Name: systems biology of metabolic regulation by estrogen receptor signaling in breast cancer
Uploaded: 2016-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer at JoVE.com

이 작품은 국립 식량 농업 연구소, 농업의 미국학과, 수상 ILLU-698-909 (ZME)과 화이자, Inc의 (ZME)에서 보조금에 의해 지원되었다. 그 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 농무부의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

RNA-SEQ 샘플 1. 준비 <ol><li> 세포 배양 및 치료 <ol><li> 문화 개선 MEM (IMEM)을 더한 10 %의 열 불활성 FBS, 1 % 페니실린 / 가습 된 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 스트렙토 페놀 레드 배지에서 MCF7 세포. 참고 : 동일한 세포주 및 세포 배양 조건을 연구 전반에 걸쳐 사용된다. </li><li> 6 웰 플레이트에 잘 당 종자 10 만 MCF7 세포. 각각의 치료를위한 삼중있다. 3 일에, 매체를 제거하거나 잘 각각 10 -8 M E2없이 2 ml의에게 신선한 매체를 추가합니다. 가습 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 접시를 품어. </li><li> 세포 수확을 위해, 각 웰에 1 ml의 RNA 분리 시약 (산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름)를 첨가하고, 실온 (RT)에서 5 분 동안 배양. 그 후 1.5 ㎖의 튜브에 피펫 예금 의해 파쇄 시약 수집 </li></ol></li><li> RNA 분리 <ol><li> 200 μL chlorofo 추가10 초 동안 1 ml의 세포 용 해물 시약 (1.1.3)와 소용돌이에 RM. 실온에서 5 분간 인큐베이션. 4 ℃에서 15 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기 샘플. 원심 분리 후, 다른 단계를 방해하지 않고 새로운 튜브로 수성 단계 (위)를 전송합니다. </li><li> 전송 된 수성 위상 새로운 튜브에 500 ㎕를 100 % 이소프로판올을 추가하고 반전 섞는다. -20 ° C에서 밤새 품어. 4 ℃에서 10 분 동안 16,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 튜브의 하단에 펠렛을 관찰한다. 뜨는을 취소하고 간단한 소용돌이에 의해 750 μL의 RNase없는 70 % 에탄올로 펠렛을 씻는다. </li><li> 원심 분리기 샘플 4 ° C에서 5 분 6,000 XG에. 상층 액을 제거하고 나머지 모든 에탄올을 수집하기 위해 4 ° C에서 1 분 동안 16,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 10 분 동안 공기 건조에 이르기까지 측 튜브를 겔 로딩 팁 피펫으로 남아있는 에탄올을 제거하고 설정합니다. 에 의존적 20 ~ 50 μL DEPC 처리 수의 펠렛을 해산펠렛의 크기에 땡. </li></ol></li><li> 프로토콜 4 다음 RNA 정화 키트를 사용하여 RNA를 정제 하였다. 프로토콜 9 따르는 대해 형광 계 분석 키트를 사용하여 RNA 농도를 측정한다. 주 : 260 nm에서의 OD는 260 nm에서 OD RNA의 농도 및 비율을 결정하기 위해 수행되며, 280 nm의이 샘플의 순도를 결정하기 위해 사용된다. 이는 바이오 분석기 분석을 사용하여 RNA 품질 검사를 권장합니다. </li><li> 시퀀싱 약 0.5-1 μg의 정제 된 RNA를 가져 가라. 참고 : 생명 공학 센터 시퀀싱 라이브러리를 준비하고 쌍 엔드 이전에 2 상세한 방법을 사용하여 염기 서열을 읽어 수행한다. </li></ol> 칩-SEQ 샘플 2. 준비 <ol><li> 세포 배양 및 치료 <ol><li> 씨앗 성장 매체에서 10cm 접시 당 50 만 MCF7 세포. 참고 : 각각의 풀다운은 16 판을 사용 하였다. 3 일에, 배지를 제거하고 또는 각 10 -8 M E2없이 5 ml의에게 신선한 매체를 추가플레이트. 45 분 (가습 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C)에 대한 세포 치료. </li></ol></li><li> 가교 및 세포 수확 <ol><li> 염색질 가교 실온에서 15 분 동안 배양 5 ㎖ 매체에 250 μL의 37 % 포름 알데히드를 추가한다. 5 ml의 얼음 차가운 1X MEM으로 세포를 세척하여 가교 중지합니다. </li><li> 플레이트 당 250 ㎕의 세포 용해 완충액 (10 mM의 EDTA, 50 mM의 트라이 HCl을 1 % SDS, 0.5 % N, N-dimethyldodecan -1- 아민 옥사이드)에서 세포를 수확. </li></ol></li><li> 염색질의 분열 <ol><li> 염색질 필요한 크기에 도달하는 30 A, 30 초 X 8 세포를 초음파 처리. 30 sec의 초음파 후 얼음에 각각의 샘플을 쿨. </li><li> 원심 분리기 16, 000 4 ° C에서 10 분 동안 XG, 조심스럽게 하단에있는 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 피펫. </li><li> 상층 액의 5 μL 나누어지는을 가지고, 이전 10 설명 된대로 1.5 % 아가 로스 젤을 통해 전기 영동에 의해 DNA의 크기를 확인합니다. 이상적인 크기DNA의 200 ~ 500 bp의 사이에 있어야한다. </li></ol></li><li> 크로 마틴 면역 침전 <ol><li> 입력으로 세포 용 해물 25 μl를 저장합니다. 50 ㎖의 튜브에 20 ㎖의 IP 버퍼 (2 mM의 EDTA, 100 mM의 염화나트륨, 20 mM의 트리스 -HCl 및 0.5 % 트리톤 X) ERα 항체 (500 μL의 F10 500 μL와 세포 용 해물의 4 ml의 혼합 cell에서 reverse 20) 500 μL와 동지 ProtG 단백질 자성 비드 코팅. chromatin- 항체 복합체의 형성을 허용하기 위해 4 ℃로 밤새 회전에 의해 상기 혼합물을 인큐베이션. </li></ol></li><li> 세척과 역 가교 <ol><li> 세척 완충액을 제거하기 위해 자화 측의 자성 비드를 수집하는 자기 받침대를 사용한다. </li><li> 25 ml의 세척 완충액으로 세척 자성 비드 I (2 mM의 EDTA, 20 mM 트리스 염산 01 % SDS, 1 % 트리톤 X 및 150 mM의 염화나트륨). 철저하게 25 ml의 모든 자성 비드가 혼합 잘 위스콘신 때까지 다음 튜브를 반전 측면을 따라 튜브에 천천히 버퍼 씻어 추가, DNA - 단백질 복합체를 방해하지 않고 자기 구슬을 씻어펠릿으로 나타나지 않고 세척 완충액을 토륨. 다른 방법으로, 튜브를 반전하는 회 전자를 사용한다. 샘플 와동하지 마십시오. 다음 단계에서 동일한 방법을 이용하여 상기 자성 비드를 세척 하였다. </li><li> 25 ml의 세척 버퍼 II (2 mM의 EDTA, 20 mM 트리스 염산 01 % SDS, 1 % 트리톤 X, 500 mM의 염화나트륨)에 자기 구슬을 씻으십시오. </li><li> 25 ml의 세척 버퍼 III에 자석 구슬을 씻으 (1.6 mM의 EDTA, 10 mM 트리스 염산, 1 % NP-40, 1 % Dexycholate 250 밀리미터의 LiCl). </li><li> 두 번 25 ㎖의 1X TE 완충액 (1 mM의 EDTA, 10 mM 트리스 염산)에 자석 구슬을 씻으십시오. </li><li> 500 ㎕의 용출 완충액에서 DNA를 용리 (1 % SDS, 10 mM의 NaHCO3을), 그리고 (4) 튜브에 500 ㎕의 DNA 용출을 할당. 입력으로부터의 DNA의 경우, 125 ㎕의 용출 완충액에서 DNA를 용출시킨다. </li><li> 가열 블록에서 밤새 65 ℃에서 인큐베이션 튜브. 심지어 모든 튜브를 통해 열을 유지하기 위해 알루미늄 호일로 가열 블록 튜브 커버. 개방에서 그들을 유지하기 위해 튜브에 무게를 둡니다. &lt;/ 리&gt; </ol></li><li> DNA 분리 <ol><li> 5 분간 RT에서 튜브를 냉각시키고. 칩 DNA 분리 키트를 이용 풀다운 시료로부터 DNA를 분리. 제조업체의 지시 사항을 따르십시오. <ol><li> 65 ℃에서의 용출 완충제를 워밍업. 각 튜브에 결합 완충액 625 μl를 추가합니다. 용액이 선명해질 때까지 침전물을 형성하는 경우, 또 다른 250 μL 바인딩 버퍼를 추가합니다. </li><li> 30 초 동안 16,000 XG에서 열 원심 분리기 상에 샘플을로드합니다. 250 μL 세척 버퍼와 샘플을 씻으십시오. 처음 사용하는 경우에 세척 완충액에 에탄올을 추가해야. 세탁을 반복합니다. </li><li> 15 ㎕의 용출 완충액에서 DNA를 용출시킨다. 동일의 DNA는 약 55 μl의 DNA를 달성하기 위해 4 관에서 풀다운 결합합니다. </li></ol></li><li> 하는 DNA 정제 키트를 사용하여 입력 DNA를 분리. <ol><li> 65 ℃에서의 용출 완충제를 워밍업. 각각의 튜브에 625 μL 바인딩 버퍼를 추가하고 10 분 동안 품어. 2 ML의 collecti에 컬럼에 샘플을로드튜브. </li><li> 1 분 동안 16,000 XG에 750 μL 세척 버퍼, 원심 분리기와 샘플을 씻으십시오. 남아있는 버퍼를 제거하기 위해 원심 분리를 반복합니다. EB 30 μL로 DNA를 용출시킨다. </li></ol></li><li> 수정 (11)와 상업 형광 색소 분석을 사용하여 DNA 농도를 측정한다. <ol><li> 시약 및 DNA 샘플을 희석 세이 버퍼로 1X TE로 20 배 TE 버퍼를 희석. 5 μL를 격리 DNA를 가지고 1X TE 50 μL로 희석. </li><li> 2 μg의 / ㎖ DNA 스톡 용액으로부터 빈 1, 10, 100, 1000 μg의 / ㎖ 범위의 DNA 표준을 만든다. 96 웰 플레이트에서, 25 각 표준의 μL뿐만 아니라 중복의 DNA 희석을 할당합니다. (표준 세중 권장합니다.) </li><li> 플라스틱 튜브로 1X TE 완충액 dsDNA 시약에서 200 배 희석함으로써 작업 시약을 준비한다. 광을 피하기 위해 알루미늄 호일로 작업 시약 용액을 커버. 각 샘플에 시약을 작업 200 μl를 추가합니다. 에서실온에서 5 분간 cubate. 빛을 피하기 위해 알루미늄 호일로 접시를 커버. </li><li> (480 nm의 방출은 520nm에서 여기)를 형광 플레이트 판독기를 사용하여 샘​​플의 형광을 측정한다. DNA 농도에 비해 개화의 DNA 표준 곡선을 생성합니다. 생성 된 DNA를 표준 곡선에 기초하여, 시료의 농도를 결정한다. </li></ol></li></ol></li><li> qPCR에 사용 칩 실험의 검증 <ol><li> DNA를 분리하고 물에 20 μL로 희석 2 μl를 가져 가라. 2.5 ㎕의 DNA 희석, 5 ㎕를 그린 I PCR 마스터 믹스, 1 μL 프라이머, 1.5 μL 클레아없는 물을 혼합하여 세중의 qPCR에 반응을 설정합니다. </li><li> 다음과 같은 프로그램을 사용하여 빠른 리얼 타임 PCR 시스템으로 qPCR에를 실행 1 단계 : 95 ° C 60 초, 단계 2 : 60 초, 2 단계를 반복 39 회 10 초 95 ° C, 60 ° C. </li></ol></li><li> 시퀀싱 생명 공학 센터 10 NG의 DNA 샘플을 보낼 수 있습니다. 참고 : BIOTEC시간 센터는 지시에 따라 라이브러리에 칩 DNA를 준비하고, 이전에 2 상세한 방법을 사용하여 하나의 읽기 순서를 수행한다. </li></ol> 3. 대사 체학 분석 샘플 준비 <ol><li> 세포 배양 및 치료 <ol><li> 씨앗 성장 매체에서 10cm 접시 당 40 만 MCF7 세포. 각각의 치료를 위해 3 개의 시료를 준비합니다. 검출을위한 충분한 세포를 받기 위해 각 샘플에 두 접시를 사용합니다. 3 일에, 배지를 제거하고 세포 또는 10-8 M E2없이 5 ml의에게 신선한 매체를 추가합니다. 24 시간 (가습 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C)에 대한 세포 치료. </li></ol></li><li> 샘플 컬렉션 <ol><li> 플레이트에 PBS 1X 5 ml의 얼음 차가운 추가 간략 판을 여러 번 틸팅 후 PBS를 대기음. 두 번 반복하고, 마지막 세척 후 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다. </li><li> 각각의 판에 미리 차가운 아세톤 750 μl를 추가하고 세포를 긁어. 두 플레이트로부터 아세톤 세포 수확기얼음에 2 ML 튜브에. </li><li> 정상화 세포 수 <ol><li> 각각의 치료를위한 세포 정량이 추가 플레이트를 사용합니다. 하려면 플레이트에서 세포를 탈 부착 HE 각 플레이트에 (1X HBSS, 10 mM의 HEPES, 0.075 %의 NaHCO3, 1 mM의 EDTA)를 버퍼 및 5 분 동안 품어 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 수집하고 HE 버퍼에 세포를 피펫 팅하여 잘 세포를 섞는다. 혈구를 사용하여 세포 수를 계산하는 20 ㎕의 세포 용액의 총을 사용합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 식별하고, 가스 크로마토 그래피 질량 분석법 (GC-MS) 분석을 이용하여 대사 물질을 정량 할 대사 체학 센터로 전송하기 전에 -80 ° C에서 샘플들을 저장한다. </li></ol> 4. 통합적인 분석 <ol><li> RNA-서열 데이터 분석 : <ol><li> FastQC를 사용하여 FASTQ 파일의 품질 검사를 수행 읽기 QC (http://galaxy.illinois.edu) <ol><li> FastQC를 선택 NGS의 도구에서 읽기 : 품질 관리 및 조작. 현재 histor에서 원시 데이터 파일을 업로드와이. 참고 : 출력 파일 작업이 다중 출력이있을 수 있으므로에 대해 무엇을 생각 나게하는 제목을 제공하는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 실행하고 출력 파일은 역사에 표시됩니다. 각 시퀀스 파일에 대한 동일한 절차를 반복한다. FASTX 툴킷 : NGS에서 클립을 사용하여 트림 어댑터. </li><li> 정렬이 나온 RefSeq 게놈 참조 주석 12 (기본값)으로 Tophat2를 사용 hg19을 읽습니다. <ol><li> NGS의 도구에서 Tophat2을 선택 RNA 분석. 라이브러리 쌍 유형 (쌍 엔드 대 단일 엔드)을 표시합니다. </li><li> 현재 역사의 입력 FASTQ 파일을 업로드합니다. 참조 게놈을 선택합니다. 기본값으로 설정을 선택합니다. 또는 수정 전체 매개 변수 목록을 사용합니다. </li><li> 실행하고 두 개의 출력 파일을 생성합니다 : 하나의 접합의 UCSC 침대 곡을; 다른 하나는 BAM 형식으로 읽기 정렬의 목록입니다. </li></ol></li><li> 시퀀싱 데이터 분석 도구에 BAM 파일을 업로드합니다. 정량적하여 식 값을 계산형 치수 도구. </li><li> 기본값을 사용하여 표현 분석 도구를 사용하여 차등 상향 조절 유전자를 확인하고 변경&gt; 2, p 값이 &lt;0.05 배. 마찬가지로, 기본값을 사용하여 표현 분석 도구를 사용하여 차등 하향 조절 유전자를 식별하고 변경 &lt;0.5 p- 값 &lt;0.05 배. </li></ol></li><li> 칩 - 서열 데이터 분석 : <ol><li> 정렬 FASTQ 갤럭시에 Bowtie2 13 (기본값)를 사용하여 hg19에 읽어들입니다. <ol><li> NSC의 도구에서 Bowtie2를 선택 매핑. 라이브러리가 동료-쌍 (쌍 엔드 대 단일 엔드) 인 경우 확인합니다. 현재의 역사에서 FASTQ 파일을 업로드합니다. </li><li> 참조 게놈을 선택합니다. 기본 매개 변수 설정을 사용합니다. 실행 및 매핑 순서가 BAM 파일로 읽어와 출력 파일을 생성합니다. 모든 시퀀스 파일에 대해이 절차를 반복합니다. </li></ol></li><li> 이전에 2 설명 된 바와 같이, MACS (14) 6.0E-7의 p- 값 컷오프 0.01의 FDR을 사용하여 봉우리를 식별합니다. </li></올&gt; </li><li> 대사 체학 데이터 분석 : <ol><li> KEGG_IDs에 대사 산물의 화학 이름을 변환합니다. </li><li> VS. E2 차량 검출 레벨을 비교하여 차별적으로 조절 대사를 확인하고 (2 배 컷오프가 본 연구에 사용 된) 샘플을 처리 하였다. </li></ol></li><li> 통합 분석 : <ol><li> 시퀀싱 데이터 분석 도구를 사용하여 ERα 결합 부위가 유전자를 식별합니다. 거리의 차단으로 20킬로바이트를 사용하여 유전자 기능에 지역을 번역합니다. </li><li> 차단으로 각각 p- 값 &lt;0.05로, 배 변경&gt; (2)를 사용하여 RNA-서열 데이터 분석에서 차동 위쪽 및 아래쪽 조절 유전자를 확인하고 변경 &lt;0.5 배. 벤 다이어그램을 비교하여 ERα 바인딩 사이트를 함유하는 유전자의 목록과 비교한다. </li><li> Cytoscape의 Metscape 15 모듈을 사용하여 E2 변조 대사 경로를 식별하기 위해이 목록을 사용합니다. <ol><li> 앱 Metscape 모듈을 선택하여 네트워크 다음 경로-BAS 빌드 선택에드 옵션을 선택합니다. </li><li> 유기체 (인간)을 선택합니다. E2 제어형 화합물 목록 선택 데이터 파일 (KEGG ID)는도 E2 유전자 목록을 조절. </li><li> 네트워크 유형으로 -Reaction -Enzyme - 유전자 및 화합물 선택합니다. 쿼리와 같은 화합물 / 유전자를 선택합니다. </li><li> 네트워크를 구축 할 수 있습니다. E2를 하향 조절 화합물 및 유전자를 사용하여 반복합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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일리노이 대학은 화이자 ZME에서 탐정 개시 허가를받은 YCZ이 기금에서 급여 지원을 받았다.

본 논문에서는 E2로 치료 MCF-7 세포에서 생성 및 RNA-서열, 칩 - 서열 및 대사 체학 데이터의 통합 분석을 설명했다. 우리는 생물학적으로 중요한 발견을 생산하는 가장 효율적인 방법과 사용자 친화적 인 부드러운 상품을 활용하는 전략 수립 프로토콜을 개발. 우리의 지식으로, 우리는 세 가지 분석 ERα 직접 유방암 세포 규제 식별 새로운 대사 경로에서 -omics 데이터를 통합하는 최초의 연구이다. Transcriptomics 성공적인 transcriptomic 분석을위한 고품질의 RNA를 시작하는 것이 중요합니다. 좋은 방법은,의 RNase없는 벤치를 만들어 자주 장갑을 변경, C °에서 -80 저장하고 사용 얼음에 유지를 포함하여 RNA 분해의 가능성을 제거합니다. -20 ºC에서 하룻밤 배양의 추가는 RNA 복구를 향상시킨다. 반복 동결 융해의 RNA를 방지하기 위해, 하나는 다운 스트림 procedur의 RNA를 할당 할 수단리 및 정제시 에스. 시퀀싱 에러의 존재는 샘플로부터의 cDNA를 사용 QRT-PCR 종종 RNA-SEQ에서 식별 발현 된 유전자를 확인하기 위해 수행된다. 따라서, 충분한 RNA는이 목적을 위해 할당한다. 우리는 스플 라이스 변형, 비 코딩 RNA를과의 miRNAs를 분석하기 위해 우리가 할 수 쌍 엔드 시퀀싱을 수행합니다. 높은 시퀀싱 비용을 피하기 위해, 단일 엔드 시퀀싱뿐만 아니라 수행 할 수있다. 마이크로 어레이에 비해 RNA-SEQ 더 민감하고 칩에 형성된 프로브에 한정되지 않는다. 우리는 코딩 서열에뿐만 아니라, 비 - 코딩 유전자 전 사체에 접합 차동뿐만 아니라 정보를 획득. 현재는 쥐 실험에서 얻어진 리간드 치료뿐만 아니라 조직 후 다양한 세포주의 전 사체 분석을 위해이 기술을 사용한다. Cistromics 초고 처리량 시퀀싱 방법은 라이브러리 생성을위한 최소한 5 ng의 DNA 칩을 필요로한다. 표준 장에서IP-SEQ 프로토콜 (18), 적어도 10 NG를하는 것이 좋습니다. 형광 측정으로 정량 중요합니다. 이 프로토콜에서 우리는 DNA의 농도를 결정하는 이중 가닥 DNA 검출 분석을 사용 하였다. 하나는 정확한 DNA 정량을위한 형광 분석을 사용할 수 있습니다. 각 실험 바람직한 DNA 단편의 크기를 생성하는 자신의 초음파 프로토콜을 확립하기위한 장비 및 재료의 차이에 대해, 매우 중요하다. 오버 전단 큰 사이즈의 칩의 DNA를 효율적으로 시퀀싱에 대한 문제를 만드는 동안 대상의 DNA를 농축의 손실이 발생할 수있는 칩 DNA를. 서열로 DNA를 제출하기 전에, qPCR에 의해 몇 가지 알려진 영역 농축을 확인하는 것이 중요하다. 이 기술은 여전히​​ 면역 침전에 사용되는 항체의 효율성 및 특이성에 의해 제한된다. 확실하게 비교 분석에 사용될 수있는 결합 부위의 정보를 얻으려면, 우리는 ENCODE 칩 서열 표준에 다음과 같은 우리의 시약을 확인, 19 및 사용 standar을일관된 데이터 세트를 제공 dized 프로토콜. 이후 전사 인자 결합 부위 농축 분석 결합 칩 서열 여전히 염색질로 전사 인자의 직접적인 결합을 결정하는 가장 좋은 방법 중 하나이다. 현재는 다른 세포주뿐만 아니라 에스트로겐 응답 마우스 조직에서 염색질을 채용 키나제 coregulators 및 다른 전사 인자를 연구하기 위해,이 프로토콜을 이용하고있다. 대사 체학 인간의 유방암 세포에서 성공적인 대사 프로파일 들어 조심 샘플 준비는 매우 중요하다. 이 프로토콜에서 사용하고 세포 배양 조건에서 세포의 양은 MCF7 세포에 적합하다. 다른 세포주 대사 상당수의 검출을위한 더 많거나 적은 세포가 필요할 수 있습니다. 우리는 각각의 실험에서 100 대사를 주위에 얻을 수 있습니다. 이 방법은 낮은 농도로 존재하는 단명 대사 또는 대사 산물의 검출 제한됩니다. 이 방법은 USI의 용이성을 제공한다하나의 샘플 준비를 ng를하는 것은 여러 대사 산물을 식별합니다. 우리는 현재 혈청 및 마우스의 다양한 조직에서 에스트로겐 규제 대사를 식별하기 위해이 기술을 사용하고 있습니다. 데이터 통합 수많은 transcriptomics 및 cistromics 연구는 MCF7 세포 2,5-7,20 포함 유방암 세포에서 에스트로겐 시그널링 및 유전자 조절을 조사하기 위하여 수행 하였다. 본 연구에서 최초로, 우리는 대사 체학 데이터를 직접 첨가 리간드 첨가시 ERα 의해 조절되는 대사성 네트워크를 추정하려고. 이 새로운 접근 방식은 세포 대사에 영향을 미칠 에스트로겐에 의해 조절 점 분자 회로들을 핀 할 수있게. 전반적으로, 우리의 연구 결과는 유방암 생물학의 마스터 레귤레이터로 ERα의 역할을 지원합니다. 요약하면, 우리는 integr 치료 후 에스트로겐과 RNA-SEQ 유방암 세포 칩 서열 및 대사 체학의 샘플 생성을 위해 프로토콜의 세부 개론을 제공이 -omics 방식에서 얻은 데이터의 극상 분석. 이러한 프로토콜은 다른 전사 인자의 핵 수용체 리간드 영양 조건 유사한 분석을 수행하는 연구자있게된다.

에스트로겐은 생식 조직, 대사 조직, 뇌와 뼈 하나를 포함하여 모두 여성과 남성의 많은 생리 학적 과정의 중요한 규제입니다. 이 조직에서의 유익한 효과에 더하여, 에스트로겐은 유방 및 생식 조직에서 발생하는 암을 구동한다. 에스트로겐은 주로 세포 유형 특정한 효과를 유도 ERS를 통해 작동한다. 칩-서열을 이용하여 RNA-서열 및 게놈 전체 ERα DNA 결합 부위 분석을 사용 ERα에 의해 규제 성적 증명서의 깊은 순서는 ERα 그들로부터 발생하는 다른 조직과 암에서 어떻게 작동하는지 이해하는 데 유용한 것으로 입증되었다. 우리와 다른 유전자 발현 (ERβ 대 ERα) 다른 수용체와 관련된 프로파일 2, 3, 다른 리간드 3-5 다른 coregulators 2,4,6,7를 발표했다. RNA-서열은 마이크로 어레이 바에 비해 높은 정밀도와 효율성을 제공하는 전 사체를 검사하는 주요 방법입니다SED의 유전자 발현 분석 (8). 세포주 2-4,7, 조직 또는 종양 샘플에서 얻은 RNA 게놈이 가능한 어셈블리에 매핑 서열화되고 차등 조절 유전자 식별된다. 염색질 면역 침전 (칩)은 알려진 규정 결합 부위에 결합하는 전사 인자와 coregulator 염색질을 해부하기 위해 사용된다. 칩-SEQ (높은 처리량 시퀀싱 뒤에 칩)는 글로벌 결합 부위의 편견 검출을 제공한다. 대사 체학은 다른 점점 사용하는 시스템 생물학 접근, 정량적으로 측정, 화학 물질 및 유전 적 교란 등의 다양한 자극에 살아있는 시스템의 동적 multiparametric 반응이다. 글로벌 대사 프로파일 링을 수행하여, 판독 기능은 세포, 조직 및 혈액에서 수득 할 수있다. 또한, 사체 실험에​​서 정보는 항상 생화학 적 경로에 기여하는 효소의 수준에서 실제 변화를 반영하지 않습니다. 결합 된사체 및 대사 체 데이터의 분석을 확인하고 실제 대사 산물의 변화와 유전자 발현의 변화의 상관 관계를 우리에게 있습니다. 이러한 대규모 데이터 집합은 기계적 세부 사항을 제공 모두로부터 정보를 모으고 복잡한 생물학적 시스템, 인간 발달과 암, 당뇨병과 같은 질환들에 관련된 특히 조절 전사 인자의 역할을 이해한다. 포유 동물 게놈의 복잡한 본질은 도전 통합 완전히 사체, cistrome 대사 체 및 실험으로부터 얻은 데이터를 해석 할 수있다. 일단 기능적 결합 부위가 확인되어 있기 때문에 표적 유전자의 발현에 중요한 변화를 초래할 것이다 기능적 바인딩 이벤트를 식별하는 단계; 전사 바인딩 (TF) 모티브 분석을 포함, 분석 계속되는, 높은 정밀도로 수행 될 수있다. 이는 생물학적으로 의미있는 TF 캐스케이드 및 메커니즘의 식별을 이끈다. 또한 직접 comparis각 실험의 데이터가 저울과 소음을 다른 어떤 경우에는 의미있는 신호가 인구 노이즈에 의해 가려하는이 있기 때문에 RNA-서열 및 칩-SEQ 실험에 항상 가능한 것은 아니다. 우리는 유방암에 ERα에 의해 직접 신진 대사 조절을 이해하는 세 가지 독립적이지만 관련 접근 방식에서 정보를 통합하는 연구의 인식하지 못합니다. 따라서, 본 논문에서 우리의 전반적인 목표는 유전자 발현 및 대사 산물의 변화에​​ 생산 바인딩 이벤트를 관련하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해, 우리는 RNA-SEQ 칩-SEQ와 대사 체학 실험으로부터 데이터를 통합 및 대사 경로에서의 유전자 발현 변화를 야기 할 이벤트를 결합 ERα 유도 이러한 에스트로겐을 확인 하였다. 처음으로, 우리는 유방의 대사를 조절하는 신규 한 유전자 회로를 밝히기 위해서 칩 서열, RNA-SEQ와 대사 체학 프로파일을 생성하고, 상기 데이터의 통합 분석을 수행하기위한 프로토콜 (도 1)의 완전한 세트를 제공 할암 세포주.

<table><tbody><tr><td>Triglyceride Mix</td><td>Sigma</td><td>17810-1AMP-S</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O1257-10MG</td><td>Oleic Acid-Water Soluble powder&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>10006D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>10007D</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td>DNA isolation of input sample&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ZYMO ChIP-DNA Isolation kit&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research&amp;nbsp;</td><td>D5205</td><td>ChIP DNA Clean &amp;amp; Concentrator</td></tr><tr><td>Quant-iT&amp;ordf; PicoGreen&amp;uml; dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>P7589</td><td>DNA Quantitation</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>RNA purification</td></tr><tr><td>DEPC Treated Water&amp;nbsp;</td><td>LIFE TECH</td><td>462224</td><td>Dnase/Rnase Free</td></tr><tr><td>Model 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>FB120110</td><td>With 1/8 probe&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Fisher Scientific Sound Enclosure</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>FB-432-A</td><td>For sound reduction</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Eppendorf Tubes 5.0 ml</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>0030 119.401</td><td>200 tubes (2 bags of 100 ea.)</td></tr><tr><td>Random Primer Mix&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>DNTP MIX</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td><td>NEB</td><td>M0253S</td><td></td></tr><tr><td>FastStart SYBR Green Master</td><td>ROCHE</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP160100</td><td>1.5% agarose gel&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>Q32852</td><td>RNA quantification (100 assays)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor tablets&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>4693116001</td><td>Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer</td></tr><tr><td>PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>4906845001</td><td>Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer</td></tr><tr><td>Qubit Assay Kits</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>Q32850</td><td>For 100 assays</td></tr><tr><td>Automated cell counter</td><td>ORFLO</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>tube Rotator&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5 Multilple plate reader&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Diagenode</td><td>B04000001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fast Real-time PCR system</td><td>Applied Science&amp;nbsp;</td><td>4351405</td><td></td></tr></tbody></table>

systems biology of metabolic regulation by estrogen receptor signaling in breast cancer

-omics의 출현으로 암과 대사 증후군과 같은 만성 질환에 대한 우리의 이해가 개선 된 접근한다. 그러나, 유전자 발현 마이크로 어레이 깊이 순서화 실험 대사 프로파일로부터 획득되는 대규모 데이터 집합의 정보를 효과적으로 마이닝 발견하는 것이 필수적이다하고 효과적으로 병든 세포 표현형의 중요한 표적 레귤레이터. 에스트로겐 수용체 α (ERα)은 에스트로겐 반응 유방암에 중요한 유전자 프로그램을 조절하는 마스터 전사 인자 중 하나입니다. ERα는 유방암 대사에 신호의 역할을 이해하기 위해서 우리는 에스트라 디올로 치료 MCF-7 세포에서 transcriptomic cistromic 및 메타 볼로 데이터를 이용했다. 이 보고서에서 우리는 RNA-서열, 칩 - 서열 및 대사 체학 실험 얻어진 데이터의 통합 전산 분석을 위해 샘플의 생성을 설명했다. 이 방법은 새로운 몰을 서술에 유용하다정상 또는 병에 걸린 세포의 영향 대사 특정 전사 인자에 의해 조절된다 큘라 메커니즘과 유전자 조절 회로.

Transcriptomics E2 처리에 의한 차등 발현 유전자를 분석하기 위해, 우리는 RNA-SEQ 실험을 수행하기로 결정했습니다. mRNA 수준에 대한 정보를 제공 할뿐만 아니라, RNA-SEQ 데이터는 비 코딩 RNA를 (길이 비 코딩 RNA를, 마이크로 RNA)와 스 플라이 싱 이벤트의 변화를 모니터링하기 위해 사용될 수있다. 본 연구의 범위는 대사 조절에 중요​​한 단백질 코딩 유전자를 식별하기 때문에 우리는 RNA를 코딩 비 또는 대안 전사 유전자의 분석에 대한 정보를 제공하지 않았다. 그러나, RNA-SEQ 차등 유전자 발현 이벤트에 대한 정보를 얻을 수있는 훌륭한 방법이다. 고품질 판독 얻기 위해서는 고순도의 RNA를 얻기 위해 중요하다. RNA를 분리 한 후 우리는 RNA 청소 키트를 사용하여 RNA를 정제 하였다. 불행하게도 RNA의 약 50 %는이 과정에서 손실되고 RNA를 시작의 양이 C로 이동해야onsideration 정제 공정의 마지막에 필요한 양 (100-500 NG)을 얻었다. 우리는 매우 정확하며 미량 RNA의 정량 선호하는 방법입니다 형광 RNA HS 분석을 사용하여 RNA 수율을 정량화. 다음에, RNA 샘플의 무결성 및 전반적인 품질은 RNA의 최소량을 사용하여 겔 전기 대안이다 bioanlayzer을 이용하여 조사 하였다. 분석은 모든 샘플이 샘플 (그림 2B)의 무결성과 순도를 나타내는 18S와 28S rRNAs의 선명하고 깨끗한 밴드를 보여줍니다. RNA 무결성 번호 (RIN)은 RNA의 품질 관리를위한 기준으로 사용되었다. RIN (10)는 그대로 RNA를 나타내고, RIN 6 부분적으로 저하 및 RIN3 강하게 (16)을 분해. RIN은 시퀀싱 실험을 위해 최소 7 할 것을 권장합니다. 우리 RNA 샘플 모두는 9.6-9.9 사이 RIN 값을 수신 &lt;강한&gt; (그림 2A). 시퀀싱 라이브러리는 다운 스트림에 대한 준비 각 샘플 (표 1)에 대해 획득 된 판독 평균 18,000,000 고품질 시퀀싱 Illumina 사 (2500)로서 매우 높은 처리량 서열화 시스템을 사용하여 각 샘플에서 고품질 RNA의 500ng에서 생성 된 분석. 높은 처리량 시퀀스 원시 데이터의 전반적인 품질을 확인하려면 FastQC 각 샘플의 판독을 위해 실행되었습니다. 한 차량 RNA-서열 데이터에 대한 대표적인 FastQC 보고서는 (그림 3) 줬습니다. (가) 대부분의 판독 시퀀스 길이는 약 100 염기쌍 (도 3A)이었다. 각각의 읽기, 품질 평가 점수는 제 5 BP에 대한 32 ~ 34과 6-100bp (그림 3B) 36-38이었다. 17990863이 시료로부터 생성 된 판독 중 대부분은보다 높은 품질 (34) (도 3c)를 점수였다. 시퀀스에서 판독 당 GC 함량은 48 %의 GC의 평균 정규 분포를 따랐다. 전반적으로 품질(가) 읽기의 점수는 매우 높았다. ERα 결합 부위의 Cistromic 분석 바람직한 크기 DNA 단편을 수득 효율적 깊은 시퀀싱을 달성하기 중요한 요소 중 하나이다. 현재 시퀀싱 방법은 예를 들어, 매우 높은 처리량 시퀀싱 시스템 300-600 BP, 쏠리 AB / 17 100-200 염기쌍을 DNA 조각에 다른 요구 사항이있을 수 있습니다. 이 실험에서, DNA 단편의 대부분은 300 bp의 600 bp의 겔과 같이 (도 4) 사이에있다. 대안으로, 독자 그러나 우리는 우리의 설립 프로토콜은 높은 품질 필요한 샘플을 제공하고 재현 가능한 결과를 제공 느낌 MNase의 소화를 사용하여 염색질을 준비하기로 결정했습니다 수 있습니다. 각 치료에서 DNA와 해당 입력 샘플의 열 NG는 EB 완충액을 제조 하였다. DNA 칩은 매우 높은 처리량 시퀀싱 시스템을 사용하여 서열화 단일 판독 하였다. DNA 칩 샘플에 대해 수득입력 DNA가 35.000,000는 (표 1)를 읽어보다 더 굴복하면서 20000000 읽습니다. 대사 체학 GCMS를 이용하여 포유류 세포에서 대사 산물을 정량하기 위해 세포 질량의 적어도 10 μg의 필요하다. 우리는 실험과 40 MCF7 세포에서 시작되었다. 수확의 시간으로 각 접시에 약 50 만 세포가 있었다. 피크로 표시되는 대사의 개요 제어 및 에스트라 디올 처리 샘플 (도 5)를 비교 하였다. mammalians에 공지 전체의 60 %에 대해 계산 된 식별 정보 (100) 대사. 여기에서 우리는 E2 치료 (표 2)에 상당한 변화를 보여 상위 10 대사 산물의 목록을 제시한다. 전반적으로, E2는 프럭 토스 및 만노스 대사 히스티딘 대사 퓨린 대사, 콜레스테롤 생합성 비타민 B3 대사 경로를 포함한 상향 조절. 하향 조절 경로이었다 부타 metabolism, 새로이 지방산 생합성, 펜 토스 포스페이트 경로, 요소 회로 및 아르기닌 대사 (표 3). 데이터 분석 및 통합 RNA-SEQ 칩-SEQ와 GC-MS로부터 데이터가 RNA-SEQ 칩-SEQ에서 확인 된 유전자와 비교 한 결과. 단계 (도 6)의 일련의 처리 및 분석 하였다 상향 - 조절 한 세트 및 에스트라 디올에 의해 하향 조절 유전자 한 세트를 추출 하였다. 대사 데이터에서, 우리는 에스트라 디올 처리에 의해 위, 아래로 조절 화합물의 두 세트를 획득했습니다. 다음으로 시각화하고 인간의 신진 대사 (15)의 맥락에서 유전자 발현 및 대사 데이터를 해석, Metscape, Cytoscape에 대한 응용 프로그램을 사용했다. 먼저 우리는 네트워크의 화합물의 구성 요소, 반응, 효소, 유전자를 포함하기로 결정했습니다. 우리는 화합물 / 쿼리와 같은 유전자와 두 E2까지 규제 (도 7a)의 네트워크와 다운 선택-regulation (그림 7B)를 나타내었다. Metscape 또한 선택적 경로에 네트워크를 구축 할 수있는 옵션을 제공합니다. 예를 들어, 다운 - 조절 전체 네트워크 구축 등의 데이터의 동일한 세트를 이용하여, 안드로겐 호르몬 생합성 대사 경로의 서브 네트워크는 특정 경로로 화합물 / 유전자로부터 쿼리를 전환하여 생성 하였다. 큰 변화와 유전자 또는 화합물을 밝은 색으로 강조했다. 한 바와 같이, 드롭 다운 창에서 특정 경로를 선택하는 외에, 하나는 선택된 영역에 &quot;서브 네트워크를 생성&quot;기능을 적용하여 서브 네트워크를 생성 할 수있다. 도 6A 및 B, ERα 활성화 및 유전자 조절 영역에 직접 결합에 도시 된 바와 같이 유방암 세포에서 많은 대사 경로 영향. 우리 통합 분석은 ERα 직접 (F가 결합하고 새로이 지방산 생합성 경로에 중요 FASN 유전자의 발현을 조절하는 것으로 나타났다igure 7C). 또한 E2 처리는 다음 경로에 CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, TPO, GSTA4 및 GSTM2의 발현을 억압에 의해 안드로겐 에스트로겐 생합성 경로를 하향 조절. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig1.jpg" /> 그림 1 : RNA-서열, 칩 - 서열, 및 대사 체 분석을위한 RNA, DNA의 샘플 및 세포 용 해물의 준비의 워크 플로우. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig2.jpg" /> 그림 2 :. 애질런트 2100 Bioanalyzer RNA 무결성 번호 (RIN), RNA 품질의 지표로 분석 된 RNA를의 대표적인 electropherogram은 9.9로 분석에 의해 주어졌다. RNA의의 가상 젤 그림에 (A)의 26S와 18S의 두 밴드는 날카로운 샘플. (B) t에서 개별 추적의 형광 신호그는 RNA가 28S 피크의 강도가보다 큰 18S 피크가 있음을 보여주고 더 오염이 보이지 않는다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig3.jpg" /> 도 3 :. RNA-SEQ 원 데이터에 대표 품질 검사 차량 샘플의 시퀀스 데이터 중 하나 FastQC를 사용하여 분석 하였다. (A) 100 bp의 인 라이브러리의 시퀀스 길이 분포. (B) 읽기의 위치를 따라 품질 평가 점수. (C) 순서에 따라 품질 점수는 모든 시퀀스의 보편적 높은 품질을 보여 주었다. (D) 이론적 분포와 일치 읽기 당 GC 함량. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig3large.jpg" target="_blank">라를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 rger 버전입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig4.jpg" /> 도 4 : 초음파 염색질 단편을 겔 전기 영동에 각 시료의 세포 용 해물의 5 μL 첫 차선의 1000 bp의 플러스 사다리 1.5 % 아가 로스 겔상에서 실행 하였다.. 조각의 대부분은 혈압 (300) 사이에 600.있는 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig5.jpg" /> 그림 5 :. GC-MS에서 대사를 나타내는 피크의 개요 상단 패널은 컨트롤에서 하부 패널 동안 E2 처리 된 샘플에서 확인 된 피크를 보여줍니다. 에 방 아파트 된 밀폐 지역은 각각의 페이지로 표시되는 정확한 대사를 표시합니다<html> eak. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53832/53832fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig6.jpg" /> 그림 6 : 통합적인 클러스터링 방법의 흐름도. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53832/53832fig7.jpg" /> 그림 7 : Metscape에서 통합 된 유전자의 대사 산물 데이터의 시각화 (A) E2에 의해 조절이 최대 경로의 네트워크.. (B) E2로 하향 조정 경로의 네트워크. (C) E2는 서브 함수를 적용함으로써 생성되는 새로이 지방산 생합성 네트워크에서 조절되는 것으로 발견 FASN의 인근 지역에 ERα 채용 자극.3832fig7large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/53832/53832table1.jpg" /> 표 1 : RNA-서열 및 칩 서열의 매우 높은 처리량 시퀀싱의 요약. <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/53832/53832table2.jpg" /> 표 2 : E2 처리에 상당한 변화와 상위 10 대사 산물의 목록입니다. <img alt="표 3" src="/files/ftp_upload/53832/53832table3.jpg" /> 표 3 : 진학 위쪽 및 아래쪽 규제 E2 처리에 의해.

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Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

유방암에서 에스트로겐 수용체 신호 전달에 의해 대사 규제 시스템 생물학

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.3K 조회수.  University of Illinois, Urbana-Champaign. Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol. 

비디오: Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning display increased atherosclerotic lesions in the aorta compared with female mice with intact ovarian function. However, laboratory models involving estrogen-deficient mice with atherosclerosis-prone status are lacking. This deficit is crucial because clinical estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of pre-existing or ongoing lipid disruption and atherosclerosis. In this study, we establish an in vivo estrogen-deficient mouse model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apolipoprotein E (apoE)-/- mice. We then compare the effects of 17&#946;-estradiol and pseudoprotodioscin (PPD) (a phytoestrogen) perorally administered via hazelnut spread. We find that although PPD exerts some effect on reducing final body weight and plasma TG in OVX apoE-/- mice, it has anti-atherosclerotic and cardiac-protective capacities comparable with its 17&#946;-estradiol counterpart. PPD is a phytoestrogen that has been reported to exert anti-tumor properties. Thus, the proposed method is applicable for screening phytoestrogens via peroral administration to substitute for traditional hormone replacement therapy in postmenopausal women, which has been reported to have potentially deleterious tumorigenetic capacity. Peroral administration via hazelnut spread is noninvasive, rendering it widely applicable to many patients. This article contains step-by-step demonstrations of bilateral ovariectomy via the double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice and peroral 17&#946;-estradiol or phytoestrogen hormone replacement via hazelnut spread. Plasma lipid and cardiovascular function analyses using echocardiography follow.

Clinically, estrogen deficiency in menopausal women may aggravate the incidence of lipid disruption and atherosclerosis. We established an in vivo estrogen deficiency model by bilateral ovariectomy via a double dorsal-lateral incision in apoE-/- mice. The mouse model is applicable for screening exogenous estrogen treatments of cardiovascular dysfunction after menopause.

폐경 후 심장 혈관 기능 장애의 외인성 에스트로겐 치료를 선별하기위한 생체 내 에스트로겐 결핍 마우스 모델

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

연구

생화학

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

암 연구학

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in the vertebrates that consume them, such as endocrine function. Phytoestrogens, the most well studied endocrine-active phytochemicals, directly interact with the hypothalamo-pituitary gonadal axis of the vertebrate endocrine system. Here we present the novel use of a cell-based assay to screen plant extracts for the presence of compounds that have estrogenic biological activity. This assay uses mammalian cells engineered to highly express estrogen receptor beta (ER&#946;) and that have been transfected with a luciferase gene. Exposure to compounds with estrogenic activity results in the cells producing light. This assay is a reliable and simple way to test for biological estrogenic activity. It has several improvements over transient transfection assays, most notably, ease of use, the stability of the cells, and the sensitivity of the assay.

We have optimized a commercially available estrogen receptor &#946; reporter assay for screening human and nonhuman primate foods for estrogenic activity. We validated this assay by showing that the known estrogenic human food soy registers high, while other foods show no activity.

세포 기반 에스트로겐 수용체를 사용하여 식물에스트로겐에 대한 검사 β 리포터 분석

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

의학

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

수정<em&gt; 시험관</em&gt; 침공 분석은 호르몬, 중재 암 세포 침략의 사이토 카인 및 / 또는 성장 인자의 잠재적 인 역할을 확인하는

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

<em&gt; 생체 내</em&gt; 모델은 인간의 유방암에서 호르몬 행동을 연구하기 위해

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Using 16&#945;-[18F]-Fluoro-17&#946;-Estradiol PET to Visualize Estrogen Receptor &#945; Expression in Human Breast Cancer Xenografts in Female Ovariectomized Mice

To demonstrate how estrogen receptor alpha (ER&#945;) positive breast cancer xenografts may be visualized in BALB/c nude mice using 16&#945;-[18F]-fluoro-17&#946;-estradiol (18F-FES) positron emission tomography (PET), ovariectomized BALB/c nude mice were injected with ER&#945;-positive breast cancer cells (MCF-7, 3 &#215; 106 cells; shoulder [n = 10] or 4th inguinal mammary fat pad [n = 10]) or ER&#945;-negative breast cancer cells (MDA-MB-231, 1 &#215; 106 cells; mammary fat pad [n = 5]). Mice harboring MCF-7 cells received subcutaneous injections of 20 &#181;g of 17&#946;-estradiol (20 &#181;g/20 &#181;L; corn oil:ethanol, 9:1) in the nape of their necks 2 days prior to cell injection, followed by daily injections five times per week for 5 weeks. Tumor volumes were measured according to the formula: (L*W2)/2 (L; length, W; width). Once tumor volumes reached approximately 100 mm3, 17&#946;-estradiol injections were halted 2 days prior to mice receiving 18F-FES for PET imaging to avoid competitive binding with ER&#945;. Upon 18F-FES administration via the lateral tail vein, PET/MRI was performed for 15 min at 1 h to 1.5 h post-injection. 18F-FES uptake was not observed in ER&#945;-negative, MDA-MB-231 tumor-bearing mice. 18F-FES uptake was most pronounced in mice harboring MCF-7 tumors in the shoulder. In MCF-7 tumors grown in the inguinal mammary fat pad, 18F-FES uptake was less visible, as the intestinal excretion pattern of 18F-FES obscured the radioactivity detectable in these tumors. To use 18F-FES PET as a tool to visualize ER&#945; expression in ER&#945;-positive breast xenografts, we demonstrate that the visibility of 18F-FES uptake is clear in tumors located away from the abdominal region of mice, such as in the shoulder.

Here, we demonstrate a protocol to use 16&#945;-[18F]-fluoro-17&#946;-estradiol (18F-FES) positron emission tomography (PET) as a tool to visualize ER&#945; expression in ER&#945;-positive breast xenografts.

16α-[18F]-Fluoro-17β-Estradiol PET를 사용하여 암컷 난소 절제술 마우스의 인간 유방암 이종이식편에서 에스트로겐 수용체 α 발현 시각화

To demonstrate how estrogen receptor alpha (ER&#945;) positive breast cancer xenografts may be visualized in BALB/c nude mice using ...

Salidroside의 MCF-7 세포 이동 및 증식 억제 메커니즘

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer mechanisms have been only incompletely elucidated. Hence, this protocol intended to decode the potential of Sal in regulating the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway in the malignant proliferation of human breast cancer MCF-7 cells. First, the pharmacological activity of Sal against MCF-7 was evaluated by CCK-8 and cell scratch assays. Moreover, the resistance of MCF-7 cells was measured by migration and Matrigel invasion assays. For cell apoptosis and cycle assays, MCF-7 cells were processed in steps with annexin V-FITC/PI and cell cycle-staining detection kits for flow cytometry analyses, respectively. The levels of reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ were examined by DCFH-DA and Fluo-4 AM immunofluorescence staining. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were determined using the corresponding commercial kits. The protein and gene expression levels in apoptosis and the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway were further determined using western blot and qRT-PCR analyses, respectively. We found that Sal treatment significantly restricted the proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells with dose-dependent effects. Meanwhile, Sal administration also dramatically forced MCF-7 cells to undergo apoptosis and cell cycle arrest. The immunofluorescence tests showed that Sal observably stimulated ROS and Ca2+ production in MCF-7 cells. Further data confirmed that Sal promoted the expression levels of pro-apoptotic proteins, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, and their corresponding genes. Consistently, Sal intervention prominently reduced the expression of the Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1&#945;, and FoxO1 proteins and their corresponding genes. In conclusion, Sal can be used as a potential herb-derived compound for treating breast cancer, as it may reduce the malignant proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells by inhibiting the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway.

저자 스포트라이트: 유방암 치료에서 Salidroside의 분자 메커니즘 탐구 

The present protocol describesa comprehensive strategy for evaluating the pharmacological action and mechanism of salidroside in inhibiting MCF-7 cell proliferation and migration.

MCF-7 세포 증식 및 이동 억제에서 Salidroside의 약리학적 작용 및 분자 메커니즘 탐구

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

유방암에서 에스트로겐 수용체 신호 전달에 의해 대사 규제 시스템 생물학

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미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링

세포 기반 에스트로겐 수용체를 사용하여 식물에스트로겐에 대한 검사 β 리포터 분석

유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일

수정

16α-[18F]-Fluoro-17β-Estradiol PET를 사용하여 암컷 난소 절제술 마우스의 인간 유방암 이종이식편에서 에스트로겐 수용체 α 발현 시각화

MCF-7 세포 증식 및 이동 억제에서 Salidroside의 약리학적 작용 및 분자 메커니즘 탐구

MCF-7 세포 증식 및 이동 억제에서 Salidroside의 약리학적 작용 및 분자 메커니즘 탐구

MCF-7 세포 증식 및 이동 억제에서 Salidroside의 약리학적 작용 및 분자 메커니즘 탐구