Die Autoren danken: Dr. Frank Jiang, Dr. David Lin, Dr. Bernard Yurke und Dr. Uday Chippada für ihre Beiträge zur Entwicklung der DNA-Gel-Technologie; Dr. Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter für ihre Kommentare und Bearbeitungen dieser Handschrift; Finanzierungsquellen, einschließlich der New Jersey Kommission auf Rückenmarksforschung (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) und New Jersey Neuroscience Institute (MLP); und Herausgeber von Tissue Engineering, Teil A, für die Erlaubnis, 2 und 4 und Biomaterialien für die Erlaubnis, Abbildung 3 Reprint.

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	<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+focal+adhesion+assembly+A+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates.">Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).</li><li>Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+equilibrium+swelling+behaviour+of+ph-sensitive+hydrogels+containing+2-hydroxyethyl+methacrylate.">Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate.</a> Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).</li><li>Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. 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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Fähigkeit von DNA-Gelen zu erweichen oder zu versteifen, bevor und nachdem die Zelladhäsion macht sie zu einem idealen Modell, um die Rolle von Gewebesteifigkeit dynamisch auf die Zellfunktion untersucht werden. Alle drei Ausführungen sind in mechanischen und biologischen Untersuchungen verwendet. Allerdings haben alle drei Ausführungen ähnlich Elastizitäten bei verschiedenen Vernetzungsprozent anzeigt Vernetzungslänge nicht beeinflusst DNA Gel-Elastizität (Tabelle 2). Im Gegensatz dazu betrifft Acrylamidkonzentration Elastizität. Diese Muster können in Vernetzungskinetik seit Gel Platzen Tendenzen unterscheiden, oder die Tendenz der Gele in den Medien oder Puffer lösen, nimmt mit zunehmender Vernetzung der Länge. Allerdings kinetische Informationen über DNA-Gelen ist begrenzt, aber wir wissen, eine zusätzliche 30% der Vernetzung erfolgt zwei Tage nach Lieferung L2 zu 50% DNA-Gelen 11. Dennoch ist die Erzeugung der expansiven und Kontraktionskräfte von Gel Erweichung und Versteifung bzw. unvermeidbar und können nicht entkoppelt werden18,21. 100 → 70% Gele erzeugen etwa 0,5 Pa Stress 21, während 50 → 100% Gele erzeugen nur etwa 0,04 Pa von Stress, da mehr Energie wird benötigt, um Anleihen zu den drei Ständen der ssDNA 18 zu bilden. Daher ist die Interpretation der Ergebnisse erfordert die Berücksichtigung von Stress und Belastung durch die Versteifung und Erweichung der Gele erzeugt. Technische Herausforderungen bei der Vorbereitung DNA-Gelen entstehen. Die häufigste technische Problem ist Gel Platzen. Gel Bersten kann während mehrerer Stufen der DNA-Zubereitung, einschließlich Quellen des Gels, der Lagerung, und das Zellwachstum auf. Gel Zerplatzen wird durch mehrere Faktoren verursacht werden. Erstens kann ein Gel Platzen unsachgemäße Lösung Zusammensetzung sein. Häufige Fehler sind unzureichende Auflösung des gefriergetrockneten ssDNA und unsachgemäße Pipettieren von viskosen Flüssigkeiten. Pipettieren Fehler zu vermeiden, erhöhen die Heiztemperatur auf Gel-Viskosität für einfacher Pipettieren von Lösungen reduzieren oder aliquotiert die gewünschte Uhrount von SA1 und SA2 polymerisierte Lösung vor dem zweiten Schritt Einleiten von Stickstoff. Auch kann wiederholtes Erhitzen der polymerisierten Lösungen teilweise verdampfen die Lösung und erhöhen Lösungsviskosität. Zugabe von ein paar Mikroliter TE-Puffer kann dazu beitragen, die Viskosität zu verringern. Zweitens kann Gel Platzen eine Folge von schlechter DNA-Qualität sein. QA / QC-Berichte müssen häufig überprüft werden. Wenn QA / QC-Berichte sind akzeptabel und Gel Platzen immer noch auftritt, kann HPLC ssDNA DNA-Qualität zu verbessern. Drittens kann Gel Platzen unzureichende DNA Glühen führen. Wir haben das Auftreten von Gel Platzen, indem Glühschritte und Umhybridisierung Schritte in der Original-Protokoll reduziert werden (siehe Schritte 1.3.6 und 2.8; 1.3.8 und 2.10, beziehungsweise). Gel Platzen könnte durch Verlängerung Glühen und Kühlzeiten verhindert werden. Jedoch zusätzliche Wärmeeinwirkung kann das Wasser verdampfen, um eine Erhöhung der Gel Loslösung von Glas verursachen, wenn Gele werden erneut angeschwollen. Wenn Ablösung ist übertrieben für jede Glühdauer, die annEaling Schritte beseitigt (1.3.6 und 2.8) werden. Eine weitere häufige technische Problem aufgetreten ist unzureichend Zelladhäsion. Die gequollenen Gele sind weicher als die nicht aufgequollenen Gelen (Tabelle 2) 18 Herstellung Zelladhäsion schwierig. Da jeder Zelltyp reagiert anders auf Gewebesteifigkeit, einige Zelltypen kann diese technische Dilemma erleben, während andere Zelltypen nicht. Um die Haftung Fragen einige der Folgeschritte berücksichtigt werden lösen: (1) mit einem hohen Beschichtungs-Dichte, (2) abwechseln, die ECM-Proteine ​​konjugiert Sulfo-SANPAH, (3) modulieren die Steifigkeitsparameter, (4) zu erhöhen ECM-Protein oder Sulfo-SANPAH Konzentration, und (5) zu erhöhen Inkubationszeiten. Rest toxische Mittel, wie Acrylamid-Monomer, APS und TEMED könnte auch zu mangelnder Haftung und Zelltod auf Gelen beitragen. Wir haben dieses Problem nicht, da umfangreiche Erfahrung in den Waschanlagen-Protokoll integriert haben sich als ausreichend erwiesen, aber wir empfehlen performing Optionaler Schritt 3.2, wenn dieses Problem auftritt. DNA Gele können verwendet werden, um eine Vielzahl von Zellfunktionen unter dynamischen oder statischen Bedingungen besser zu studieren. Wir haben gezeigt, dass Fibroblasten und Neuronen auf DNA-Gelen gezüchtet durch die Modulation des Gels Elastizität beeinflusst werden. Seit Zell-Matrix-Interaktionen sind in der Regel drei-dimensionalen Schnittstellen, Informationen aus dreidimensionalen dynamischen Matrix Studien werden dazu beitragen, relevante Daten mehr biologisch zu produzieren. Daher sind wir derzeit übersetzen diese Technologie in einem dreidimensionalen Gerüst. Wir entwickeln eine Technik, die die Backbone-Polyacrylamid mit einem biokompatiblen Material ersetzt, während die DNA-Vernetzungstechnologie. Dieses neue Gerüst wird als dreidimensionale, dynamische Modell und einem Gewebe-Engineering-Gerüst zu dienen. Seine Biokompatibilität werden Möglichkeiten für die medizinische Geräteanwendungen öffnen.

Statische und dynamische Substrate gibt zwei Kategorien von Biomaterialien, die entwickelt wurden, um die Wirkungen einer Gewebe Elastizität oder Steifigkeit auf die Zellfunktion untersucht werden. Statische Substrate sind nicht in der Lage, ihre physikalischen Eigenschaften ändern, nachdem sie hergestellt sind, und / oder einmal Zellen plattiert. Polyacrylamid (PA)-Gelen wurden die ersten zweidimensionalen statischen Substraten für Untersuchungen Mechanobiologie 5,17 synthetisiert. PA Gele sind leicht herzustellen, preiswert, flexibel und kann mit einer Vielzahl von elastischen Moduli hergestellt werden. Obwohl diese technischen Vorteile machen PA-Gele häufig angewendet Substrat, sind statische Substrate kein Hinweis auf die Dynamik der extrazellulären Matrix (ECM) und die umliegenden Zellumgebung in vivo. Zum Beispiel kann die ECM-Steifigkeit erfährt Änderungen als Folge von Verletzungen, die Entwicklung oder Krankheit. Dynamische Substrate werden daher als gehirnähnlichen Substrat Modelle in Mechanobiologie Studien begünstigt <sup&gt; 22,24,25. Zahlreiche synthetische, natürliche, zweidimensionalen, dreidimensionalen, statischen und dynamischen Biomaterialien wurden entwickelt, um Gewebesteifigkeit 1,3,6,16,23,26 imitieren. Einige dynamische Substrate benötigen Wärme, UV, elektrischen Strom, Ionen und pH-Änderungen, um ihre mechanischen Eigenschaften zu verändern 2,4,7,8,12,15,16, aber diese Reize Bio-Anwendung des Hydrogels zu beschränken. DNA-Polyacrylamid vernetzt Hydrogele (DNA Gele) sind dynamisch zweidimensionalen elastischen Substraten. DNA-Vernetzungen ermöglichen zeitlichen, räumlichen und reversible Modulation der DNA-Gel-Steifigkeit durch die Zugabe von Einzelstrang-DNA (ssDNA), um Medien oder Puffer 9-11,13,14,18,21. Im Gegensatz zu den oben erwähnten dynamischen Gele wo Stimuli zur Modulation der Elastizität aufgebracht, stützen sich die DNA Gele auf der Diffusion von Applied ssDNA zur Veränderung der Elastizität. Deshalb ist die obere Geloberfläche, wo Zellen gezüchtet werden, ist der erste Bereich moduliert, da die Geschwindigkeit of Elastizität Modulation hängt von der Gel-Dicke. DNA-Gele sind ähnlich wie ihre Gegenstücke in PA-Gel, dass sie eine Polyacrylamid-Rückgrat haben jedoch die Bis-Acrylamid Vernetzungen mit Vernetzungen von DNA (Figur 1) zusammengesetzt ersetzt. Zwei ssDNAs (SA1 und SA2) hybridisieren mit einem Vernetzer Strang (L2) bilden die DNA-Quervernetzungen des Gels. SA1 und SA2 haben verschiedene Sequenzen, die sowohl eine ACRYDIT Modifikation am 5&#39;Ende für eine effektive Einbindung in die PA-Netzwerk enthalten. Zur Herstellung des Gels, SA1 und SA2 werden einzeln in einem PA Gerüst polymerisiert und anschließend die polymerisierten SA1 und SA2 werden miteinander vermischt. L2, das Vernetzungsmittel wird zu der SA1 und SA2 Mischung zugegeben. Der L2-Basensequenz komplementär zu beiden SA1 und SA2 und L2 Sequenzen hybridisiert SA1 und SA2, um die DNA-Vernetzungen zu bilden. Initial, DNA-Gel Elastizität wird von beiden L2-Konzentrationen und Vernetzung (Tabellen 1 bestimmt </strong&gt; und 2). DNA-Gelen, die gleiche stöchiometrische Mengen L2, SA1, SA2 und sind die härtesten Gele, weil SA1 und SA2 sind 100% vernetzt durch L2 (als 100% Gele bezeichnet). Niedrigere Konzentrationen von L2 zu einem niedrigeren Prozentsatz an DNA-Vernetzung und damit weicher DNA Gele. Gele so niedrig wie 50% vernetzt (zu 50% Gele bezeichnet) wurden konstruiert, 9-11. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. DNA-Gel Vernetzung und uncrosslinking schematische 9-11,13,14,18,21. Schritt 1: SA1 (rot) und SA2 (blau) werden einzeln in einem Polyacrylamid-Rückgrat (schwarz) polymerisiert. Nach der Polymerisation werden SA1 und SA2 polymerisiert Lösungen miteinander vermischt. Schritt 2: L2 (grün) zu und hybridisiert mit SA1 und SA2, die Vernetzungen des Gels. Schritt 3: R2 hybridisiert mit ter Ansatzpunkt von L2. Schritt 4: Brückenkopf-Hybridisierung von R2 treibt das Entpacken von L2 von SA1 und SA2. Im Gegensatz zu PA-Gele können DNA-Gele zu versteifen und zu erweichen nach der Synthese. Aus diesem Grund können die Zellen auf DNA-Gelen gezüchtet, um dynamische Steifigkeit Änderungen unterzogen werden. Zellhaftenden Gelen erstarren kann L2 zu den Kulturmedien von geringen Prozentsatz Gels zugegeben werden, um den Prozentsatz von Vernetzungen zu erhöhen. Erweichen zellhaft Gele können L2 entfernt werden, um den Prozentsatz von Vernetzungen 10,13,21 verringern. L2 hat einen zusätzlichen Brückenkopf-Sequenz am 3&#39;Ende zu ermöglichen L2 von SA1 und SA2 (Tabelle 1) uncrosslink. Entfernung von L2 durch Hybridisierung einer Umkehrstrang genannt R2 erreicht. R2 ist komplementär zu der vollen Länge von L2 und hybridisiert mit dem ersten Ansatzpunkt L2. Brückenkopf-Hybridisierung treibt das Entpacken von L2 von SA1 und SA2, die die Vernetzungs beseitigt und reduziert das Gel Steifigkeit. In diesem Bericht undVideo, Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Herstellung von Versteifungs und Erweichung DNA-Gelen zur Verfügung gestellt. Während 100% und 80% Gel Präparate beschrieben, kann dieses Protokoll zugeschnitten werden, um DNA-Gelen anderer anfänglichen und endgültigen vernetzten Prozentsätze zu erstellen. Im allgemeinen sind 100% und 80% Gele hergestellt, auf Glas-Deckgläschen immobilisiert, funktionalisiert und mit Zellen besät. L2 ist mit den Medien 80% Gele gegeben und R2 ist mit dem Medium 100% Gelen, 48 h nach dem Plattieren zugegeben. Die Zugabe von L2 Medien versteift 80% bis 100% Gelen vernetzt, während die Zugabe von R2 Medien erweicht 100% Gele zu 80% vernetzt ist. Versteift Gele sind als 80 → 100% Gele bezeichnet und aufgeweicht Gele als 100 → 80% Gele im Text bezeichnet. Für die Kontrolle oder statische Gele, ssDNA aus Ts oder As ist, um einen weiteren Satz von 100% und 80% Gelen geliefert. Nach einem Minimum von zwei Tagen nach der Elastizität Modulations können Zellen verarbeitet und analysiert werden. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:kEEP-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> DNA-Vernetzung </td><td rowspan="2"> # Basen </td><td> Sequenz (Brückenkopf) </td><td rowspan="2"> Änderung </td><td rowspan="2"> Schmelztemperatur (T m ° C) </td><td rowspan="2"> Kommentare </td></tr><tr><td> 5 &#39;→ 3&#39; </td></tr><tr><td rowspan="4"> Design 1 </td><td> SA1 </td><td> 10 </td><td> GCA CCT TTG C </td><td> 5 &#39;ACRYDIT </td><td> 34,9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 10 </td><td> GTC AGA ATG A </td><td> 5 &#39;ACRYDIT </td><td> 23,6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 30 </td><td> TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG </td><td></td><td> 56 </td><td>Ein 10 bp-Sequenz Ansatzpunkt ist inbegriffen. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 30 </td><td> CAA GTG CGC TAG ACC TTT GCG TCA GAA TGA </td><td></td><td></td><td> R2 ist komplementär zu L2 </td></tr><tr><td rowspan="4"> Design 2 </td><td> SA1 </td><td> 14 </td><td> CGT GGC ATA GGA CT </td><td> 5 &#39;ACRYDIT </td><td> 46,9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 14 </td><td> GTT TCC CAA TCA GA </td><td> 5 &#39;ACRYDIT </td><td> 40,2 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C </td><td></td><td> 65,9 </td><td> Ein 12-bp-Sequenz Ansatzpunkt ist inbegriffen. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 40 </td><td> GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A </td><td></td><td> 65,9 </td><td> R2 ist komplementär zu L2 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Design 3 </td><td> SA1 </td><td> 20 </td><td> ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC </td><td> 5 &#39;ACRYDIT </td><td> 55 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 20 </td><td> CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA </td><td> 5 &#39;ACRYDIT </td><td> 56,6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T </td><td></td><td> 68,8 </td><td> Ansatzpunkt ist nicht inbegriffen. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Kontrolle </td><td rowspan="2"> Kontrolle </td><td rowspan="2"> 20-40 </td><td> AAA AAA (etc.) oder </td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> TTT TTT (usw.) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Basissequenzen für ssDNA 9-11,13,14,18,21. Zelluläre und mechanischen Studien haben mehrere d verwendetifferent Vernetzungs Designs zur DNA-Gelen mit verschiedenen statischen und dynamischen mechanischen Eigenschaften zu erzeugen. Die in der Quer Design moduliert Parameter sind Basensequenz und Sequenzlänge oder vernetzen Länge. Bold und kursiv Schriften veranschaulichen Basenpaarung zwischen SA1 und L2 und zwischen SA2 und L2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="8"> Design </td></tr><tr><td colspan="3"> 1 </td><td colspan="3"> 2 </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td> Acrylamidkonzentration (%) </td><td colspan="3"> 10 </td><td colspan="3"> 10 </td><td> 10 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SA1 und SA2 auf den L2-hybridisiert (% vernetzt) </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> &lt;strong&gt; Elastizität (kPa, Mittelwert ± SEM) </td><td> 6,6 ± 0,6 </td><td> 17,1 ± 0,8 </td><td> 29,8 ± 2,5 </td><td> 5,85 ± 0,62 </td><td> 12,67 ± 1,33 </td><td> 22.88 ± 2.77 </td><td> 25,2 ± 0,5 </td><td> 10,4 ± 0,6 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Elastizitätsmodul (E) von DNA-Gelen 9-11,13,14,18,21. Acrylamidkonzentration, Vernetzungsprozent und Vernetzungs Länge kann in DNA-Gelen moduliert werden. Motive 1, 2 und 3 sind 20, 28 und 40 bp Vernetzungslängen sind. 100%-Gele für alle Ausführungen haben ähnliche Module anzeigt vernetzen Länge hat keinen Einfluss auf Gel-Elastizität. Variationen in Acrylamidkonzentration verändern jedoch DNA-Gel Elastizität.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ssDNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com</td>
			<td></td>
			<td>Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Tris-EDTA buffer (TE buffer)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>93290</td>
			<td>TBE is a reproductive toxin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td>
			<td>BP14021</td>
			<td>Acrylamide is a toxin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">12-mm diameter round coverglass</td>
			<td rowspan="2">Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com</td>
			<td rowspan="2">12-545-82</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland optical adhesive 72</td>
			<td>Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com</td>
			<td>NOA72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">24-well tissue culture plate</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microcentrifuge tubes</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com or thermofisher.com</td>
			<td>C111 or 22589</td>
			<td>Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37&#176;C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>P6407</td>
			<td>Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com</td>
			<td>13813</td>
			<td>Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 X 60 cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive-displacement pipette</td>
			<td>Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com</td>
			<td>F148504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td>
			<td>11-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/</td>
			<td>NI 5.0UH-R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of dna-crosslinked polyacrylamide hydrogels

Mechanobiologie ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet, das die kritische Rolle der körperliche Signale in der Leitung der Zellmorphologie und Funktion adressiert. Zum Beispiel ist die Wirkung der Elastizität des Gewebes auf die Zellfunktion ein wichtiger Bereich der Forschung, da Mechanobiologie Gewebesteifigkeit moduliert mit der Krankheit, Entwicklung und Verletzungen. Statische Gewebe-ähnlichen Materialien oder Materialien, die nicht ändern kann, wenn die Steifigkeit Zellen plattiert werden hauptsächlich verwendet, um die Effekte der Gewebesteifigkeit auf die Zellfunktionen zu untersuchen. Während Informationen aus statischen Studien gesammelt wertvoll ist, sind diese Studien kein Hinweis auf die dynamische Natur der zellulären Mikroumgebung in vivo. Um die Wirkungen der dynamischen Steifigkeit auf die Zellfunktion besser erfüllen eine DNA-vernetzte Polyacrylamid-Hydrogel-System (DNS-Gele) entwickelt. Im Gegensatz zu anderen dynamischen Substraten, haben DNA-Gelen die Fähigkeit zu verringern oder zu erhöhen in der Steifigkeit nach der Herstellung ohne Reize. DNA-Gele bestehen aus DNA crosslTinten, die in einem Polyacrylamid-Grundgerüst polymerisiert werden. Hinzufügen und Entfernen von Vernetzungen durch Lieferung von Einzelstrang-DNA kann zeitlicher, räumlicher und reversible Steuerung Gelelastizität. Wir haben in früheren Berichten dargestellt, dass die dynamische Modulation der DNA-Gel Elastizität beeinflusst Fibroblasten und Neuronen Verhalten. In diesem Bericht und Video bieten wir eine schematische, die die DNA-Gel Vernetzungsmechanismen und Schritt-für-Schritt-Anleitung beschreibt auf die Vorbereitung DNA-Gelen.

Vor unserer Studien wurden zell ECM-Wechselwirkungen auf statische konform Biomaterialien oder irreversibel und unidirektionalen dynamischen Substraten beobachtet. Diese Substrate müssen nicht genau die dynamische Natur der zellulären Mikroumgebung. Unsere Arbeit verschiebt die bestehenden technischen Paradigmen, indem sie einen physiologischen Modell zur Untersuchung von Zell-ECM-Interaktionen auf Erweichung und Versteifungs dynamische Biomaterialien. In früheren Studien untersuchten wir die Wirkungen von dynamischen Substrate auf Zellen durch die Untersuchung verschiedener Zellmorphologien und Phänotypen auf diesen Gelen. In einem Beispiel bestimmt man die Wirkung der Substratversteifungs auf Fibroblasten Fibroblasten-Morphologie durch Auswertung dynamischer DNA Gele. L929-Zellen, eine Maus-Fibroblasten-Zelllinie abgeleitet ist, wurden auf 80% und 100%-Gelen (3) 11 plattiert. Zwei Tage nach der Beschichtung, 20% mehr L2 Lösung wurde auf Medien von 80% Gele hinzugefügt, um die Gele zu 100% vernetzt (80 → 100%, Mitteltafel zu versteifen). 100% Gele und ein weiterer Satz von 80% Gele empfangenen Steuer ssDNA statische (rechts und links Platte, beziehungsweise) bleiben. Lichtmikroskopie Bilder wurden zwei Tage nach Abgabe von DNA an die Medien erfasst. Bild Unschärfen, wie in Abbildung 3 zu sehen, ist auf Gel-Oberfläche Unebenheiten und ist typisch und unvermeidlich. Gel Schwellung und Schrumpfung, durch den Zusatz von Puffern und L2 18,21 ergeben, trägt dazu bei Unebenheiten gelieren. Morphologie wurde mit ImageJ Software (NIH, Bethesda, MD) untersucht und dienten als Indikator für die Funktion. Fibroblasten auf Versteifungs Gele (80 → 100%) gewachsen hatte keine Veränderungen im Seitenverhältnis, aber zeigte eine größere Projektionsfläche als Fibroblasten auf 100% Gele 11 gewachsen. Interessanterweise ist die Morphologie von Fibroblasten auf statische Gele gewachsen war unähnlich der Morphologie von Fibroblasten auf dynamische Gelen gezüchtet. Fibroblasten auf 100% gewachsen Gele hatten eine kleinere Projektionsfläche und größeren Seitenverhältnis als Fibroblasten auf 80% Gele gewachsen. Diese WiederErgebnisse zeigen, dass Fibroblasten Verhalten ist abhängig von der Dynamik der Mikroumgebung. In einer weiteren Studie wurde die Wirkung von Weichmachersubstrat auf Neuronen durch Analyse neuronaler Phänotypen einschließlich Dendriten Nummer Dendritenlänge und Axonlänge (4) 10 bestimmt. Ratte stammRückenMarksNeuronen wurden auf 100% und 50% Gelen aufgewachsen. Vier Tage nach dem Plattieren wurden 50% R2 an die Medien von 100% Gele zugegeben, um die Gele zu 50% vernetzt (100 → 50%, Mitte) zu erweichen. 50% Gelen und einen weiteren Satz von 100% Gele empfangenen Steuer ssDNA statische (rechte und linke Platten bezeichnet) bleiben. Nach drei Tagen wurden Neuronen fixiert und mit einer dendritischen Marker (MAP2, Top-Platten), einer axonalen Marker (Tau, mittlere Panels) immun und Kerne (DAPI, Bodenplatten), um Phänotypen zu bewerten. Neuronen auf Erweichung Gelen (100 → 50%) gewachsen waren keine Unterschiede in der primären Dendriten Nummer oder Axonlänge, zeigte aber kürzer als primäre Dendriten Neuronen o gewachsen<html> n 50% Gele. Wie in Fibroblasten-Studien waren neuronalen Phänotypen auf statischen Gele unähnlich neuronalen Phänotypen auf dynamischen Gele. Neuronen auf 50% gewachsen Gele hatten weniger Primär Dendriten und Axone mehr als Neuronen auf 100% Gel gewachsen. Abschließend Fibroblasten und Neuronen-Bilder zeigen, dass mehrere Zelltypen können auf dynamische und statische DNA-Gelen untersucht werden, bewirkt, dass DNA-Gel Unebenheiten Abbildungs ​​Herausforderungen, Standard morphologischen und Immuntechniken möglich sind, und vor allem das Verhalten von Zellen ist abhängig von Substrat Dynamik. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Fibroblasten auf statische und dynamische DNA-Gelen aufgewachsen. Repräsentative Lichtmikroskopische Bilder von L929 Fibroblasten auf 80% (links), 80 → 100% (Mitte), und 100% Gelen (rechts) gewachsen. Maßstab ist 100 um. Diese Zahl hat sich von 11 geändert wurde.href = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Neuronen auf DNA-Gelen aufgewachsen. Repräsentative Fluoreszenzbilder von Rückenmarksneuronen auf 100% (links Platten) aufgewachsen, 100 → 50% (Mitte), und 50% (rechte Felder) Gele. MAP2 Immunfärbung zeigt Dendriten (oben Platten) zeigt Tau-1-Immunfärbung Axone (Mitte Platten) und DAPI-Färbung zeigt Kern (Bodenplatten). Maßstab ist 100 um. Diese Zahl wurde von 10 geändert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51323/51323fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels at JoVE.com

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Unser Labor hat DNA-vernetzte Polyacrylamid-Hydrogele, ein dynamisches System Hydrogel entwickelt, um die Effekte der Modulation Gewebesteifigkeit auf die Zellfunktion zu verstehen. Hier bieten wir Schaltpläne, Beschreibungen und Protokolle, um diese Hydrogele vorzubereiten.

Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid, Hydrogele

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

preparation-of-dna-crosslinked-polyacrylamide-hydrogels

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Aufrufe.  JFK Medical Center.  Unser Labor hat DNA-vernetzte Polyacrylamid-Hydrogele, ein dynamisches System Hydrogel entwickelt, um die Effekte der Modulation Gewebesteifigkeit auf die Zellfunktion zu verstehen. Hier bieten wir Schaltpläne, Beschreibungen und Protokolle, um diese Hydrogele vorzubereiten. 

Serie: Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

Horizontale Scheiben Vorbereitung der Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Forschung

Biologie

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Vorbereitung von dissoziierten Maus kortikale Neuron Kulturen

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and high quantitation. Furthermore, it is completely compatible with mass spectrometric protein identification. But despite these advantages, CBB is regarded to be less sensitive than silver or fluorescence stainings and therefore rarely used for the detection of proteins in analytical gel-based proteomic approaches.
Several improvements of the original Coomassie protocol1 have been made to increase the sensitivity of CBB. Two major modifications were introduced to enhance the detection of low-abundant proteins by converting the dye molecules into colloidal particles: In 1988, Neuhoff and colleagues applied 20% methanol and higher concentrations of ammonium sulfate into the CBB G-250 based staining solution2, and in 2004 Candiano et al. established Blue Silver using CBB G-250 with phosphoric acid in the presence of ammonium sulfate and methanol3. Nevertheless, all these modifications just allow a detection of approximately 10 ng protein. A widely fameless protocol for colloidal Coomassie staining was published by Kang et al. in 2002 where they modified Neuhoff's colloidal CBB staining protocol regarding the complexing substances. Instead of ammonium sulfate they used aluminum sulfate and methanol was replaced by the less toxic ethanol4. The novel aluminum-based staining in Kang's study showed superior sensitivity that detects as low as 1 ng/band (phosphorylase b) with little sensitivity variation depending on proteins.
Here, we demonstrate application of Kang's protocol for fast and sensitive colloidal Coomassie staining of proteins in analytical purposes. We will illustrate the quick and easy protocol using two-dimensional gels routinely performed in our working group.

This video shall popularize a colloidal Coomassie G-250 staining protocol according to Kang et al. for the detection of average 4 ng protein in gels. The staining is completed within 2 hours and without any effort. We routinely use Kang's protocol for analytical purposes in gel-based proteomics.

Schnell und feinfühlig Kolloidale Coomassie G-250 Färbung für Proteine ​​in Polyacrylamidgelen

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Denaturierung Urea Polyacrylamidgelelektrophorese (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogele für Tissue Engineering

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

Untersuchung der Auswirkungen von Matrix Stiffness auf Cellular-Funktion mit Acrylamid-basierte Hydrogele

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

Erstellung von Qualitäts-Inositol Pyrophosphate

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...