The authors acknowledge funding sources from D&#8217;Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.

1. Farklı Medya ve Ek Bileşenleri hazırlayın <ol><li> Deneyden önce, test edilecek da normal FBS ilave karakalem sıyrılmış FBS ya da kömür şeritli FBS artı madde ile DMEM veya diğer belirtilen ortam maddelerini kapsayan ortamı hazırlar. Birden fazla bileşen, her deneyde test edilebilir unutmayın. </li><li> Tartın ve uygun fizyolojik konsantrasyon tarafından kömür şeritli serum içinde çözünmüş hormonlar, büyüme faktörleri ya da sitokinler seyreltin. </li></ol> 2. on Ice Kollajen Matrix hazırlayın <ol><li> 200 ul 10x PBS (pH 7.4), 5.4 ul 1 N NaOH, iki kez damıtılmış H2O 600 ul ve 1.2 ml kolajen I: buzda sonra steril filtre edilmiş bileşenler eklenerek 2.2 mg / ml&#39;lik bir matris 2 mi kolajen hazırlanması (de 3.63 mg / ml). </li><li> Plaka için hazır olana kadar buz üzerinde kolajen I çözeltisi tutun. </li></ol> 3. &lt;Testi için Göç / Invasion Tabaklar hazırlayın/ P&gt; <ol><li> Her bir hücre çizgisi test edilebilmesi için, 12-kuyu ekler ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka bölmesi kullanırlar. Kemoatraktan medya ekleyerek ve deney düzeneği up için ekler aktarmak için ekler içermeyen ek 12 kuyu kullanın. NOT: hücre hatları burada kullanmak için bir polietilen tereftalat (PET) membran ve 8 mikron gözenek büyüklüğüne sahip plakalar üzerinde bir kollajen matriks uygunudur. Bununla birlikte, önceden kaplanmış plakalar içinde bir Matrigel matris, hücre çizgisi araştırılmaktadır göre azalmış gözenek boyutu ile ikame edilebilir. </li><li> Açıkça (bir kontrol, invaziv olmayan hücre hattı için FBS göç, CS-FBS göç, FBS işgali, ve CS-FBS işgali yanı sıra FBS-göç) analiz edilen duruma başına 3 kuyu kullanılarak, plaka etiket. Bir kolajen ya da Matrigel matris boyunca ve daha sonra zar içindeki gözeneklerin içinden hareket etmek sureti ile PET zar içindeki gözeneklerin içinden hareketi ve deney invazyonu ile deney göç. Bir her hücre durum için farklı renk işaretçileri kullanınKaplama işleminde kimliği. </li></ol> 4. Invasion Matrix dağıtın <ol><li> Dikkatle uçlar haline kollajen matris solüsyon içerisinde 75 ul istila deneyleri için kullanılacak pipetle. Kabarcıkları önlemek için dikkatli kullanın. Yüzeye ters pipet uygulayarak kabarcıklar Dağılın. </li><li> Katılaşmaya jel sağlamak için 30 dakika boyunca 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatöründe kolajen kaplı insertler ile plaka aktarın. </li></ol> 5. Plaka Membran veya Invasion Matrix üzerine Hücreler <ol><li> Bu arada, Hücreleri tripsinize edin ve% 10 FBS ile ortamı eklenir. Sıkma hücreleri masa üstü bir santrifüj ile 5 dakika süreyle 200 x g&#39;de ve serumsuz ortamında 3 kez yıkayın. </li><li> Serum serbest medya süspanse. Bir hemasitometre veya otomatik slayt sayacı ile hücreleri saymak. 5 x 10 4 hücre / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar serumsuz ortam ekleyin. </li><li> Kolajen matrisi (30 dakika sonra) katılaşmış girdiğinde, ortam 700 ul ya da2% tanımlanan FBS veya her kuyuya FBS kömür-elimden. Plaka başına 12 ekler: <ul><li> 3 ekler medya ile kolajen ve kuyuları var +% 2 FBS </li><li> 3 ekler medya ile kolajen ve kuyuları var +% 2 CS-FBS </li><li> 3 ekler medya +% 2 FBS ile hiçbir kolajen ve kuyuları var </li><li> 3 ekler medya ile hiçbir kolajen ve kuyuları var +% 2 CS-FBS </li></ul><ol><li> Test edilen faktörlerin sayısı ve her bir durumda karşılık gelen herhangi bir kollajen kontrol olarak, ek plakalar kullanın. </li></ol></li><li> Tüm geçiş ve istila insertlerin de uç başına 500 ul hücre vererek, 5 x 10 4 hücre / ml&#39;de ekler hücre süspansiyonu ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 22 saat boyunca kuluçkaya bırakılır. </li></ol> 6. Geçirme ve istila Hücrelerinin sayısı niceliğini <ol><li> Ayrı kuyularda metanol fiksatif, eozin ve hemotoksilin kullanarak kuyuların ayarlayın boyama. </li><li> Her kuyudan hücreleri ve matriks çıkarmak için pamuklu bezlerden kullanın.Her kuyu için ikinci sürüntü uygulaması ile Rrepeat. </li><li> Forseps ile, arka arkaya 3 çözeltilerin her birine, her bir ek 1 saniye için 5 kez batırın. </li><li> Ekler / N O kurumasını bekleyin. </li><li> Ya i) kenarlarda dikkatle kesim, bir neşter ile filtreleri kaldırabilirsiniz ve lamel ve daldırma yağ ile bir slayt monte, veya ii) ekler O / N ters kurumasını ve mikroskopi için doğrudan ekler kullanmak için izin. </li><li> Ertesi gün, bir 20X amacı ile bir mikroskop altında slaytlar veya ekler görüntüleyebilir ve filtrenin farklı bölgelerinden 5 görüntüleri çekmek. Tutarlılığı artırmak için, 4 dış alanları ve bir merkez almak. </li><li> ImageJ yazılımı kullanarak tüm koşullar için hücreleri saymak ve aşağıdaki formüller için geçerlidir. </li><li> Aşağıdaki gibi yüzde işgali belirleyin: Ben = a eklemek kollajen sayesinde işgalci hücrelerin # ortalama Kontrol eki aracılığıyla göç hücrelerin # = b Ortalama % Işgali = (a / b) x 100 </li><li> Aşağıdaki gibi% 2 FBS Invasion Endeksi belirleyin: Hücrelerin istilası% (% 2 FBS içinde) analiz edilir = C (% 2% FBS) kontrol girişimsel olmayan hücrelerin işgali = d Invasion İndeksi (FBS) = (c / d) </li><li> Aşağıdaki gibi% 2 CS-FBS Invasion Endeksi belirleyin: Hücrelerin istilası% = e (% 2 CS-FBS) analiz edilir % (% 2 CS-FBS) kontrol girişimsel olmayan hücrelerin işgali = f Invasion Endeksi (CS-FBS) = (e / f) </li></ol> 7. tekrarlayın Deneysel Protokolü + X n Çoklu Faktörler Kombine ile Kömür-elimden FBS ile FBS Kömür-elimden Karşılaştırılması <ol><li> &quot;X&quot; ya da bileşenlerin bir kombinasyonu, farklı bileşenler kullanılarak gerektiği kadar prosedür birden fazla kez tekrarlayın. </li><li> Göç ve istila etkileri her faktör &quot;X&quot; katkısını belirlemek için hesaplamalar uygulayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Cancer. , (2013).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+molecular+insights+and+evolving+paradigms.">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li><li>Dang, Z. C., Lowik, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+serum+factors+by+charcoal+treatment+promotes+adipogenesis+via+a+MAPK-dependent+pathway.">Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway.</a> Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).</li><li>Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+serum+in+the+developmental+expression+of+alkaline+phosphatase+in+MC3T3-E1+osteoblasts.">Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts.</a> J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).</li><li>Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye, ., Bagati, B., Berezney, A., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dominant+negative+Cx43+mutant+differentially+affects+tumorigenic+and+invasive+properties+in+human+metastatic+melanoma+cells.">A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells.</a> J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).</li><li>Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+actions+of+estrogen+to+promote+proliferation:+integration+of+cytoplasmic+and+nuclear+pathways.">Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways.</a> Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).</li><li>Meierjohann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP13+mediates+cell+cycle+progression+in+melanocytes+and+melanoma+cells:+in+vitro+studies+of+migration+and+proliferation.">MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation.</a> Molecular Cancer. 9, 201 (2010).</li><li>Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+signaling+pathways+must+be+targeted+to+overcome+drug+resistance+in+cell+lines+derived+from+melanoma+metastases.">Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases.</a> Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).</li><li>Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+evaluation+of+various+invasion+assays+testing+colon+carcinoma+cell+lines.">A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines.</a> Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+cancer+metastasis:+the+'seed+and+soil'+hypothesis+revisited.">The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+breast+epithelial+cells+transformed+by+17beta-estradiol.">Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol.</a> Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).</li><li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+regulation+of+miR-21+enhances+migration+and+invasion+of+hepatoma.">Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma.</a> Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).</li><li>Scheel, C., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+epithelial-mesenchymal+transition:+concepts+and+molecular+links.">Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links.</a> Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).</li><li>Kojima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts.Proc.">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc.</a> Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).</li><li>Maehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transforming+growth+factor-&#946;1+in+invasion+and+metastasis+in+gastric+carcinoma.">Role of transforming growth factor-&#946;1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma.</a> J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).</li><li>Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor-induced+tumor+cell+invasion+and+metastasis+initiated+by+dephosphorylation+and+downregulation+of+focal+adhesion+kinase.">Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase.</a> Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).</li><li>Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Cancer+stem+cells,+cytokine+networks,+and+the+tumor+microenvironment.">Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment.</a> J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).</li><li>Rosen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interrogation+of+HGF-SF+with+other+cytokines+in+tumor+invasion+and+metastasis.">The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis.</a> EXS. 65, 301-310 (1993).</li><li>Sanz-Moreno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+and+JAK1+signaling+cooperate+to+control+actomyosin+contractility+in+tumor+cells+and+stroma.">ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma.</a> Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).</li><li>Fleming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+interactions+between+primary+human+human+fibroblasts+enhance+murine+mammary+gland+humanization+in+vivo.">Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo.</a> Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).</li><li>Sikora, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M.J.,+V.,+M.E.,+M.D.,+J.M.">M.J., V., M.E., M.D., J.M.</a> Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Tümör metastaz çok aşamalı bir süreçtir. Hücreler, bazal membran kırmaya da uzak bölgelere taşınabilen lenf sistemi veya kan ya da kılcal damarlarla içine intravasate gerekir. Tümör hücreleri daha sonra damar dışına ve Makrometastaz 12 içine yerleşmektedir. Mezenkimal geçiş (EMT), tümör invazyonu ve metastaz için epitel yoluyla ilerleme steroid hormonların 13,14 tarafından geliştirilmiştir, büyüme 15-18, ve sitokinler 19-21 faktörleri. Bu moleküller, bir testin geliştirilmesi tümör invaziv potansiyeli rollerini ele bu karmaşık sinyal yolları deşifre yönünde önemli bir adımdır, tümör ilerlemesi sinyal yolunun ele çok önemlidir. Bu tümör hücreleri göç olan tahrik kuvvetini tespit amaçlar için kömürle sıyrılmış serum kullanılarak bu deney, mevcut yöntemlere göre bir avantaja sahiptir. Daha önceki deney sahipişgal odaları normal primer meme fibroblastlar kullanılarak yayınlanmıştır. Bu çalışmada, yazarlar kömür-elimden medya kullanılan ve hücreler tümörijenik değildi çünkü beklendiği gibi işgali neden olmadı matrigel odalarında geri östrojen eklendi. Bununla birlikte, estrojen varlığında veya yokluğunda, makrofaj koşullu ortamın varlığı ile ve benzer ölçüde 22 istila yükselmiştir. Bu deney, bu ya da yokluğunda, östrojen varlığında kömür-sıyrılmış serum ile istila deneyleri kullanılan benzer olsa da, bu, bir tümör deney değildi ve makrofajlar ve fibroblastlar 22 arasında parakrin etkileşimlerin incelenmesinde yönelikti. Kömürle sıyrılmış ortam kullanılan bir başka deney östrojen Ayrıca düşük seviyelerde, meme kanseri hücrelerinin çoğalmasını artarken, inhibitörlerin 23 kinaz dirence yol olduğunu gösterir. Bu çalışma için tasarlanmış kanser hücrelerinin çeşitli uygulanabilen bir istila deney olmasıyla Çalışmamız benzersizTek başına ya da kombinasyon halinde, tek tek hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler etkisi. Bundan başka, mevcut literatürde tabi olarak, fizyolojik olarak uygun seviyelerinin (Tablo 1) elde etmek için kömür soyulmuş seruma ilave edilmesi gerekli hormonu konsantrasyonları belirlenmiştir. Serum içinde normal olarak mevcut seviyelerde ayrı bir bileşen, bir &quot;X&quot; bir ekleme tahlilinde önemli bir parametredir. Bu deney, serum içinde hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler yayınlanmış seviyeleri ile sınırlı olması gibi gözükse de, araştırmacının ek faktörler seviyelerini belirlemek için ELISA deneyleri kullanabilir. Protokol kolajen I kullanımı için özel olsa araştırmacı sürekli bu matrisi kullanılarak ise, Matrigel da ikame edilmiş olabilir. tanımlandığı bir tek bileşenidir ve dermis asli kurucu olduğu için biz kollajen I kullanmayı tercih nedenidir. Buna ek olarak, 100 μ 75 ul kullanıng / ml kollajen işgali matrisi yapmak. Bu aynı zamanda, arzu edilen sonuçları elde etmek için modifiye edilebilir. Bu hücrelerin makul sayıda filtreler sayılır böylece konsantrasyonu optimize etmek en iyisidir. Hücreler oldukça invaziv iseniz, matris için kolajen I, 100 ul kullanmak veya kollajen konsantrasyonunu artırmak için daha iyi olabilir. Bu teknik, araştırmacı önemli bilgiler edinmenize yardımcı olsa da tümör hücreleri serum kömür-sıyırma tarafından çıkarılan bir kemoatraktan doğru istila halinde, sadece yararlıdır. Kontrol ve kömür-elimden serum sonuçları arasında fark varsa, o zaman deney takip değer olmaz. Tahlil bireysel chemoattractants yanı sıra kemotaksisinin bastırıcılarının sonuçları giderir. Ayrıca, mümkün sonuçlarının karşılaştırılması (Şekil 3), her bir deney için kabul edilen, deneysel hatanın seviyesi standart sapma kullanılır. Ancak, gerçek valdaah standart sapma ya da standart hata, önemli bir P değerine dayalı bir araştırmacı tarafından belirlenebilir. Ayrıca, bu testte toplanan bilgiler, belirli sinyal yolları farmakolojik inhibitörlerinin tasarımında yararlı olabilecek. Örneğin, bir veya daha fazla hormon, büyüme faktörleri ve / veya sitokinler halinde kullanılabilir varolan farmakolojik madde veya bu yolu inhibe etmek üzere tasarlanmış yeni bir ilaç değil, belli bir tümör hücresi mutasyon için istila mekanizmasında rolü olduğu bulunmuştur. Tahlil da özellikle tümör mutasyonu eğitim ve amino asit artığı değiştirerek veya konumu bu deney ile tespit edilmiştir kemoatraktan aynı afinite korur olmadığını etkili bir araçtır. Bu şekilde, bizim deney, tümör istilasını engellemek için, kanser hücreleri ve muhtemelen yöntemleri istila mekanizması için ipuçları temin etmek için yeni bir yaklaşım sağlar.

Bir yeni işgal tahlil belirli hormonlar, kanser hücresi yayılımını tamamen içinde kimyasal çekici olarak sitokin ve / veya büyüme faktörlerinin katılımı belirlenmesi amacı ile geliştirilmiştir. hücre dışı matriks (ECM) ile işgal etmeye tümör hücrelerinin yeteneği metastatik fenotip 1-3 bir özelliğidir. İstila odaları yaygın olarak kanser hücresi istilasını ve göç çalışma, in vitro araç olarak kullanılmıştır ve in vivo tümör istilası ve metastaz mekanizmaları da bilgiyi sağlayabilir. odalar, hücre kültür plakalarının gözeneklerine içinde iç içe geçmiş silindir hücre kültürü ekler oluşur. insertlerin taban, tanımlanmış gözenek büyüklüğü ve yarı geçirgen polikarbonat veya polistirol membranlardır. Standart istila deneyinde, hücreler, serumsuz ortam ile uç zar üzerine ekilir ve serum veya serum gibi kemoatraktantlarla dolu olan hücre kültür çukurlarına yerleştirildi set kadar kemoatraktif kuvvet. Bu kuvvet, tahrik Hücreler daha sonra tespit etmek ve hücrelerin sayısını belirlemek için geleneksel boyaları kullanılarak boyanmış hücre dışı matris (yayılma) &#39;in bir kaplama boyunca, alternatif olarak, yarı geçirgen bir zar (göç) hareket ettirin. hücre sayısı daha sonra invaziv olmayan hücre hattında göç ve istila derecesine göre normalize edilir. Bu yöntem araştırmacının, genetik manipülasyon da dahil olmak üzere koşullar altında çeşitli farklı hücre tiplerinin invaziv potansiyelini değerlendirmek için izin verir. Hormonlar, sitokinler ve büyüme faktörleri serum kritik bileşenleridir ve giderek invaziv fenotip 4 sürüş ile ilişkili olduğu gösterilmiştir edilmektedir. Ancak, yine de işgali aracılık bu kemoatraktif serum moleküllerinin yapısı, rolü ve özgüllük zor kalır. meydan sürüş sorumlu serum veya serum benzeri chemoattractants belirli hangi faktörlerin belirlenmesi kalırmoleküller işgali sürecini inhibe ne olabilir kanser hücresi işgali yanı sıra. Bu yazıda, kanser hücrelerinin chemoattraction ve işgali sürüş molekülleri olarak, hormonlar, sitokinler ve / veya serum içinde mevcut olan büyüme faktörleri potansiyel katılımı değerlendirmek için bir yöntem tarif eder. Önerilen bu tadil edilmiş protokolde, odun kömürü sıyırma% 2 karakalem sıyrılmış FBS (CS-FBS) oluşturmak üzere,% 2 fetal sığır serumu (FBS) ile ilgili hormonlar, sitokinler ve büyüme faktörleri çıkarmak için kullanılır. % 2 FBS ve% 2 CS-FBS iki kanser hücre istilasını sürücü kemoatraktif kuvveti ayarlamak için maddeler olarak kullanılmaktadır. Normal% 2 FBS ile karşılaştırıldığında, kemoatraktif madde olarak% 2 CS-FBS kullanarak ilk dahil olmak üzere çeşitli yararlar elde edilir, ve en belirgin olarak, hormonlar, sitokinler ve büyüme faktörleri, indirgenmiş / bağıl yokluğunda kanser istilası fenotipi çalışma yeteneği. Ayrıca hormonlar, büyüme faktörleri kolektif çıkarılması olup olmadığını değerlendirmek için araştırmacı sağlar ve cytokines invaziv endeksteki artış veya azalmaya neden olur. Daha sonra deney, (Şekil 2 ve 3 e bakınız), &quot;X&quot; olarak adlandırılan tek bir bileşen eklenmesi azalma artışı önleyen, ya da orijinal değerine invaziv endeksi geri olup olmadığını belirlemek için tasarlanmıştır. Bu yöntem, kömür sıyırma boyunca serum uzaklaştırılır bileşen fizyolojik seviyelerini elde etmek için spesifik olan, ancak, aynı zamanda kömür sıyırma aynı zamanda sinyal iletim yollarını etkileyen unutulmamalıdır. Örneğin, odun kömürü sıyırma osteoprogenitör hücrelerinin alkalin fosfataz aktivitesi azalır ve MAPK nin aktivatörlerinin 5 azaltılması yoluyla adipogenesis uyarabilir bildirilmiştir. Karakalem sıyrılmış ortam ticari olarak temin edilebilir ve protokolüne göre bu dekstran ile kömür birleştirir ve fetus inek serumu, O / N 6 ile inkübe özetlenmiştir. Bu deney, RESPO geliştirilenNSE Zucker ve ark. 7 tarafından bildirilen bir sonuç yazarlar, normal% 2 FBS ile medya doğru göç sırasında gap junction iletişimi etkileyen bir mutant fenotip işgali endeksindeki artış gösterdi olduğunu gösterdi. Bu artış, kömürle sıyrılmış serum ikamesi ile ortadan kaldırıldı. Bu sonuçtan, Yazarlar, bir lipofilik molekül yönelik bu mutan etkilenen taşıma (daha özel olarak ise, bir hormon, bir büyüme faktörü, sitokin ya da) 7. İyi hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler tümör promosyonuyla ve istila 4 yer alan sinyal yolları aracılık ettiği bilinmektedir. Bu nedenle, bu bilim araştırmacılar ne faktör (ler) çalışma altında, özellikle kanser hücrelerinin veya mutantlar tümör invazyonu sürüş belirlemek için de önemlidir. bileşenin konsantrasyonu arasındaki farka bağlı olarak, belirlenen deney fizyolojik konsantrasyonda ayrı ayrı bileşenlerin rolünü ele almak üzere tasarlanmıştır ve# 8220, X &quot;, normal FBS ve CS-FBS içinde. Bu testin gelişme sayesinde, araştırmacılar kendi sistemini düzenleyen özel invaziv yolun içine daha fazla fikir sahibi olabilir. Hormonlar, büyüme faktörleri, sitokinler ve genellikle tümör destekleyicileri 8 olarak sınıflandırılmıştır. Örneğin EGF, bu faktörlerden bazıları istila odaları 9 kimyasal çekici doğrudan kaynakları olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, bu doğrudan tümör invazyonu bu serum ana bileşenleri temsil gibi görünmektedir. Bu protokol bir araştırmacı kanser hücrelerinin invaziv potansiyeli aracılık hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler katılımını değerlendirmek için izin verir geleneksel in vitro işgali tahlil için basit, ama önemli, değişiklik önermektedir. Ancak, tahlil değerli zaman ve r kullanmak şekilde değil, prosedür analizinde erken aşamada yaptıkları çalışmada etkili olacaktır dair bir cevap ile araştırmacı sağlamak için tasarlanmıştıresources gereksiz görülmesi halinde. Bu yöntem CS-FBS kullanır ve potansiyel kanser hücresi işgali aracılık kurşun adayları olarak sürdürmeye molekülleri hangi şekilde araştırmacılar takdirine bağlıdır. Bu analizlerin sonuçları, serum bileşenleri, özellikle hücre hattı veya mutant için Kemoattraktantlar veya inhibitörleri çalışılan olarak hizmet hangi belirlenmesinde yararlı olduğu ispatlamak zorundadır. Ayrıca, bu yaklaşım araştırmacı teşvik veya kanser hücresi işgali inhibe ya anahtar sinyal yolları belirlemeye yardımcı olabilir; Böylece gelecekte ilaç tasarımı yönlendiren.

<table><tbody><tr><td>BioCoat Control Inserts with 8.0 &amp;micro;m PET membrane</td><td>Corning</td><td>354578</td><td>12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate</td></tr><tr><td>Collagen I, rat tail</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Source = rat tail tendon, purity = 90%</td></tr><tr><td>Fixative; Diff-Quick</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9844047</td><td>Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000</td><td>Designated as FBS</td></tr><tr><td>Charcoal stripped fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>12676</td><td>Designated as CS-FBS</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30070</td><td>Designated as FBS</td></tr><tr><td>Charcoal stripped fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30068</td><td>Designated as CS-FBS</td></tr></tbody></table>

a modified in vitro invasion assay to determine the potential role of hormones, cytokines and/or growth factors in mediating cancer cell invasion

Kan serumu kanser hücrelerinin mikrodamarlara kendi intravasation kolaylaştırılması, göç ve istila hangi doğru kemoatraktan olarak hizmet vermektedir. Ancak, hücre göç hangi doğru gerçek moleküller zor kalır. Bu modifiye işgali tahlil hücre göçü ve işgali sürücü hedefleri belirlemek için geliştirilmiştir. Bu teknik, belirli bir hormon, büyüme faktörü, sitokin ya da bir kanser hücresinin invaziv potansiyel aracılık bir rol oynayıp oynamadığını belirlemek için üç koşullar altında istila endeksi karşılaştırır. Bu koşullar, i), normal fetal sığır serumu (FBS), ii) kömür-sıyrılmış hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler ve iii) CS-FBS + molekülü kaldırır FBS (CS-FBS) (&quot;X&quot;) gösterilir içerir. FBS ile karşılaştırıldığında CS-FBS ile hücresi yayılmasında belirgin bir değişiklik, değişiklik aracılık hormonlar, sitokinler ya da büyüme faktörleri olduğu anlamına gelir. Bağımsız molekülleri daha sonra yeniden kabiliyetlerini test etmek için, CS-FBS geri eklenebilirayet ya da işgali fenotip kurtarmak. Ayrıca, iki ya da daha çok faktör katkı maddesi veya araç veya yayılmasının inhibe edilmesinde çok sayıda molekülün sinerjistik etkilerini değerlendirmek için kombine edilebilir. Genel olarak, bu yöntem, hormonlar, sitokinler ve / veya büyüme faktörlerinin kanser hücresinin özel bir tip ya da belirli bir mutant için kimyasal çekici ve istila inhibitörleri olarak görev yapan hücre istilasında rol oynayan olup olmadığını belirlemek için araştırmacı sağlar. Belirli chemoattractants ve inhibitörleri tanımlayarak, bu değiştirilmiş işgali tahlil kanser hücresi işgali yönlendiren sinyal yolları aydınlatmak için yardımcı olabilir.

işgal endeksi noninvaziv hücre hattına normalleşme göre her durum için hesaplanır. Deneyler için, biz 1205Lu melanom hücre çizgisi ve kurulan varyant kararlı hücre kuşaklarının z invaziv çizgiler olarak hem de 1205Lu hücreleri mantıksal kontrol olarak hizmet vermektedir 10 türetildikleri premalign invaziv olmayan değişik türde, WM793 kullanın. Bu dermis birincil bileşeni olduğundan biz de işgali matrisi olarak kollajen I kullanmaktadır. Optimal işgali matris hücre hattı dayalı ve in vivo ile uyumlu ölçüde 11 sonuçları değişir sayede bu bir önceki çalışmada uygun olduğunu. Bu işgali tahlil araştırmacı elde olabilecek olası sonuçlarına göre şematik özetlenmiştir. Başlangıçta,% 2 FBS için işgal endeksi bu testte (Şekil 1 ve 2) takip etmek için CS-FBS için işgal endeksi önemli ölçüde daha yüksek veya daha düşük olmalıdır. Önemli artır halindekolaylaştırmak ya da işgali endeksindeki düşüş kömür-elimden FBS ile belirgindir, bu deney araştırmacı (Şekil 2 ve 3) için kullanışlı değildir. Bu artışın kömür-elimden FBS ile elenirse, araştırmacı zaten gelişmiş işgali bir hormon, büyüme faktörü veya sitokin (Şekil 2 ve 3) doğru yönlendirilir bilgiye sahiptir. Ardından, araştırmacı belirli tümör tipine ve chemoattractants olarak hangi aday (lar) mevcut makul mekanizmaları belirlemek için mutasyon hakkında bilgi kullanmak gerekir. Araştırmacı% 2 FBS ve% 2 CS-FBS (Tablo 1) arasındaki konsantrasyon farkı bir bileşen ilave ederek fizyolojik konsantrasyonda bir ya da daha fazla bileşenin, tek başına çalışan başlayabilir. Bir bileşen kömürle sıyrılmış serum ilave ise kömürle sıyrılmış yalnız serum, bu aday, &quot;X&quot; ile karşılaştırıldığında istila potansiyeli azalır önemli ölçüde kısmi ya da hizmet edebilir artarartış ölçüde (Şekil 2 ve 3) bağlı olarak tam kurtarıcı. İki veya daha fazla bileşen, bir katkı maddesi ya da sinerjistik bir artış elde etmek için kombine edilebilir, (Şekil 3) (X olarak 1 + X2 + X3 ... gösterilen). Işgali ölçüde azalır bir faktör (- 4 Şekil 2) inhibitör faktör olarak sınıflandırılmış olacaktır. Deneylerde, onun hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler ile çıkarıldı kemoatraktan doğru giden bir mutan melanom hücre hattı (1205Lu T154A) kullanılması, tümör yayılma bir azalmaya neden olduğunu gösterdi. Üç hormonlar olası bir &quot;X&quot; belirlemek için test edilmiştir. Bu estrojen (estradiol), progesteron, ve tiroid hormon (T4) içerir. Estrojen inhibe edici faktör (Şekil 4) &#39;deki gibi tanımlanmıştır, oysa bu hormonların ikisi, istila indeksi (projesteron ve tiroid hormonu) üzerinde herhangi bir etki. Listelenen potansiyel sonuçlarına göreŞekil 3, bu örnekte, deneysel sonuçlar, belirli bir sinyal faktörleri tecrit yollarının tanımlanması için önemli olabilir, çünkü Östrojenin bu tahlilde de kullanılabilir olasıdır Durum 2 azalmaya ve Durum 3 ile bir önleme gösterir Gelecekteki uyuşturucu tasarım stratejileri için. Ek deneyler &quot;fenotip kurtarma&quot; yanlısı işgali chemoattractants olarak hizmet edebilir diğer bileşenleri tanımlamak için büyüme faktörleri ve sitokinler yönelik olacaktır. Her iki yanlısı invaziv ve inhibitör moleküllerinin belirlenmesi toplu soruşturma kapsamında hücre hatları ve mutant varyantlar için invaziv potansiyeli aydınlatmak olabilir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/51480/51480fig1.jpg" /> Şekil 1. Deneysel kurulum ve tasarım. Modeli doğrudan PET membran veya c üzerine ya kaplama hücreleri gösteren deneysel işlem için ayarlanmışserumsuz ortam içinde ollagen tabaka. Hücreler ya göç ya da protokole göre modifiye ve Koşul 1, 2 olarak tanımlanan bir kemoatraktan doğru kollajen matriks ile işgal ve 3. geçirilen ya da işgal hücreler daha sonra sabit ve lekeli olan. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51480/51480fig1large.jpg" target="_blank">bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/51480/51480fig2.jpg" /> Bir standart işgali tahlil membran sonucu 2. Potansiyel sonuçları Şekil. Bu model araştırmacı işgali tahlil ve nasıl bu sonuçları yorumlamak için karşılaşabilecekleri olası sonuçları göstermektedir. Her bir halka, Şekil 1 &#39;de özetlenen 3 koşullar kullanılarak lekeli bir filtre için bir temsili sonucudur. Her bir nokta istila geçmiş olan bir hücreyi temsilMatris ve membranın altına lekeli. Hücreler uygun sayısal ve buna göre analiz edilecektir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51480/51480fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/51480/51480fig3.jpg" /> Şekil 3. Veri yorumlanması CS-FBS ± X ile işgali için bu anahat Invasion Endeksi hesaplamaları deneysel sonuçlar belirler açıklar. CS-FBS kömürle sıyrılmış serum ve X, metin içinde tarif edilen CS-FBS ortamı eklenmiştir münferit bileşenler anlamına gelir. Yazarlar nedeniyle bizim koşullarda deneysel hata kabul değişkenlik gibi standart sapma (ss) ayarlayın. Bununla birlikte, gözlem altındaki koşulları ve replika sayısına bağlı olarak, bu etken devletçi aralığında olması için ayarlanabiliraraştırmacı için nik önemi. deney birden bir &quot;X&quot; moleküller ile tekrar edilebilir, (X olarak belirtilen 1 + X 2 + X 3 ...). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51480/51480fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/51480/51480fig4.jpg" /> Şekil 4. işgal tahlil sonuçları. Bu grafik 1205Lu metastatik melanom hücrelerinden oluşturulan bir mutant varyant hücre hattı 3 ile elde edilen deney sonuçlarını göstermektedir. östrojen (0.566 ug / ml), progesteron (0.001 ng / ml), tiroid hormonu (0.283 ug / dl): eklenen hormon konsantrasyonları aşağıdaki gibidir. Bu deneyler için kullanılan kontrol, invaziv olmayan hücre çizgisi WM793B idi. Bu deney benzer sonuçlar ile 3 kez tekrarlandı ve temsili bir grafik gösterilmektedir. <tableborder = &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2" style="padding-left:2px;padding-right:2px"></td><td style="width:41px"> Birimler </td><td style="width:52px;padding-left:4px;padding-right:4px"> Tanımlı FBS </td><td> CS FBS </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> Fark </td><td style="width:70px"> [% 2 FBS] - [2,% CS-FBS] </td><td style="width:85px"> Kaynak </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td rowspan="5" style="padding-left:4px;padding-right:2px"> Hormonlar </td><td style="padding-left:7px;padding-right:4px"> Östrojen (Estradiol) </td><td> ug / ml </td><td> 28.30 </td><td> 8.76 </td><td> 19,540 </td><td> 0.566 </td><td rowspan="5"> Life Technologies FBS kedi # 16000 CS FBS cat # 12676 </td><td> Sigma E2257 </td></tr><tr><td> Ensülin </td><td> uIU / ml </td><td> 8.61 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> tespit edilmemiş </td><td> 8.610 </td><td> 0.172 </td><td> Sigma I3536 </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> ng / ml </td><td> 0.05 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> tespit edilmemiş </td><td> 0.050 </td><td> 0.001 </td><td> Sigma P8783 </td></tr><tr><td> Testosteron </td><td> ng / ml </td><td> 0.10 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> tespit edilmemiş </td><td> 0.100 </td><td> 0.002 </td><td> Sigma T1500 </td></tr><tr><td> Tiroid Hormon (T4) </td><td> ug / dl </td><td> 14.14 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> tespit edilmemiş </td><td> 14,140 </td><td> 0.283 </td><td> Sigma T1775 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Büyüme Faktörleri </td><td> IGF </td><td> ng / ml </td><td> 111.00 </td><td> 49.30 </td><td> 61.70 </td><td> 1.23 </td><td rowspan="3"> Thermo Scientific Hyclone <br/&gt; FBS kat no SH30070 CS FBS kedi # SH30068 </td><td> Sigma I3769 </td></tr><tr><td> TGF-β </td><td> ng / ml </td><td> 12.60 </td><td> 7.30 </td><td> 5.30 </td><td> 0.11 </td><td> Sigma SRP3170 </td></tr><tr><td> FGF-2 </td><td> ug / ml </td><td> 37,30 </td><td> 32.70 </td><td> 4.60 </td><td> 0.09 </td><td> Sigma SRP4037 </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td> Birimler </td><td style="padding-left:6px;padding-right:2px"> Insan serumu </td><td colspan="3"></td><td> Kaynak </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td rowspan="4" style="padding-left:4px;padding-right:2px"> Sitokinler </td><td> G-CSF </td><td> ug / ml </td><td> 14.7 ± 13.2 </td><td colspan="3" rowspan="4"> N / A </td><td rowspan="4"> Sayfalar: 21774806 </td><td> Sigma SRP3331 </td></tr><tr><td> GM-CSF, </td><td> ug / ml </td><td> 40.9 ± 108,6 </td><td> Sigma SRP3201 </td></tr><tr><td> MCP 1 </td><td> ug / ml </td><td style="padding-left:7px;padding-right:4px"> 213,5 ± 100.7 </td><td> Sigma SRP3109 </td></tr><tr><td> TGF-α </td><td> ug / ml </td><td> 3.2 ± 4.0 </td><td> Sigma T7924 </td></tr></tbody></table> Tablo baş hayvan ve insan serumunda seçme hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler arasında konsantrasyon aralıklarında 1. örnekler.% 2 FBS ve% 2 CS-FBS arasındaki sürede derişim farkı fizyolojik konsantrasyonlarının elde edilmesi için ilave bir miktarını temsil eder.

Watch this Scientific Journal Video about A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion at JoVE.com

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Bir Modifiye<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Deneyi Hormonlar, Açan Kanser Hücre Invasion Sitokinlerin ve / veya Büyüme Faktörleri Potansiyel Rolü belirlemek için

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

a-modified-vitro-invasion-assay-to-determine-potential-role-hormones

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

10.6K Görüntüleme.  Roswell Park Cancer Institute. This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Video: A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Kanser Araştırmaları

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Tıp

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a porous membrane in a process analogous to the initial steps of cancer cell metastasis. The tested cells can be altered for the gene expression or treated with inhibitors to test for changes in the invasion potential. This experiment tests the aggressive phenotype of the mouse mammary tumor cells to discover and characterize the potential oncogenes that promote cell invasion. This technique, however, can be versatile and adapted to many different applications. The experiment itself can be done in one day and the results are acquired by light microscopy in less than a day. The results include counts of the number of invading cells for comparison and analysis. The in vitro invasion assay is a rapid, inexpensive, and clear-cut method for determining cell behavior in a culture that can be used as an initial assessment before more involved in vivo assays.

The in vitro cell invasion assay is used to measure the potential of cancer metastasis by quantifying the cellular potential for invasion and migration using cell culture inserts containing protein matrix. Cells are challenged to migrate through the protein matrix and a porous membrane, towards a chemoattractant, and then quantified by light microscopy.

Onkojenik hücre davranışının bir ölçüsü olarak bir In vitro Invazif tahlil içinde Mouse mammary tümör hücrelerinin kullanımı

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

Genetik

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Kanser Biyolojisinde 3 Boyutlu Modeller: Heterosferoidlerde İnvazyon Dinamiği

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Yazar Spotlight: Baş ve Boyun Kanseri İlerlemesi Sırasında Kanser ve Bağışıklık Hücreleri Arasındaki Karışmanın Deşifre Edilmesi

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish between invasive and non-invasive cells, and enables study of the effects of test compounds on tumor invasion. Cancer cells - either as aggregates or single cells - are confronted with fragments of embryonic chick heart. After organ culture in suspension for a few days or weeks the confronting cultures are fixed and embedded in paraffin for histological analysis. The three-dimensional interaction between the cancer cells and the normal tissue is then reconstructed from serial sections stained with hematoxylin-eosin or after immunohistochemical staining for epitopes in the heart tissue or the confronting cancer cells. The assay is consistent with the recent concept that cancer invasion is the result of molecular interactions between the cancer cells and their neighbouring stromal host elements (myofibroblasts, endothelial cells, extracellular matrix components, etc.). Here, this stromal environment is offered to the cancer cells as a living tissue fragment. Supporting aspects to the relevance of the assay are multiple. Invasion in the assay is in accordance with the criteria of cancer invasion: progressive occupation and replacement in time and space of the host tissue, and invasiveness and non-invasiveness in vivo of the confronting cells generally correlates with the outcome of the assay. Furthermore, the invasion pattern of cells in vivo, as defined by pathologists, is reflected in the histological images in the assay. Quantitative structure-activity relation (QSAR) analysis of the results obtained with numerous potentially anti-invasive organic congener compounds allowed the study of structure-activity relations for flavonoids and chalcones, and known anti-metastatic drugs used in the clinic (e.g., microtubule inhibitors) inhibit invasion in the assay as well. However, the assay does not take into account immunological contributions to cancer invasion.

Here, we present a protocol to study the invasion of tumor cells into living normal tissue fragments in three dimensions. This organ culture technique is mainly applied to test potentially anti-invasive drugs in vitro.

Test Chick Kalp Invasion Testi Kanser hücrelerinin invazivliğini ve Potansiyel Anti-invaziv Bileşikler Etkinlik

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

Bir Modifiye

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

Onkojenik hücre davranışının bir ölçüsü olarak bir In vitro Invazif tahlil içinde Mouse mammary tümör hücrelerinin kullanımı

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Test Chick Kalp Invasion Testi Kanser hücrelerinin invazivliğini ve Potansiyel Anti-invaziv Bileşikler Etkinlik