저자는 감사의 말씀을 프랭크 박사 지앙 박사 데이비드 린 박사 버나드 Yurke 박사 우다이 Chippada을 DNA 겔 기술을 개발에 대한 자신의 기여에 대한; 박사 노넬 Hadzimichalis, SMIT 샤 킴벌리 피터 맨, 자신의 의견이 원고의 편집 로버트 Arter; 척수에 뉴저지위원회 연구 (그랜트 # 07A-019-SCR1, NAL)와 뉴저지 신경 과학 연구소 (MLP)을 포함하여 자금 출처; 및 조직 공학 출판사, 부품이 권한은 그림 3을 다시 인쇄 할 수있는 권한에 대한 그림 2와 그림 4와 생체 재료를 다시 인쇄 할 수.

<ol>
	<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+focal+adhesion+assembly+A+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates.">Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).</li><li>Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+equilibrium+swelling+behaviour+of+ph-sensitive+hydrogels+containing+2-hydroxyethyl+methacrylate.">Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate.</a> Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).</li><li>Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+elastomeric+biomaterials+based+on+resilin-like+polypeptides.">Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides.</a> Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).</li><li>Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+behavior+on+shape+memory+polymer+substrates.">Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates.</a> Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repositioning+of+cells+by+mechanotaxis+on+surfaces+with+micropatterned+youngs+modulus.">Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus.</a> J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).</li><li>Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ions+on+the+dynamic+behavior+of+an+electrodriven+ionic+polymer+hydrogel+membrane.">Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane.</a> Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).</li><li>Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+swelling+of+polyacrylate+hydrogels+in+physiological+salt+solutions.">Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).</li><li>Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+outgrowth+on+a+DNA+crosslinked+hydrogel+with+tunable+stiffnesses.">Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses.</a> Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).</li><li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+dynamic+stiffness+of+the+substrates+on+neurite+outgrowth+by+using+a+DNA-crosslinked+hydrogel.">Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).</li><li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+fibroblast+growth+and+the+dynamic+stiffnesses+of+a+DNA+crosslinked+hydrogel.">The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel.</a> Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).</li><li>Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+photodegradable+hydrogels+as+dynamically+tunable+cell+culture+platforms.">Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).</li><li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+a+reversible,+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogel.">Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel.</a> J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).</li><li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+rigid+spherical+inclusions+in+young's+moduli+determination:+Application+to+DNA-crosslinked+gels.">Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels.</a> J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).</li><li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+immobilization+of+biomolecules+to+agarose+hydrogels+for+controlled+cellular+response.">Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response.</a> Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).</li><li>Marklein, R. A., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+controlled+hydrogel+mechanics+to+modulate+stem+cell+interactions.">Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions.</a> Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).</li><li>Pelham Jr, R. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogels+with+increasing+crosslinker+density.">Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density.</a> BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).</li><li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+substrate+stiffness+and+cell+density+on+primary+hippocampal+cultures.">Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures.</a> J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).</li><li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dendrite+arborization+by+substrate+stiffness+is+mediated+by+glutamate+receptors.">Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors.</a> Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).</li><li>Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+morphology+on+dynamic+softening+of+hydrogels.">Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels.</a> Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).</li><li>Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+the+injured+spinal+cord+after+lateral+spinal+hemisection+injury+in+the+rat.">Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat.</a> J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+growth+in+3d+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties.">Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).</li><li>Wozniak, M. A., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+in+development+A+growing+role+for+contractility.">Mechanotransduction in development A growing role for contractility.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).</li><li>Wuerfel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mr-elastography+reveals+degradation+of+tissue+integrity+in+multiple+sclerosis.">Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis.</a> Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).</li><li>Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymerization+in+microfluidic+gradient+generators+Microscale+control+of+substrate+compliance+to+manipulate+cell+response.">Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response.</a> Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

DNA 겔의 능력은 연화 시키거나 세포 접착 그들에게 세포 기능의 동적 강성 조직의 역할을 연구하는 이상적인 모델을 만든다 전후 완고. 세가지 설계는 기계적 및 생물학적 연구에 사용되었다. 그러나, 모든 세 개의 디자인 가교 길이는 DNA 겔 탄성 (표 2)에 영향을주지 않는 나타내는 각종 비율로 가교 유사한 탄력성이있다. 대조적으로, 아크릴 아마이드 농도는 탄성에 영향을 미친다. 이러한 디자인은 겔 붕괴 경향 때문에 가교 반응 속도에 따라 다를 수 있고, 또는 젤의 경향 미디어 또는 버퍼에 용해, 가교 결합의 길이가 증가함에 따라 감소한다. DNA 젤에 그러나 운동 정보는 제한되어 있지만, 우리는 가교의 추가 30 % 이일 50 %의 DNA 젤 11 L2 전달 후 발생 알고있다. 그럼에도 불구하고, 겔 연화 경직에서 팽창과 수축의 힘의 발생을 각각 분리하고 피할 수 없다18,21. 더 많은 에너지가 ssDNA를 18 세 스탠드 사이의 결합을 형성하는 데 필요하기 때문에 50 → 100 % 젤은 스트레스에 대한 0.04 아빠를 생성하는 동안 100 → 70 % 젤은 스트레스 (21)의 약 0.5 파를 생성합니다. 따라서 결과의 해석은 보강 젤의 연화에 의해 생성 된 응력과 변형의 고려가 필요합니다. DNA 젤을 준비 할 때 기술적 인 문제가 발생할 수 있습니다. 가장 흔한 기술적 인 문제는 겔 파열이다. 젤 버스 팅 젤 부종, 스토리지 및 세포 성장을 포함하여 DNA 젤 준비의 여러 단계에서 발생할 수 있습니다. 젤 버스 팅은 여러 요인에 의해 발생합니다. 먼저, 겔 붕괴 부적절한 용액 조성물의 결과 일 수있다. 일반적인 오류는 동결 건조 된 ssDNA의 점성 액체의 부적절한 피펫의 부족 용해를 포함한다. 피펫 오류를 방지하기 위해, 솔루션 쉽게 피펫 겔 점도를 감소 시키거나 필요한 AM 나누어지는 데, 가열 온도를 상승SA1 및 두번째 질소 버블 링 단계에 앞서 SA2 중합 용액 ount. 또한, 중합 용액의 반복 가열 부분적으로 솔루션을 증발 용액 점도를 증가시킬 수있다. TE 완충액 몇 마이크로 리터를 첨가하여 점도를 줄일 수있다. 둘째, 겔 파열 불량 DNA 품질의 결과 일 수있다. QA / QC 보고서는 빈번하게 검토해야합니다. QA / QC 보고서를 허용 아르 겔 붕괴가 계속 발생하면, HPLC 정제 ssDNA를이 DNA의 품질을 향상시킬 수 있습니다. 셋째, 겔 파열이 부족 DNA 어닐링에서 발생할 수 있습니다. 우리는 원래 프로토콜의 어닐링 단계 및 rehybridization 단계를 포함하여 겔 파열의 발생을 감소 (단계 1.3.6 및 2.8를 참조 각각 1.3.8 및 2.10). 젤 붕괴는 시간을 어닐링을 확장 및 냉각에 의해 방지 될 수 있습니다. 겔이 다시 팽창되는 경우에는, 물을 증발시킬 수있는 열에 부가 노출 유리 겔 분리의 증가를 야기한다. 박리 모든 어닐링 시간 동안 과도한 경우 앤일링 단계 (1.3.6 및 2.8)을 제거 할 수 있습니다. 자주 발생하는 또 다른 기술적 과제는 세포 접착이 불충분하다. 부어 젤 어렵다 (표 2) 18를 만드는 세포 접착 팽윤 젤보다 부드럽고입니다. 각각의 세포 유형은 조직 경화에 다르게 반응 이후 다른 세포 유형이 없지만 더욱이, 일부 세포 유형은이 기술 딜레마가 발생할 수있다. 후속 단계의 일부 고려되어야 접착 문제를 해결하는 방법 : (1), (3) 강성 파라미터를 변조, (2) 술포 SANPAH을 위해 공액 ECM 단백질을 번갈아, 높은 도금 밀도를 사용하여 (4) ECM 단백질을 늘리거나 술포 SANPAH 농도, 및 (5) 배양 시간을 증가시킨다. 아크릴 아미드 단량체, APS와 TEMED 등의 잔류 독성 에이전트는 젤에 접착력과 세포 사멸의 부족에 기여할 수있다. 프로토콜에 통합 광범위한 세척이 충분히 입증했기 때문에 우리는이 문제를 경험하지 않은,하지만 우리가 반환 한 추천이 문제가 발생하는 경우 3.2 선택적 단계를 orming. DNA 겔은보다 효과적으로 동적 또는 정적 조건 하에서 세포의 다양한 기능을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 우리는 DNA 젤 섬유 아세포 성장과 뉴런 겔 탄성 변조에 의해 영향을받는 것으로 나타났다. 세포 - 기질 상호 작용은 일반적으로 3 차원 인터페이스 입체 동적 매트릭스 연구 내용이므로 자세한 생물학적 관련 데이터를 생성하기 위하여 도움이 될 것이다. 따라서, 우리는 현재 삼차원 지지체에이 기술을 번역한다. 우리는 DNA 가교 기술을 유지하면서,보다 생체 적합성 물질로 폴리 아크릴 아미드 백본을 대체하는 기술을 개발하고있다. 이 새로운 비계 입체, 동력학 모델과 조직 공학적 지지체의 역할을 할 것이다. 그것의 생체 적합성은 의료 기기 응용을위한 기회를 엽니 다.

정적 및 동적 기질은 세포의 기능에 조직 탄성 또는 강성의 영향을 연구하기 위해 개발 된 생체 물질의 두 가지 범주이다. 정적 기판은 세포가 도금 및 / 또는 일단 제작 된 후 물리적 속성을 변경할 수 없습니다. 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔은 제어 공학 조사 5,17 위해 합성했다 제 이차원 정적 기판이었다. PA 젤은 다용도, 저렴, 쉽게 준비하고, 탄성 계수의 넓은 범위로 제조 될 수있다. 이 기술의 장점은 PA가 일반적으로 적용 기판 젤하게하지만, 정적 기판은 생체 내에서 세포 외 기질 (ECM) 및 주변 세포 환경의 동적 특성을 나타내는 것은 아닙니다. 예를 들면, ECM은 상해, 현상, 또는 질병의 결과로서 강성 변화를 겪는다. 동적 기판 따라서 제어 공학 연구에서 조직을 흉내 낸 기판 모델로 선호 <sup&gt; 22,24,25. 수많은 합성은 자연적인, 이차원, 삼차원, 정적 및 동적 생체 재료는 티슈 1,3,6,16,23,26 강성을 모방하기 위해 개발되어왔다. 몇몇 기판들은 동적 기계적 특성을 변경 2,4,7,8,12,15,16 열, UV, 전류, 이온, 및 pH 변화를 필요로하지만, 이들 자극은 하이드로 겔의 생체 응용을 제한 할 수있다. DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔 (DNA 젤)은 동적 이차원 탄성 기판이다. DNA의 가교는 미디어에 단일 가닥 DNA (ssDNA를)의 첨가에 의한 DNA 젤 강성, 시간, 공간, 가역적 변조 허용하거나 9-11,13,14,18,21 버퍼. 자극이 탄성 변조 적용되는 상기 동적 젤과는 달리, DNA 젤은 탄성의 변화에​​ 대한 적용 ssDNA의의 확산에 의존하고 있습니다. 따라서 세포가 성장 상부 겔 표면은, 속도 오 때문에 변조 된 첫 번째 영역은F 탄성 변조 겔 두께에 의존한다. DNA 젤 그러나 비스 아크릴 아미드 가교는 DNA (그림 1)으로 구성 가교로 대체됩니다, 그들은 폴리 아크릴 아미드 백본을 가지고 그 자신의 PA 젤 대응과 유사하다. 두 ssDNAs (SA1 및 SA2)가 겔의 가교 결합 된 DNA를 만드는 가교제 스트랜드 (L2)와 함께 혼성화. SA1과 SA2는 모두 PA 네트워크에 효과적으로 통합하기위한 5 &#39;끝에 Acrydite 수정을 포함하는 별개의 시퀀스를 가지고있다. 젤, SA1과 SA2의 준비를위한 개별적으로 PA 백본으로 중합하고, 그 후, 중합 SA1과 SA2 함께 혼합된다. L2, 가교제는, SA1 및 SA2 혼합물에 첨가된다. L2의 염기 서열을 모두 SA1과 SA2에 상보적인 서열이며, L2는 DNA의 가교 결합을 형성하기 위해 플러스 SA1 SA2와 혼성화. 초기, DNA 젤 탄력성 L2 농도 및 가교 (표 1 모두에 의해 결정된다 </strong&gt; 및 2). SA1과 SA2가 (100 % 젤로 지정) L2에 의해 백퍼센트 가교 때문에 L2, SA1, SA2와 동등한 화학 양 론적 양을 포함하는 DNA 젤은 뻣뻣한 젤입니다. 따라서 낮은 DNA 가교의 비율과, L2에서 결과의 낮은 농도, 부드러운 DNA 젤. (50 % 젤로 지정) 50 % 가교 낮은 젤은 9-11를 구성하고있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig1highres.jpg" /> 도 1 DNA 겔 가교 uncrosslinking 개략적 9-11,13,14,18,21 1 단계 :. SA1 (적색)과 SA2 (청색)은 개별적으로 폴리 아크릴 아미드 백본 (흑)로 중합된다. 중합 후, SA1과 SA2 중합 솔루션은 함께 혼합. 단계 2 : L2 (녹색)을 첨가하고, 겔의 가교 결합을 형성하기 위해 플러스 SA1 SA2와 혼성화된다. 3 단계 : R2는 t으로 하이브 리다그는 L2의 발붙일. 4 단계 : R2의 발붙일 하이브리드는 SA1과 SA2에서 L2의 압축 풀기를 추진한다. PA 젤과는 달리, DNA 젤은 완고하고 합성 한 후 부드럽게. 이러한 이유로, DNA 겔상에서 성장한 세포를 동적 강성도 변화를 실시 할 수있다. 세포 접착 성 겔 완고, L2는 가교 결합의 비율을 증가시키기 위해 낮은 퍼센트 겔 배양 배지에 첨가 될 수있다. 세포 접착 성 젤을 부드럽게하기 위해, L2는 가교 10,13,21의 비율을 감소 제거 할 수 있습니다. L2는 L2가 SA1과 SA2 (표 1)에서 uncrosslink 할 수 있도록 3 &#39;끝에 추가 발붙일 순서가 있습니다. L2를 제거하여 R2라고 반전 가닥의 혼성화에 의해 달성된다. R2는 L2의 전체 길이에 상보과 L2의 발붙일와 제 혼성화. 발붙일 하이브리드는 가교을 제거하고 겔 강성을 감소 SA1과 SA2에서 L2의 압축 풀기를 추진한다. 이 보고서에서와지시 보강 및 DNA 젤 연화의 제조에 제공되는 단계별 비디오. 100 % 및 80 % 겔 제제가 기재되어 있지만,이 프로토콜은 다른 초기 및 최종 가교 백분율 DNA 겔을 만들 맞추어 질 수있다. 일반적으로, 100 % 및 80 % 겔은, 제조되는 유리 커버 슬립 상에 고정화 된, 작용 및 세포 시드. L2는 80 %의 겔 매체에 첨가하고 R2가 100 % 겔, 도금 후 48 시간의 매체에 첨가된다. 미디어 R2의 첨가는 가교 결합 된 80 % 100 % 겔을 부드럽게하는 반면 매체 L2의 첨가는 가교 결합 된 100 % ~ 80 % 겔을 경화된다. 보강 된 겔은 80 → 100 % 젤로 지정되어 연화 겔은 텍스트의 80 → 100 % 젤 지정되어 있습니다. 제어 또는 정적 젤, ssDNA를 들어 TS 구성된 또는 100 %와 80 %의 젤의 또 다른 세트에 전달된다. 탄성 변조 다음 두 최소 일 후, 세포를 처리 및 분석 할 수있다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:kEEP-together.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> DNA의 가교 </td><td rowspan="2"> 기지 # </td><td> 시퀀스 (발붙일) </td><td rowspan="2"> 수정 </td><td rowspan="2"> 녹는 온도 (T m의 ° C) </td><td rowspan="2"> 댓글 </td></tr><tr><td> 5 &#39;→ 3&#39; </td></tr><tr><td rowspan="4"> 디자인 한 </td><td> SA1 </td><td> 10 </td><td> GCA CCT TTG C </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 34.9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 10 </td><td> GTC AGA ATG </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 23.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 30 </td><td> TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG </td><td></td><td> 56 </td><td>10 염기쌍으로 발 시퀀스가​​ 포함되어 있습니다. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 30 </td><td> CAA GTG의 TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA </td><td></td><td></td><td> R2는 L2에 상보 </td></tr><tr><td rowspan="4"> 디자인이 </td><td> SA1 </td><td> 14 </td><td> CGT GGC ATA GGA CT </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 46.​​9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 14 </td><td> GTT TCC CAA TCA GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 40.2 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCT GAT TGG GAA AC GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C </td><td></td><td> 65.9 </td><td> 12 bp의 순서 발붙일 곳이 포함되어 있습니다. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 40 </td><td> GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG </td><td></td><td> 65.9 </td><td> R2는 L2에 상보 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 사이트 디자인N 세 </td><td> SA1 </td><td> 20 </td><td> ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 55 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 20 </td><td> CAT GCT의 TAG GGA CGA CTG GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 56.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T </td><td></td><td> 68.8 </td><td> 발붙일는 포함되어 있지 않습니다. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 제어 </td><td rowspan="2"> 제어 </td><td rowspan="2"> 20 ~ 40 </td><td> AAA AAA (등) 또는 </td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> TTT TTT (등) </td></tr></tbody></table> 셀룰러 및 기계 연구 라 여러 가지 사용했다. ssDNA를 9-11,13,14,18,21 표 1 염기 서열ifferent 가교 디자인은 정적 및 동적 기계적 특성의 범위 DNA 젤을 생성합니다. 가교 디자인 변조 파라미터는 기본 시퀀스와 시퀀스 길이 또는 가교 길이이다. 굵게 및 기울임 꼴 글꼴은 SA1과 L2 사이에 각각 SA2와 L2 사이의 염기쌍을 보여줍니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="8"> 디자인 </td></tr><tr><td colspan="3"> 1 </td><td colspan="3"> 이 </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td> 아크릴 아미드 농도 (%) </td><td colspan="3"> 10 </td><td colspan="3"> 10 </td><td> 10 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SA1 플러스 L2에 하이브리드 SA2 (% 가교) </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> &lt;강한&gt; 탄성 (kPa의, ± SEM을 의미) </td><td> 6.6 ± 0.6 </td><td> 17.1 ± 0.8 </td><td> 29.8 ± 2.5 </td><td> 5.85 ± 0.62 </td><td> 12.67 ± 1.33 </td><td> 22.88 ± 2.77 </td><td> 25.2 ± 0.5 </td><td> 10.4 ± 0.6 </td></tr></tbody></table> 표 2 DNA 젤 9-11,13,14,18,21. 아크릴 아마이드 농도 비율 가교 결합 및 가교 길이의 영률 (E)의 DNA 젤에서 변조 될 수있다. 디자인 1, 2, 3은 각각 20, 28, 및 40 bp의 길이가 가교. 모든 설계를위한 100 % 젤은 젤 탄력에 영향을주지 않습니다 가교 길이를 나타내는 유사한 계수가있다. 하지만, 아크릴 아마이드 농도 변화는 DNA 겔 탄성을 변경.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ssDNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com</td>
			<td></td>
			<td>Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Tris-EDTA buffer (TE buffer)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>93290</td>
			<td>TBE is a reproductive toxin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td>
			<td>BP14021</td>
			<td>Acrylamide is a toxin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">12-mm diameter round coverglass</td>
			<td rowspan="2">Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com</td>
			<td rowspan="2">12-545-82</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland optical adhesive 72</td>
			<td>Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com</td>
			<td>NOA72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">24-well tissue culture plate</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microcentrifuge tubes</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com or thermofisher.com</td>
			<td>C111 or 22589</td>
			<td>Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37&#176;C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>P6407</td>
			<td>Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com</td>
			<td>13813</td>
			<td>Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 X 60 cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive-displacement pipette</td>
			<td>Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com</td>
			<td>F148504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td>
			<td>11-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/</td>
			<td>NI 5.0UH-R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of dna-crosslinked polyacrylamide hydrogels

제어 공학은 세포 형태와 기능을 연출 물리적 신호의 중요한 역할을 해결하는 새로운 과학 분야이다. 조직 경화 질병, 개발 및 부상으로 변조하기 때문에 예를 들어, 세포 기능에 조직 탄성 효과는 제어 공학 연구의 중요한 영역이다. 세포가 일단 도금 강성을 변경할 수없는 고정 조직 모방 재료, 또는 재료는 주로 세포의 기능에 대한 조직의 강성의 영향을 조사하기 위해 사용된다. 정적 스터디에서 수집 된 정보는 가치가 있지만, 이러한 연구는 생체 내에서 세포 미세 환경의 동적 특성을 나타내는 것은 아닙니다. 더 세포 기능에 동적 강성의 영향을 해결하기 위해, 우리는 DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔 시스템 (DNA 젤)을 개발 하였다. 다른 동적 기판과 달리, DNA 겔이 감소 또는 자극없이 제조 후 강성도를 증가시키는 능력을 가지고있다. DNA 젤은 DNA의 crossl 구성폴리 아크릴 아미드 백본으로 중합 잉크. 추가 및 단일 가닥 DNA의 전달을 통해 가교를 제거하는 것은 시간, 공간, 겔 탄성 가역 제어 할 수 있습니다. 우리는 DNA 젤 탄성 동적 변조 섬유 아세포와 신경 세포의 행동에 영향을 미치는 것을 이전 보고서에 표시했다. 이 보고서와 비디오에서 우리는 준비 DNA 젤에서 DNA 겔 가교 메커니즘과 단계별 지침을 설명하는 회로도를 제공한다.

우리의 연구에 앞서, 세포 ECM 상호 호환 생체 물질은 정적 또는 동적 비가역 단방향 기판 상에 관찰되었다. 이 기판은 정확하게 세포 미세 환경의 동적 특성을 반영하지 않습니다. 우리의 작업은 연화에 세포 ECM 상호 작용을 공부하고 동적 생체 재료를 보강하기위한 더 많은 생리 학적 모델을 제공함으로써 기존의 기술 패러다임을 이동합니다. 이전 연구에서, 우리는 이러한 젤에 다양한 세포 모폴로지 및 표현형을 조사하여 세포에 동적 기판의 효과를 분석 하였다. 일 예시에서는, 동적 DNA 젤에 섬유 모세포 형태를 평가함으로써, 섬유 아세포에 기판의 보강 효과를 판정. L929 세포, 마우스 유래의 섬유 아세포 세포주는 80 %와 100 %의 겔 (도 3) (11) 상에 도금 하였다. 이틀 후 도금, 20 % 추가 L2 액 가교 100 % (80 → 100 %, 센터 패널 젤 완고 80 % 겔에 첨가 하였다 매체). 백퍼센트 젤 80 % 젤의 또 다른 정적 (오른쪽과 왼쪽 패널 각각을) 유지 관리 ssDNA를 받았다. 광학 현미경 이미지는 이일 미디어에 DNA 전달 후 촬영 하였다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 이미지 얼룩 불량, 겔 표면 요철에 의한이고 전형적인 불가피하다. 젤 팽창과 수축은 버퍼와 L2 18,21의 추가로 인한 요철 겔에 기여한다. 형태는 ImageJ에 소프트웨어 (NIH, 베데스다, MD)로 평가 기능의 지표로 봉사했다. 겔을 보강 (80 → 100 %), 섬유 아세포 성장 비율에는 변화가 없었다하지만 100 % 겔 (11) 상에 성장 된 섬유 아세포보다 큰 투영 영역을 나타내었다. 흥미롭게도, 정적 젤에서 재배 섬유 아 세포의 형태는 동적 젤에서 재배 섬유 아세포의 형태로 비슷했다. 100 % 젤 섬유 아세포 성장은 80 % 겔에 섬유 아세포 성장보다 작은 투영 면적보다 큰 종횡비를 가지고 있었다. 이러한 재sults은 섬유 아세포의 동작은 미세 환경의 동적 특성에 종속되어 있음을 나타냅니다. 또 다른 연구에서, 뉴런에 기재의 연화 효과 수지상 번호, 덴 드라이트 길이, 축삭 길이 (도 4)을 포함한 10 신경원 표현형 분석에 의해 결정 하였다. 쥐 유래 척수 신경 세포는 100 %와 50 % 젤에서 재배되었다. 네 일 도금 한 후, 50 % R2는 가교 50 % (100 → 50 %, 센터 패널)에 젤을 부드럽게 백퍼센트 젤의 미디어에 추가되었습니다. 50 %의 젤 백퍼센트 젤의 또 다른 세트 (각각 오른쪽과 왼쪽 패널) 정적을 유지하기 위해 제어 ssDNA를 받았다. 삼일 후, 신경 세포는 수정 된 수지상 마커 (MAP2, 상단 패널), 축삭 마커 (타우, 중간 패널)과 면역 염색 및 핵 (DAPI, 하단 패널) 표현형을 평가. 연화 젤 (100 % → 50)에 성장 뉴런은 신경 세포가 O를 성장보다 짧은 주 수상 돌기를 주 수상 돌기 번호 또는 축삭의 길이 차이가 없었다, 그러나 전시<html> n은 50 % 겔. 섬유 아세포의 연구에서와 같이 정적 젤에 신경 표현형 동적 젤에 신경 표현형 다르지이었다. 50 % 젤에 성장 뉴런은 적은 차 수상 돌기 100 % 젤에 성장 뉴런보다 긴 축색 돌기를 가지고 있었다. 결론적으로, 섬유 아세포 및 신경 영상 여러 세포 유형은 동적 및 정적 DNA 젤에서 연구 될 수 있다는 입증은 DNA 겔 불균일 촬상 도전 표준 형태 학적 및 면역 염색 기술이 가능하다 발생, 그리고 가장 중요한 세포의 동작은, 기판 역학에 의존한다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig3highres.jpg" /> 정적 및 동적 DNA 젤에 성장 그림 3 섬유 아세포. L929 섬유 아세포의 대표적인 광학 현미경 이미지는 80 % (왼쪽 패널), 80 → 100 % (중앙 패널), 100 % 젤 (오른쪽 패널)에 성장합니다. 스케일 바는 100 μm의입니다. 이 그림은 11에서 수정되었습니다.= &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;href를&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig4highres.jpg" /> DNA 젤에 성장 그림 4 뉴런. 백퍼센트 (왼쪽 패널)에 성장 척수 신경의 대표적인 형광 이미지 (100) → 50 % (중앙 패널), 50 % (오른쪽 패널) 젤. MAP2 면역 염색은 타우-1 면역 염색은 축삭 (중간 패널)을 나타냅니다 수상 돌기 (상단 패널)을 표시하고, DAPI 염색 핵 (아래 패널)을 나타냅니다. 스케일 바는 100 μm의입니다. 이 수치가 10에서 수정되었습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51323/51323fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels at JoVE.com

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

본 연구실은 더 세포 기능에 티슈 강성 변조의 효과를 이해하는 DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔, 하이드로 겔 동적 시스템을 개발했다. 여기서, 우리는 이러한 하이드로 겔을 제조하기위한 회로도, 설명, 및 프로토콜을 제공한다.

DNA-가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔의 제조

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

preparation-of-dna-crosslinked-polyacrylamide-hydrogels

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K 조회수.  JFK Medical Center.  본 연구실은 더 세포 기능에 티슈 강성 변조의 효과를 이해하는 DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔, 하이드로 겔 동적 시스템을 개발했다. 여기서, 우리는 이러한 하이드로 겔을 제조하기위한 회로도, 설명, 및 프로토콜을 제공한다. 

비디오: Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

망막의 수평 슬라이스 준비

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

연구

생물학

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Dissociated 마우스 두피 신경 세포 배양의 준비

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and high quantitation. Furthermore, it is completely compatible with mass spectrometric protein identification. But despite these advantages, CBB is regarded to be less sensitive than silver or fluorescence stainings and therefore rarely used for the detection of proteins in analytical gel-based proteomic approaches.
Several improvements of the original Coomassie protocol1 have been made to increase the sensitivity of CBB. Two major modifications were introduced to enhance the detection of low-abundant proteins by converting the dye molecules into colloidal particles: In 1988, Neuhoff and colleagues applied 20% methanol and higher concentrations of ammonium sulfate into the CBB G-250 based staining solution2, and in 2004 Candiano et al. established Blue Silver using CBB G-250 with phosphoric acid in the presence of ammonium sulfate and methanol3. Nevertheless, all these modifications just allow a detection of approximately 10 ng protein. A widely fameless protocol for colloidal Coomassie staining was published by Kang et al. in 2002 where they modified Neuhoff's colloidal CBB staining protocol regarding the complexing substances. Instead of ammonium sulfate they used aluminum sulfate and methanol was replaced by the less toxic ethanol4. The novel aluminum-based staining in Kang's study showed superior sensitivity that detects as low as 1 ng/band (phosphorylase b) with little sensitivity variation depending on proteins.
Here, we demonstrate application of Kang's protocol for fast and sensitive colloidal Coomassie staining of proteins in analytical purposes. We will illustrate the quick and easy protocol using two-dimensional gels routinely performed in our working group.

This video shall popularize a colloidal Coomassie G-250 staining protocol according to Kang et al. for the detection of average 4 ng protein in gels. The staining is completed within 2 hours and without any effort. We routinely use Kang's protocol for analytical purposes in gel-based proteomics.

Polyacrylamide의 젤의 단백질에 대한 신속하고 민감한 콜로이드 쿠매시 G - 250 스테 이닝

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Denaturing 요소의 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (우레아 페이지)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

셀룰러 Lysates에서 Multiprotein의 단지의 분석을 위해 블루 기본 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (BN - PAGE)

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

품질 이노시톨 Pyrophosphates의 준비

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

Chondrocyte - 아가로 오스 Hydrogels의 기계적 자극

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...