This work was supported by a Professional Development Grant to C.Z.P. from the Shepherd University Foundation. The authors wish to thank Brett Zirkle and Malia Deshotel for helpful discussions on the protocols, and Dr. Carol Hurney for generous assistance.

Tüm deney prosedürleri Virginia Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Not: Şekil 1, deneysel prosedürler şematik görünümünü gösterir. Oosit hazırlanması 1. <ol><li> Ön asal X oosit izolasyon önceden Gebe Kısrak Serum Gonadotropin 150 U (PMSG) yaklaşık bir hafta ile kadın laevis. 29 G iğne ile 1 cc steril şırınga ile dorsal lenf kese içine 1 ml 150 U / ml PMSG enjekte edilir. </li><li> Oosit enjeksiyonu ve oosit-hayvan kap deneyi için çözümler hazırlayın. <ol><li> Ca Hazırlama ++ / Mg ++ içermeyen OR2 (OR2-): 82 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1.5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM HEPES pH 7.2. </li><li> OR2- artı 1 mM CaCl2 ve 1 mM MgCl2: ya da 2&#39;yi hazırlayın. </li><li> % 60 Leibovitz L15, 0.4 mg / ml BSA, 100 ug / ml gentamisin, pH 7,8: OCM hazırlayın. </li><li> Ön1x MBS hazırlanması: 88 mM NaCI, 1 mM KCI, 0.7 mM CaCl2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES (pH 7.8), 2.5 mM 3 NaHCO. </li><li> 1x MBS% 3 Ficoll hazırlayın. </li><li> 1x NAM hazırlayın: 110 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7.4 ile yıkanır. </li></ol></li><li> 0.1X MBS Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzunun% 0.03 çözeltisi (MS222) &#39;de kadın anestezisi için çözelti kurbağa yerleştirerek (ilk 10 ml% 95 etanol içinde 0.3 g MS222 çözülür, daha sonra 1 L, 0.1X MBS sulandırmak) 10-15 dakika veya tepkisiz kadar. <ol><li> Bu anestezi yanıt vermiyor sağlamak (eksik anestezi kurbağa uzuvları taşımak veya bedeni teslim) onun sırtına anestezi kurbağa çevirerek tam olup olmadığını kontrol edin. </li></ol></li><li> Cerrahi forseps ile yumurtalık dokusu izole bisturi cilt ve vücut duvarı boyunca abdominal insizyon yapılıp, yumurtalık fragmanlarını izoleve makas. OR2- içine yumurtalık parçaları yerleştirin. 24 mm&#39;lik kavisli iğne 3-0 ipek sütür ile vücut duvarı kapatın ve aynı sütür ile ayrı ayrı cilt kapatın. Su içinde 1 g / L akvaryum tuzu kadın kurtarma izin verir. </li><li> (- 20 oosit 10) adet ve taze OR2- transfer küçük içine ince forseps, gözyaşı yumurtalık dokusu kullanma. </li><li> 1 saat boyunca karıştırma cihazı üzerinde, hafifçe ajite taze kolajenaz geçiş ve bir saat daha çalkalayarak OR2- 2.0 mg / ml kollajenaz A Defolliculate yumurtalık fragmanları. </li><li> Yıkama küçük oosit atarak OR2 [Ca ++ / Mg ++ ihtiva eden] 10 kez, oositlerde. </li><li> OCM iki kez oosit yıkayın ve taze OCM transfer. Görsel inceleme üzerine boyutuna göre Evre VI oosit izole edin ve olgunlaşmamış (küçük) oosit atın: Sahne VI oositlerin hayvan yarımkürede bile pigmentasyon ile olgunlaşmamış oositlerin büyüktür ve çapı yaklaşık 1.2-1.4 mm. </li><li> 20 ° C i - 18 oosit koruyunenjeksiyondan önce n OCM. Not: Agaroz kaplı petri kaplarına çanak oositlerin yapışmasını en aza indirmek için de kullanılabilir. </li></ol> Kütüphane Transkriptler 2. Enjeksiyon <ol><li> Gelişme uygun bir aşamada (örneğin, nöral plak aşaması 14 10) ekstre yönlü bir cDNA kütüphanesi 15 kullanarak, RNA yı hazırlamak. Bir cDNA kütüphanesi satın alın ya da aşağıda dört adımda genel başına bir ticari kit kullanılarak bir inşa. <ol><li> Poli (A) + RNA (Malzeme Tablo bakınız) için zenginleştirmek için bir ürünü kullanırken ve üreticinin yönergeleri izleyerek yaklaşık 5 ug mRNA izole edin. Not: transkript (istenilen doku mikrodiseksiyon sonra, nöral levha gibi) bir indükleme dokuya sınırlı olabilir cDNA kütüphanesini üretmek için kullanılır, ya da belirli bir aşamada bütün embriyolardan olabilir. </li><li> Üreticinin yönergeleri izleyerek bir ticari kit ile cDNA üretin. </li><li> Bir Vecto içine cDNA ng, yaklaşık 20 Arterr ticari kit veya uygun başka bir vektör ile birlikte. Uygun bir plazmid vektörü mRNA stabilitesi gibi 5 &#39;β-globin ve 3 poli (A) sekansları (PCS2 +, pTnT, pCS105) için dizileri içerir. </li><li> Isı şok dönüşümü için tedarikçinin önerdiği protokol kullanılarak yetkili bakteri hücrelerine ligasyonu Transform. Not: Alternatif olarak, açık okuma çerçevesi (ORFeome) klonları koleksiyonu, ticari olarak mevcuttur ve enjeksiyon için transkriptleri oluşturmak için kullanılabilir. </li></ol></li><li> 10 4 karmaşıklık (10 Nisan - 10 Mayıs toplam karmaşıklığı) 10 3 Plazmidlerin 10 havuzları hazırlayın. 10.000 kolonilerin her - Bu 1000 ile 10 plakaları temsil eder. <ol><li> 37 ˚C de 18 saat ve 7 ml LB bir cam dağıtıcı ile hafif basınç her gelen koloniler toplamak - Plaka kütüphane kültürü 10 15 cm LB-ampisilin plakalar üzerine, 12 büyüyecek </li><li> 0.5 ml bir gliserol stok hazırlayın (-20 &amp; 0.2 ml steril gliserol ve mağaza eklemek# 730 C) ve bir standart ile, üretici firmanın talimatlarına aşağıdaki ticari olarak temin edilebilir DNA miniprep kiti DNA hazırlamak için, kalan 6.5 ml kullanılır. </li></ol></li><li> 1.5 saat - Enzim 1 için 37 ° C&#39;da 16 sindirimi, uygun kısıtlama - (2,0 ug 1,0) havuzlanmış plazmid DNA Linearize. Kullanılan RNA polimeraz kit özelliklerine göre su içinde etanol çökeltme ve yeniden süspansiyon haline getirildi, fenol / kloroform ekstraksiyonu ile linearize DNA izole edin. Üreticinin yönergeleri izleyerek bir ticari RNA polimeraz kiti ile duyu RNA sentez. </li><li> Yaklaşık 20 mikron çapında (cam kılcal boru ile bir iğne çektirmenin kullanarak) mikroenjeksiyon için iğne hazırlayın; kalibre oküler mikrometre ile bir bileşik mikroskop iğne uçları ölçün. Not: İğne çektirmesi ayarları ince forseps ile kırıldığı zaman istenilen uç boyutu ortaya çıkarır şekilde ince uçlu bir iğne üretmek ampirik olarak tespit edilmelidir. </li><li> (Içine kil itin hazırlayınçanak alt) üzerine muntazam tabakalı kil astarlı 35 x 10 mm mikroenjeksiyon sırasında yerinde oosit tutmak için paralel oluklar petri yemekler; alev ucunda erimiş bir alışveriş merkezi probu veya Pasteur pipeti ile oluklar üretirler. Kil, bir alternatif olarak, bir elastomer kalıp 17, girinti yaparak agaroz yemekler hazırlamak. Kil astarlı yemekleri satırları 1X MBS% 3 Ficoll (yaklaşık 2 ml) geniş çaplı bir pipet ile Aktarım oosit. </li><li> Mikroenjektör kullanarak, 1 ng / nl RNA ile iğne doldurup (oosit sitoplazması kadar çizim önlemek için) hafif pozitif basınç üretmek için dengesini ayarlamak. </li><li> Ekvator bölgesinde yaklaşık 20 nl RNA ile oosit enjekte edilir. Daha sonra, Ficoll-MBS kalır 1x MBS yavaşça aktarmak için enjekte edilmiş oositlerde için 1 saat izin verin. Önceden hayvan başlık tahlili için 20 ° C&#39;de 24 saat - 8 inkübe edin. </li></ol> 3. Hayvan Cap Testi <ol><li> Ince forseps, saç döngü, kavisli lamel parçaları, kil astarlı dis 3 / 4x NAM hazırlayın ve eldefincan şekilli girinti çıkıntılar ile hes oosit tutun. Kavisli parça üreten, (4 mm - - 2 mm x 2 yaklaşık 1) ve kenarları lehçe ve sarkık kadar alev geçerek küçük parçalara cam lamelleri ayrı kırarak kavisli lamel parçaları olun. </li><li> X döller laevis yumurta in vitro veya doğal çiftleşme ve aşamaları gastrula kültürün içinden 18 - önceden aşamaya göre sıralama için 0.1x MBS (10 oda sıcaklığında 11 saat sonrası fertilizasyon); 10 embriyoların - orta gastrula (11.5 aşama 11) toplamak. </li><li> 3 / 4x NAM yaklaşık yarısı dolu bir petri embriyolar transfer. Ince forseps iki çift kullanarak, gastrulae gelen fertilizasyon (vitellin) membran kaldırmak. </li><li> Aktarım kil astarlı yemekleri 3 / 4x NAM (yaklaşık 2 ml) oocytes ve oluklar yukarıda açıklandığı gibi bireysel embriyolar karşılamak için gösterim üreten, kil bireysel izlenimler hareketsiz. </li><li> Kil astarlı yemekleri embriyolar transfer ve g kapalı hayvan kesim kapaklarıastrulae ince forseps iki çift kullanarak. Değil, sadece ekvator doku 18 hayvan kap ektoderm izole etmek için özen gösterin. </li><li> Oosit ile temas hayvan kapağın iç yüzeyi ile her bir oosite hayvan yarımkürede bir hayvan kapağını yerleştirin. 8 saat veya daha uzun - 6 oosit yüzeyine maruz iç tabaka ile açık kalabilir (lamel kontaklar olarak hayvan kapakları kil ektoderm düzleşme, bombeli cam lamel fragmanı uygulanması ve cama aşağı doğru basınç uygulayarak rekombinantlarını arada tutmak ). Alternatif olarak, yukarı doğru bakan iç yüzeyi ile bir kil girinti hayvansal takarak ve kapağı üzerinde bir oosit yerleştirmek; Not: kil, küçük uzantıları ile rekombinant sabitleyin. </li><li> 20 ° C&#39;de Kültür kontrol embriyolar tahlil için sahne istenen ulaştıkları kadar. </li><li> Lamel / kil kaldırılması ve forseps ve saç döngü ile ektoderm izole ederek ayrı rekombinant. </li><li> MEMFA 1 saat (% 3.8 için ektodermal fragmanları FixMEM [0,1 M MOPS pH 7.4, 2 mM EGTA ve 1 mM MgSO 4] formaldehit). </li><li> -20 ˚C etanol ve mağaza MEMFA transfer fragmanları (ve kontrol embriyolar). </li></ol> In situ Hibridizasyon tarafından Ektoderm içinde Yanıtın 4. Analizi (ISH) <ol><li> ISH için çözümler hazırlayın. <ol><li> 1x PBS hazırlayın: 0.01 M fosfat tamponlu tuz, NaCl 0.138 M, pH 7.4 </li><li> Hazırlama PBS-Tween (PTW): 1x PBS,% 0.1 Tween-20 </li><li> 100x Denhart solüsyonu hazırlayın: 2% BSA,% 2 polivinilpirolidon,% 2 Ficoll </li><li> Hibridizasyon tamponu hazırlayın:% 50 formamid, 5x SSC, 1 mg / ml maya RNA Torula, 1 ug / ml heparin, 1x Denhart solüsyonu,% 0.1 Tween-20,% 0.1 CHAPS, 10 mM EDTA, DEPC H2O </li><li> Hazırlama Maleik asit tampon (MAB): 100 mM maleik asit, 150 mM NaCI, pH 7.5 </li><li> (Çözünmesi 60 ˚C ısı) MAB,% 2 reaktifi engelleme: MAB + blok hazırlayın </li><li> 100 mM Tris: Alkalen Fosfataz (AP) Tampon hazırlayınpH 9.5, 50 mM MgCI2, 100 mM NaCI,% 0.1 Tween, dH 2 O </li></ol></li><li> RNA Probe hazırlayın. <ol><li> 1.5 ml tüp (50 ul reaksiyon) eklemek ticari bir RNA polimeraz kit kullanılarak ve karışımı-NTP dig: 25.5 ul DEPC, H2O, 10 ul 5X Transkripsiyon tamponu, 2.5 ul 10x dig-NTP karışımı, 5 ul 100 mM DTT, 2 ul RNAsin, 2 ul doğrusallaştırılmış DNA şablonu (~ 1 ug / ul), 3 ul RNA Polimeraz ve 90 dakika için 37 ° inkübe edin. </li><li> 2 ul RNA Polymerase ekleyin ve 60 dakika için 37 ° inkübe edin. </li><li> % 1 agaroz jeli üzerinde reaksiyon 2 ul kontrol edin. </li><li> 1 ul RQ1 RNase-barındırmayan DNase ilave edin ve 20 dakika boyunca 37 ° inkübe edin. </li><li> 50 ul DEPC H2O, 25 ul 10 M amonyum asetat ve 313 ul etanolün eklenmesi ile prob Çökelme. -20 ° C&#39;de saklayın, gece boyunca (O / N), daha sonra 20 dakika boyunca 13.800 x g&#39;de santrifüjleme ile geri RNA. Kısaca spin 500 ul% 75 etanol ile yıkayın, kaldırmaketanol ve kuru hava pelet izin verir. Ekle 50 ul DEPC H 2 O. </li><li> 0.5 ug / ul ~ arasında nihai bir konsantrasyona kadar Hibridizasyon Tamponu ekleyin. </li></ol></li><li> Hibridizasyon için Tissue hazırlayın. Aksi belirtilmediği sürece, her bir çözüm değişikliği tarif edildiği gibi (yaklaşık 4 mi) ile üst şişeler doldurulur. <ol><li> Yatay rocker, 10 dakika her biri için% 75 etanol / PTW, daha sonra% 50 etanol / PTW Şişelerden ve transfer embriyolar etanol çıkarın. </li><li> 5 dakika rocker üzerinde her biri için PTW üç kez yıkayın. </li><li> 10 ug PTW içinde / ul Proteinaz K tedavisi transfer; Kaya tüpleri dik 15 dk. </li><li> Dikey kaya tüpleri - 0.1 M Triethanolamine pH 7.8 iki kez 10 dakika her durulayın. </li><li> Tüplere 12.5 ul asetik anhidrit eklenir ve dikey olarak 5 dakika sallayın. 5 dakika boyunca ilave 12,5 ul asetik anhidrit ile tekrarlayın. </li><li> Rocker dk dikey PTW 5 yıkayın. </li><li> Rocker% 4 paraformaldehid 20 dakika içinde Refix. Isı Hibridizasyon Tampon60 ˚C ye. </li><li> 5 dakika rocker üzerinde her biri için PTW üç kez yıkayın. </li><li> 250 ul Hyb Buffer her tüpten PTW tüm ama ~ 1 ml çıkarın ve ekleyin; hafifçe karıştırın tüpler girdap. Kaya tüpleri dik 5 dk. </li><li> 60 ˚C Hyb Tamponu (0.5 mi) ile değiştirin ve 60 ° C&#39;de 10 dakika yavaşça çalkalayın. Taze Hyb Tampon ile değiştirin ve 60 ˚C iki 4 saat sonra çalkalayın. </li><li> Isı sondası 60 ° C (3 dakika) (0.5 ug Hyb Tamponu içinde / ml 1 ml). Hyb Buffer çıkarın ve tüpler probu ekleyin. O / N 60 ° C&#39;de yavaşça çalkalayın. </li></ol></li><li> Antikor için Tissue hazırlayın. <ol><li> 60 ° C&#39;ye ısınmaya Hyb Tampon ve 2 x SSC +% 0.1 Tween-20 çözümler. </li><li> (- 3x yeniden kullanım için 2 -20 ˚C de probları kaydetmek) Hyb Tampon ile prob çözümü değiştirin. 10 dakika boyunca 60 ° C&#39;de yıkanır. </li><li> 2x SSC-Tween 60 ° (20 dakika çalkalanarak her biri) üç kez yıkayın. </li><li> 0.2X SSC-Tween 60 ° (20 dakika çalkalanarak her biri) üç kez yıkayın. </li><li> Rocker üzerinde 15 dakika her yatay için MAB (RT) iki kez yıkayın. </li><li> 1 ml MAB + bloğu ekleyin. Rocker dikey 2 saat yıkayın. </li><li> 1 / 2.000 Anti-dioksijenin-AP içeren 1 ml MAB + blok transfer. 4 CO / N dikey sallayın. </li></ol></li><li> Renk Reaktif için Tissue hazırlayın. <ol><li> MAB ile antikor çözüm değiştirin; MAB 5 dakika her yatay rocker üç kez yıkayın. </li><li> MAB 1 saat her yatay rocker üç kez yıkayın. </li><li> AP Tampon 10 dakika içinde her yatay rocker iki kez yıkayın. </li><li> Birden-iyi plastik tepsi doku aktarın AP Buffer kaldırmak ve BM Mor reaktifmi (~ 1 ml). Reaksiyon O / N karanlık 5 dakika içinde ilerlemeye izin verin. </li><li> Uygun boyama elde edildiğinde, PTW ve şişelere doku aktarın. Rocker üzerinde PTW iki kez 10 dakika her yıkayın. </li><li> Rocker 4 CO / N at Bouin çözeltide sabitleyin. </li><li> RT&#39;de Bouin üç% 70 etanol /% 30 PTW yıkar ile yıkayın. T DevamGerekli 18 ise epi-aydınlatma ve bir mikroskop monte kamera, ağartma kullanarak o görüntü yakalama. </li></ol></li></ol> 5. Sib Seçimi ve Klonlama <ol><li> En yüksek aktivite ile seçin havuzu (ektodermal dokusunda büyük tepki). </li><li> (Yukarıda protokol bölümü 2 kullanılarak) önceki adımda elde edilen koloniler, en yüksek etkinliği olan havuzu için gliserol stokları (uygun yoğunluğa LB ile seyreltilmiş) ile yaklaşık onda biri ile on yeni plakaları plaka titre edilir. </li><li> Etkinlik tek koloni takip dek havuzu boyutunu azaltın. </li><li> Vektör standart primerler kullanılarak DNA sekansı elde edilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Yergeau, D., Kelley, C. ., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+Genetic+Screens+in+Xenopus.+Using+Transposon-Mediated+Insertional+Mutagenesis.">Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).</li><li>Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis.+as+a+Model+Organism+for+Genetics+and+Genomics:+Past,+Present+and+Future.">Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).</li><li>Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Efficient+CRISPR/Cas9-Mediated+Targeted+Mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51, 835-843 (2013).</li><li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis.">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis.</a> Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li><li>Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetic+Studies+Using+Antisense+Morpholino+Oligonucleotides.">Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).</li><li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injected+Xwnt-8.+RNA+acts+early+in+Xenopus.+embryos+to+promote+formation+of+a+vegetal+dorsalizing+center.">Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center.</a> Cell. 67, 753-765 (1991).</li><li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+cloning+of+noggin.,+a+new+dorsalizing+factor+localized+in+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos.">Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li><li>Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+of+induction+of+anterior+head+ectodermal+properties+in+Xenopus.+embryos+are+mediated+by+transcriptional+cofactor+ldb1.">Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).</li><li>Servetnick, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus.+ectoderm:+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer.">Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Development. 112, 177-188 (1991).</li><li>Nieuwkoop, P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+cloning+of+Siamois.,+a+Xenopus.+homeobox+gene+expressed+in+dorsal-vegetal+cells+of+blastulae+and+able+to+induce+a+complete+secondary+axis.">Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis.</a> Cell. 81, 85-94 (1995).</li><li>Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+cloning+of+a+Xenopus+T.-related+gene+(Xombi.)+involved+in+mesodermal+patterning+and+blastopore+lip+formation.">Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation.</a> Development. 122, 4001-4012 (1996).</li><li>Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus.+dorsalizing+factor+Gremlin+identifies+a+novel+family+of+secreted+proteins+that+antagonize+BMP+activities.">The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities.</a> Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).</li><li>Lustig, K., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+oocyte+expression+assay+to+reconstitute+inductive+signaling.">Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li><li>Viczian, A., Zuber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Determination+Using+the+Animal+Cap+Transplant+(ACT)+Assay+in+Xenopus+laevis.">Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis.</a> J. Vis. Exp. (39), e1932 (2010).</li><li>Sive, H., Grainger, R., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. , (2000).</li><li>Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+activation+during+early+stages+of+lens+induction+in+Xenopus.">Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus.</a> Development. 125, 3509-3519 (1998).</li><li>Medina-Martinez, O., Jamrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxe+view+of+lens+development+and+disease.">Foxe view of lens development and disease.</a> Development. 134, 1455-1463 (2007).</li><li>Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+in+the+tetraploid+Xenopus.laevis.+enables+genome-wide+insight+in+a+classic+developmental+biology+model+organism.">RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism.</a> Methods. 66, 398-409 (2014).</li><li>Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+large+set+of+full-length+clones+from+a+Xenopus+tropicalis+EST+project.">Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project.</a> Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).</li><li>Karpinka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenbase,+the+Xenopus.+model+organism+database;+new+virtualized+system,+data+types+and+genomes.">Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).</li><li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signaling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis.">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PLoS ONE. , e79469 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Yetkili ektoderm bir yanıt indükleme yeteneğine sahip genlerin fonksiyonel klonlanması için, burada açıklanan yöntem, gen ürünlerinin geniş tanımlamak için kullanılabilir. Bu yöntem ifade klonlama teknikleri ile doku uyaran deneyleri birleştirerek geçmiş iş üzerine genişletir. Bu RNA, enjeksiyonu takiben, doğrudan veya dolaylı olarak, faktör uyarıcı üretim kaynağı olarak, Xenopus oosit metabolik yolları kullanmaktadır. Bu ilgi, bir cDNA kütüphanesi veya klonları diğer toplama elde edilen transkriptlerin ekspresyonunu kullanarak 6,7 bir genin klonlanması için kurulan yöntemlerin kullanımı ile kombinasyon halinde embriyonik katılan yeni bir ilgi genleri tanımlamak için arayan için değerli bir yaklaşım sağlar indüksiyon. Yeni genlerin fonksiyonel kimlik bu yöntemin geniş bir uygulama verici yeni ters genetik yaklaşımlar için yararlı bir tamamlayıcısıdır, ve aynı zamanda yüksek thr kullanılarak belirlenen deney transkript fonksiyonel olarak kullanılabiliroughput (örneğin, RNA-SEQ gibi) yöntem 21. Kontroller kap Deneyde kullanılan oositlerin metabolik fonksiyonu izlenmesi büyük önem taşımaktadır. Hem INHBB test edilmiştir mezoderm uyarıcının mRNA değişken konsantrasyonları, her parti oosit ve düşük miktardaki transkriptlerini algılamak için bu sistem kullanışlılığı kurmak için sağlığını sağlamak; Bu gen lens indüksiyon yolunun ilgisi yoktur ve iyi belgelenmiş bir bağımsız denetim 14&#39;tür. 2 ile gözlemlendi, 12/101 antikoru ile hayvan kap ektoderm kasa özgü antijenlerin ekspresyonu ile analiz, aktivitesi kas indükleyici - daha varlığında, 200 pg INHBB mRNA aşırı aşaması 14 poli (A) 500 misli + RNA,. Sistem enjekte RNA miktarı çok geniş bir aralıkta, böylece yararlıdır ve oositler, kararlı bir şekilde protein üretir ve 50 nl ve daha yüksek hacim sitoplazmik enjeksiyonu takiben canlı kalması mümkün bulunmaktadır. U için bir gözBu protokolde bir cDNA kütüphanesinin se tam uzunluktaki veya hemen hemen tam uzunlukta klonlar için bir gerekliliktir. Protokolü içerisinde kullanım öncesinde, kütüphane kütüphane bilinen transkript boyutunu belirlemek ve bu nedenle dominant-negatif etkiler potansiyel olarak kesildi enjekte transkript elde edilir olasılığını azaltmak için Northern analizi ile kontrol edilmelidir. Tam uzunlukta bir cDNA havuzu, önemli olduğu için, EST klonlarının kullanımı 22 ve optimum bir şekilde, (doğrulanmış tam uzunluktaki klonların tam bir kümesi içerir) Xenopus ORFeome 23, geleneksel bir cDNA kütüphanesinden tercih edilir safha ve doku sürece cDNA, belirli bir kaynak talep ve kütüphane yapımı için kullanılır. Diğer bir önemli husus β-globin ve poli (A) enjekte transkript mRNA stabilitesini artırmak amacıyla tasarlanmıştır kütüphane vektöründeki dizilerin varlığıdır. Bu enjekte sentetik mRNA&#39;dan üretilen proteinin miktarını arttırmak için arzu edilir ise, aynı zamanda possibil yükseltirin vivo olarak daha kararlılığı ve aktivitesi yüksektir mRNA&#39;dan dominant-negatif bir etki üretme olmadığını göstermektedir. Düşük kopya numarası mRNA büyük bir havuzun arka planda endojen meslektaşı ile aynı etkilere neden olmayabilir; Klonlama ve transkripsiyon işleminde stabilize edilir, bir kap deneyinde saptanmasına olanak tanınması için devam edebilir. Üçüncü konu havuzu boyutu; Havuz boyutu önemli azalma (10 klon veya daha az) embriyolar 24 son kazanç fonksiyon-tarama projelerinde avantajlı olduğu gösterilmiş ve net sonuçlar ve aday genlerin daha kolay tanımlanmasını sağlamak muhtemeldir edilmiştir. 10 3 den daha küçük bir havuz boyutu - klonların koleksiyonunun toplam karmaşıklığı az 10 4 ise ORFeome 23 ile olduğu gibi, bu protokolde tavsiye 10 4, ulaşılabilir; o prohibitively emek-yoğun olabilir ama biri, 900 10 havuzları ile başlayan ~ 9000 klonları taramak olabilirBir deneyde fazla 10 havuzları işlem. Olarak belirlenen gen tarafından yapılan (sekans analizi ile) gen ürününün tipinin belirlenmesi işlevi testlerinin doğasını belirler. Nükleer transkripsiyon kofaktör Ekranımıza 8&#39;de belirtilen bu yana, ldb1 getirilmesi ile tetiklenen endüktif işlemde çekirdeğin rolünü doğrulamak için gerekliydi. Enüklee oosit tam işleyen bir protein sentetik makine ve uygulanabilir ve enjekte transkript salgılanan faktörlerin üretme yeteneğine sahiptir. Ancak, çekirdeğinin olmaması transkripsiyon faktörleri, kofaktör veya diğer dolaylı etkili gen ürünlerinin işleyişini ortadan kaldıracaktır. Ekranda belirlenen genlerin sonraki analizler in situ melezleme yoluyla gelişimsel ifade deseninin belirlenmesi dahildir ve kazanç fonksiyon-ve-kaybı fonksiyonu testlerinde. Zigot içine RNA enjeksiyonla ya da sp enjeksiyon sınırlayarak aşırı ekspresyonuecific blastomerler in vivo transkript karşı morfolino oligonükleotid enjeksiyon yoluyla anlayış, hem de gen fonksiyonu demonte sağlayabilir embriyo belirli bölgelere etkileri kısıtlamak için. Büyük ölçüde tarama süreci hızlandırmak ve in situ melezleme RNA ifade analizi için gereksinimini ortadan kaldırabilir (GFP gibi) bir raportör gen ile bir transgenik hattı kullanarak yanıt hayvan kap ektoderm bir endüktif etki Doğrudan görselleştirme. Benzer şekilde, tarama hızlı aracı olarak antikorların kullanımı, arzu edilir ise, uygun bir antikor vardır (yukarıda ele alınan kas yanıt 12/101 gibi). Albino embriyolar daha iyi renk reaksiyonu eşya görselleştirmek için, vahşi tip pigmentasyon bir ağartma ihtiyacını ortadan kaldırarak, in situ hibridizasyon sürecini kolaylaştırmak daha zor olmasına rağmen gastrula aşamalarında doğru sahne hayvan kapaklar için kullanılabilmektedirUCT. Son olarak, çeşitli nedenlerle, denemelerin büyük sayısı, verilen bir genin belirlenmesi için yürütülen gerekebilir dikkate alınması önemlidir. İlk olarak, bir durumda sayısı belli bir denemede uygun süreç, daha embriyo büyük toplu olan ve kültüre bunları sıcaklıklarda bir dizi verilen bir süre içinde meydana gelir gelişimi (ve yetkinlik nihai kaybı) ile sınırlıdır olabilir iyi işleme ektoderm küçük parçalar oluşabilecek kaybı. Başka için, ektoderm bir seçilmiş marker ifade başarı oranları çok düşük olması ve istatistiksel olarak anlamlı bir etkisinin gözlemlemek için birçok vaka gerektirebilir.

Forward genetic approaches to identify genes of interest through their function or loss-of-function1,2 are an integral part of understanding complex patterning events in development. Coupled with powerful reverse genetic techniques available to an ever-widening array of systems and researchers3-5, it is now possible to identify genes with a key functional role in a pathway and then elucidate that function at the cellular level and in interaction with other gene products. One approach to functionally identifying genes of interest that has yielded many key findings in the past is expression cloning6,7.
Our recent aim8 was to identify early lens-inductive factors, since it has been demonstrated that initial steps in the vertebrate lens-inductive process occur as early as gastrula stages. To that end, we used the transiently lens-competent9 animal cap ectoderm (stage 11-11.510) of Xenopus embryos as responding tissue for induction, and the stage VI Xenopus oocyte as a source of production for the inducing factors.
The following protocol builds on the expression cloning and sib selection protocols of Smith and Harland6,7, also successfully used by others11-13. In our oocyte expression system (first utilized for production of inducing factors by Lustig and Kirschner14), pools of injected transcripts capable of directly or indirectly causing the oocytes to produce factors that elicit a lens-inductive response in animal cap ectoderm are selected for and identified. Since the system is useful for expressing secreted inducing molecules directly (oocyte-injected INHBB mRNA causes mesoderm induction in mesoderm-competent animal cap ectoderm8), we originally expected the screening procedure to be useful chiefly for identification of paracrine factors. However, since we identified a nuclear factor in our screen (ldb18), it is clear that the system can be used to identify a wide variety of molecules such as transcriptional or translational regulatory factors, miRNAs, cofactors, or juxtacrine factors.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="766">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">12/101 Antibody</td>
			<td style="width:191px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">12/101</td>
			<td style="width:233px;">Monoclonal antibody for detection of muscle tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">20X SSC Buffer</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">S6639</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Acetic anhydride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A6404</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Dig-AP</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:135px;">11093274910</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Aurum Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">732-6400</td>
			<td style="width:233px;">Plasmid DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Blocking Reagent</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:135px;">11096176001</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">BM Purple</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:135px;">11442074001</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Boekel Hybridization Oven</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">13-245-121</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Bouin&#39;s Solution</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">HT10132</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">BSA</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A9647</td>
			<td style="width:233px;">for OCM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CHAPS</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">C3023</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Collagenase A</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:135px;">10103578001</td>
			<td style="width:233px;">Defolliculation of oocytes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cysteine</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">C121800</td>
			<td style="width:233px;">Dejelly embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">DEPC-H2O</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP5611</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Dig-RNA Labeling Mix</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:135px;">11277073910</td>
			<td style="width:233px;">for ISH probes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:135px;">500233</td>
			<td style="width:233px;">for Vitelline envelope removal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethyl 3-aminobenzoate</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A5040</td>
			<td style="width:233px;">MS222 anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ficoll PM 400</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">F4375</td>
			<td style="width:233px;">for Injection media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formamide</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">F9037</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G1914</td>
			<td style="width:233px;">for OCM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Glass capillaries</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:135px;">4878</td>
			<td style="width:233px;">3.5&#34; long, I,D, 0.530mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Glass sample vials</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">06-408B</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Hair loop</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:233px;">Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">H4784</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Injector Nanoliter 2010</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:135px;">Nanoliter 2010</td>
			<td style="width:233px;">Microprocessor-controlled microinjector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:191px;">Carolina</td>
			<td style="width:135px;">972433</td>
			<td style="width:233px;">Aquarium Salt for frog recovery</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA</td>
			<td style="width:191px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:135px;">989_IRBG</td>
			<td style="width:233px;">cDNA library&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">LB Agar plates with 100 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:135px;">L5004</td>
			<td style="width:233px;">150mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">LB Luria Broth</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:135px;">L8650</td>
			<td style="width:233px;">LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Magnetic mRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:191px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:135px;">S1550S</td>
			<td style="width:233px;">for isolation of poly(A)-enriched RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Maleic Acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">M0375</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Manual Microfil Micromanipulator</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:135px;">M3310R</td>
			<td style="width:233px;">Manual micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Nutating Mixer</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">22-363-152</td>
			<td style="width:233px;">Rocker for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Permoplast</td>
			<td style="width:191px;">Nasco</td>
			<td style="width:135px;">SB33495M</td>
			<td style="width:233px;">Clay for injection and dissection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P5368</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">PMSG</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G4877</td>
			<td style="width:233px;">to stimulate oocyte development</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">PVP40</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Programmable Puller</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:135px;">PUL-1000</td>
			<td style="width:233px;">Micropipette needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P6556</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">pTnT Vector</td>
			<td style="width:191px;">Promega</td>
			<td style="width:135px;">L5610</td>
			<td style="width:233px;">cDNA library construction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Riboprobe Combination System</td>
			<td style="width:191px;">Promega</td>
			<td style="width:135px;">P1450</td>
			<td style="width:233px;">in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">18248013</td>
			<td style="width:233px;">kit for cDNA library construction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Sutures, 3-0 silk</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">19-037-516</td>
			<td style="width:233px;">Suture thread and needle for post-oocyte removal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Torula RNA</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">R3629</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triethanolamine</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T1502</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Tween 20</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P9416</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Universal RiboClone cDNA Synthesis System</td>
			<td style="width:191px;">Promega</td>
			<td style="width:135px;">C4360</td>
			<td style="width:233px;">alternative kit for cDNA library construction</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration</td>
			<td style="width:191px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:135px;">5055_XenORFeome</td>
			<td style="width:233px;">ORFeome Clones</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">XL2-Blue Ultracompetent Cells</td>
			<td style="width:191px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:135px;">200150</td>
			<td style="width:233px;">cells for transformation of cDNA library</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional cloning using a xenopus oocyte expression system

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Hayvan kap doku yanıt, oositler enjekte mRNA ekspresyonu yanıt olarak in situ hibridizasyon (Şekil 2 ve Tablo 1) e göre otx2 ekspresyonu için tahlil edilmiştir; otx2 göz taslakları nöral tüp kapanması ile ilgili olası lens ektoderm (PLE) cinsinden ifade edilir kalınlaşma 19. Otx2 da PLE dışındaki ön nöral ektoderm olarak nöral olmayan baş ektoderm ifade edilir Bununla birlikte, bu nöral ve placodal tepkiler, her iki ile ilişkilidir. Foxe3 nöral plakadan PLE ifade edilir çünkü foxe3 kullanımı sentezleme klonlama amacı için daha özel bir yaklaşım izin lens yetkin hayvan kap ektoderm bir lens uyarılma karşılığının üretebilen bir gen ürünü için kütüphanenin taranması için Bitişik placodal bölgelerde mevcut ama neuroectoder eksik aşamaları ve lens vezikül oluşumu 20 boyunca,<html> m. Yukarıda klonlama ve ifade sib bir seçilim protokolü kullanarak kütüphane transkriptlerinin havuzları enjekte hayvan kaplar içine foxe3 ifade üretme yetisine sahip bir gen (Tablo 2) elde edildi. Klonun izolasyonundan sonra, kütüphane transkriptleri ile enjekte edilmiş oositlerde kullanılarak 179 ek hayvan kap deneyleri foxe3 sentezlenmesi için taranmıştır; 50 olumlu (% 28). Uninjected oosit yerleştirilen 140 hayvan kap parçaları, 0 (Şekil 3) pozitif bulunmuştur. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53518/53518fig1.jpg" /> Şekil 1. Oosit hayvan başlık tahlili ve ifade klonlama protokol şematik gösterimi. Transkript klonu kütüphane hazırlandı ve oositleri içine enjekte edilir, hayvan kap ektoderm oositlerde kültürlendi ve sonra da in situ hibridizasyon ile uyarılan gen ifadesi için test edilir.<html> d / 53518 / 53518fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53518/53518fig2.jpg" /> MRNA Enjeksiyon ve Otx2 in situ Hibridizasyon aşağıdaki hayvan başlık tahlili Şekil 2. Tipik sonuçlar. (AB) endüktif yanıtın Örnek sonucu yerinde bütün montaj tarafından otx2 ifadesi için tahlil, hayvan kapaklar evre 14 poli (A) + RNA dorsalized için melezleşme. Oosit üzerinde okuyun (A) Hayvan kapaklar aşamasına aşamada 10.5 enjeksiyon yapılmamış oosit üzerine yerleştirilmiş ve kültüre 25 (B) Aşama 10.5 hayvan kapaklar 10 ng RNA ile enjekte edilmiş ve sentezleme ile 6/7 olguda ve belirtilen otx2 aşamasında 25 nolu kültürlenmiş ok uçları. Çubuk = 500 um.<html> &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53518/53518fig3.jpg" /> In situ olarak melezleşme ile foxe3 ekspresyonu için test edilen oosit hayvan kap tahlilleri, Hayvan Deneyi Cap Foxe3 in situ Hibridizasyon, aşağıdaki Şekil 3. tipik sonuçları. (AC) Örnek hayvan kapakları. (A) 11-11,5 Aşama hayvan kapaklar aşaması 23. foxe3 ifade ldb1-enjekte edilmiş oositlerde üzerine yerleştirilmiş ve kültürlenmiş ok uçları ile belirtilir. (B) Sahne uninjected oosit ve yerleştirilen 11-11,5 hayvan kapakları 23 sahneye kültürlü; Hiçbir foxe3 ekspresyonu tespit edilmiştir. Foxe3 ila (C) Bölüm ektoderm iç ve dış tabakalar bir gösteren ifade hayvan kapağı neden pozitif. Barlar, 500 mikron =.f = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:263px;"> Enjekte RNA </td><td style="width:147px;"> Pozitif vaka </td><td style="width:73px;"> Gen </td><td style="width:64px;"> % </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Aşama 14 dorsalized mRNA, 10 ng </td><td> 12/24 </td><td> otx2 </td><td> 50 </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> 10 5 klonların Kütüphane havuzları, 20 ng </td><td> 3/9 </td><td> otx2 </td><td> 33 </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> 10 5 klon 10 0 Kütüphane havuzları<html> es, 20 ng </td><td> 50/179 </td><td> foxe3 </td><td> 28 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Hiçbiri </td><td> 0/140 </td><td> foxe3 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Oosit-Hayvan Deneyi Sonuçları Cap hayvan başlık tahlili sonuçları mRNA veya cDNA kütüphane havuzu sentezlenen transkriptleri ile enjekte edilmiş oositlerde kullanılarak otx2 ve foxe3 in situ olarak melezleşme ile değerlendirildi.; veya uninjected oosit. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:256px;"> Enjekte RNA </td><td style="width:191px;"> Havuz atama / seçim </td><td style="width:183px;"> Pozitif foxe3 ifadesi </td></tr><tr height="24">Sekiz: 24px; &quot;&gt; 10 5 klonların Kütüphane havuzları, 20 ng </td><td> A </td><td> 2/4 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> B * </td><td> 4/28 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> C </td><td> 4/44 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> 10 4 klonların Kütüphane havuzları, 20 ng </td><td> 1 </td><td> 0/11 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 2 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 3 </td><td> 3/14 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 4 </td><td> 0/12 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 5 </td><td> 0/15 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 6 </td><td> 1/20 </td></tr><tr height="21"><html><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 7 </td><td> 3/23 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 8 </td><td> 0/16 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 9 </td><td> 0/16 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 10 * </td><td> 5/20 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 5000 klonların Kütüphane havuzları, 20 ng </td><td> 1 </td><td> 0/7 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 2 * </td><td> 5/16 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 3 </td><td> 1/7 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 4 </td><td> 0/7 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 5 </td><td> 0/7 </td></tr><tr height="21">ht: 21px; &quot;&gt; 400 klonları Kütüphane havuzları, 20 ng </td><td> 1 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 2 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 3 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 4 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 5 * </td><td> 8/26 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 6 </td><td> 0/11 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 7 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 8 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 9 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 10 </td&gt; <td> 0/8 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 70-200 koloni Kütüphane havuzları, 20 ng </td><td> 1 </td><td> 0/8 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 2 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 3 * </td><td> 1/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 4 * </td><td> 1/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 5 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 6 </td><td> 0/9 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 7 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 8 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 20 koloni Kütüphane havuzları, 20 ng </td><td> 1 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 2 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 3 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 4 * </td><td> 7/21 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 5 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 6 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 7 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 8 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 9 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 10 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td<html> height = &quot;21&quot; style = &quot;height: 21px;&quot;&gt; 6 Kütüphane havuzları - 7 kolonilerinin, 20 ng </td><td> K2-6 L1 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> L2-6, M7 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> M8-12, N7-8 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> K5-6, L1-4 </td><td> 1/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> L5-6, M7-10 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> M11-12, N7-8, K2-4 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> K2, K5, L2, L5, M8, M11 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> K3, K6, L3, L6, M9, M12 </td><td> 0/9 </td></tr><tr height="21">1px; &quot;&gt; </td><td> K4, L1, L4, M7, M10, N7, N8 </td><td> 1/9 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Kütüphane RNA&#39;lar 20 ng </td><td> K6 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> L1 * </td><td> 3/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> L3 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> L4 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Kütüphane RNA, 20 ng </td><td> L1 (ldb1) onay </td><td> 50/179 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> * Seçilen havuz gösterir </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2. Sib Seçimi ve Expresalgılanması klonlanması (10 ve% foxe3 ifadesi açısından pozitif% 36 arasında değişen) her bir hayvan başlık tahlili yanıtın en üst düzeyde havuz bir klon aktivitesi daraltmak için aşağıdaki deneyde kullanılmak üzere seçildi. Sonuçlar. Asterisk, seçilen havuz gösterir.

Watch this Scientific Journal Video about Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System at JoVE.com

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit ekspresyon sistemi

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

functional-cloning-using-a-xenopus-oocyte-expression-system

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

8.0K Görüntüleme.  Shepherd University. We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Video: Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Gelişim Biyolojisi

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Larva Zebra balığı Skin bir İndüklenebilir Gal4 / UAS İfade Sisteminin Kullanılması doğuştan gelen bağışıklık ve preneoplastik Hücre Etkileşimleri Canlı Görüntüleme

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Detaylı Mekansal İfade Haritalar Dinamik İfade Verilerinin Zamansal Sipariş

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

Kullanılması Anne Gen Ürünlerinin Fonksiyonel Manipülasyonu<em&gt; İn Vitro</emZebra balığı&gt; Oosit Olgunlaştırma

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Fetal fare bir yüksek frekans ultrason (30/45 MHZ) sistemi kullanarak Imaging kardiyovasküler

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Endotel Kolonisi Oluşturan Hücreler ve Mezenkimal Kök Hücreler tarafından Oluşturulan Eş Kültür Sfaoidler Kullanılarak Üç Boyutlu Anjiyogenez Tsay Sistemi

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...