This work was supported by a Professional Development Grant to C.Z.P. from the Shepherd University Foundation. The authors wish to thank Brett Zirkle and Malia Deshotel for helpful discussions on the protocols, and Dr. Carol Hurney for generous assistance.

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dalla University of Virginia Istituzionale Animal Care and Use Committee. Nota: la figura 1 mostra una panoramica schematica delle procedure sperimentali. 1. Preparazione di ovociti <ol><li> Pre-prime X. laevis femmine con 150 U di Pregnant Mare Serum gonadotropina (PMSG) circa una settimana di anticipo di isolamento degli ovociti. Iniettare 1 ml 150 U / ml PMSG in dorsale linfa sac con 1 cc siringa sterile con 29 ago G. </li><li> Preparare le soluzioni per l&#39;iniezione degli ovociti e degli ovociti animale cap test. <ol><li> Preparare Ca ++ / Mg ++-free OR2 (OR2-): 82 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,5 mm Na 2 HPO 4, 50 mM HEPES pH 7,2. </li><li> Preparare OR2: OR2- più 1 mM CaCl 2 e 1 mm MgCl 2. </li><li> Preparare OCM: il 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml di BSA, 100 mg / ml Gentamicina, pH 7,8. </li><li> Prepare MBS 1x: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mm CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES (pH 7.8), 2.5 NaHCO mm 3. </li><li> Preparare 3% Ficoll in 1x MBS. </li><li> Preparare NAM 1x: 110 mM NaCl, KCl 2 mM, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7.4. </li></ol></li><li> Anestetizzare la femmina in una soluzione 0,03% di Ethyl sale metansolfonato 3-amminobenzoato (MS222) in 0.1x MBS (prima sciogliere 0,3 g MS222 in 10 ml di etanolo 95%, poi diluite in 1 L 0.1x MBS) ponendo rana in soluzione per 10-15 minuti o fino a quando non risponde. <ol><li> Verificare che l&#39;anestesia è completa ruotando rana anestetizzato sulla schiena per assicurarsi che non risponde (non completamente rane anestetizzati muovere gli arti o girare corpo sopra). </li></ol></li><li> Chirurgicamente isolare frammenti ovarici facendo un&#39;incisione addominale attraverso la pelle e la parete del corpo con bisturi, isolando tessuto ovarico con una pinzae forbici. Mettere i frammenti ovarici in OR2-. Chiudere la parete del corpo con una sutura di seta 3-0 su un ago curvo 24 mm e chiudere la pelle separatamente con gli stessi punti di sutura. Permettere il recupero della femmina in 1 g / L salata serbatoio in acqua. </li><li> Utilizzando una pinza sottile, il tessuto ovarico lacrima in piccole (10 - 20 ovociti) pezzi e trasferimento OR2- fresco. </li><li> Frammenti ovarici Defolliculate a 2,0 mg / ml di collagenasi A OR2- agitando delicatamente su agitatore per 1 ora, il trasferimento di collagenasi fresco e agitazione per un&#39;ora supplementare. </li><li> Lavare ovociti 10 volte in OR2 [contenenti Ca ++ / Mg ++], scartando ovociti più piccoli. </li><li> Lavare gli ovociti in OCM due volte e trasferimento a fresco OCM. Isolare ovociti Fase VI per dimensione su ispezione visiva e scartare immaturi (più piccoli) ovociti: ovociti Fase VI sono più grandi di ovociti immaturi anche con pigmentazione nell&#39;emisfero animale e sono circa 1,2-1,4 mm di diametro. </li><li> Mantenere ovociti a 18 - 20 ° C in OCM prima dell&#39;iniezione. Nota: capsule di Petri Agarosio-rivestiti possono essere utilizzati per ridurre al minimo incollaggio di ovociti a servire. </li></ol> 2. Iniezione di Biblioteca Trascrizioni <ol><li> Preparare una libreria di cDNA direzionale 15 utilizzando RNA estratto in una fase adeguato di sviluppo (per esempio, lo stadio piastra neurale 14 10). Acquistare una libreria di cDNA o costruirne uno utilizzando un kit commerciale per la panoramica nelle quattro fasi che seguono. <ol><li> Isolare circa 5 mg di mRNA utilizzando un prodotto per arricchire di poli (A) + RNA (vedi Tabella dei Materiali) e seguendo le istruzioni del produttore. Nota: Le trascrizioni da utilizzare per produrre la libreria di cDNA può essere limitata ad un tessuto induzione (come la piastra neurale, dopo microdissezione del tessuto desiderato), o possono essere da embrioni interi in una fase particolare. </li><li> Produrre cDNA con un kit commerciale, seguendo le indicazioni del produttore. </li><li> Legare circa 20 ng cDNA in un vectoR incluso con il kit commerciale o di un altro vettore adatto. Un appropriato vettore plasmidico comprende sequenze di mRNA stabilità come 5 &#39;β-globina e 3 poly (A) + sequenze (pCS2, pTnT, pCS105). </li><li> Trasforma legatura in cellule batteriche competenti mediante protocollo raccomandato del fornitore per la trasformazione shock termico. Nota: In alternativa, una raccolta di cornice di lettura aperta (ORFeome) cloni è disponibile in commercio e può essere utilizzato per generare trascrizioni per iniezione. </li></ol></li><li> Preparare 10 piscine di plasmidi di 10 3 al 10 4 complessità (10 4 al 10 5 complessità totale). Questo rappresenta 10 tavole con 1.000 - 10.000 colonie ciascuno. <ol><li> Biblioteca piastra di coltura su 10 piatti da 15 cm LB-ampicillina, crescere 12-18 ore a 37 ° C, e raccogliere le colonie da ogni da una leggera pressione con una spatola di vetro a 7 ml LB. </li><li> Preparare un stock di glicerolo da 0,5 ml (aggiungere 0,2 ml glicerolo sterile e conservare a -20 &amp;# 730; C), e utilizzare i restanti 6,5 ml per preparare il DNA con uno standard disponibile in commercio kit miniprep DNA seguendo le indicazioni del produttore. </li></ol></li><li> Linearizzare pool DNA plasmide (1,0-2,0 mg) con adeguate enzima di restrizione digerire 16 a 37 ° C: 1 - 1,5 ore. Isolare il DNA linearizzato con estrazione con fenolo / cloroformio seguita dalla precipitazione con etanolo e risospensione in acqua secondo le specifiche del kit RNA polimerasi utilizzata. Sintetizzare RNA con un kit RNA polimerasi commerciale seguendo le indicazioni del produttore. </li><li> Preparare aghi per microiniezione (usando un estrattore ago con tubi capillari di vetro) di circa 20 micron di diametro; misurare punte degli aghi su un microscopio composto con un micrometro oculare calibrata. Nota: le impostazioni estrattore ago deve essere empiricamente determinato a produrre un ago con punta fine in modo tale che in caso di rottura con una pinza sottile produce il formato di punta desiderata. </li><li> Preparare (spingere argilla instrato uniforme sul fondo del piatto) argilla alberati 35 x 10 mm piatti di Petri con scanalature parallele di tenere ovociti in atto durante la microiniezione; produrre scanalature con una sonda centro commerciale o pipetta Pasteur fuso alla punta di fiamma. In alternativa argilla, preparare piatti agarosio rendendo rientranze con uno stampo elastomero 17. Ovociti di trasferimento con una pipetta ampio tunnel al 3% Ficoll a 1X MBS (circa 2 ml) in file nei piatti di creta-allineati. </li><li> Utilizzando microinjector, riempire ago con 1 ng / RNA nl e regolare l&#39;equilibrio di produrre una leggera pressione positiva (per evitare stesura di ovociti citoplasma). </li><li> Iniettare ovociti con circa 20 RNA nl nella regione equatoriale. Lasciare 1 ora per ovociti iniettati di rimanere in Ficoll-MBS, quindi trasferire delicatamente per 1x MBS. Incubare per 8-24 ore a 20 ° C prima dell&#39;analisi protezione animale. </li></ol> 3. Animal Cap Assay <ol><li> Preparare 3 / 4x NAM e ottenere una pinza sottile, ciclo dei capelli, frammenti coprioggetto curve, dis argilla alberatihes con rientranze a forma di coppa per tenere ovociti. Fai frammenti coprioggetto curve da sbriciolarsi vetrini in piccoli frammenti (circa 1-2 mm x 2-4 mm) e passando attraverso la fiamma fino a quando i bordi polacco e languore, la produzione di un pezzo curvo. </li><li> Fertilizzare X. laevis uova 18 attraverso in vitro o l&#39;accoppiamento naturale e la cultura di gastrula fasi (10 - 11 ore dopo la fecondazione a RT) a 0.1x MBS prima l&#39;ordinamento per fase; raccogliere metà gastrula (fase 11-11,5) 10 embrioni. </li><li> Trasferimento degli embrioni a una capsula di Petri circa mezzo pieno con 3 / 4x NAM. Utilizzando due coppie di una pinza sottile, rimuovere la fecondazione (vitellina) membrana dal gastrulae. </li><li> Trasferimento ovociti a 3 / 4x NAM (circa 2 ml) in piatti di terracotta alberati e immobilizzare in singole impressioni in argilla, producendo impressioni per accogliere singoli embrioni solchi sono stati descritti sopra. </li><li> Trasferimento degli embrioni ai piatti d&#39;argilla alberati e tagliato le protezioni animali fuori gastrulae utilizzando due coppie di pinza sottile. Fare attenzione a isolare animale tappo ectoderma e non tessuti equatoriali 18. </li><li> Inserire un tappo animale nell&#39;emisfero animali di ciascun ovocita con la superficie interna del tappo animale contattando l&#39;ovocita. Tenere ricombinanti insieme applicando frammento coprioggetto vetro curvo e applicando pressione verso il basso sul vetro, appiattimento ectoderma come i contatti coprioggetto l&#39;argilla (tappi animale può rimanere aperto con lo strato interno esposta alla superficie del ovocita per 6 - 8 ore o più ). Nota: In alternativa, inserire la protezione animale in una rientranza di argilla con la sua superficie interna rivolta verso l&#39;alto e inserire un ovocita sul tappo; fissare il ricombinante con piccole estensioni di argilla. </li><li> Cultura a 20 ° C fino a quando gli embrioni di controllo portata desiderata palco per il dosaggio. </li><li> Ricombinante separata rimuovendo vetrino / argilla ed isolando ectoderma con una pinza e un ciclo di capelli. </li><li> Fissare frammenti ectodermica per 1 ora a MEMFA (3,8%formaldeide in MEM [0,1 M pH 7,4 MOPS, 2 mM EGTA, e 1 mM MgSO 4]). </li><li> Frammenti di trasferimento (ed embrioni di controllo) da MEMFA in etanolo e conservare a -20 ° C. </li></ol> 4. Analisi di risposta in Ectoderma l&#39;ibridazione in situ (ISH) <ol><li> Preparare soluzioni per ISH. <ol><li> Preparare 1x PBS: 0,01 M tampone fosfato, NaCl 0,138 M, pH 7,4 </li><li> Preparare PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% di Tween-20 </li><li> Preparare la soluzione di 100x Denhart: 2% di BSA, 2% Polivinilpirrolidone, 2% Ficoll </li><li> Preparare Hybridization Buffer: 50% formammide, 5x SSC, 1 mg / ml torula RNA, 1 mg / ml di eparina, soluzione 1x Denhart, 0.1% Tween-20, 0,1% CHAPS, EDTA 10 mM, DEPC-H 2 O </li><li> Preparare maleico Acid Buffer (MAB): 100 mM acido maleico, NaCl 150 mM, pH 7,5 </li><li> Preparare MAB + blocco: MAB, 2% reagente bloccante (calore a 60 ° C per sciogliere) </li><li> Preparare della fosfatasi alcalina (AP) Buffer: Tris mm 100pH 9.5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween, dH 2 O </li></ol></li><li> Preparare la sonda RNA. <ol><li> Utilizzando un kit di RNA polimerasi commerciale e scavare-NTP mix, aggiungere in una provetta da 1,5 ml (50 reazione microlitri): 25,5 ml DEPC-H 2 O, 10 microlitri 5X Transcription Buffer, 2,5 microlitri 10x scavo-NTP mix, 5 ml 100 mM DTT, 2 microlitri RNasin, 2 ml DNA stampo linearizzato (~ 1 mg / mL), 3 ml di RNA polimerasi e incubare 37 ° C per 90 min. </li><li> Aggiungere 2 ml di RNA polimerasi e incubare 37 ° C per 60 min. </li><li> Controllare 2 ml di reazione su 1% gel. </li><li> Aggiungere 1 ml RQ1 RNase-Free DNase e incubare 37 ° C per 20 minuti. </li><li> Precipitare il probe aggiungendo 50 microlitri DEPC-H 2 O, 25 microlitri 10 M ammonio acetato e 313 ml di etanolo. Conservare a -20 ° C durante la notte (O / N) poi recuperare RNA per centrifugazione a 13.800 xg per 20 min. Lavare con 500 ml 75% di etanolo, girare brevemente, rimuovereetanolo e lasciare asciugare all&#39;aria pellet. Aggiungere 50 ml DEPC-H 2 O. </li><li> Aggiungi Tampone di ibridazione a una concentrazione finale di ~ 0.5 mg / mL. </li></ol></li><li> Preparare dei tessuti per l&#39;ibridazione. Se non diversamente specificato, riempire fiale in cima ad ogni cambio di soluzioni descritte (circa 4 ml). <ol><li> Rimuovere l&#39;etanolo da fiale e trasferimento di embrioni in 75% di etanolo / PTW, quindi il 50% di etanolo / PTW per 10 minuti ciascuna, orizzontalmente sulla sedia a dondolo. </li><li> Lavare tre volte in PTW per 5 minuti ciascuno su sedia a dondolo. </li><li> Trasferimento a 10 mg / mL trattamento Proteinase K in PTW; Tubi di roccia verticale 15 min. </li><li> Sciacquare due volte 10 minuti ciascuno a 0,1 M Triethanolamine pH 7,8 - tubi di roccia verticale. </li><li> Aggiungere 12,5 ml di anidride acetica ai tubi e roccia verticale 5 min. Ripetere con l&#39;aggiunta di 12,5 ml di anidride acetica per 5 min. </li><li> Lavare in PTW 5 minuti verticalmente sulla sedia a dondolo. </li><li> REFIX in 4% paraformaldeide 20 min a bilanciere. Calore Tampone di Ibridazionea 60 ° C. </li><li> Lavare tre volte in PTW per 5 minuti ciascuno su sedia a dondolo. </li><li> Rimuovere tutti ma ~ 1 ml di PTW da ciascuna provetta e aggiungere 250 microlitri Hyb Buffer; agitare delicatamente i tubi per mescolare. Tubi di roccia verticale 5 min. </li><li> Sostituire con 60 ° C Hyb Buffer (0,5 ml) e agitare delicatamente a 60 ° C 10 min. Sostituire con fresco Hyb tampone e agitare a 60 ° C per 4 ore due. </li><li> Sonda termica (1 ml a 0,5 mg / mL in Hyb tampone) a 60 ° C (3 min). Rimuovere Hyb Buffer e aggiungere la sonda ai tubi. Agitare delicatamente O / N a 60 ° C. </li></ol></li><li> Preparare dei tessuti per l&#39;anticorpo. <ol><li> Caldo Hyb Buffer e 2x SSC + 0,1% Tween-20 soluzioni a 60 ° C. </li><li> Sostituire soluzione della sonda con Hyb Buffer (salvare le sonde a -20 C per 2 - 3x riutilizzo). Lavare a 60 ° C per 10 min. </li><li> Lavare tre volte a 60 ° C in 2x SSC-Tween (20 minuti ciascuno con agitazione). </li><li> Lavare tre volte a 60 ° C a 0.2x SSC-Tween (20 minuti ciascuno con agitazione). </li><li> Lavare due volte in MAB (RT) per 15 min per riga sull&#39;attuatore. </li><li> Aggiungere 1 ml MAB + blocco. Lavare 2 ore in verticale sulla sedia a dondolo. </li><li> Trasferimento a 1 ml MAB + blocco contenente un anti-digossigenina-AP 1 / 2.000. Roccia verticale a 4 Co / N. </li></ol></li><li> Preparare dei tessuti per reagente colore. <ol><li> Sostituire soluzione di anticorpi con MAB; lavare tre volte in MAB 5 min per riga sull&#39;attuatore. </li><li> Lavare tre volte in MAB 1 ora ciascuno orizzontalmente sull&#39;attuatore. </li><li> Lavare due volte in AP Buffer 10 minuti ogni orizzontalmente sulla sedia a dondolo. </li><li> Trasferimento tessuto multi-pozzo vassoio di plastica, rimuovere AP tampone e aggiungere BM viola reagente (~ 1 ml). Lasciare reazione di procedere nel buio 5 minuti a O / N. </li><li> Al raggiungimento del caso colorazione, trasferire il tessuto di fiale di PTW. Lavare due volte 10 min ciascuno in PTW sulla sedia a dondolo. </li><li> Fissare in soluzione di Bouin a 4 CO / N sulla sedia a dondolo. </li><li> Lavare Bouin con tre il 70% di etanolo / 30% lavaggi PTW a temperatura ambiente. Procedere to l&#39;acquisizione di immagini con epi-illuminazione e una videocamera a microscopio, candeggio, se necessario 18. </li></ol></li></ol> 5. Sib Selezione e clonazione <ol><li> Selezionare piscina con la più alta attività (grande risposta nel tessuto ectodermica). </li><li> Titolare (diluire con LB alla densità del caso) la stock di glicerolo per la piscina con la più alta attività e piastra fuori dieci nuovi piatti con circa un decimo delle colonie dal passo precedente (utilizzando la sezione 2 del protocollo sopra). </li><li> Ridurre le dimensioni della piscina fino a quando l&#39;attività viene fatta risalire ad un&#39;unica colonia. </li><li> Ottenere sequenza di DNA con primer standard, nel vettore. </li></ol>

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E., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+in+the+tetraploid+Xenopus.laevis.+enables+genome-wide+insight+in+a+classic+developmental+biology+model+organism.">RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism.</a> Methods. 66, 398-409 (2014).</li><li>Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+large+set+of+full-length+clones+from+a+Xenopus+tropicalis+EST+project.">Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project.</a> Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).</li><li>Karpinka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenbase,+the+Xenopus.+model+organism+database;+new+virtualized+system,+data+types+and+genomes.">Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).</li><li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signaling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis.">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PLoS ONE. , e79469 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Il metodo descritto qui per il clonaggio funzionale di geni capaci di indurre una risposta in ectoderma competente può essere utilizzato per identificare una vasta gamma di prodotti genici. Questo metodo si espande sul lavoro passato, combinando analisi dei tessuti che inducono con tecniche di clonazione espressione. Utilizziamo le vie metaboliche della oocita Xenopus come fonte di produzione di indurre fattori, direttamente o indirettamente, dopo l&#39;iniezione di RNA. Questo, in combinazione con l&#39;uso di metodi stabiliti per la clonazione di un gene di interesse 6,7 utilizzando l&#39;espressione dei trascritti generati da una libreria di cDNA o altra raccolta di cloni, fornisce un valido approccio per coloro che cercano di identificare i geni di nuovo interesse coinvolti in embrionali induzione. L&#39;ampia applicabilità di questo metodo per l&#39;identificazione di nuovi geni funzionale è un utile complemento nuovi giochi approcci genetici inversa, e potrebbe anche essere utilizzato per funzionalmente trascritti prova identificate utilizzando high-throughput metodi (come RNA-seq) 21. I controlli sono critici nel controllo della funzione metabolica di ovociti utilizzati nel saggio tappo. Sia per garantire la salute di ogni lotto di ovociti e di stabilire l&#39;utilità di questo sistema per rilevare trascritti bassa abbondanza, concentrazioni variabili di mRNA del induttore mesoderma INHBB sono stati testati; questo gene è correlato al percorso lente induzione ed è ben documentato controllo indipendente 14. Muscle-attività induttiva, dosati con l&#39;espressione di antigeni muscolo-specifici in protezione animale ectoderma con l&#39;anticorpo 12/101, è stato osservato con 2 - 200 pg INHBB mRNA, anche in presenza di 500 volte superiore stadio 14 poli (A) + RNA. Il sistema è quindi utile su una gamma molto ampia di RNA quantità iniettata, e gli ovociti sono in grado di produrre stabilmente proteine ​​e rimanere vitali dopo iniezione citoplasmatica di volumi di 50 nl e superiori. Una considerazione per l&#39;use di una libreria di cDNA in questo protocollo è la necessità di full-length o quasi cloni full-length. Prima dell&#39;uso nel protocollo, la biblioteca dovrebbe essere esaminata da analisi Northern per determinare la dimensione di trascritti noti nella libreria e quindi ridurre la possibilità che gli effetti dominanti negativi sono ottenuti da trascrizioni iniettati potenzialmente troncati. Poiché una piscina full-length cDNA è importante, l&#39;uso di cloni EST 22 o in modo ottimale, il Xenopus ORFeome 23 (che fornisce una serie completa di convalidati cloni integrali) sono da preferire per una libreria di cDNA tradizionale salvo scena- e tessutale specifica fonte di cDNA sono ricercati e utilizzati per la costruzione della libreria. Un&#39;altra considerazione è la presenza di sequenze nel vettore libreria destinato ad aumentare la stabilità mRNA trascritti in iniettati β-globina e poli (A). Mentre questo è desiderabile aumentare la quantità di proteina prodotta da iniettare mRNA sintetico, solleva anche la possibillità di produrre un effetto dominante negativo da mRNA che è superiore in termini di stabilità e di attività in vivo. Un numero basso copia mRNA non può esercitare gli stessi effetti di sua controparte endogena sullo sfondo di una grande piscina di trascrizioni; uno che è stabilizzato nel processo di clonazione e trascrizione può persistere per consentire il rilevamento nel dosaggio tappo. Una terza questione è la dimensione della piscina; notevole riduzione delle dimensioni della piscina (10 cloni o meno) è stato dimostrato di essere vantaggiosa in recenti progetti guadagno-di-funzione di screening in embrioni di 24 ed è probabile che fornire risultati più chiari e più facile l&#39;identificazione di geni candidati. Una dimensione più piccola della piscina 10 3 - 10 4 raccomandato in questo protocollo è realizzabile se la complessità totale della raccolta di cloni è inferiore a 10 4, come è il caso con il ORFeome 23; si potrebbe schermo del ~ 9.000 cloni che inizia con 10 piscine di 900, anche se può essere proibitivo per intensità di lavoroelaborare più di 10 piscine in un esperimento. Determinazione del tipo di prodotto genico (mediante analisi di sequenza) realizzato dal gene identificato nella schermata determina la natura delle prove della sua funzione. Poiché un cofattore trascrizionale nucleare è stato identificato nel nostro schermo 8, è stato necessario confermare il ruolo del nucleo nel processo induttivo innescato dall&#39;introduzione di ldb1. Ovociti enucleati hanno proteina pienamente funzionante macchinari sintetico e sono vitali e capaci di produrre fattori secreti dalle trascrizioni iniettati. Tuttavia, l&#39;assenza del nucleo abolisce funzionamento di fattori di trascrizione, cofattori, o altri prodotti genici indirettamente ad azione. Le successive analisi di geni identificati nella schermata includono la determinazione di sviluppo pattern di espressione per ibridazione in situ e guadagno di funzione e la perdita di funzione test. Sovraespressione mediante iniezione di RNA in zigoti o limitando iniezione SPblastomeri ecific per limitare i suoi effetti a particolari regioni del embrione in grado di fornire approfondimenti, così come atterramento della funzione genica mediante iniezione di oligonucleotidi morfolino diretti contro la trascrizione in vivo. Visualizzazione diretta di un effetto induttivo nel rispondere protezione animale ectoderma utilizzando una linea transgenica con un gene reporter (ad esempio GFP) può accelerare notevolmente il processo di screening e di eliminare la necessità per l&#39;analisi dell&#39;espressione di RNA mediante ibridazione in situ. Analogamente, l&#39;uso di anticorpi come mezzi rapidi di screening è desiderabile se un anticorpo appropriato (come il 12/101 per risposta muscolare discusso sopra) è disponibile. Embrioni albini possono essere utilizzati per i tappi animali, che anche se più difficile in scena precisione nelle fasi gastrula, semplificare il processo di ibridazione in situ, eliminando la necessità di qualsiasi sbianca di tipo selvaggio pigmentazione per visualizzare meglio il prod reazione cromaticaUCT. Infine, è importante considerare che per vari motivi, un gran numero di prove può essere necessario condotte per identificare un dato gene. Per uno, il numero di casi si può ragionevolmente processo in un determinato processo è limitata dallo sviluppo (e l&#39;eventuale perdita di competenza) che si verifica nel tempo anche in una grande serie di embrioni e una gamma di temperature a cui alla cultura loro, così come la perdita che potrebbe verificarsi di piccoli pezzi di ectoderma in lavorazione. Per un altro, il tasso di successo di espressione di un marcatore scelta nel ectoderma possono essere molto basse e richiedono molti casi per osservare un effetto statisticamente significativo.

Forward genetic approaches to identify genes of interest through their function or loss-of-function1,2 are an integral part of understanding complex patterning events in development. Coupled with powerful reverse genetic techniques available to an ever-widening array of systems and researchers3-5, it is now possible to identify genes with a key functional role in a pathway and then elucidate that function at the cellular level and in interaction with other gene products. One approach to functionally identifying genes of interest that has yielded many key findings in the past is expression cloning6,7.
Our recent aim8 was to identify early lens-inductive factors, since it has been demonstrated that initial steps in the vertebrate lens-inductive process occur as early as gastrula stages. To that end, we used the transiently lens-competent9 animal cap ectoderm (stage 11-11.510) of Xenopus embryos as responding tissue for induction, and the stage VI Xenopus oocyte as a source of production for the inducing factors.
The following protocol builds on the expression cloning and sib selection protocols of Smith and Harland6,7, also successfully used by others11-13. In our oocyte expression system (first utilized for production of inducing factors by Lustig and Kirschner14), pools of injected transcripts capable of directly or indirectly causing the oocytes to produce factors that elicit a lens-inductive response in animal cap ectoderm are selected for and identified. Since the system is useful for expressing secreted inducing molecules directly (oocyte-injected INHBB mRNA causes mesoderm induction in mesoderm-competent animal cap ectoderm8), we originally expected the screening procedure to be useful chiefly for identification of paracrine factors. However, since we identified a nuclear factor in our screen (ldb18), it is clear that the system can be used to identify a wide variety of molecules such as transcriptional or translational regulatory factors, miRNAs, cofactors, or juxtacrine factors.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="766">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">12/101 Antibody</td>
			<td style="width:191px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">12/101</td>
			<td style="width:233px;">Monoclonal antibody for detection of muscle tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">20X SSC Buffer</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">S6639</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Acetic anhydride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A6404</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Dig-AP</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:135px;">11093274910</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Aurum Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:135px;">732-6400</td>
			<td style="width:233px;">Plasmid DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Blocking Reagent</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:135px;">11096176001</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">BM Purple</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:135px;">11442074001</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Boekel Hybridization Oven</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">13-245-121</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Bouin&#39;s Solution</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">HT10132</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">BSA</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A9647</td>
			<td style="width:233px;">for OCM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CHAPS</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">C3023</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Collagenase A</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:135px;">10103578001</td>
			<td style="width:233px;">Defolliculation of oocytes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cysteine</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">C121800</td>
			<td style="width:233px;">Dejelly embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">DEPC-H2O</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP5611</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Dig-RNA Labeling Mix</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:135px;">11277073910</td>
			<td style="width:233px;">for ISH probes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:135px;">500233</td>
			<td style="width:233px;">for Vitelline envelope removal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethyl 3-aminobenzoate</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A5040</td>
			<td style="width:233px;">MS222 anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ficoll PM 400</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">F4375</td>
			<td style="width:233px;">for Injection media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formamide</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">F9037</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G1914</td>
			<td style="width:233px;">for OCM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Glass capillaries</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:135px;">4878</td>
			<td style="width:233px;">3.5&#34; long, I,D, 0.530mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Glass sample vials</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">06-408B</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Hair loop</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:233px;">Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">H4784</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Injector Nanoliter 2010</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:135px;">Nanoliter 2010</td>
			<td style="width:233px;">Microprocessor-controlled microinjector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:191px;">Carolina</td>
			<td style="width:135px;">972433</td>
			<td style="width:233px;">Aquarium Salt for frog recovery</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA</td>
			<td style="width:191px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:135px;">989_IRBG</td>
			<td style="width:233px;">cDNA library&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">LB Agar plates with 100 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:135px;">L5004</td>
			<td style="width:233px;">150mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">LB Luria Broth</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:135px;">L8650</td>
			<td style="width:233px;">LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Magnetic mRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:191px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:135px;">S1550S</td>
			<td style="width:233px;">for isolation of poly(A)-enriched RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Maleic Acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">M0375</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Manual Microfil Micromanipulator</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:135px;">M3310R</td>
			<td style="width:233px;">Manual micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Nutating Mixer</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">22-363-152</td>
			<td style="width:233px;">Rocker for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Permoplast</td>
			<td style="width:191px;">Nasco</td>
			<td style="width:135px;">SB33495M</td>
			<td style="width:233px;">Clay for injection and dissection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P5368</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">PMSG</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G4877</td>
			<td style="width:233px;">to stimulate oocyte development</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">PVP40</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Programmable Puller</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:135px;">PUL-1000</td>
			<td style="width:233px;">Micropipette needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P6556</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">pTnT Vector</td>
			<td style="width:191px;">Promega</td>
			<td style="width:135px;">L5610</td>
			<td style="width:233px;">cDNA library construction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Riboprobe Combination System</td>
			<td style="width:191px;">Promega</td>
			<td style="width:135px;">P1450</td>
			<td style="width:233px;">in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">18248013</td>
			<td style="width:233px;">kit for cDNA library construction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Sutures, 3-0 silk</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">19-037-516</td>
			<td style="width:233px;">Suture thread and needle for post-oocyte removal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Torula RNA</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">R3629</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triethanolamine</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T1502</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Tween 20</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P9416</td>
			<td style="width:233px;">for ISH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Universal RiboClone cDNA Synthesis System</td>
			<td style="width:191px;">Promega</td>
			<td style="width:135px;">C4360</td>
			<td style="width:233px;">alternative kit for cDNA library construction</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration</td>
			<td style="width:191px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:135px;">5055_XenORFeome</td>
			<td style="width:233px;">ORFeome Clones</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">XL2-Blue Ultracompetent Cells</td>
			<td style="width:191px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:135px;">200150</td>
			<td style="width:233px;">cells for transformation of cDNA library</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional cloning using a xenopus oocyte expression system

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

In risposta alla espressione di mRNA iniettato in oociti, rispondendo tessuto protezione animale è stato analizzato per l&#39;espressione di Otx2 mediante ibridazione in situ (Figura 2 e Tabella 1); Otx2 si esprime nella ectoderma lente presuntivo (PLE) da chiusura del tubo neurale attraverso la lente placode ispessimento 19. Tuttavia, poiché Otx2 si esprime anche nella ectoderma neurale anteriore, così come non-neurale ectoderma testa fuori della PLE, è associato sia con neurale e risposte placodal. L&#39;uso di foxe3 allo schermo la libreria per un prodotto del gene in grado di produrre una risposta lenti induttivo lente competente protezione animale ectoderma consentito un approccio più specifico per l&#39;obiettivo della clonazione espressione, dal momento che foxe3 si esprime nella PLE da placca neurale tappe e in tutta lente vescicola formazione 20, presenti nelle regioni limitrofe placodal ma assenti da neuroectoder<html> m. Usando l&#39;espressione e clonazione protocollo selezione sib sopra e iniettando piscine di trascritti di libreria, un gene capace di produrre espressione foxe3 nelle calotte animali è stato isolato (Tabella 2). Dopo aver isolato il clone, 179 ulteriori saggi protezione animale utilizzando ovociti iniettati con trascrizioni di libreria sono stati sottoposti a screening per l&#39;espressione di foxe3; 50 erano positivi (28%). Di 140 pezzi protezione animale immessi sul ovociti uninjected, 0 sono risultati positivi (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53518/53518fig1.jpg" /> Figura 1. ovociti-animale Cap saggio ed Expression Clonazione Schema del protocollo:. Trascrizioni sono preparati dalla libreria clone e iniettato in oociti, protezione animale ectoderma è colta con ovociti e poi analizzati per l&#39;espressione genica indotta da ibridazione in situ.<html> d / 53518 / 53518fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53518/53518fig2.jpg" /> Figura 2. risultati tipici di Animal Cap Assay seguenti mRNA iniezione e ibridazione in situ per Otx2. (AB) risultato Rappresentante di risposta induttiva a dorsalized fase 14 poli (A) + RNA in capsule animali, effettuati per Otx2 espressione da montare tutto in situ ibridazione. (A) le protezioni animali immessi sul ovociti uninjected in fase 10.5 e coltivate per fase 25. (B) Fase 10.5 protezioni animali immessi sul ovociti iniettati con 10 ng RNA e colto allo stadio 25. Otx2 espressione osservata in 6/7 dei casi e indicato da punte di freccia. Bar = 500 micron.<html> &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53518/53518fig3.jpg" /> Figura 3. risultati tipici di Animal Cap Assay seguente In situ Ibridazione per Foxe3. (AC) tappi di animali rappresentativi di saggi cap ovocita animale, testati per l&#39;espressione di foxe3 mediante ibridazione in situ. (A) Fase 11-11.5 tappi animali immessi sul ovociti ldb1-iniettato e coltivate per fase 23. foxe3 espressione è indicato da frecce. (B) Fase 11-11.5 tappi animali immessi sul ovociti uninjected e colta di mettere in scena 23; nessuna espressione foxe3 rilevato. (C) Sezione di foxe3 -positivo indotto protezione animale da A mostrando espressione in strati interni ed esterni di ectoderma. Bar = 500 micron.f = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:263px;"> RNA iniettato </td><td style="width:147px;"> I casi positivi </td><td style="width:73px;"> Gene </td><td style="width:64px;"> % </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Tappa 14 mRNA dorsalized, 10 ng </td><td> 12/24 </td><td> Otx2 </td><td> 50 </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> Piscine Biblioteca di 10 cloni 5, 20 ng </td><td> 3/9 </td><td> Otx2 </td><td> 33 </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> Piscine Biblioteca di 5-10 Ottobre 0 clon<html> es, 20 ng </td><td> 50/179 </td><td> foxe3 </td><td> 28 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Nessuna </td><td> 0/140 </td><td> foxe3 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. ovociti-animale Cap Assay Risultati Risultati del test protezione animale valutati mediante ibridazione in situ con Otx2 e foxe3, utilizzando ovociti iniettati con mRNA o con trascrizioni sintetizzati dal pool cDNA library.; o ovociti uninjected. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:256px;"> RNA iniettato </td><td style="width:191px;"> Designazione Pool / selezione </td><td style="width:183px;"> Espressione foxe3 positivo </td></tr><tr height="24">otto: 24px; &quot;&gt; piscine Biblioteca su 10 cloni 5, 20 ng </td><td> UN </td><td> 2/4 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> B * </td><td> 4/28 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> C </td><td> 4/44 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> Piscine Biblioteca di 10 4 cloni, 20 ng </td><td> 1 </td><td> 0/11 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 2 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 3 </td><td> 3/14 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 4 </td><td> 0/12 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 5 </td><td> 0/15 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 6 </td><td> 1/20 </td></tr><tr height="21"><html><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 7 </td><td> 3/23 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 8 </td><td> 0/16 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 9 </td><td> 0/16 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 10 * </td><td> 5/20 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Piscine Biblioteca di 5.000 cloni, 20 ng </td><td> 1 </td><td> 0/7 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 2 * </td><td> 5/16 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 3 </td><td> 1/7 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 4 </td><td> 0/7 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 5 </td><td> 0/7 </td></tr><tr height="21">HT: 21px; &quot;&gt; piscine Biblioteca di 400 cloni, 20 ng </td><td> 1 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 2 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 3 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 4 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 5 * </td><td> 8/26 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 6 </td><td> 0/11 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 7 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 8 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 9 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 10 </td&gt; <td> 0/8 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Piscine Biblioteca di 70-200 colonie, 20 ng </td><td> 1 </td><td> 0/8 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 2 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 3 * </td><td> 1/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 4 * </td><td> 1/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 5 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 6 </td><td> 0/9 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 7 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 8 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Piscine Biblioteca di 20 colonie, 20 ng </td><td> 1 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 2 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 3 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 4 * </td><td> 7/21 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 5 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 6 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 7 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 8 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 9 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 10 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td<html> height = &quot;21&quot; style = &quot;height: 21px;&quot;&gt; piscine Biblioteca di 6 - 7 colonie, 20 ng </td><td> K2-6, L1 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> L2-6, M7 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> M8-12, N7-8 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> K5-6, L1-4 </td><td> 1/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> L5-6, M7-10 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> M11-12, N7-8, K2-4 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> K2, K5, L2, L5, M8, M11 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> K3, K6, L3, L6, M9, M12 </td><td> 0/9 </td></tr><tr height="21">1px; &quot;&gt; </td><td> K4, L1, L4, M7, M10, N7, N8 </td><td> 1/9 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> RNA Biblioteca, 20 ng </td><td> K6 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> L1 * </td><td> 3/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> L3 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> L4 </td><td> 0/10 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> RNA Biblioteca, 20 ng </td><td> L1 (ldb1) conferma </td><td> 50/179 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> * Indica pool selezionato </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2. Sib Selezione e Exprefissione Clonazione Risultati. La piscina con il più alto livello di risposta in ogni analisi protezione animale (che varia tra il 10% e il 36% positivo per l&#39;espressione foxe3) è stato selezionato per l&#39;uso nel prossimo esperimento di restringere l&#39;attività di un clone. L&#39;asterisco indica pool selezionato.

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Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Clonazione funzionale utilizzando un<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

8.0K Views.  Shepherd University. We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

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Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata<em&gt; In Situ</em&gt; Protocollo di ibridazione in<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Incapsulamento alginato di cellule staminali pluripotenti usando un ugello coassiale

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilizzando Analisi confocale di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Monitoraggio celle in Zebrafish GFP-transgenico Utilizzo del sistema fotoconvertibile PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Temporale ordinazione di espressione Dynamic Data di espressione spaziale dettagliata Mappe

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

Manipolazione funzionale delle materne genica Utilizzando<em&gt; In Vitro</em&gt; La maturazione degli ovociti in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Fetali del Mouse cardiovascolari Imaging mediante un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza (30 / 45MHZ)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Sistema di analisi dell'angiogenesi tridimensionale utilizzando Gli spheroidi co-culturali formati da cellule formanti colonia endoteliale e cellule staminali mesenchiche

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...