Bu çalışma Texas McGovern Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatri Bölümü&#39;nden Sağlık NIDDK hibe (K01DK092320) ve başlangıç ​​fon Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

(: HSC-AWC-13-135 protokol #) Aşağıdaki protokol Kurumsal Bakım ve Kullanım Kurulu olarak hizmet vermektedir Laboratuar Hayvan Hastalıkları Hayvan Refahı Komitesi için Houston&#39;ın Merkezi&#39;nde Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Böbrek hedefli Enjeksiyonlar için blastomer 1. Kimlik ve Seçimi <ol><li> Embriyoların oluşturmadan önce, embriyo erken hücre bölünmeleri yönünü anlamak için Xenopus Kalkınma 21 Normal Tablo kullanın. Alternatif olarak, Xenbase 11 Xenopus erken gelişim aşamaları erişim şemaları. </li><li> Mikroenjeksiyon için hedeflenen hangi blastomere seçmek için Xenbase 11 interaktif Xenopus hücre kaderi haritalar erişin. </li><li> Tek hücreli embriyo bir koyu pigmentli hayvan kutup beyaz ve yolky bir bitkisel kutup, sahip olduğunu gözlemleyin. Not Vitellin E olarak bilinen koruyucu zar,nvelope, embriyo kapsar. </li><li> İlk bölünme genellikle embriyonun sol ve sağ taraf arasında meydana dikkat edin. Bu hücreler Pronephric soy eşit katkıda bulunur. </li><li> İkinci bölünme 4 hücreli embriyo lider, dorsal ve embriyonun ventral yarılarına ayıran unutmayın. Dorsal hücreleri daha küçüktür ve ventral hücreleri (Şekil 2A ve Şekil 3A) daha az bir pigment. <ol><li> Sol ve sağ tarafta, dorsal daha gelişen böbrek daha fazla katkıda (D; küçük, hafif hücreler) blastomer (Şekil 2A); ventral blastomer (büyük, koyu hücreler V) belirleyin. </li><li> 4 hücreli embriyo içine enjekte ise, sol böbrek (Şekil 3A ve Bölüm 3) hedef sol ventral blastomer enjekte. </li></ol></li><li> üçüncü bölge sekiz hücreli embriyonun sonucu, hayvansal ve bitkisel tarafı ikiye bölmektedir. Bu noktada, dört hayvan blastomerler [vardır sol ve sağ ventral(V1) ve dorsal (D1)], dört bitki blastomerler [sol ve ventral sağ (V2) ve dorsal (D2)] (Şekil 2B ve Şekil 3B). <ol><li> ventral, bitkisel blastomer (V2) bulun. Bu blastomer başka hücreler bu aşamada (Şekil 2B) gelişmekte böbreğe daha fazla katkıda bulunur. 8 hücreli embriyo sol böbrek hedeflemek için, sol V2 blastomer (Şekil 3B ve Bölüm 3) içine enjekte edilir. </li></ol></li><li> Dördüncü ve beşinci bölünmelerin hayvansal ve bitkisel blastomer ikiye bölmek dikkat edin. İki döl 16 hücreli embriyo ile sonuçlanan, her blastomere oluşturulur. Hücreler kendi selefi adını taşır. Örneğin, 8-hücre evresinden itibaren V2 blastomere 16 hücreli aşamada (Şekil 2C) V2.1 ve V2.2 döl yol açar. 16-hücre aşamasında V2.2 hücrenin gelişmekte olan böbrek katkıda hücrelerin çoğunluğu içerir. </li><li> Altıncı ve yedinci bölünmelerin 32 hücre Embry neden NotO. Yine, iki döl onların selefi aşağıdaki adlandırılır her blastomer, oluşturulur. Örneğin, 16-hücre evresinden itibaren V2.2 blastomere 32 hücreli aşamada V2.2.1 ve V2.2.2 yol açar. Orada hücreleri (bitkisel hayvana) A, B, C ve D olmak üzere dört sıra halinde tespit edildiği 32. hücreli aşamada alternatif bir adlandırma sistemi ve dört sütun içinde 1, 2, 3 ve 4 (şekilde dorsal) ventral için. Bu nedenle, gelişmekte olan pronephros en çok katkıda bulunan V2.2.2 blastomere, bu alternatif bir adlandırma sistemi (Şekil 2D) altında C3 adlandırılır. </li></ol> Embriyolar 2. Hazırlık <ol><li> (PH-8,0% 2 sistein, NaOH) Dejelly çözeltisinden 50 ml hazırlayın. </li><li> Standart protokollere 14&#39;e göre bir tek erkek kurbağa hem testis izole edin. 0.1 M NaCI, 2 mM KCI, 1 mM MgSO 4, 2 mM; 10 mi Testis saklama solüsyonu (1 x Marc Modifiye Ringer [MMR ile dolu bir 60 mm Petri kabı içinde testisler yerleştirinCaCl2, 5 mM HEPES, pH 8, 0.1 mM EDTA] 12,% 1 sığır serum albümini, 50 ug / ml gentamisin). 4 ° C&#39;de testisler saklayın. Not: Testis yaklaşık 7 saklanabilir - 4 ° C&#39;de 10 gün, ancak döllenme verimliliği testis saklanmış olan daha azalır. </li><li> Standart protokollere 14&#39;e göre yumurta elde etmek için bir dişi kurbağa sıkıştırın. 100 mm Petri kabındaki yumurta toplamak. Fazla suyu dökünüz. </li><li> o forseps ve bir jilet kullanarak Testis Depolama Çözüm ise bir testisin ¼ kesti. yumurta içeren Petri kabı testis parçasını aktarın. Testis saklanan ne kadar süredir testis, büyüklüğüne hesabına kullanılan testis bölümünün boyutunu ayarlayın ve kaç yumurta döllenir edilecektir. Genellikle yumurta bir debriyaj döller taze disseke testis 1/3 ¼ kullanın. </li><li> forseps ve bir jilet kullanarak küçük parçalar halinde testis bölümünü kesmek. Yeterince 0.3x MMR eklePetri kabı + 30 mg / ml gentamisin yumurta kapsayacak. karıştırmak için çanak MMR girdap. </li><li> döllenme oda sıcaklığında gerçekleşmesi için yaklaşık 30 dakika bekleyin. Hayvan yarımküre (embriyonun pigmentli tarafı) etkili verimlilik üzerine embriyonun üstünde oturup unutmayın. Daha sonra, bir transfer pipeti kullanılarak Petri kabı MMR çıkarın. Embriyoların karşılamak için çanak yeterli Dejelly Çözüm ekleyin. </li><li> Önümüzdeki birkaç dakika içinde, yavaşça aralıklı çanak girdap. Şu anda yemeğin Dinç sallayarak ekseni kusurlarına neden olabilir. &#160; Embriyoların jöle kat eriyecektir ve embriyolar dönen sırasında yemeğin ortasında birleştirmek olacaktır. Embriyolar yakından yemeğin ortasında birbirlerine dokunmadan sonra, bir transfer pipet yardımıyla Dejelly Çözüm kaldırın. 5 dakikadan daha uzun için Dejelly Çözüm embriyolar bırakmayın, ya da embriyolar zarar görebilir. </li><li> 0.3x 5 kez - dejellied embriyolar 3 yıkayındikkatlice dökerek veya MMR kapalı pipetleme ve yeni MMR ile çanak doldurarak MMR + 30 mg / ml gentamisin. çanak MMR tüm çıkarmayın ya da embriyolar zarar görebilir. </li><li> Bir transfer pipet kullanarak Petri kabı herhangi bir gübresiz yumurta ya da testis parçaları çıkarın. </li><li> 14 ve 22 ° C arasında embriyolar inkübe edin. Not: düşük sıcaklıklarda yetiştirilen Embriyolar yüksek sıcaklıklarda yetiştirilen embriyolar daha yavaş gelişir. Gelişim aşamaları Zamanlama Xenbase 22 bulunabilir. <ol><li> gelişim üzerinden alanı için, bir Petri kabı içinde tek bir döllenme embriyoların yerde yarısı 14 ° C &#39;de tutulur ve bir Petri tabağına embriyoların yarısı 18 ° C&#39;de tutuldu. Bu, tek bir gübreleme 4-hücre ya da 8 hücreli embriyolara enjeksiyonu iki set sağlar. </li></ol></li></ol> Enjeksiyon Çözümleri ve Embryoların Mikroenjeksiyon 3. hazırlanması <ol><li> 0.01 içeren enjeksiyon çözeltisi hazırlayınng / nl membrana bağlı kırmızı floresan proteini (MEM-RFP) mRNA 9 embriyolar 4-hücre ya da 8-hücre aşamasına kadar olan gelişmekte iken. enjekte etmeye hazır olana kadar buz üzerinde enjeksiyon solüsyonu saklayın. </li><li> &quot;. İğne çektirmenin durumda üst hizalanmış yedek tüp üst, bir iğne çektirmenin içine yedek cam kapiller tüp 800 ısı 2. değerini ayarlayın ve 650 Press çekme değer&quot; 7 Yük çekme &quot;butonuna iğneyi çekin. Bu, tek bir 7 2 iğne yaratacak&quot; cam kapiller tüp. </li><li> Dumont forseps bir çift ile bir çekti iğne ucu kapalı snip. Not: İğneyi çekerek sonra, ucu kapalı mühürlü ve açık kesmek gerekir. İğne ucu olacak çapı daha küçük, bu kesilir iğne noktasına yakın. uç çapı Burada kullanılan mikroenjeksiyon sistemi ile enjeksiyon hacmi etkilemez, ancak daha büyük bir çapa sahip bir uç embriyo hasar olasılığı daha yüksektir. </li><li> m kaymaİğnenin sırtına icropipette pens. Sonraki, yuvanın arkasında iğne sırtına büyük delik O-halkasını slip. </li><li> madeni yağ iğne hava kabarcıkları almak için dikkatli olmak, bir 27 ölçü derialtı iğne kullanarak iğne doldurun. </li><li> piston yüklü beyaz plastik spacer büyük bir delik içine iğne oturma, mikroenjektör piston üzerine iğne Kayma. dalgıç beyaz aralama, büyük delik O-ring ve halkasında takip mikroenjektör gövdesine, en yakın küçük bir O-ring olmalıdır. halkayı sıkarak iğne sabitleyin. Düzgün güvenli olduğundan emin olmak için iğne yavaşça çekin. </li><li> iki bip kalmayana kadar basın ve mikroenjektör kontrol kutusu üzerindeki &quot;boş&quot; düğmesini basılı tutun. </li><li> Parafilm bir parça üzerine enjeksiyon solüsyonu pipetle 3 ul. Parafilm enjeksiyon solüsyonu boncuk içine iğne ucu yerleştirin. Basın ve microi düğmesine &quot;doldurmak&quot; tutunnjector kontrol kutusu iğne içine enjeksiyon çözümü çizmek için. </li><li> 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamisin içinde% 5 Ficoll kenetlenmek 500 mikronluk bir poliester ile kaplı bir 60 mm Petri kabı doldurmak. çanak içine 30 4-hücreli ya da 8 hücreli embriyolar - dikkatle 20 pipetle. </li><li> Saç döngüsünü 14 kullanılarak blastomer iğne karşı karşıya enjekte edilecek, böylece embriyolar manipüle. Sol böbreği hedef 4-hücreli embriyolar ya da 8 hücreli embriyo sol V2 blastomer sol ventral blastomer iğne bakacak şekilde embriyolar sıraya. </li><li> çanak her bir embriyonun seçilen blastomere içine enjeksiyon solüsyonu 10 nL enjekte edilir. Not: Petri kabı altındaki örgü embriyolar stabilize eder ve bunları stabilizasyon için saç döngü kullanılmadan enjekte sağlayan, kaymasını engeller. </li><li> Aktarım 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamisin içinde% 5 Ficoll ile dolu bir kültür plakasının oyuklarına embriyolar enjekte edilmiştir. Enjekte embriyo inkübeen az bir saat süreyle 16 ° C&#39;de in enjekte blastomerler iyileşmesi izin vermek. </li><li> aşama 9 (ön gastrulasyon kadar) 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamisin ile dolu olan yeni bir kültür plakasının yuvaları içine iyileşti embriyolar aktarın. </li><li> 40 21 - embriyolar evre 38 ulaşana kadar 22 ° C - 14 embriyolar inkübe edin. </li></ol> 4. Sabitleme ve Embriyolar immün <ol><li> MOPS / EGTA / magnezyum sülfat 50 ml hazırlamak / formaldehit Tamponu [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7.4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO 4,% 3.7 (h / h) formaldehid]. </li><li> bir cam şişede 40 embriyo - 20 evre 38 - Bir transfer pipeti kullanarak, 10 koydu. karıştırmak için flakon ve ters şişeye% 100 etanol içinde 10 ul% 5 benzokain ekleyin. embriyoların uyutmak için 10 dakika bekleyin. </li><li> Cam bir pipet kullanılarak şişeden MMR çıkarın. Aynı anda birden fazla şişe işleme durumunda, şişeler, 24-iyi hücre kültür plakasına dik yapılabilir. </li><li> Cam borutte, MEMFA ile flakon doldurun. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile, üç boyutlu bir sallanan platform üzerinde şişe yerleştirin. </li><li> Cam bir pipet kullanılarak şişeden MEMFA çıkarın. % 100 metanol ile flakon doldurun. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç boyutlu bir sallanan platform üzerinde şişe yerleştirin. Bu yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın ve -20 ° C&#39;de% 100 metanol gecede embriyolar saklayın. </li><li> Hazırlama 1x Fosfat Tamponlu Tuzlu Su-İnek Serumlu bir Albümin-Triton (PBT): 1X PBS, 2 mg / ml inek serum albümini,% 0.1 Triton X-100. </li><li> 1x PBT 1% 10 keçi serumu ile: Primer antikor solüsyonu hazırlayın fare monoklonal 5 seyreltme 4A6 antikoru, fare monoklonal antikorunun 3G8 bir 1:30 seyreltme (ara ürün uzak ve bağlantı tübüller 20 zarlarını etiket) ve 1 (proksimal tübüllerin 20 etiket lümen): tavşan poliklonal RFP antikor 250 seyreltme (MEM-RFP izli etiket). 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Seconda hazırlayınRy antikor çözeltisi:% 10 keçi serumu ile 1 x PBT, 1: 500 Alexa 488 keçi anti-fare IgG (stok konsantrasyonu 2 mg / ml; etiket 4A6 ve 3G8 etmek için) ve 1: 500 Alexa 555 keçi anti-tavşan IgG (hazır konsantrasyonu 2 mg / ml MEM-RFP tracer etiket). Mağaza 4 ° C&#39;de, folyo tüp kapsayan ışıktan korumak için. </li><li> Seçenek olarak ise, boyama sonrası, birincil ve ikincil antikorlar toplamak ve gelecekteki deneyler yeniden kullanım için 4 ° C&#39;de saklayın. Antikor yeniden kullanım için kaydedilecek ise,% 0.01 sodyum azit ekleyin. </li><li> Yerleşik protokoller 18 kullanılarak embriyolar immunostain. </li></ol> Embriyolar ve Hedeflenen Pronephric Doku Analizi 5. Görselleştirme <ol><li> Doğru blastomere 1X bir floresan stereomikroskop altında tracer floresan görüntüleyerek enjekte edildi doğrulamak için immunohistokimyasal embriyolar Ekran (bütün embriyo görmek için) ve 5X büyütme (böbrek görmek için). biz ile çok iyi bir cam levha yerleştirin embriyolar1x PBT ucu ile bir transfer pipet kullanarak dolu rf kesti. Bir saç döngü ile embriyolar işleyin. Embriyonun sol tarafında pronephros eş enjekte izleyici hediyem var sadece embriyolar kullanın (Şekil 3C, F ve Şekil 4C, F) geninin aşırı ekspresyonu veya demonte analizi için. </li><li> Bir cam şişe içinde embriyoların yerleştirilmesi ve Murray Clear flakon doldurarak: Alternatif olarak, Murray&#39;in Clear embriyolar (1 kısım benzil alkol 2 parça benzil benzoat) temizleyin. Bir cam plaka kullanarak embriyolar gözünüzde canlandırın. Not: Murray Temizle bir organik çözücü ve dikkatle ele alınmalıdır. eldiven giyin ve sadece Murray&#39;nın Clear cam şişeleri ve pipet kullanın. </li><li> 3 hafta - 2 için 4 ° C 1x PBT saklayın embriyolar. embriyoların uzun süreli depolama için, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 100 metanol içinde iki kez yıkanarak embriyolar dihidrat. % 100 metanol içinde -20 ° C&#39;de embriyolar saklayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+the+study+of+kidney+development:+Use+of+the+pronephros+in+the+analysis+of+organ+induction+and+patterning.">Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning.</a> Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).</li><li>Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+anatomy+of+the+Xenopus+pronephric+kidney.">Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).</li><li>Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+pronephros+as+a+model+system+for+the+study+of+kidney+development+and+pathophysiology.">The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 17, 73-74 (2002).</li><li>Carroll, T., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development.">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li><li>Zhou, X., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+tubules.">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules.</a> Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).</li><li>Raciti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+pronephric+kidney+revealed+by+large-scale+gene+expression+mapping.">Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping.</a> Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).</li><li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+(Xenopus+laevis)+blastomeres.">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+of+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li><li>Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+stage+origin+of+Spemann's+Organizer:+Analysis+of+the+movements+of+blastomere+clones+before+and+during+gastrulation+in+Xenopus.">The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus.</a> Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).</li><li>Karpinka, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenbase,+the+Xenopus+model+organism+database;+new+virtualized+system,+data+types+and+genomes.">Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).</li><li>Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1+and+fibronectin+regulate+polarized+cell+protrusions+required+for+Xenopus+convergence+and+extension.">Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension.</a> Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).</li><li>Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precocious+expression+of+the+Wilms'+tumor+gene+xWT1+inhibits+embryonic+kidney+development+in+Xenopus+laevis.">Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis.</a> Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+pronephros:+A+kidney+model+making+leaps+toward+understanding+tubule+development.">The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development.</a> Xenopus Development. , 215-238 (2014).</li><li>Lienkamp, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+kidney+tubules+elongate+using+a+planar+cell+polarity-dependent+rosette-based+mechanism+of+convergent+extension.">Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension.</a> Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).</li><li>Lyons, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+Wnt/&#946;-catenin+signaling+in+pronephric+kidney+development.">Requirement of Wnt/&#946;-catenin signaling in pronephric kidney development.</a> Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).</li><li>Miller, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronephric+tubulogenesis+requires+Daam1-mediated+planar+cell+polarity+signaling.">Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).</li><li>Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Xenopus+pronephric+system.">Development of the Xenopus pronephric system.</a> Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).</li><li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+12:+The+Xenopus+Pronephros:+A+Kidney+Model+Making+Leaps+toward+Understanding+Tubule+Development.">Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development.</a> Xenopus Development. , (2014).</li><li>Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+LIM+class+homeobox+gene+Xlim-1+in+pronephros+and+CNS+cell+lineages+of+Xenopus+embryos+is+affected+by+retinoic+acid+and+exogastrulation.">Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation.</a> Development. 120, 1525-1536 (1994).</li><li>Weber, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+the+tissue-specific+transcription+factor+HNF1+alpha+(LFB1)+during+Xenopus+development.">Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development.</a> Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).</li><li>Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development.">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li><li>Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+injected+DNA+templates+in+Xenopus+embryos.">Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos.</a> Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).</li><li>Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloride+conductance+channel+ClC-K+is+a+specific+marker+for+the+Xenopus+pronephric+distal+tubule+and+duct.">The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct.</a> Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).</li><li>Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Na+,+K+-ATPase+alpha+subunit+requires+gastrulation+in+the+Xenopus+embryo.">The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo.</a> Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical &amp; chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs.">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li><li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage.">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li><li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos.">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Xenopus embriyoların geliştirilmesi pronephros Hedefleme belirlenmesi ve doğru blastomer enjekte dayanır. 8 hücreli embriyo V2 blastomer enjeksiyon sol pronephros 18 hedefliyor. Bu bir iç kontrol olarak kontralateral sağ pronephros bırakır. morfolino demonte veya RNA aşırı böbrek gelişimi değiştirmek için kullanıldığı takdirde, kontralateral sağ pronephros sol pronephros gen demonte veya aşırı ekspresyonuna etkilerini karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu durumda, böyle bir uyumsuz kontrol morfolino veya dominant negatif RNA yapı olarak uygun kontroller gen ifadesinin değişikliklerin sonuçlarını analiz etmek kontralateral iç kontrol ek olarak kullanılmalıdır. Nedeniyle Xenopus embriyo göreli şeffaflık, böbrek kusurları kolayca birden teknikler kullanılarak belirlenebilir. Örneğin gen yok etme ya da aşın basit embriyoların Pronephric indisinin hesaplanması ile belirlenebilirEmbriyonun enjekte ve kontrol tarafta proksimal tübüllerin gelişimini karşılaştırır antikor 3G8 13 ile boyanmış. Pronephric gelişimi incelenmesine ek olarak, bu teknik, kolay 7-10 harita kurulan kaderi ile enjekte etmek için uygun bir blastositin seçerek diğer hedef dokulara uyarlanabilir. diğer doku tiplerini hedef ek olarak, bu protokol, aynı zamanda, farklı aşamalarda böbrek gelişimini incelemek için kullanılabilir. Bu protokol aşamasında farklı böbrek doku tespit eden antikorlar 3G8 ve 4A6 ile boyanmış 40 embriyo, görünüyordu. Daha genç embriyoların çok farklı böbrek antikorlar ile boyanmış ya da in situ hibridizasyon 5, 6, 20 &#39;de tabi tutulabilir. Örneğin, antikor Lim1 gelişmekte pronephros 21, 22 tespit edebilir. Aynı şekilde, lim1, PAX8 ve hnf1- β transkript olabilir aşamada 12.5 22-24 de in situ hibridizasyon başlatılmasında ile tespit </sup&gt;. In situ hibridizasyon belirteçler daha sonra diğer geç gelişim evrelerinde böbrek farklı bölgelerini tespit etmek için kullanılabilir. Örneğin, problar glomus olarak nphs1, clckb, slc5a1 ve ATP1A1 ekspresyonunu tespit etmek için tasarlanmıştır, distal ve tübüller, proksimal tübül ve tüm böbrek bağlanması sırasıyla, 27 26, 5, 25 tarif edilmiştir. Böbrek değerlendirilmesi tedavi böbrek gelişimi değiştirir nasıl daha iyi anlaşılması için sağlayacak farklı antikorlar ya da in situ analizi kullanarak çoklu aşamaları boyunca. Bu protokolün bir kritik bir yönü enjekte edilecek doğru seçimi ve blastomere tanımlanmasıdır. Bu protokol, biz 8 hücreli embriyolar sol V2 blastomer ya da 4-hücreli embriyo sol ventral blastomer enjekte ederek pronephros hedef açıklanmıştır. Yanlış blastomere enjekte edilir, pronephros doğru hedef değildir. Bu nedenle, buerken hücre bölünmeler bakmak hangi sadece enjekte embriyolar yararlıdır kadar erken Xenopus embriyoların gelişimi ve hücre dilinim düzlemleri önce mikroenjeksiyon 28 aşina olmak için kritik öneme sahiptir, 29. Embriyo bölünme her zaman, kurulmuş gelişimsel aşama çizelgeleri takip etmez &quot;Normal&quot; ve uygun blastomere kolayca tespit edilebilir. Bu yanlış hedeflenmiş olan embriyo sayısını azaltacaktır. Embriyonun blastomerler tam enjeksiyonu sırasında ayrı olması için ek olarak, bu önemlidir. blastomer V1 ve 8 hücreli embriyo V2 arasındaki bölünme mikroenjeksiyon önce tam değilse Örneğin, izleyici V2 yanı sıra V1 içine yayılabilir. Bu mikroenjeksiyon hedefleme verimini azalmakta, ve elde edilen embriyo 4 hücreli aşamada yerine 8-hücre aşamasında enjekte embriyonun çok benzer görünen iz dağılım gösterebilir. birBu protokolün diğer kritik kısmı pronephros düzgün mikroenjeksiyon tarafından hedef alındı ​​doğrulama olduğunu. Embriyolar düzgün Elde edilen veri kümesi çarpık olabilir hedeflenen pronephros olmadı çünkü bu, Pronephric gelişimini analiz öncesinde yapılmalıdır. Uygun hedeflemeyi doğrulamak için, her enjekte embriyo izleyici dağılımını analiz eder. Embriyonun enjekte (sol) tarafında floresan izleyici büyük çoğunluğu göstermesi gerekir. Embriyonun kontrolü (sağ) tarafında floresan önemli bir miktarını gösterir, o zaman bu embriyo atılmalıdır. Bu durum ortaya çıkarsa, yanlış blastomer ya enjekte edildi, ya da enjekte blastomer enjeksiyon öncesi bölünmüş tamamlanmış değil. İkincisi, embriyo enjekte (solda) tarafında floresan doğru pronephros hedeflemelidir. Embriyo 8-hücreli aşamasında, dorsal ve ventral Somitlerin, yanal plaka, arka bağırsak, proctodeum, enjekte ise bagajda gövde ve nöral cilt grip göstermesi bekleniyororescence pronephros 6, ilave olarak 29. geniş cilt ve somitlerinden floresan tracer dağılımı hem de hedefleme olmalıdır 4-hücre aşamasında enjekte 8 hücreli enjeksiyon için listelenen dokuların embriyolar ilaveten çimento bezi, otocyst, objektif ve koku plakod. Embriyo uygun doku hedeflemesi görünmezse, bu analizden önce (Şekil 5) atılmalıdır. Bu protokolde belirtilen hedef enjeksiyonları arzu edilen bir doku içinde gen ekspresyonunu idare için bir yol sağlar. Bu tekniğin bir sınırlama, bu enjeksiyon hedeflenir, ancak, sadece gelişmekte olan böbrek etki kalmamasıdır. Bu teknikte açıklanan 4 ve 8 hücreli enjeksiyonları daha gen ifadesi tüm embriyo değişmiş olacak tek hücreli aşamasında, yapılan enjeksiyonlar daha hedefli ve enjeksiyonlar iki hücreli safhada yapılır nerede yarısı embriyo görüntüler değişmiş gen ekspresiyon. Bununla birlikte, sadece bir hedef dokuya yoktur. 4 hücreli embriyoları ve 8 hücreli embriyolar V2 blastomerlerin ventral blastomerlerin enjeksiyonlar pronephros gen ifadesini değiştirebilir olmakla birlikte, bunlar aynı zamanda başka dokularda gen ekspresyonunu değiştirir. Diğer etkilenen dokular cilt, somitler, gut ve sinirsel tepe bulunmaktadır. Nedenle, 4 ve 8 hücreli enjeksiyonları bir veya iki hücre enjeksiyonu daha hedeflenmiş olmasına rağmen, yine de çoklu dokularda gen ekspresyonunu değiştirir anlamak önemlidir. 4 ve 8 hücreli aşamada embriyolar enjekte ek olarak, enjeksiyonları da 2-, 16- ve 32-hücre aşamasında gerçekleştirilebilir. 2-hücreli aşamada enjekte embriyolar sonraki aşamalarda enjekte edilen embriyoların daha etkilenmiş dokuların daha geniş olacaktır. daha teknik açıdan zor olsa da, 16 ve 32 hücreli aşamalarında enjekte embriyolar 4 ve 8 hücreli aşamalarında enjekte edilen embriyoların daha etkilenmiş dokuların dar aralığına sahip olacaktır. MEM-RFP soy izr mikroenjeksiyon sonra uygun hedefleme doğrulamak için bu protokolde kullanılır. MEM-RFP mRNA hücrelerinde sonra hücre zarları enjekte RNA&#39;dan protein tercüme etiketler. Embriyo ölüm için hesap gerekiyordu ve izleyici floresan yoğunluğu istendiği gibi bu protokol (10 nl enjeksiyon MEM-RFP mRNA 0.1 ng) kullanılan MEM-RFP soy izleyici konsantrasyonu modifiye edilmelidir. Bu rodamin-dekstran kuantum noktalar ya da histokimyasal tespit β-galaktosidaz gibi enjekte nesilli izleyici miktarı, başka bir soy tracer, değiştirmenin yanı sıra, bunun yerine MEM-RFP kullanılabilmektedir. Lineage izleyiciler embriyo geliştikçe azaltmak için floresan seviyeleri neden hücre bölünmeleri daha seyreltik hale gelir. Bu tekniğin bir başka uygulaması aşın veya ilgi duyulan bir genin ekspresyonunu yıkmak nesilli izleyicisi ile ekzojen RNA ya da morfolino birlikte enjekte edilmesidir. soy izleyici pronephros doğru hedefleme doğrulamak için kullanılan değil,birlikte enjekte eksojen RNA veya morfolino embriyoda lokalize nerede gösterir. Eksojen RNA hem morpholinos potansiyel izleyici fakat eksojen RNA ya da 30 morfolino, mevcut olan kız hücrelerde ortaya çıkan, birlikte enjekte tracer aynı oranda enjekte blastomere yayılan olabilir. Aslında, bir tek hücre enjekte iki farklı RNA yapılarının her yok ko-lokalize (yayınlanmamış veriler) gözledik. Bu nedenle, bir hücrede tracer bulunması, birlikte enjekte ekzojen RNA veya morfolino her zaman hücrede mevcut olduğunu göstermez. Bu protokol Xenopus embriyoların geliştirilmesi pronephros doğuran blastomerlerde için mikroenjeksiyon hedeflemek için bir prosedür ayrıntıları. Zaman bir veya enjekte ise Gen ifadesi, genellikle neden erken gelişim anomalileri önlemek her ikisi de morpholinos veya eksojen RNA enjeksiyonu yoluyla Xenopus embriyolar manipüleİki hücreli embriyolar. gelişmekte olan embriyo hücrelerinin her tek hücre aşamasında sergi devirme veya aşırı ekspresyonuna enjekte embriyolar. Gen, uygun erken gelişim süreçleri için gerekli ise, embriyo pronephros geliştirmek olabilir. Bu burada ayrıntılı 8 hücreli enjeksiyonlar, daha sonraki aşamalarda, yapılan enjeksiyonlar Gastrulasyon ve sonuçta Pronephric gelişme 18 geçmesi embriyolar neden olabilir. Bu nedenle, burada tartışılan hedeflenen enjeksiyonlar embriyo Pronephric geliştirilmesi yoluyla ilerleme sağlayan bazı genlerin ifadesinin değiştirilmesiyle neden gastrulasyon kusurlarını üstesinden gelebilir. Gelecekte, bu protokol aynı zamanda istenilen blastomerlerde için CRISPR yapıları hedef kullanılabilir.

Xenopus embriyonik böbrek, pronephros, böbrek gelişimini ve hastalığın incelemek için iyi bir modeldir. Embriyolar, harici olarak geliştirilmesi büyük boyutta, çok sayıda üretilebilir ve kolayca mikroenjeksiyon veya cerrahi prosedürler ile işlenir. Buna ek olarak, memeliler ve amfibiler böbrek gelişimini yöneten genler korunur. Embriyonik amfibiler bir pronephros var ve yetişkin amfibi bir metanephros varken, pronephros, mesonephros ve metanephros 1: Memeli böbrekler üç aşamadan yoluyla ilerleme. Bu, böbrek formlarının temel filtreleme birimi nefron ve memeli ve amfibi hem nefrogenezisi 2, 3 geçmesi, aynı sinyal iletim ve endüktif olaylar. Xenopus pronephros proksimal, orta ve distal tübülleri bağlayan oluşan tek nefron içerir, ve (memeli glomerulus benzer) glomus 1, 4-6 (Şekil 1 </strong&gt;). Xenopus pronephros tek büyük nefron, bu böbrek gelişim ve hastalık süreçlerinde rol oynayan genlerin incelenmesi için basit bir model olarak uygun hale getirir. Hücre kader haritaları erken Xenopus embriyolar için kurulan ve serbestçe Xenbase 7-11 online olarak mevcuttur edilmiştir. Aynı teknik, kalp ya da gözler gibi diğer hedef dokulara adapte edilebilir, ancak burada, gelişmekte Xenopus pronephros hedef soyu izleyicilerin mikroenjeksiyon için bir teknik açıklanmaktadır. Köken izleyiciler erken blastomere enjekte edilebilir, geliştirme sırasında bu hücre soyu görselleştirme sağlayan (vital boyaların, floresan etiketli dekstranlar, histokimyasal tespit enzimler, ve mRNA floresan proteinleri kodlayan dahil) etiketlerdir. Bu protokol MEM-RFP mRNA kodlama membran soy izleyici olarak, kırmızı floresan proteini 12 hedef kullanır. Hedeflenen Mikroenjeksiyon teknolojiBurada tarif edilen 4- ve 8 hücreli embriyolar bireysel blastomerlerin için bir dizi yöntem vasıtasıyla ilgili bir geni fazla-sentezlemek üzere gen ekspresyonunu veya eksojen RNA ile yıkmak morpholinos enjeksiyon için kullanılabilir. ventral, bitkisel blastomer içine enjekte edilerek, öncelikle embriyo pronephros gelişimsel bir kontrol olarak kontralateral pronephros bırakarak, hedeflenecektir. Bir izleyicinin ko-enjeksiyon doğru blastomere enjekte edildi doğrular ve embriyoda dokular gösterir pronephros hedeflenmesi doğrulayarak, enjekte blastomer ortaya çıktı. pronephros immün Pronephric tübüller hedef alınmıştır ne kadar iyi görselleştirme sağlar. Overekspresyonu ve demonte etkiler daha sonra bir gelişimsel kontrol olarak hizmet veren embriyo, kontralateral tarafa karşı gol olabilir ve Pronephric indeksi 13 hesaplamak için kullanılabilir. hücre kaderinin haritaların temini bu hedefli mikroenjeksiyon tekniği oth hedef dokulara kullanılmasına olanaker pronephros ve, bir floresanlı işaretleyici birlikte enjeksiyon dışında her bir dokuya hedeflenmiş mikroenjeksiyon analiz öncesi doğrulanmasına izin verir. Embriyo mikroenjeksiyon sırasında, gelişimsel sıcaklık, sıkı regüle Xenopus gelişme oranı o 14 oranda bağımlı olduğu verilmelidir. Geliştirme süresi yavaşlatılır için 4 ve 8-hücresi enjeksiyonu - (16 ° C 14) Embriyolar daha soğuk sıcaklıklarda inkübe edilmelidir. 22 ° C, evre 1 (1 hücreden) kalkınma anda 16 ° C geliştirme anda 3 yaklaşık 4 saattir sahneye iken 3 (4 hücreleri) yaklaşık 2 saattir sahneledi. Bu 22 ° C&#39;de 8 hücreli (evre 4) embriyo için bir 4-hücreli embriyo gitmek için yaklaşık 15 dakika sürer, ancak 16 ° C&#39;de yaklaşık 30 dakika sürer. Benzer bir şekilde, 22 ° C &#39;de, sadece bir 16 hücreli embriyo (Aşama 5) ilerleme için bir 8-hücreli embriyonun 30 dakika sürer. Bu kez 16 ° C&#39;de 45 dakika için artırılır.refore, embriyolar, 16 hücre aşamasına kadar ilerleme önce, 8-hücre aşamasında enjeksiyon için yeterli zaman sağlamak için embriyo gelişimi hızını yavaşlatmak için yararlıdır. Buna ek olarak, büyüme sıcaklığı hız veya böbrek tam gelişmiş kadar embriyo gelişimini yavaşlatmak için modüle edilebilir. Iribaş aşamalı Xenopus embriyoların epidermis dokusu 15 diseksiyon veya takas olmadan gelişen pronephros kolay görüntüleme için izin nispeten şeffaftır. Nedeniyle Xenopus embriyoların göreli şeffaflık, canlı hücre görüntüleme de 16,17 mümkündür. Sonra Xenopus embriyolar 18-20 gen ifadesinin manipülasyonu hedeflenen Pronephric gelişmenin değerlendirilmesinde izin 40 embriyolar - pronephros görselleştirmek için immün, orta distal proksimal ve sahnenin bağlantı tübül 38 etiket kurulan antikorlarla mümkündür tüm montaj.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin solution, 50 mg/mL</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E737-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine, 99%+</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>52-90-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP525-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Fridge II</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>260009</td>
			<td>Benchtop incubator for embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gap43-RFP plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine dextran, 10,000 M.W.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1817</td>
			<td>Tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade, USP sterile purified water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7&#34; Drummond replacement tubes</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/XL</td>
			<td>Microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>For breaking microinjection needle tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td>Microinjector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, heavy</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CAS 8042-47-5</td>
			<td>Oil for needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G monoject hypodermic needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881200508</td>
			<td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-Lok syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 micron polyester mesh</td>
			<td>Small Parts</td>
			<td>CMY-0800-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm x 45 mm screw thread vial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-339-25B</td>
			<td>For fixing, staining, and storing embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzocaine</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>BE130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP661-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumen</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D mini rocker, model 135</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>57281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, New Zealand origin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S227I-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 3G8 antibody</td>
			<td>European Xenopus Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody to label proximal tubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 4A6 antibody</td>
			<td>European Xenopus Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody to label distal tubule and duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td>Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Secondary antibody to label distal tubule and duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21428</td>
			<td>Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cavity spot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>105862500</td>
			<td>Optional - for clearing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A396-500</td>
			<td>Optional - for clearing embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique to target microinjection to the developing xenopus kidney

Xenopus laevis (kurbağa), pronephros, embriyonik böbrek tek nefron oluşur ve böbrek hastalığı için bir model olarak kullanılabilir. Xenopus embriyolar dışarıdan geliştirmek, büyük ve kolayca mikroenjeksiyon veya cerrahi işlemler tarafından manipüle edilebilir. Buna ek olarak, kader haritaları erken Xenopus embriyolar için kurulmuştur. sonuçta bir organa veya ilgili dokuya sebebiyet verecek bağımsız blastomere hedefli mikroenjeksiyon seçici gelişen embriyonun geri kalan ikincil etkilerin azaltılması, aşın ya da, bu sınırlı bölge içinde gen ekspresyonunu yıkmak kullanılabilir. Bu protokol, biz 4 ve 8 hücreli embriyolar belirli blastomer içine mikroenjeksiyon yoluyla gelişen Xenopus böbrek (pronephros), hedef kurulan Xenopus kader haritaları nasıl kullanılacağını açıklar. soy izleyicilerin enjeksiyon enjeksiyon spesifik hedefleme doğrulamasına imkan sağlar.Embriyolar 38 evresine kadar gelişti sonra - 40 tüm montaj immün Pronephric gelişimi görselleştirmek için kullanılır ve pronephros hedeflenen hücrelerin katılım değerlendirilebilir. Aynı teknik pronephros ilave olarak diğer doku tiplerini hedef uyarlanabilir.

MEM-RFP mRNA ile 4 ve 8 hücreli Xenopus embriyoların Microinjections pronephros hedefleme farklı düzeylerde göstermektedir. 4 gösterileri sahne doğru MEM-RFP mRNA ekspresyonu ile 40 embriyolar Şekil. Embriyolar, sol ventral blastomere (Şekil 4A) enjekte ve MEM-RFP mRNA uygun ekspresyon modeli için kriteri edildi. Ara uzak proksimal, MEM-RFP&#39;yi tanımlayan ve böbrek tübülleri bağlanmanın yanı sıra, uygun bir şekilde enjekte edilen embriyolar baş, gövde, ve kuyruk epidermisinde floresan göstermeleri beklenir. Ayrıca otocyst fluoresans çimento bezi, proctodeum ve somitler (Şekil 4C) göstermelidir. 8 doğru enjekte edilen embriyoların böbreklerde MEM-RFP flöresan dağılımının flöresanlı bir stereomikroskop (Şekil 4B) ile tespit edilmiştir. epidermiste MEM-RFP ifade düzeyi yüksek olan Embriyolar buBöbrek bölgelerin tespiti &quot;tıkalı&quot; olarak skorlandı engelledi. tıkalı olarak MEM-RFP ifade proksimal tespit edildi, tüm embriyoların, orta distal ve bağlantı tübül attı olmadığını. Stereoskop (Şekil 4D-F) ve konfokal mikroskop (Şekil 4G-I) 3G8 ve 4A6 ile boyanmış MEM-RFP ve böbrek dokusu ko-lokalizasyonunu doğrulamak için kullanılmıştır. Konfokal görüntüleme sol ventral blastomere içine MEM-RFP mikroenjeksiyon doğru böbreği hedef gösteren, proksimal, böbrek, orta ve distal bağlantı tübüller MEM-RFP ko-lokalizasyonunu sunmaktadır. 8-hücre aşamasında MEM-RFP mRNA enjekte edilmiş embriyolar (Şekil 5A) 8 hücreli enjeksiyonları böbrek ikincil etkiler potansiyelini azaltmak gösteren floresan gösteren dokular daha dar bir aralığını gösterir. 4-hücreli aşama, EMBR enjekte embriyolar gibiyolar proksimal 8 hücreli evre göster floresan enjekte ara böbrek, uzak ve bağlantı tübülleri, hem de hücre grubu ve proctodeum (Şekil 5C-F). 4-hücreli aşamada enjekte edilen embriyoların aksine, çimento bezi ve otocyst MEM-RFP ile etiketlenmiş değildir. 10 doğru hedeflenmiş embriyoların dışında, bir embriyonun proksimal tübül neredeyse tüm MEM-RFP gösterdi ve 3 hemen hemen tüm böbrek (Şekil 5B) &#39;nin ara maddesi ve distal tübül MEM RFP göstermiştir. 7 embriyoların bağlantı tübül kısmen MEM-RFP ile etiketlenmiş. Buna ek olarak, 8 hücreli aşamada enjekte embriyo böbrek görselleştirmek için daha kolay olduğunu ve tıkalı şekilde tek değerlendirilmiştir. MEM-RFP ve böbrek (3G8 ve 4A6) etiketleme antikorlar eş-lokalizasyonu Stereomikroskopta (Şekil 5D-F) kullanılarak belirlenir ve konfokal mikroskop (Şekil 5G-I) kullanarak tetkik edilmiştir. proksimal, orta, uzak ve bağlantı tuböbrek bules 4-hücre sol ventral blastomere enjekte embriyolar daha az dokularda floresan görüntülerken V2 blastomere enjeksiyon böbrek etiketler hedef 8 hücreli aşamada enjekte embriyolar MEM-RFP, ortaya çıkarılması ile etiketlenmiştir sahne. Bu tahlil, bir floresan kullanılması mikroenjeksiyon hedef hangi dokular belirtmek için bir izleyici olarak mRNA etiketli yapar. Analiz öncesi tutarlı izleyici lokalizasyonu için embriyolar taranması önemlidir ve beklenen izleyici dağılımını göstermek değil herhangi bir embriyolar atılmalıdır. 6 hatalı olarak MEM-RFP mRNA ile hedeflenmiş bir sahne 40 embriyo bir örneğini göstermektedir 4-hücreli sahne. MEM-RFP mRNA ifade embriyo yerine sol tarafında (Şekil 6A) sağ tarafında yer almaktadır. Buna ek olarak, mRNA ekspresyonu çoğu, gövdenin alt kısmında ve kuyruk deridekiSomitlerin küçük anlatım. Hiçbir mRNA ekspresyon böbrek uygunsuz hedefleme teyit proksimal, orta, distal ve bağlantı tübüller (Şekil 6B) görülür. Bu nedenle, bu embriyo analizi için kullanılmamalıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53799/53799fig1.jpg" /> Şekil 1:. Bir sahne 35 Xenopus embriyo böbrek Xenopus Embriyonik Böbrek Şeması, proksimal, orta, uzak gösteren ve tübülleri bağlantı. Raciti ark dayanmaktadır. (2008) 6. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53799/53799fig2.jpg" /> Şekil 2: Xenopus Embriyonik Fate Haritalar. Kader harita belirlenmesi ve gelişmekte olan pronephros katkıda blastomer adlandırma. 4 hücreli embriyo) kader haritası. B) 8-hücreli embriyo Kader haritası. 16 hücreli embriyo C) kader haritası. 32 hücreli embriyo D) kader haritası. 32-hücreli embriyo blastomer da alternatif bir blastomer adlandırma sistemi kullanılarak etiketlenir. Moody (1987) 8, 9 ve Moody ve Kline (1990) dayalı Fate haritaları 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53799/53799fig3.jpg" /> Şekil 3:. Xenopus Pronephros Hedefleme Enjeksiyon Programı Kırmızı oklar hücre enjekte göstermektedir. A) Hayvan ve 4-hücreli embriyo ventral görüşleri sol ventral b enjeksiyon gösterenSol pronephros hedef lastomere. Kırmızı oklar sol ventral blastomer göstermektedir. B) Hayvan ve sol V2 blastomer enjeksiyonu gösteren bir 8-hücreli embriyo ventral görüşleri sol pronephros hedef. Kırmızı oklar sol V2 blastomer göstermektedir. AB) 4X büyütme Stereoskop alınan embriyoların Görüntüler. Xenopus kaderi dayalı Enjeksiyonlar Moody (1987) 8, 9 ve Moody ve Kline (1990) tarafından geliştirilen haritalar 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53799/53799fig4.jpg" /> Şekil 4:. 4-hücreli Sahnesi&#39;nde Hedeflenen Embriyolar örnekleri immüno aşaması izleyici olarak MEM-RFP mRNA kullanılarak 4-hücreli aşamada sol pronephros hedefleyen enjeksiyon gösteren 40 Xenopus embriyolar. MEM-RFP etiketlerihücre zarları kırmızı. A) 4-hücreli embriyo sol ventral blastomer içine MEM-RFP mRNA şematik gösteren enjeksiyonu. Düzgün enjekte edilen embriyoların böbreklerde MEM-RFP floresan B) Doku yerelleştirme. C) Aşama 40 embriyo 4 hücreli aşamada sol ventral blastomer MEM-RFP ile enjekte edilir. Böbrek yeşil etiketli ise MEM-RFP lokalizasyonu, kırmızı renkte gösterilmiştir. 1X büyütme. D) böbrek proksimal tübülleri lümenini etiket 3G8 ile boyanmış ve 4A6, ara uzak ve bağlantı tübül hücrelerinin membranları etiket. 5X büyütme. MEM-RFP lokalizasyonu gösteren böbrek üzerinde bölgenin E) Genişleme. 5X büyütme. F) böbrek ile MEM-RFP izleyici eş yerelleştirme gösteren görüntü Birleştirilmiş. 5X büyütme. CF) Stereoskop bir Olympus DP71 kamera ile çekilen embriyoların görüntüleri. G) 3G8 ve 4A6 ile boyanmış ikinci embriyonun böbrek Konfokal görüntü. H) böbrek MEM-RFP lokalizasyonu ve çevresindeki doku. I) görüntü sho Birleştirilmişböbrek MEM-RFP, 3G8 ve 4A6 kanat co-lokalizasyon. GI) 20X büyütme maksimum projeksiyon kullanarak Konfokal görüntüler. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53799/53799fig5.jpg" /> Şekil 5:. 8 hücreli Sahnesi&#39;nde Hedeflenen Embriyolar örnekleri immüno aşaması izleyici olarak MEM-RFP mRNA kullanılarak 8-hücreli aşamada sol pronephros hedefleyen enjeksiyon gösteren 40 Xenopus embriyolar. MEM-RFP kırmızı hücre zarlarını etiketler. 8 hücreli embriyo sol V2 blastomer içine MEM-RFP mRNA A) şematik gösteren enjeksiyonu. Düzgün enjekte edilen embriyoların böbreklerde MEM-RFP floresan B) Doku yerelleştirme. C) 40 embriyo 8 hücreli aşamada sol V2 blastomer MEM-RFP enjekte Sahne. MEM-RFP lokalizasyonu gösterilirkırmızı, böbrek yeşil etiketli iken. 1X büyütme. D) böbrek proksimal tübülleri lümenini etiket 3G8 ile boyanmış ve 4A6, ara uzak ve bağlantı tübül hücrelerinin membranları etiket. 5X büyütme. MEM-RFP lokalizasyonu gösteren böbrek üzerinde bölgenin E) Genişleme. 5X büyütme. F) böbrek ile MEM-RFP izleyici eş yerelleştirme gösteren görüntü Birleştirilmiş. 5X büyütme. CF) Stereoskop bir Olympus DP71 kamera ile çekilen embriyoların görüntüleri. G) 3G8 ve 4A6 ile boyanmış ikinci embriyonun böbrek Konfokal görüntü. H) böbrek MEM-RFP lokalizasyonu ve çevresindeki doku. I) &#39;böbrek MEM-RFP, 3G8 ve 4A6 ko-lokalizasyonunu gösteren resim birleştirilmiştir. GI) 20X büyütme maksimum projeksiyon kullanılarak çekilen Konfokal görüntüler. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 6: Embriyonun Örnek yanlış 4-hücreli aşamada hedeflenen immüno aşama 40 Xenopus embriyo bir izleyici olarak MEM-RFP mRNA kullanılarak 4-hücreli aşamada sol pronephros yanlış hedefleme gösteren.. MEM-RFP kırmızı hücre zarlarını etiketler. A) Sahne yanlış blastomer içine enjekte göstergesidir MEM-RFP uygunsuz dağılımını gösteren 40 embriyo. Yanlış blastomere içine enjeksiyon gösteren hatalı iz dağılımına sahip olmanın yanısıra, bu embriyo sağ tarafında enjekte edilmiştir. 1X büyütme. böbrek (3G8, 4A6) etiketleme antikorları ile MEM-RFP eş-lokalizasyonu eksikliği gösteren böbrek B) Birleştirilmiş görüntü. 5X büyütme. AB) Stereoskop alınan embriyo görüntüleri. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney at JoVE.com

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

technique-to-target-microinjection-to-the-developing-xenopus-kidney

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

11.1K Görüntüleme.  University of Texas McGovern Medical School. Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos. 

Video: Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Gelişim Biyolojisi

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Gen İfade Etkileyen Sinyal İletimi Pathways tanımak Tavuk Embriyo uzuvlar Geliştirme içine Boncuk eklenme

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Kordalı embriyo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

5-mC Nokta-Blot Testi Kondrosit Farklılaşmasımın DNA Metilasyon Seviyesinin Nicelendirilmesi<em&gt; In vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...