Yazarlar teşekkür etmek istiyorum: Dr Frank Jiang, Dr David Lin, Dr Bernard Yurke ve Dr Uday Chippada DNA jel teknoloji geliştirme katkıları için; Dr Norell Hadzimichalis, Smit Şah, Kimberly Peterman, onların yorum ve bu yazının düzenleme için Robert Arter; Omurilik üzerinde New Jersey Komisyonu Araştırma (Grant # 07A-019-SCR1 NAL) ve New Jersey Nörobilim Enstitüsü (MLP) dahil finansman kaynakları; ve Doku Mühendisliği yayıncılar, Bölüm A izni Şekil 3 yeniden basım izni için Şekil 2 ve 4 ve biyomalzemeleri yeniden yazdırmak için.

<ol>
	<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+focal+adhesion+assembly+A+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates.">Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).</li><li>Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+equilibrium+swelling+behaviour+of+ph-sensitive+hydrogels+containing+2-hydroxyethyl+methacrylate.">Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate.</a> Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).</li><li>Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+elastomeric+biomaterials+based+on+resilin-like+polypeptides.">Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides.</a> Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).</li><li>Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+behavior+on+shape+memory+polymer+substrates.">Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates.</a> Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repositioning+of+cells+by+mechanotaxis+on+surfaces+with+micropatterned+youngs+modulus.">Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus.</a> J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).</li><li>Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ions+on+the+dynamic+behavior+of+an+electrodriven+ionic+polymer+hydrogel+membrane.">Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane.</a> Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).</li><li>Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+swelling+of+polyacrylate+hydrogels+in+physiological+salt+solutions.">Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).</li><li>Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+outgrowth+on+a+DNA+crosslinked+hydrogel+with+tunable+stiffnesses.">Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses.</a> Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).</li><li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+dynamic+stiffness+of+the+substrates+on+neurite+outgrowth+by+using+a+DNA-crosslinked+hydrogel.">Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).</li><li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+fibroblast+growth+and+the+dynamic+stiffnesses+of+a+DNA+crosslinked+hydrogel.">The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel.</a> Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).</li><li>Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+photodegradable+hydrogels+as+dynamically+tunable+cell+culture+platforms.">Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).</li><li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+a+reversible,+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogel.">Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel.</a> J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).</li><li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+rigid+spherical+inclusions+in+young's+moduli+determination:+Application+to+DNA-crosslinked+gels.">Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels.</a> J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).</li><li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+immobilization+of+biomolecules+to+agarose+hydrogels+for+controlled+cellular+response.">Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response.</a> Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).</li><li>Marklein, R. A., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+controlled+hydrogel+mechanics+to+modulate+stem+cell+interactions.">Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions.</a> Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).</li><li>Pelham Jr, R. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogels+with+increasing+crosslinker+density.">Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density.</a> BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).</li><li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+substrate+stiffness+and+cell+density+on+primary+hippocampal+cultures.">Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures.</a> J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).</li><li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dendrite+arborization+by+substrate+stiffness+is+mediated+by+glutamate+receptors.">Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors.</a> Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).</li><li>Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+morphology+on+dynamic+softening+of+hydrogels.">Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels.</a> Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).</li><li>Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+the+injured+spinal+cord+after+lateral+spinal+hemisection+injury+in+the+rat.">Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat.</a> J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+growth+in+3d+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties.">Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).</li><li>Wozniak, M. A., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+in+development+A+growing+role+for+contractility.">Mechanotransduction in development A growing role for contractility.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).</li><li>Wuerfel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mr-elastography+reveals+degradation+of+tissue+integrity+in+multiple+sclerosis.">Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis.</a> Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).</li><li>Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymerization+in+microfluidic+gradient+generators+Microscale+control+of+substrate+compliance+to+manipulate+cell+response.">Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response.</a> Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

DNA, jellerin özelliği yumuşatmak ya da hücre yapışması olanağına hücre işlevi üzerindeki dinamik doku sertliği rolünü incelemek için ideal bir model haline getirir önce ve sonra sertleştirir. Tüm üç tasarım mekanik ve biyolojik çalışmalarda kullanılmıştır. Bununla birlikte, her üç tasarım çapraz uzunluk DNA jel esneklik (Tablo 2) etki etmediğini gösterir, çeşitli çapraz bağlama yüzdeleri benzer esnekliklere sahiptir. Bunun aksine, akrilamid konsantrasyonunun elastikiyet etkiler. Bu tasarımlar jel patlama eğilimleri yana çapraz bağlama kinetikleri farklı olabilir, ya da jeller eğilimi ortamı veya tampon maddesi içinde çözündürülmesi için, çapraz bağlama uzunluğunun artması ile azalmaktadır. DNA jeller Ancak kinetik bilgiler sınırlıdır, ama biz çapraz bağlama ek bir 30% iki gün% 50 DNA jeller 11 L2 doğumdan sonra ortaya çıkar biliyorum. Bununla birlikte, jel yumuşatma ve takviye ikinci geniş ve kontraktil kuvvetlerinin üretilmesi, sırasıyla kaçınılmazdır ve dekuple edilemez18,21. Fazla enerji ssDNA&#39;nın 18 üç standların arasında bağ oluşturmak için gerekli beri 50 →% 100 jeller Sadece stres yaklaşık 0.04 Pa üretirken 100 70 →% jeller, stres 21 yaklaşık 0.5 Pa oluşturmak. Bu nedenle, sonuçların yorumlanması sertleşmesi ve jellerin yumuşatması ile üretilen stres ve gerginlik dikkate alınmasını gerektirir. DNA jelleri hazırlarken teknik zorluklar ortaya çıkabilir. En sık teknik konu jel patlama olduğunu. Jel patlama jelin şişmesine, depolama ve hücre büyümesi olmak üzere DNA jel hazırlık birkaç aşamalarında oluşabilir. Jel patlama çok faktör tarafından neden olur. İlk olarak, jel patlama uygunsuz çözelti bileşiminde bir sonucu olabilir. Ortak hatalar liyofilize ssDNA&#39;ya ve viskoz sıvıların uygunsuz pipetleme yetersiz çözülmesini içerir. Pipet hatalarını önlemek için, çözümleri daha kolay pipetle için jel viskozitesini azaltmak veya gerekli am bölmeyin için ısıtma sıcaklığını yükseltmekSA1 ve ikinci nitrojen kabarması, aşamasından önce SA2 polimerize çözeltisi arttırır. Aynı zamanda, polimerize çözeltilerin tekrarlı ısıtma kısmen çözeltinin buharlaştırılması ve solüsyon viskozitesi artırabilir. TE tamponu birkaç mikrolitre ekleme viskozitesini azaltmaya yardımcı olabilir. İkincisi, jel patlama yoksul DNA kalitesinde bir sonucu olabilir. QA / QC raporlarında sık sık gözden geçirilmelidir. QA / QC raporlar kabul edilebilir ve jel patlama devam ederse, HPLC saflaştırılmış ssDNA DNA kalitesini artırabilirsiniz. Üçüncü olarak, jel patlama yetersiz bir DNA tavlama neden olabilir. Biz orijinal protokolde tavlama adımları ve rehybridization adımları dahil ederek jel patlama insidansını azaltmıştır (adım 1.3.6 ve 2.8 görüyorum; sırasıyla 1.3.8 ve 2.10). Jel patlama kez tavlama uzanan ve soğutma önlenebilir. Jeller yeniden kabardı zaman Ancak, su buharlaşması ısı ek maruz camdan jel dekolmanı bir artışa neden olur. Dekolmanı tavlama süre fazla ise, annEaling adımlar (1.3.6 ve 2.8) elimine edilebilir. Karşılaşılan bir diğer sık ​​teknik bir sorun yetersiz hücre yapışması olduğunu. Şişen jeller zordur (Tablo 2) 18 yapma hücre yapışma unswollen jeller daha yumuşaktır. Her hücre tipi doku sertliği farklı tepkiler beri diğer hücre türleri yok ederken Dahası, bazı hücre tipleri bu teknik ikilemi karşılaşabilirsiniz. Aşağıdaki adımlara bazı düşünülmelidir yapışma sorunları çözmek için: (1), (3) sertlik ölçümleri modüle (2) sülfo-SANPAH konjüge ECM proteinlerini alternatif bir yüksek kaplama yoğunluğu üzerinden (4) bir ECM protein artırmak veya sülfo-SANPAH konsantrasyonu, ve (5) bir bekleme süresi artar. Örneğin akrilamid, APS ve TEMED gibi artık toksik maddeler, jeller yapışması ve hücre ölümü eksikliği katkıda bulunabilir. Protokol dahil kapsamlı yıkar yeterli görülmüştür beri bu sorunu yaşamamış, ama biz perf tavsiyeBu sorun oluştuğunda 3.2 eğer İsteğe Bağlı Adım oluşturmayan. DNA, jeller daha etkili dinamik ya da statik koşullar altında hücre fonksiyonları çeşitli çalışma için kullanılabilir. Bu DNA, jel üzerinde büyümüş fibroblastlar ve nöronlar jel elastikiyet modülasyonunun neden olduğunu göstermiştir. Hücre-matriks etkileşimleri genellikle üç-boyutlu arayüzler, üç-boyutlu dinamik matris, bilgilerin olduğundan daha fazla biyolojik ilgili veri üretmek için yardımcı olacaktır. Bu nedenle, şu anda üç boyutlu bir yapı iskelesi bu teknolojiyi çeviriyoruz. Bu DNA çapraz bağlama teknolojisi korurken, daha biyouyumlu bir materyal ile poliakrilamid omurgası yerine bir teknik geliştirmektedir. Bu yeni iskele üç boyutlu dinamik modeli ve bir doku mühendisliği iskelesi olarak işlev görecektir. Onun biyouyumluluk medikal cihaz uygulamaları için fırsatlar açacak.

Statik ve dinamik yüzeylerde hücre fonksiyonu üzerinde doku esnekliği veya sertliğinin etkilerini incelemek için geliştirilen biyomalzeme iki kategori vardır. Statik yüzeyler onlar hücreleri kaplama ve / veya bir kez imal sonra fiziksel özelliklerini değiştirmek mümkün değildir. Poliakrilamid (PA) jeller mechanobiology araştırmalar 5,17 için sentez edilmiştir ilk iki boyutlu, statik maddelerdir. PA jeller çok yönlü, ucuz, hazırlanması kolay, ve elastik modülünün geniş bir yelpazesi ile imal edilebilir. Bu teknik avantajları PA yaygın olarak uygulanan bir alt tabaka jelleri yapmak, statik yüzeyler in vivo hücre dışı matriks (ECM) ve çevresindeki hücresel çevrenin dinamik doğasının göstergesi değildir. Örneğin, ECM yaralanma, gelişme ya da hastalığın bir sonucu olarak sertlik değişiklikleri maruz kalır. Dinamik alt-tabakalar, bu nedenle mechanobiology çalışmalarda doku taklit eden tabaka model olarak tercih edilir <sup&gt; 22,24,25. Çok sayıda doğal, sentetik, iki boyutlu, üç boyutlu, statik ve dinamik sertlik biyomateryaller doku 1,3,6,16,23,26 taklit etmek için geliştirilmiştir. Bazı dinamik yüzeyler mekanik özelliklerinin 2,4,7,8,12,15,16 değiştirmek için ısı, UV, elektrik akımını, iyonları ve pH değişiklikleri gerektiren, ancak bu uyaranların hidrojelin biyo-uygulama kısıtlayabilirsiniz. DNA çapraz bağlı poliakrilamid hidrojeller (DNA, jeller) dinamik bir iki boyutlu esnek substratlardır. DNA çapraz ortama tek bağlı DNA (ssDNA) eklenerek DNA jel sertliğinin, zamansal mekansal ve geri dönüşümlü modülasyonu için izin vermek veya 9-11,13,14,18,21 tampon. Uyaranlara elastikiyet modülasyonu için uygulanır belirtilen dinamik jeller farklı olarak, DNA jeller elastiklik değiştirilmesi için uygulanan ssDNA&#39;nın difüzyon dayanır. Bu nedenle, hücrelerin büyüdüğü üst jel yüzeyi, o oran için modüle edilmiş birinci alanıf esnekliği modülasyon jel kalınlığına bağlıdır. DNA, jeller, ancak bis-akrilamid çapraz bağlar DNA (Şekil 1) oluşan çapraz bağlar ile değiştirilir, bir poliakrilamid omurgaya sahip olmasıyla da Pensilvanya jel meslektaşları benzerdir. İki ssDNA&#39;larının (SA1; ve SA2) jel DNA çapraz bağ oluşturan bir çapraz bağlayıcı kordon (L2) ile hibridize olur. SA1 ve SA2 hem PA ağına etkili katılması için 5&#39;ucunda bir akridit modifikasyon içeren ayrı diziye sahiptir. Jeller, SA1 ve SA2 hazırlanması için ayrı ayrı bir PA omurgasına polimerize edilir, ve daha sonra polimerize SA1; ve SA2 karıştırılır. L2, çapraz bağlayıcı, ve SA1 SA2, karışıma ilave edilir. L2 baz sekansı, her iki SA1, ve SA2 dizilerine tamamlayıcı olan ve L2, DNA çapraz bağlar oluşturulması için SA1 artı SA2 ile melezleşir. Başlangıç, DNA jel elastikiyet L2 konsantrasyonları ve çapraz bağlama (Tablo 1 tarafından belirlenir </strong&gt; ve 2). SA1 ve SA2 (% 100 jelleri olarak adlandırılır), L2 ile% 100 çapraz bağlanmış olduğundan L2 SA1 ve SA2 eşit olarak stokiyometrik miktarlarda ihtiva eden DNA jeller en sert jellerdir. Bu nedenle daha düşük bir çapraz bağlanma, DNA yüzdesi ve L2 sonucu daha düşük konsantrasyonlarda, daha yumuşak jeller DNA. (% 50 jel olarak belirlenmiştir)% 50 gibi düşük bir çapraz bağlanmış jeller, 9-11 inşa edilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig1highres.jpg" /> Şekil 1. çapraz bağlama ve DNA jel uncrosslinking şematik 9-11,13,14,18,21 Adım 1:. SA1, (kırmızı) ve SA2 (mavi) tek tek poliakrilamid omurga (siyah) polimerize edilir. Polimerizasyondan sonra SA1 ve SA2 polimerize çözeltiler karıştırılır. Adım 2: L2 (yeşil) ilave edildi ve jel ilave bağlar oluşturduğu SA1 artı SA2 ile hibridize edilir. Adım 3: R2, t ile hibridizeO L2 Toehold. Adım 4: R2&#39;nin Toehold hibridizasyon SA1 ve SA2 gelen L2 unzipping iter. PA jellerin aksine, DNA, jeller katılaştıran ve sentez sonrasında yumuşatır. Bu nedenle, DNA, jel üzerinde yetiştirilen hücreler, dinamik sıkılık değişikliklere tabi tutulabilir. Hücre-yapışkan jel sertleştirilmesi için, L2 çapraz bağların yüzdesini arttırmak için düşük bir yüzde jellerin kültür ortamına ilave edilebilir. Hücre-yapışkan jel yumuşatmak için, L2 çapraz bağların 10,13,21 yüzdesini azaltmak için çıkarılabilir. L2 ve L2 SA1 SA2 (Tablo 1) için uncrosslink izin vermek için 3 &#39;ucunda bir ek Toehold dizisine sahiptir. L2 çıkarılması R2&#39;nin adı verilen bir dönüş telin hibridizasyonu ile gerçekleştirilir. R2, L2 tam uzunlukta tamamlayıcı olan ve L2 toehold ilk hibridize olur. Toehold melezleştirme çapraz bağ ortadan kaldırır ve jel sertliği azaltır ve SA1 SA2 gelen L2 unzipping, iter. Bu raporda vetalimatlar sertleştirme ve DNA jel yumuşatıcı hazırlanması için sağlanmış olan adım adım video. % 100 ve% 80 jel preparasyonlar tarif edilmesine rağmen, bu protokol için diğer başlangıç ​​ve son çapraz bağlanmış yüzdeleri DNA jeller oluşturmak için uygun olabilir. Genel olarak,% 100 ve% 80 jel, hazırlanan cam kapak slipleri üzerinde hareketsiz kılınmış, fonksiyonalize ve hücreleri ile tohumlanmıştır. L2% 80 jellerin ortama ilave edilir ve R2,% 100 jeller, kaplama sonrası 48 saat arasında ortama ilave edilir. R2 ortama eklenmesi, çapraz bağlı% 80 ile% 100 jelleri yumuşatır ise ortama L2 ek olarak,% 100 çapraz bağlanmış jel% 80 sertleşir. Kasıldı jeller 80 →% 100 jeller olarak belirlenmiş ve yumuşatılmış jeller metinde 80 → 100 olarak% jelleri belirlenir. Kontrol ya da statik jeller, ssDNA için Ts oluşan ya da% 100 ve% 80 jeller başka bir dizi teslim edilir. Esnekliği modüle takip eden iki gün, en az sonra, hücreler işlenmiş ve analiz edilebilir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:kEEP-together.within-page = &quot;her zaman&quot;&gt; <tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> DNA çapraz bağ </td><td rowspan="2"> Bazlar arasında </td><td> Sıra (Toehold) </td><td rowspan="2"> Modifikasyon </td><td rowspan="2"> Erime sıcaklığı (Tm, ° C) </td><td rowspan="2"> Yorumlar </td></tr><tr><td> 5 &#39;→ 3&#39; </td></tr><tr><td rowspan="4"> Tasarım 1 </td><td> SA1 </td><td> 10 </td><td> GKRY SKK TTG C </td><td> 5 &#39;akridit </td><td> 34,9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 10 </td><td> GTC AGA ATG bir </td><td> 5 &#39;akridit </td><td> 23.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 30 </td><td> TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G KTHY CAC TTG </td><td></td><td> 56 </td><td>Bir 10 bp Toehold dizisi dahildir. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 30 </td><td> CAA GTG TAG CGK ACC TTT JGK TCA GAA TGA </td><td></td><td></td><td> R2, L2 tamamlayıcıdır </td></tr><tr><td rowspan="4"> Tasarım 2 </td><td> SA1 </td><td> 14 </td><td> CGT GGC ATA GGA CT </td><td> 5 &#39;akridit </td><td> 46,9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 14 </td><td> GTT TTK CAA TCA GA </td><td> 5 &#39;akridit </td><td> 40.2 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCT GAT TGG GAA AC GTC KTHY TGC CAC G GT TAC CTT CAT C </td><td></td><td> 65.9 </td><td> Bir 12 bp sekansı Toehold dahildir. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 40 </td><td> GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A </td><td></td><td> 65.9 </td><td> R2, L2 tamamlayıcıdır </td></tr><tr><td rowspan="3"> Design, 3 </td><td> SA1 </td><td> 20 </td><td> ACG GAG GTG TAT GKRY ATG TC </td><td> 5 &#39;akridit </td><td> 55 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 20 </td><td> CAT GTT TAG GGA CGA CTG GA </td><td> 5 &#39;akridit </td><td> 56.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TTK AGT CGT CCC TAA DHA TG G AKA TTG CAT ACA SKK CCG T </td><td></td><td> 68.8 </td><td> Toehold dahil değildir. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Kontrol </td><td rowspan="2"> Kontrol </td><td rowspan="2"> 20-40 </td><td> AAA AAA (vb) veya </td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> TTT TTT (vb) </td></tr></tbody></table> Hücresel ve mekanik çalışmalar d birkaç kullanmıştır. SsDNA&#39;ya 9-11,13,14,18,21 Tablo 1. Taban dizileriifferent çapraz tasarımları statik ve dinamik mekanik özellikleri bir dizi DNA jeller oluşturmak için. Çapraz tasarım ile modüle edilmiş parametreler baz dizisi ve dizi uzunluğu veya çapraz uzunlukta. Kalın ve italik yazı tipi SA1 ve L2 arasındaki sırasıyla SA2&#39;nin ve L2 arasındaki baz eşleşmesinin göstermektedir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="8"> Tasarım </td></tr><tr><td colspan="3"> 1 </td><td colspan="3"> 2 </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td> Akrilamid Konsantrasyon (%) </td><td colspan="3"> 10 </td><td colspan="3"> 10 </td><td> 10 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SA1 artı L2 hibridize SA2 (% çapraz bağlanmış) </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> &lt;strong&gt; Esneklik (kPa ± SEM ortalama) </td><td> 6.6 ± 0.6 </td><td> 17.1 ± 0.8 </td><td> 29.8 ± 2.5 </td><td> 5.85 ± 0.62 </td><td> 12.67 ± 1.33 </td><td> 22.88 ± 2.77 </td><td> 25.2 ± 0.5 </td><td> 10.4 ± 0.6 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. DNA, jel 9-11,13,14,18,21. Akrilamid konsantrasyonunun, çapraz yüzdesi ve çapraz uzunluğun Young modülü (E), DNA jellere de modüle edilebilir. Tasarımlar 1, 2 ve 3, sırasıyla, 20, 28 ve 40 bp&#39;lik bir çapraz uzunluklara sahiptir. Tüm tasarımlar için% 100 jeller jel elastikiyeti etkilemez çapraz uzunluğunu gösteren benzer modülüne sahiptir. Bununla birlikte, akrilamid konsantrasyonunun değişiklikler DNA jel esnekliğini değiştirir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ssDNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com</td>
			<td></td>
			<td>Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Tris-EDTA buffer (TE buffer)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>93290</td>
			<td>TBE is a reproductive toxin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td>
			<td>BP14021</td>
			<td>Acrylamide is a toxin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">12-mm diameter round coverglass</td>
			<td rowspan="2">Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com</td>
			<td rowspan="2">12-545-82</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland optical adhesive 72</td>
			<td>Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com</td>
			<td>NOA72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">24-well tissue culture plate</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microcentrifuge tubes</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com or thermofisher.com</td>
			<td>C111 or 22589</td>
			<td>Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37&#176;C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>P6407</td>
			<td>Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com</td>
			<td>13813</td>
			<td>Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 X 60 cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive-displacement pipette</td>
			<td>Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com</td>
			<td>F148504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td>
			<td>11-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/</td>
			<td>NI 5.0UH-R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of dna-crosslinked polyacrylamide hydrogels

Mechanobiology hücre morfolojisi ve fonksiyonunu yönetmenlik fiziksel ipuçlarının kritik bir rol hitap yükselen bir bilimsel alandır. Doku sertlik hastalığı, geliştirme ve yaralanmaya bağlı olarak düzenlemesi nedeniyle Örneğin, hücre fonksiyonu üzerindeki doku elastikliği etkisi mechanobiology araştırmalar için önemli bir alan. Hücreler kaplama kez sertliğini değiştirmeyecektir Statik doku taklit malzeme veya malzemeler, ağırlıklı olarak hücre fonksiyonları üzerine doku sertliğinin etkilerini araştırmak için kullanılır. Statik çalışmalarda toplanan bilgileri değerli iken, bu çalışmalar in vivo hücresel mikroçevresinin dinamik doğasının göstergesi değildir. Daha iyi hücre fonksiyonu üzerinde dinamik sertlik etkilerini gidermek için, bir DNA-çapraz bağlı poliakrilamid hidrojel sistemi (DNA jeller) geliştirdi. Diğer alt-tabakalar, dinamik farklı olarak, DNA, jeller, azaltmak veya uyaran olmadan imal edildikten sonra sertlikteki artış yeteneğine sahiptir. DNA, jeller, DNA crossl oluşmaktadırBir poliakrilamid omurga içine polimerleşir mürekkepler. Ekleme ve tek sarmallı DNA sağlama ile çapraz bağ çıkarma uzamsal, zamansal ve jel elastikiyet döner bir kontrol sağlar. Biz DNA jel elastisite dinamik modülasyonu fibroblast ve nöron davranışı etkilediğini önceki raporlarda göstermiştir. Bu raporda ve video, hazırlık DNA jeller üzerinde DNA jel çapraz mekanizmaları ve adım adım talimatları tanımlayan bir şematik sağlar.

Çalışmalarımızda önce, hücre-ECM etkileşimleri statik uyumlu biyomalzeme veya geri dönüşümsüz ve tek yönlü dinamik yüzeylerde gözlendi. Bu substratlar doğru hücresel mikroçevresinin dinamik doğasını yansıtmıyor. Çalışmalarımız yumuşatılması üzerinde hücre-ECM etkileşimler üzerinde çalışmak ve dinamik biyo materyaller sertleştirmek için bir daha fizyolojik bir model sağlayarak mevcut teknik paradigmaları kaydırır. Daha önce yapılan çalışmalarda, bu jelleri üzerinde çeşitli hücre morfolojileri ve fenotipler inceleyerek hücreleri üzerinde dinamik substratların etkilerini analiz ettik. Bir örnekte, DNA, dinamik jelleri üzerinde fibroblast morfolojisi değerlendirilerek fibroblast alt-tabaka takviye etkileri belirlenmiştir. L929 hücreleri, fare-türevli fıbroblast hücre hattı,% 80 ve% 100 jeller (Şekil 3) 11 ile kaplanmıştır. İki gün sonra kaplama,% 20 ilave L2 çözeltiyle çapraz bağlanmış 100 (% 80 →% 100, merkez panele jelleri sertleştirmek için% 80, jellerin ortamına ilave edildi). % 100 jeller ve% 80 jellerin başka bir set statik (sağ ve sol paneli, sırasıyla) kalması için kontrol ssDNA&#39;yı aldı. Işık mikroskobu görüntüleri iki gün medyaya DNA&#39;nın doğumdan sonra ele geçirildi. Şekil 3&#39;te görüldüğü gibi görüntü bulanıklık, jel yüzeyi düzgünsüzlüğe bağlı olarak, tipik ve kaçınılmazdır. Jel şişme ve daralma, tamponlar ve L2 18,21 eklenmesinden kaynaklanan pürüzler jel katkıda bulunur. Morfoloji ImageJ yazılım (NIH, Bethesda, MD) ile değerlendirildi ve fonksiyonun bir göstergesi olarak görev almıştı. Jelleri sertleştirme (80 →% 100) üzerinde yetiştirilen fibroblastlar boy oranı herhangi bir değişim vardı, ama% 100 jeller 11 büyüdü fibroblastlarının daha geniş bir projeksiyon alanı sergiledi. İlginçtir, statik jeller üzerinde yetiştirilen fibroblast morfolojisi dinamik jeller üzerinde yetiştirilen fibroblast morfolojisi birbirine benzemeyen oldu. % 100 jeller üzerinde yetiştirilen Fibroblast&#39;lar% 80 jeller üzerinde yetiştirilen fibroblastlarının daha küçük projeksiyon alanı ve büyük boy oranını vardı. Bu yenidenneticeleri, fibroblast davranış mikro-dinamik doğasına bağlı olduğunu göstermektedir. Bir başka çalışmada, nöronlar üzerindeki yumuşatıcı alt-tabakanın etkileri, dendrit numarası, dendrit uzunluğu ve akson uzunluğu (Şekil 4) da dahil olmak üzere nöronal 10 fenotipleri analiz ile tespit edilmiştir. Sıçandan türetilmiş omurilik nöronlarıdır% 100 ve% 50 jel üzerinde büyütüldü. Dört gün sonra kaplama,% 50 R2, çapraz bağlı% 50 (100 →% 50, orta panel) için jeller yumuşatmak için% 100 jellerin ortamına ilave edildi. % 50 jeller ve% 100 jellerin başka bir set (sırasıyla, sağ ve sol paneller) statik kalmasını kontrol ssDNA&#39;yı aldı. Üç gün sonra, nöronlar sabitlendi ve dendritik işaretleyici (MAP2, üst paneller), bir akson işaretleyici (Tau, orta paneller) ile boyanmış, ve çekirdekler (DAPI, alt paneller) fenotipleri değerlendirmek. Yumuşatma jeller (% 100 50 →) yetiştirilen nöronlar nöronlar o yetiştirilen daha kısa birincil dendrit birincil dendrit sayı veya akson uzunluğu açısından herhangi bir farklılık vardı, ama sergiledi<html> n, 50% jeller. Fibroblast çalışmalarda olduğu gibi, statik jeller üzerinde sinir fenotipleri dinamik jeller üzerinde sinir fenotiplerine farklı idi. % 50 jeller üzerinde yetiştirilen nöronlar daha az birincil dendrit ve 100% jel üzerinde yetiştirilen nöronlardan daha uzun aksonlar vardı. Sonuç olarak, fibroblast ve nöron görüntüleri birden fazla hücre tipleri, dinamik ve statik DNA jeller okudu edilebileceğini gösteren, DNA jel düzgünsüzlük görüntüleme zorlukları, standart morfolojik ve immün teknikleri mümkün bulunmaktadır neden olur, ve en önemlisi hücrelerin davranışı yüzey dinamiklere bağlıdır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/51323/51323fig3highres.jpg" /> Statik ve dinamik DNA jeller üzerinde yetiştirilen Şekil 3. Fibroblast&#39;lar. L929 fibroblast Temsilcisi ışık mikroskobu görüntüleri% 80 (sol panel), 80 →% 100 (merkez paneli), ve% 100 jeller (sağ panel) üzerinde büyüdü. Ölçek çubuğu 100 mikron. Bu rakam 11 ile modifiye edilmiştir.= &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot; href&gt; Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig4highres.jpg" /> DNA jel üzerinde büyümüş Şekil 4. nöronlar.% 100 (sol paneller) üzerinde büyümüş omurilik nöronları Örnek floresan görsel 100 → 50% (orta panel) ve% 50 (sağ panel) jelleri üzerinde belirlenmiştir. MAP2 İmmünoboyama, Tau-1 İmmünoboyama akson (orta paneller) gösterir dendritler (üst paneller) gösterir ve DAPI boyama çekirdeğini (alt paneller) gösterir. Ölçek çubuğu 100 mikron. Bu rakam, 10 modifiye edilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51323/51323fig4large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels at JoVE.com

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Laboratuvarımız iyi hücre fonksiyonu üzerinde doku sertliği modüle etkilerini anlamak için DNA çapraz bağlı poliakrilamid hidrojeller, dinamik bir hidrojel sistemi geliştirdi. İşte, bu hidrojeller hazırlamak için şemaları, açıklamaları ve protokolleri sağlamak.

DNA çapraz bağlı poliakrilamid hidrojellerinin hazırlanışı

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

preparation-of-dna-crosslinked-polyacrylamide-hydrogels

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Görüntüleme.  JFK Medical Center.  Laboratuvarımız iyi hücre fonksiyonu üzerinde doku sertliği modüle etkilerini anlamak için DNA çapraz bağlı poliakrilamid hidrojeller, dinamik bir hidrojel sistemi geliştirdi. İşte, bu hidrojeller hazırlamak için şemaları, açıklamaları ve protokolleri sağlamak. 

Video: Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

Retina Yatay Dilim Hazırlık

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Biyoloji

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and high quantitation. Furthermore, it is completely compatible with mass spectrometric protein identification. But despite these advantages, CBB is regarded to be less sensitive than silver or fluorescence stainings and therefore rarely used for the detection of proteins in analytical gel-based proteomic approaches.
Several improvements of the original Coomassie protocol1 have been made to increase the sensitivity of CBB. Two major modifications were introduced to enhance the detection of low-abundant proteins by converting the dye molecules into colloidal particles: In 1988, Neuhoff and colleagues applied 20% methanol and higher concentrations of ammonium sulfate into the CBB G-250 based staining solution2, and in 2004 Candiano et al. established Blue Silver using CBB G-250 with phosphoric acid in the presence of ammonium sulfate and methanol3. Nevertheless, all these modifications just allow a detection of approximately 10 ng protein. A widely fameless protocol for colloidal Coomassie staining was published by Kang et al. in 2002 where they modified Neuhoff's colloidal CBB staining protocol regarding the complexing substances. Instead of ammonium sulfate they used aluminum sulfate and methanol was replaced by the less toxic ethanol4. The novel aluminum-based staining in Kang's study showed superior sensitivity that detects as low as 1 ng/band (phosphorylase b) with little sensitivity variation depending on proteins.
Here, we demonstrate application of Kang's protocol for fast and sensitive colloidal Coomassie staining of proteins in analytical purposes. We will illustrate the quick and easy protocol using two-dimensional gels routinely performed in our working group.

This video shall popularize a colloidal Coomassie G-250 staining protocol according to Kang et al. for the detection of average 4 ng protein in gels. The staining is completed within 2 hours and without any effort. We routinely use Kang's protocol for analytical purposes in gel-based proteomics.

Proteinler için Poliakrilamid Jeller Hızlı ve Hassas Kolloidal Coomassie G-250 Boyama

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Denatüre Üre Poliakrilamid Jel Elektroforez (Üre SAYFA)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Doku Mühendisliği 3D Hidrojeller Hücresel Kapsülleme

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

Matrix Rijitlik Akrilamid tabanlı Hidrojeller kullanarak Hücresel Fonksiyon Üzerindeki Etkilerinin incelenmesi

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Hücresel lizatları Multiprotein Kompleksleri Analizi Mavi Native Poliakrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE)

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

Kalite İnositol Pyrophosphates hazırlanması

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

Kondrosit-agaroz Hidrojeller mekanik stimülasyonu

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...