרס ILLU-698-909 (ZME) ופייזר, Inc (ZME). תוך הם באחריות בלעדית של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות הרשמיות של משרד החקלאות האמריקאי.

<ol>
	<li>Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+hormone+physiology:+reproductive+findings+from+estrogen+receptor+mutant+mice.">Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice.</a> Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).</li><li>Madak-Erdogan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+of+gene+and+metabolic+regulation+by+estrogen+receptors+alpha+and+beta,+and+their+coregulators.">Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators.</a> Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).</li><li>Gong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+identifies+gene+networks+regulated+by+estrogen+receptor+alpha+(ERalpha)+and+ERbeta+that+control+distinct+effects+of+different+botanical+estrogens.">Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens.</a> Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).</li><li>Bergamaschi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forkhead+transcription+factor+FOXM1+promotes+endocrine+resistance+and+invasiveness+in+estrogen+receptor-positive+breast+cancer+by+expansion+of+stem-like+cancer+cells.">The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).</li><li>Madak-Erdogan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+extranuclear+pathway+inputs+in+the+regulation+of+global+gene+expression+by+estrogen+receptors.">Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors.</a> Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).</li><li>Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+collaboration+of+estrogen+receptor+alpha+and+extracellular+signal-regulated+kinase+2+in+regulating+gene+and+proliferation+programs.">Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs.</a> Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).</li><li>Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+roles+for+ERK5+and+cofilin+as+critical+mediators+linking+ERalpha-driven+transcription,+actin+reorganization,+and+invasiveness+in+breast+cancer.">Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer.</a> Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quant-iT&#8482; PicoGreen &#174; dsDNA Reagent and Kits. , (2008).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quant-iT&#8482; Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , (2006).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).</li><li>Langdon, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+genetic+programming+optimised+Bowtie2+on+genome+comparison+and+analytic+testing+(GCAT)+benchmarks.">Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks.</a> BioData Min. 8, (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metscape:+a+Cytoscape+plug-in+for+visualizing+and+interpreting+metabolomic+data+in+the+context+of+human+metabolic+networks.">Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks.</a> Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).</li><li>Mokry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+double+fragmentation+ChIP-seq+provides+nucleotide+resolution+protein-DNA+binding+profiles.">Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles.</a> PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Hah, N., Kraus, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-regulated+transcriptomes:+lessons+learned+from+estrogen+signaling+pathways+in+breast+cancer+cells.">Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells.</a> Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).</li></ol>

אוניברסיטת אילינוי קיבל מענק החוקר שהופעלו מתוך פייזר ZME ו YCZ קיבל תמיכה משכורת מענק זה.

במאמר זה תיארנו הדור וניתוח אינטגרטיבי של RNA-seq, שבב Seq ונתונים metabolomics מתאי MCF-7 כי מטופלים עם E2. פתחנו סדרה של פרוטוקולים האסטראטגי כדי לנצל את השיטות היעילות ביותר ואת מרכולתם רכה ידידותית למשתמש אשר מייצרות גילוי ביולוגי רלוונטי. למיטב ידיעתנו, ושלנו הוא המחקר הראשון לשלב נתוני -omics משלושה ניתוח שונה מסלולי מטבוליים חדשים זיהו כי ERα מוסדר ישירות בתאי סרטן השד. transcriptomics זה קריטי כדי להתחיל עם RNAs באיכות גבוהה עבור ניתוח transcriptomic מוצלח. תרגול טוב יבטל את הסיכוי של השפלה RNA, כולל יצירת ספסל RNase ללא, שינוי כפפות לעתים קרובות, אחסון ב -80 ° C ושמירה על קרח בשימוש. תוספת של דגירת הלילה ב -20 ºC משפרת התאוששות RNA. כדי למנוע קפיאה ו- RNA הפשרת שוב ושוב, אפשר להקצות את RNAs עבור procedur במורד הזרםes על בידוד וטיהור. לעניין קיומו של טעויות רצף, qRT-PCR באמצעות cDNA ממדגמים מתבצע לעיתים קרובות כדי לוודא את הגנים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי מזוהים RNA-seq. לכן, מספיק RNA יש שמור למטרה זו. אנו מבצעים לזווג סוף-רצף המאפשר לנו לנתח וריאנטים אחוי, RNAs ללא קידוד ו miRNAs. כדי להימנע מעלויות גבוהה רצף, רצף חד קצה יכול להתבצע גם כן. לעומת microarrays, RNA-seq הוא יותר רגיש אינו מוגבל החלליות הניתנות על השבב. אנו משיגים מידע לא רק על רצפי קידוד, אלא גם על גנים ללא קידוד תעתיקי שחבור דיפרנציאלי. כרגע אנחנו שימוש בטכניקה זו כדי לנתח transcriptomes של שורות תאים שונות לאחר טיפולים ליגנד כמו גם רקמות שהתקבלו מניסויי עכבר. Cistromics שיטת רצף אולטרה תפוקה גבוהה דורשת DNA שבב מינימאלי 5 ng לבניית ספרייה. בתקן ChIP-Seq פרוטוקול 18, מומלץ שיהיו לפחות 10 ng. כימות עם fluorometry הן קריטיות. בפרוטוקול זה השתמשנו assay זיהוי הדנ&quot;א הכפול גדיל כדי לקבוע את ריכוז ה- DNA. אפשר גם להשתמש assay fluorometer כימות DNA מדויק. להבדלי ציוד וחומרים, חשוב מאוד עבור כל מעבדה להקים פרוטוקול sonication משלהם, אשר מייצר בגדלי קטעי דנ&quot;א רצויים. יתר גז הדנ&quot;א השבב עלול לגרום לאובדן של העשרת DNAs היעד תוך DNA השבב במידות גדולות ליצור בעיה עבור סידור יעיל. לפני הגשת DNA כדי רצף, זה תמיד חשוב לוודא העשרה כמה אזורים ידועים על ידי qPCR. הטכניקה עדיין מוגבלת על ידי היעילות ואת הספציפיות של הנוגדן המשמש immunoprecipitations. כדי להשיג מידע אתר הקישור שיכול לשמש באופן אמין ניתוחים השוואתיים, אנו לאמת ריאגנטים שלנו על פי תקני שבב Seq לקודד, 19 והשימוש standarפרוטוקולי dized המספקים לנו עם ערכות נתונים עקביות. אם נוסיף לכך את ניתוח העשרה אתר הקישור גורם שעתוק פוסט, שבב Seq היא עדיין אחת השיטות הטובות ביותר כדי לקבוע ישירה מחייב של גורמי שעתוק כדי הכרומטין. אנחנו כרגע באמצעות פרוטוקול זה ללמוד קינאזות גיוס, coregulators וגורמים שעתוק אחרים כדי הכרומטין שורות תאים אחרים כמו גם רקמות העכבר מגיבים לאסטרוגן. metabolomics במשך פרופיל מטבולים מוצלח תאים סרטניים אנושיים שד, הכנת מדגם זהירה היא קריטית. כמות התאים בשימוש ומצבו תרבית תאים בפרוטוקול זה הוא אופטימלי עבור תאים MCF7. שורות תאים אחרות עשויות לחייב יותר או פחות תאים לגילוי של מספר לא מבוטל של מטבוליטים. אנו משיגים סביב 100 מטבוליטים בכל ניסוי. שיטה זו מוגבלת לגילוי של מטבוליטים וקצר טווח או מטבוליטים שנמצאים בריכוזים נמוכים. שיטה זו מציעה את הקלות של using הכנה מדגם יחיד לזהות מטבוליטים מרובים. כרגע אנחנו שימוש בטכניקה זו כדי לזהות מטבוליטים מוסדרים אסטרוגן בסרום וברקמות שונות מעכבר. שילוב נתונים Transcriptomics ו cistromics מחקרים רבים נעשו כדי לחקור איתות אסטרוגן ויסות הגנים בתאי סרטן השד, כולל תאים MCF7 2,5-7,20. במחקר זה, בפעם הראשונה, הוספנו נתוני metabolomics וניסיתי להסיק רשתות מטבולית מוסדרות ישירות על ידי ERα על תוספת ליגנד. גישה חדשנית זו אפשרה לנו להצמיד circuitries המולקולרית נקודה מוסדרת על ידי אסטרוגנים המשפיעים חילוף חומרים תאיים. באופן כללי, הממצאים תומכים התפקיד ERα בתור רגולטור של ביולוגית סרטן השד. לסיכום, סיפקנו מצבור מפורט של פרוטוקולים עבור הדור של RNA-seq, שבב Seq ו metabolomics דגימות מתאי סרטן שד לאחר אסטרוגן טיפולים בקר מובנהניתוח ative של נתונים המתקבלים גישות -omics אלה. פרוטוקולים אלה ייאפשרו לחוקרים לעשות ניתוח דומה לגורמי תעתיק אחרים, הליגנדים ותנאי מזין רצפטור גרעיניים.

אסטרוגנים הם הרגולטורים החשובים של תהליכים פיזיולוגיים רבים בשתי נקבות וזכרים כולל רקמות הרבייה, רקמות מטבולית, המוח ועצמות 1. בנוסף השפעות מועילות ברקמות אלה, אסטרוגנים גם לנהוג סרטן עולה חלב ורקמות רבייה. אסטרוגנים בעיקר לעבוד דרך למיונים להשרות סוג תא השפעות ספציפיות. רצף עמוק של תמלילי מוסדר על ידי ERα באמצעות RNA-seq ו הגנום כולו ניתוח אתרי הקישור ERα DNA באמצעות שבב Seq הוכיח להיות שימושי כדי להבין כיצד ERα עובד ברקמות וסוגי סרטן שונים שעולים מהם. אנחנו ואחרים פרסמנו פרופילי ביטוי גנים הקשורים קולטנים שונים (ERα vs ERβ) 2,3, הליגנדים שונים 3-5 ו coregulators השונה 2,4,6,7. RNA-seq הוא השיטה העיקרית לבחון את transcriptome, מציע דיוק גבוה ויעילות לעומת ba microarrayניתוח ביטוי גנים SED 8. RNA המתקבל שורות תאים 2-4,7, רקמות או דגימות גידולים הם רצף, ממופה מכלולי גנומי זמינים וגנים מוסדרים באופן דיפרנציאלי מזוהים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא מועסק לנתח את גורם שעתוק coregulator הכרומטין מחייב לאתרים מחייב רגולטוריות ידוע. שבב Seq (שבב ואחריו רצף קצב העברת נתונים גבוה) מספק זיהוי משוחדת של אתרי קישור העולמיים. Metabolomics היא גישה אחרת ביולוגיה מערכתית משמשת יותר ויותר, אשר מודדת באופן כמותי, בתגובת multiparametric הדינמית של מערכות חיות לגירויים שונים, כוללים כימיקלי הפרעות גנטיות. על ידי ביצוע פרופיל מטבולים עולמי, הודעה תפקודית ניתן המתקבל תאים, רקמות, ודם. בנוסף, מידע מניסויים transcriptome לא תמיד משקפים שינויים בפועל ברמת אנזימי שתורמים הביוכימיים. מְשׁוּלָבניתוח של נתוני transcriptome ו metabolome מאפשר לנו לזהות לתאם שינויים בביטוי גנים עם שינויים המטבוליט בפועל. רתימת מידע מכל מערכי נתונים בקנה מידה גדול אלה מספקים את הפרטים מכניסטית כדי להבין את התפקיד של גורמי שעתוק ויסות מערכות ביולוגיות מורכבות, במיוחד אלה הנוגעים להתפתחות אנושית ומחלות כמו סרטן וסוכרת. האופי המורכב של הגנום היונק מהווה אתגר לשלב באופן מלא לפרש את הנתונים שהתקבלו מניסויי transcriptome, cistrome ו metabolome. זיהוי אירועים מחייבים פונקציונליים שיובילו שינויים בביטוי של גני היעד חשוב כי אתרי קישור פונקציונליים פעם מזוהות; שהתפתח ניתוח, כולל ניתוח מוטיב שעתוק מחייבים (TF), יכול להתבצע עם דיוק גבוה. זה מוביל לזיהוי מפלים ומנגנוני TF משמעות ביולוגית. כמו כן comparis ישירהעל ניסויים RNA-seq ו-Seq שבב הם לא תמיד אפשרי מאחר שהנתונים כל ניסוי יש שונות קשקשים ורעשים ובמקרים מסוימים להיות מעורפלים ומטושטשים אותות משמעותיים על ידי רעש האוכלוסייה. אנחנו לא מודעים לכל מחקר המשלב את המידע על שלוש גישות עצמאיות אלא קשורות להבין את ויסות חילוף חומרים הישירה ידי ERα בסרטן השד. לכן, המטרה הכללית שלנו במאמר זה היא להתייחס אירועים מחייבים פרודוקטיבי ביטוי גנים ושינויים המטבוליט. על מנת להשיג מטרה זו, אנו משולבים נתוני RNA-seq, שבב Seq ו metabolomics ניסויים וזיהינו אלה אסטרוגן מושרה ERα מחייב אירועים שיגרמו לשינויי ביטוי גני מסלולים מטבוליים. בפעם הראשונה, אנו מספקים מערך שלם של פרוטוקולים (איור 1) להפקת שבב Seq, RNA-seq ו פרופיל metabolomics וביצוע ניתוח אינטגרטיבי של הנתונים לחשוף מעגלי גן רומן ויסות חילוף חומרים של שדשורות תאים סרטניים.

<table><tbody><tr><td>Triglyceride Mix</td><td>Sigma</td><td>17810-1AMP-S</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O1257-10MG</td><td>Oleic Acid-Water Soluble powder&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>10006D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>10007D</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td>DNA isolation of input sample&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ZYMO ChIP-DNA Isolation kit&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research&amp;nbsp;</td><td>D5205</td><td>ChIP DNA Clean &amp;amp; Concentrator</td></tr><tr><td>Quant-iT&amp;ordf; PicoGreen&amp;uml; dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>P7589</td><td>DNA Quantitation</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>RNA purification</td></tr><tr><td>DEPC Treated Water&amp;nbsp;</td><td>LIFE TECH</td><td>462224</td><td>Dnase/Rnase Free</td></tr><tr><td>Model 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>FB120110</td><td>With 1/8 probe&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Fisher Scientific Sound Enclosure</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>FB-432-A</td><td>For sound reduction</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Eppendorf Tubes 5.0 ml</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>0030 119.401</td><td>200 tubes (2 bags of 100 ea.)</td></tr><tr><td>Random Primer Mix&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>DNTP MIX</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td><td>NEB</td><td>M0253S</td><td></td></tr><tr><td>FastStart SYBR Green Master</td><td>ROCHE</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP160100</td><td>1.5% agarose gel&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>Q32852</td><td>RNA quantification (100 assays)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor tablets&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>4693116001</td><td>Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer</td></tr><tr><td>PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>4906845001</td><td>Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer</td></tr><tr><td>Qubit Assay Kits</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>Q32850</td><td>For 100 assays</td></tr><tr><td>Automated cell counter</td><td>ORFLO</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>tube Rotator&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5 Multilple plate reader&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Diagenode</td><td>B04000001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fast Real-time PCR system</td><td>Applied Science&amp;nbsp;</td><td>4351405</td><td></td></tr></tbody></table>

systems biology of metabolic regulation by estrogen receptor signaling in breast cancer

עם כניסתו של -omics גישות הבנתנו את המחלות הכרוניות כמו סרטן ותסמונת מטבולית השתפרה. עם זאת, כריית יעיל של המידע המערך הנתונים גדול בקנה המידה כי מתקבלים microarrays ביטוי גנים, ניסויי רצף עמוקים או פרופיל מטבולים חיונית לחשוף ולאחר מכן למקד בצורה יעילה הרגולטורים הקריטיים של פנוטיפים תא פגועים. קולטן אסטרוגן α (ERα) הוא אחד הגורמים מאסטר תמלול הסדרת תוכניות הגן שחשוב סרטן שד תגובת אסטרוגן. על מנת להבין את תפקידו של ERα איתות במטבוליזם סרטן השד השתמשנו נתונים transcriptomic, cistromic ו metabolomic מתאי MCF-7 שטופלו אסטרדיול. בדו&quot;ח זה תארנו דור של דגימות RNA-seq, שבב Seq וניסויי metabolomics ועל ניתוח חישובית אינטגרטיבית של הנתונים המתקבלים. גישה זו שימושית המגדירה שומה רומןמנגנוני cular ומעגלי רגולטוריות גן מוסדר על ידי גורם שעתוק מסוים אשר משפיע חילוף חומרים של תאים נורמלים או חולים.

transcriptomics כדי לנתח גנים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי על ידי טיפול E2, בחרנו לבצע ניסוי RNA-seq. בנוסף לאספקת מידע על רמות ה- mRNA, נתוני Seq RNA יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר שינויים ללא קידוד RNA (RNAs ללא קידוד ארוך, מיקרו-רנ&quot;א) ואירועים שחבור חלופי. אנחנו לא מספקים מידע על ניתוח של RNAs ללא קידוד או לחילופין עיבד גנים, מאז היקף המחקר שלנו היא לזהות גנים המקודדים חלבונים שחשובים וויסות חילוף חומרים. עם זאת, RNA-seq הוא דרך מצוינת של קבלת מידע על אירועי ביטוי גני הפרש. על מנת לקבל איכות גבוהה קוראה, חשוב לקבל RNA הטוהר גבוה. לאחר בידוד RNA אנו טהרנו את RNA באמצעות ערכת RNA לנקות. למרבה הצער כמעט 50% של ה- RNA הוא איבד במהלך תהליך זה וכמות החל RNA צריך להילקח גonsideration להשיג הסכום הנדרש (100-500 ng) עד סוף שלב טיהור. אנחנו לכמת תשואות RNA באמצעות fluorometer RNA HS assay, וזה מאוד מדויק הוא שיטה מועדפת עבור כימות של רנ&quot;א נמוך שפע. לאחר מכן, על שלמות ועל האיכות הכוללת של דגימות רנ&quot;א נבחנו באמצעות bioanlayzer, המהווה חלופה ג&#39;ל אלקטרופורזה באמצעות כמות מזערית של RNA. הניתוח מראה לכולם יש את הדגימות להקות חדות ונקיות של 18S ו -28 rRNAs המציינות את התקינות וטוהרת של הדגימות (איור 2 ב). Integrity RNA מספר (רין) שימש כאמת מידה בקרת איכות RNA. RIN 10 מציין RNA ללא פגע, RIN 6 מושפל חלקית RIN3 מושפל מאוד 16. מומלץ כי RIN להיות לפחות 7 עבור ניסוי רצף. כל דגימות רנ&quot;א שלנו קיבל ערך RIN בין 9.6-9.9 &lt;(איור 2 א) strong&gt;. רצף ספריות נבנו 500ng של רנ&quot;א איכותיים מכל מדגם באמצעות מערכת רצף אולטרה תפוקה גבוהה כגון Illumina 2500. בממוצע 18,000,000 רצף תפוקה גבוהה באיכות קורא התקבלו עבור כל דגימה (טבלה 1), אשר היה מוכן במורד הזרם אָנָלִיזָה. כדי לבדוק את האיכות הכוללת של הנתונים הגולמיים רצף תפוקה גבוהה, FastQC נדרס עבור כל דגימה של קורא. דו&quot;ח FastQC נציג נתוני Seq RNA רכב אחד הוצג (איור 3). אורך הרצף של רוב הקורא היה כ -100 נ&quot;ב (איור 3 א). עבור כל קריאה, ציון האיכות היתה 32-34 עבור BP 5 הראשון 36-38 מ 6-100bp (איור 3 ב). בין 17,990,863 כניסות המופק מדגם זה, רובם היו באיכות ציון גבוה יותר מ -34 (איור 3 ג). התוכן GC לכל קריאה ברצף גם בעקבות התפלגות נורמלית עם ממוצע של GC 48%. האיכות הכוללתהציון של הקורא היה מאוד גבוה. ניתוח Cistromic של אתרי קישור ERα כדי להשיג את הרצף העמוק ביותר, קבלת שברי DNA בגודל רצוי הוא אחד הגורמים החשובים. גישות רצף נוכחיות עשויות להיות צורכים שונים על קטעי דנ&quot;א, למשל 300-600 נ&quot;ב עבור מערכת רצף אולטרה תפוקה גבוהה, 100-200 נ&quot;ב עבור AB / מוצקה 17. בניסוי זה רוב קטעי דנ&quot;א הם בין 300 נ&quot;ב ו -600 נ&quot;ב כפי שמוצג על ג&#39;ל (איור 4). כחלופה, קוראים עלולים בוחרים להכין הכרומטין שלהם באמצעות עיכול MNase, אולם אנו חשים הפרוטוקול הוקם שלנו מספק את הדגימות הנדרשות עם באיכות גבוהה ומספק תוצאות לשחזור. עשרה ng של DNA מכל טיפול מדגם הקלט המקביל שלה הוכן חיץ EB. ה- DNA השבב היה חד לקריאת רצף באמצעות מערכת רצף אולטרה תפוקה גבוהה. דגימות שבב DNA הניב כ20,000,000 קורא בעוד DNA קלט הניב יותר מ 35.000,000 קורא (טבלה 1). metabolomics כדי לכמת את מטבוליטים בתאי יונקים באמצעות GCMS, לפחות 10 מיקרוגרם של מסת תאים נדרשים. התחלנו עם 400,000 תאים MCF7 עם הניסויים. עד קציר, היו כ 500,000 תאים כל צלחת. בראייה כוללת של מטבוליטים מיוצגים על ידי פסגות הושוותה בין מלא המדגם שטופל אסטרדיול (איור 5). כ -100 מטבוליטים זוהו, אלה יש משקל 60% מכלל תושבי העיר ידועה mammalians. כאן אנו מציגים רשימה של 10 מטבוליטים העליונים, אשר מראים שינויים משמעותיים בטיפול E2 (טבלה 2). בסך הכל, E2 שהוגברו מסלולים כולל פרוקטוז ומטבוליזם מנוז, מטבוליזם היסטידין, מטבוליזם purine, ביוסינתזה כולסטרול ומטבוליזם ויטמין B3. מסלולי downregulated היו butanoate metabolisמ &#39;, דה נובו ביוסינתזה של חומצות שומן, מסלול פוספט pentose, מעגל האוריאה וחילוף החומרים של ארגינין (לוח 3). ניתוח נתונים ואינטגרציה נתוני RNA-seq, שבב Seq ו- GC-MS עובדו ונותחו באמצעות סדרה של צעדים (איור 6). לאחר השוואה בין גנים שזוהו RNA-seq ו שבב Seq, קבוצה אחת של עד-מוסדר קבוצה אחת של גנים מוסדרים על ידי אסטרדיול חולצה. מהנתונים מטבולית, השגנו שני סטים של תרכובות למעלה ולמטה מוסדרות על ידי טיפול אסטרדיול. הבא השתמשנו Metscape, אפליקציה cytoscape, לדמיין ולפרש את ביטוי הגנים ונתונים מטבולית בהקשר של חילוף החומרים האנושי 15. ראשית בחרנו לכלול אלמנטים של מתחם, תגובה, אנזים, וג&#39;ין ברשת. בחרנו מתחמים / גנים כמו שאילתא שתי רשתות של up-regulation E2 (איור 7 א) ומטה-regulation (איור 7 ב) הוצג. Metscape מספקת גם אפשרות לבנות רשתות על מסלולים סלקטיבית. לדוגמה, באמצעות אותה קבוצה של נתונים כמו בבניית רשת הכוללת מוסדר למטה, subnetwork של מסלול ביוסינתזה ומטבוליזם-אסטרוגן אנדרוגן נוצר על ידי החלפת שאילתה מהמתחם / הגן מסלול ספציפי. הגנים או תרכובות עם שינויים משמעותיים היו מודגשים בצבע בהיר יותר. מלבד בחירת מסלול ספציפי מהחלון הנפתח כמתואר, אפשר גם ליצור רשת תת-ידי החלה &quot;ליצור subnetwork&quot; פונקציה לאזור הנבחר. כפי שניתן לראות בתרשים 6A ו- B, ERα הפעלה ישירה מחייב לאזורים רגולטוריים הגן השפיעו רבות מסלולים מטבוליים בתאי סרטן השד. ניתוח אינטגרטיבי שלנו הצביעו על כך, ERα נקשר ישירות ומסדירה הביטוי של גן FASN, שהינה חשובה מסלול ביוסינתזה דה נובו של חומצות שומן (Figure 7C). בנוסף E2 טיפול downregulated מסלולים ביוסינתזה אסטרוגן-אנדרוגן על ידי דיכוי הביטוי של CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, TPO, GSTA4 ו GSTM2 במסלולים אלה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig1.jpg" /> איור 1: Workflow של הכנת דגימות של RNA, DNA ו- lysates תא עבור RNA-seq, שבב Seq, וניתוח metabolomic. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig2.jpg" /> איור 2:. Electropherogram נציג RNAs נותח עם 2100 Agilent Bioanalyzer RNA יושר מספר (רין), אינדיקטור של איכות RNA, ניתן על ידי הניתוח כמו 9.9. (א) על תמונת ג&#39;ל וירטואלית של RNA לדגום שני הלהקות של 26s ו 18S חדות. (ב) אותות פלורסנט של עקבות בודדות tהוא RNA עולה כי עוצמת שיא 28S עולה 18S שיא וללא זיהום נתפס. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig3.jpg" /> איור 3:. בדיקת איכות תציג את הנתונים הגולמיים-Seq RNA אחד נתוני הרצף של רכב המדגם נותח באמצעות FastQC. (א) חלוקת אורך הרצף של הספרייה שהיא 100 נ&quot;ב. (ב) ציון האיכות לאורך העמדה לקרוא. (C) ציון האיכות לכל רצף הראה את האיכות גבוהה האוניברסלית של כל הרצפים. (ד) תוכן GC לכל קריאה תאם את ההתפלגות התיאורטית. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג לה</a>גרסת rger של נתון זה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig4.jpg" /> איור 4: ג&#39;ל אלקטרופורזה של שברי הכרומטין sonicated 5 μl של lysate התא מכל מדגם נדרס על ג&#39;ל agarose 1.5% עם 1,000 נקודות בסיס בתוספת הסולם על הנתיב הראשון.. רוב המקטעים הנם בין 300 ל 600 נ&quot;ב. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig5.jpg" /> איור 5:. הסקירה של פסגות מייצג מטבוליטים מן GC-MS הפנל העליון מציגה את הפסגות מזוהות דגימות מטופלי E2 בעוד הפנל התחתון מהשלט. המתחם היה ושכרתי חדר להראות המטבוליט המדויק המיוצגות על ידו p<html> eak. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig6.jpg" /> איור 6: תרשים זרימה של שיטת אשכולות אינטגרטיבית. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig7.jpg" /> איור 7: ויזואליזציה של נתוני גני המטבוליט המשולבים Metscape (א) הרשת של שבילים למעלה מוסדרים על ידי E2.. (ב) רשת של מסלולים למטה מוסדר על ידי E2. (C) E2 מגורה גיוס ERα לאזור הסמוך FASN, אשר יימצא תחת פיקוח ברשת ביוסינתזה דה נובו חומצות שומן שנוצר על ידי יישום פונקציה subnetwork.3832fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/53832/53832table1.jpg" /> טבלה 1: סיכום של רצף אולטרה תפוקה גבוהה של RNA-seq ו שבב Seq. <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/53832/53832table2.jpg" /> טבלה 2: רשימת 10 מטבוליטים העליונים עם שינויים משמעותיים עם טיפול E2. <img alt="טבלה 3" src="/files/ftp_upload/53832/53832table3.jpg" /> טבלה 3: משעול למעלה ולמטה מוסדר על ידי E2 טיפול.

Watch this Scientific Journal Video about Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer at JoVE.com

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

ביולוגית מערכות ויסות חילוף חומרים על ידי איתות קולטן אסטרוגן לסרטן השד

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

systems-biology-metabolic-regulation-estrogen-receptor-signaling

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.3K Views.  University of Illinois, Urbana-Champaign. Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol. 

Video: Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning display increased atherosclerotic lesions in the aorta compared with female mice with intact ovarian function. However, laboratory models involving estrogen-deficient mice with atherosclerosis-prone status are lacking. This deficit is crucial because clinical estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of pre-existing or ongoing lipid disruption and atherosclerosis. In this study, we establish an in vivo estrogen-deficient mouse model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apolipoprotein E (apoE)-/- mice. We then compare the effects of 17&#946;-estradiol and pseudoprotodioscin (PPD) (a phytoestrogen) perorally administered via hazelnut spread. We find that although PPD exerts some effect on reducing final body weight and plasma TG in OVX apoE-/- mice, it has anti-atherosclerotic and cardiac-protective capacities comparable with its 17&#946;-estradiol counterpart. PPD is a phytoestrogen that has been reported to exert anti-tumor properties. Thus, the proposed method is applicable for screening phytoestrogens via peroral administration to substitute for traditional hormone replacement therapy in postmenopausal women, which has been reported to have potentially deleterious tumorigenetic capacity. Peroral administration via hazelnut spread is noninvasive, rendering it widely applicable to many patients. This article contains step-by-step demonstrations of bilateral ovariectomy via the double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice and peroral 17&#946;-estradiol or phytoestrogen hormone replacement via hazelnut spread. Plasma lipid and cardiovascular function analyses using echocardiography follow.

Clinically, estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of lipid disruption and atherosclerosis. We established an in vivo estrogen deficiency model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice. The mouse model is applicable for screening exogenous estrogen treatments of cardiovascular dysfunction after menopause.

A In Vivo אסטרוגן מחסור בעכבר מודל עבור ההקרנה הטיפולים האסטרוגן אקסודוגני של בעיות לב וכלי דם אחרי גיל המעבר

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Biochemistry

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

דוגמנות סרטן השד ברקמת השד האנושית באמצעות מערכת מיקרופיזיולוגית

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Cancer Research

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in the vertebrates that consume them, such as endocrine function. Phytoestrogens, the most well studied endocrine-active phytochemicals, directly interact with the hypothalamo-pituitary gonadal axis of the vertebrate endocrine system. Here we present the novel use of a cell-based assay to screen plant extracts for the presence of compounds that have estrogenic biological activity. This assay uses mammalian cells engineered to highly express estrogen receptor beta (ER&#946;) and that have been transfected with a luciferase gene. Exposure to compounds with estrogenic activity results in the cells producing light. This assay is a reliable and simple way to test for biological estrogenic activity. It has several improvements over transient transfection assays, most notably, ease of use, the stability of the cells, and the sensitivity of the assay.

We have optimized a commercially available estrogen receptor &#946; reporter assay for screening human and nonhuman primate foods for estrogenic activity. We validated this assay by showing that the known estrogenic human food soy registers high, while other foods show no activity.

הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

השתנה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלישת Assay כדי לקבוע את התפקיד הפוטנציאלי של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה בפלישת תאי הסרטן המתווך

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Using 16&#945;-[18F]-Fluoro-17&#946;-Estradiol PET to Visualize Estrogen Receptor &#945; Expression in Human Breast Cancer Xenografts in Female Ovariectomized Mice

To demonstrate how estrogen receptor alpha (ER&#945;) positive breast cancer xenografts may be visualized in BALB/c nude mice using 16&#945;-[18F]-fluoro-17&#946;-estradiol (18F-FES) positron emission tomography (PET), ovariectomized BALB/c nude mice were injected with ER&#945;-positive breast cancer cells (MCF-7, 3 &#215; 106 cells; shoulder [n = 10] or 4th inguinal mammary fat pad [n = 10]) or ER&#945;-negative breast cancer cells (MDA-MB-231, 1 &#215; 106 cells; mammary fat pad [n = 5]). Mice harboring MCF-7 cells received subcutaneous injections of 20 &#181;g of 17&#946;-estradiol (20 &#181;g/20 &#181;L; corn oil:ethanol, 9:1) in the nape of their necks 2 days prior to cell injection, followed by daily injections five times per week for 5 weeks. Tumor volumes were measured according to the formula: (L*W2)/2 (L; length, W; width). Once tumor volumes reached approximately 100 mm3, 17&#946;-estradiol injections were halted 2 days prior to mice receiving 18F-FES for PET imaging to avoid competitive binding with ER&#945;. Upon 18F-FES administration via the lateral tail vein, PET/MRI was performed for 15 min at 1 h to 1.5 h post-injection. 18F-FES uptake was not observed in ER&#945;-negative, MDA-MB-231 tumor-bearing mice. 18F-FES uptake was most pronounced in mice harboring MCF-7 tumors in the shoulder. In MCF-7 tumors grown in the inguinal mammary fat pad, 18F-FES uptake was less visible, as the intestinal excretion pattern of 18F-FES obscured the radioactivity detectable in these tumors. To use 18F-FES PET as a tool to visualize ER&#945; expression in ER&#945;-positive breast xenografts, we demonstrate that the visibility of 18F-FES uptake is clear in tumors located away from the abdominal region of mice, such as in the shoulder.

Here, we demonstrate a protocol to use 16&#945;-[18F]-fluoro-17&#946;-estradiol (18F-FES) positron emission tomography (PET) as a tool to visualize ER&#945; expression in ER&#945;-positive breast xenografts.

שימוש ב-16α-[18F]-Fluoro-17β-Estradiol PET כדי לדמיין ביטוי α של קולטן אסטרוגן בסרטן שד אנושי Xenografts בעכברים נקבות עם שחלות

To demonstrate how estrogen receptor alpha (ER&#945;) positive breast cancer xenografts may be visualized in BALB/c nude mice using ...

המנגנון של סלידרוסיד בדיכוי נדידת תאי MCF-7 והתפשטותם

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer mechanisms have been only incompletely elucidated. Hence, this protocol intended to decode the potential of Sal in regulating the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway in the malignant proliferation of human breast cancer MCF-7 cells. First, the pharmacological activity of Sal against MCF-7 was evaluated by CCK-8 and cell scratch assays. Moreover, the resistance of MCF-7 cells was measured by migration and Matrigel invasion assays. For cell apoptosis and cycle assays, MCF-7 cells were processed in steps with annexin V-FITC/PI and cell cycle-staining detection kits for flow cytometry analyses, respectively. The levels of reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ were examined by DCFH-DA and Fluo-4 AM immunofluorescence staining. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were determined using the corresponding commercial kits. The protein and gene expression levels in apoptosis and the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway were further determined using western blot and qRT-PCR analyses, respectively. We found that Sal treatment significantly restricted the proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells with dose-dependent effects. Meanwhile, Sal administration also dramatically forced MCF-7 cells to undergo apoptosis and cell cycle arrest. The immunofluorescence tests showed that Sal observably stimulated ROS and Ca2+ production in MCF-7 cells. Further data confirmed that Sal promoted the expression levels of pro-apoptotic proteins, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, and their corresponding genes. Consistently, Sal intervention prominently reduced the expression of the Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1&#945;, and FoxO1 proteins and their corresponding genes. In conclusion, Sal can be used as a potential herb-derived compound for treating breast cancer, as it may reduce the malignant proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells by inhibiting the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway.

מחבר זרקור: חקר המנגנונים המולקולריים של סלידרוסיד בטיפול בסרטן השד 

The present protocol describesa comprehensive strategy for evaluating the pharmacological action and mechanism of salidroside in inhibiting MCF-7 cell proliferation and migration.

חקר הפעולה הפרמקולוגית והמנגנון המולקולרי של סלידרוסיד בעיכוב התרבות ונדידת תאי MCF-7

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

ביולוגית מערכות ויסות חילוף חומרים על ידי איתות קולטן אסטרוגן לסרטן השד

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

A In Vivo אסטרוגן מחסור בעכבר מודל עבור ההקרנה הטיפולים האסטרוגן אקסודוגני של בעיות לב וכלי דם אחרי גיל המעבר

דוגמנות סרטן השד ברקמת השד האנושית באמצעות מערכת מיקרופיזיולוגית

הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב Assay

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

השתנה

שימוש ב-16α-[18F]-Fluoro-17β-Estradiol PET כדי לדמיין ביטוי α של קולטן אסטרוגן בסרטן שד אנושי Xenografts בעכברים נקבות עם שחלות

חקר הפעולה הפרמקולוגית והמנגנון המולקולרי של סלידרוסיד בעיכוב התרבות ונדידת תאי MCF-7

חקר הפעולה הפרמקולוגית והמנגנון המולקולרי של סלידרוסיד בעיכוב התרבות ונדידת תאי MCF-7

חקר הפעולה הפרמקולוגית והמנגנון המולקולרי של סלידרוסיד בעיכוב התרבות ונדידת תאי MCF-7