This work was supported by the Belgian National Foundation for Scientific Research (F.R.S.-FNRS) through &#8220;MIS Confocal Microscopy&#8221;, &#8220;Cr&#233;dit aux Chercheurs&#8221; grants and the &#8220;Nanomotility FRFC project&#8221; (no. 2.4622.11). T.G. doctoral fellowship is supported by the Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). The authors gratefully acknowledge Sylvain Desprez for mechanical characterization and G&#233;raldine Circelli for confocal imaging.

1. Cam lameller Yüzey etkinleştirme <ol><li> Bir Petri kabı ve smear (önerilen kimyasal davlumbaz) 5 dakika için üzerine 0,1 M NaOH çözeltisi koyun cam dairesel lamelleri (25 mm çap). </li><li> NaOH çözüm çıkarın ve yavaşça steril bir kültürü kaputu bir sallanan plaka üzerinde sallanan ise tam 20 dakika boyunca steril GKD 2 O ile lamelleri batırmayın. </li><li> Steril GKD 2 O boşaltın ve adımı 1.2 tekrarlayın. </li><li> Steril bir cımbız ile lamelleri çıkarın ve aktif yüzü yukarıya yeni bir Petri tabağına yerleştirin. </li><li> Yüksek saflıkta bir azot gazı akışı altında sabit bir kuru lamelleri. </li><li> Bir steril kültür kaput, 1 saat boyunca lamel aktive tarafında 3-(trimetoksisilil) propil akrilat (% 92) ince bir tabaka sürün. </li><li> Yaygın steril GKD 2 O 3 yıkar cam lamelleri yıkayın ve yeni bir Petri kabındaki steril GKD 2 O bunları bırakın. </li><li> Petri kabı dokununParafilm ile ve 10 dakika için hafif ajitasyon altında olan bir kavrama plakası üzerine yerleştirin. </li><li> Ince ipuçları ile steril bir cımbız ile GKD 2 O gelen lamelleri çıkarın ve aktif yüzü yukarıya yeni bir Petri tabağına yerleştirin. </li><li> Lamelleri yapışmasını toz önlemek için alüminyum folyo ile kuru bir yerde oda sıcaklığında saklayın. </li></ol> Hidroksi-PAAm hidrojellerin 2. Hazırlık <ol><li> , 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüpü içinde N-hidroksietil akrilamid (HEA) 65 mg ağırlığında hazırlayın. Bu taze HEA solüsyonu hazırlamak için önemlidir. </li><li> HEA kadar 50 mM HEPES tamponunun 1 ml ilave edilir ve tam çözünme gerçekleşene kadar HEA bir vorteks cihazı kullanılarak karıştırın. </li><li> İstenen hidrojel sertliği ulaşmak w / HEPES akrilamid çözeltisi ve / hepes-bis-akrilamid çözeltisi içinde ağırlık (Tablo 1 e bakınız) ağırlık oranı% 2 olan gerekli hacimde% 40 ağırlık 400 ul ilave edin. 5 ml&#39;lik bir nihai hacme, 50 mM HEPES ile ayarlayın. </li><li> Bir vorteks ve Degas kullanarak çözüm karıştırınhidroksi-PAAm polimerizasyonunu önleyen solüsyonu içindeki oksijen konsantrasyonunu azaltmak için 20 dakika boyunca vakum odasındaki. </li><li> , Steril bir başlık altında, sterilize etmek için bir 0.2 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre ile degased çözelti filtre. </li><li> 7 dakika boyunca UV / ozon temizleyici dairesel cam lamelleri (22 mm çap) etkinleştirin. </li><li> % 10 amonyum persülfat (APS) çözüm 100 ul hazırlayın, bu 100 ul GKD 2 O. 10 mg APS Bu taze APS-eriyiğinin hazırlanması önemlidir. </li><li> Polimerizasyonun başlatılması için tetrametilendiamin 2.5 ul (TEMED) ile sterilize hidroksi-PAAm çözeltisi (adım 2.5) APS çözeltisi 25 ul ekle. , Steril koşullar altında, kabarcıkların giriş olmadan 3 ardışık pipettings çözeltiyi karıştırın. </li><li> , Steril bir başlık altında, 22 mm yer gl hemen (adım 1.9 temin edilebilir) ve 25 mm örtücü kısım üzerine hidroksi-PAAm çözeltisi 25 ul damla yerleştirmekdamlasının üstüne eşek lamel (adım 2.5 ile elde edilmiş) çözeltisi hidroksi-PAAm sıkmak. Steril bir cımbız ile 22 mm cam lamel merkezi ve kabarcıkları yumuşatır. </li><li> Hidroksi-PAAm hidrojeller, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında polimerize olmaya bırakın. Polimerizasyon işleminin tamamlanmasını takip Eppendorf tüpü içinde el ile geriye kalan hidroksi-PAAm çözeltisi ters çevirin. </li><li> Tam steril GKD 2 O lamelleri sokmak ve dikkatli bir şekilde 22 mm &#39;lik cam lamelleri ve hidroksi-PAAm hidrojel tabakası arasında bir traş makinesi bıçak kenarına tanıtarak 22 mm ebadındaki bir cam lamelleri ayırın. </li><li> Steril PBS ile hidroksi-PAAm hidrojeller yıkayın (PBS 3 borsalar) ve tam hidrasyon korumak için steril PBS dalmış jeller edelim. </li><li> 3 güne kadar, 4 ° C&#39;de steril PBS hidroksi-PAAm hidrojeller saklayın. </li></ol> 3. Polidimetilsiloksan (PDMS) Microstamp imalatı NOT: Bir silikon usta imalat sta önce gerekliPDMS microstamp imalat rt. Bir silikon ustanın Bu mikroimalat özel ekipman ve eğitim gerektirir taşbaskı teknikleri ile yapılabilir. Bir Nanofabrikasyona tesisi ile işbirliği silikon ana imal teşvik edilmektedir. Alternatif olarak, talep üzerine ısmarlama mikrostrüktürlü silikon ustaları fabricates bir şirkete başvurun. Bu silikon master fabrikasyon tek ihtiyacı bir kez yapılması dikkat etmek önemlidir. Gerçekten de, mikrostrüktürlü silikon ustaları elastomerik pulları elde etmek için süresiz kullanılabilir. <ol><li> Karışım PDMS ve bir 10 sertleştirme ajanı: plastik bir şişeye 1 oranında 10 dakika boyunca, bir pipet kullanılarak iyice karıştırın. </li><li> Aşama 3.1 sırasında oluşmuş hava kabarcıklarını çıkarmak için vakum altında PDMS karışım gaz çıkışına. </li><li> Bir Petri kabındaki mikrostrüktürlü silikon ustası yerleştirin ve kabarcıklar oluşturan olmadan bunun üzerine gazdan arındırılmış PDMS karışımı bir 10 mm kalınlığında bir tabaka döküm. </li><li> Bir 60 ° C &#39;de 2 saat boyunca PDMS tedavi sağlarfırın. </li><li> Bir neşter ile tozsuz bir ortamda, soyulan PDMS katman ve tüketim 1 cm 2 microstamps. </li><li> Forseps kullanarak, yer PDMS bir Petri kabındaki desen-up microstamps. </li></ol> 4. micropatterning Hidroksi-PAAm hidrojeller <ol><li> 15 dakika boyunca, bir etanol / su içinde yer PDMS microstamps (50/50) çözeltisi ve sonikasyon. </li><li> Nitrojen akışı akımı ile pul kurutun ve onları, 7 dakika boyunca UV / ozon süpürge (λ &lt;200 nm) model-up yerleştirin. </li><li> , Steril bir başlık altında, bir 1 cm&#39;lik 2 PDMS damga mikroyapılı yüzeyi üzerine arzu edilen bir protein çözeltisi (örneğin, 100 ug / ml PBS içinde laminin veya 25 ug / ml PBS içinde fibronektin) bir 150-ul damla yerleştirin. </li><li> İsteğe bağlı: hücre yoğunluğu ligand modüle protein çözeltisinin konsantrasyonu değiştirin. </li><li> Her bir köşesine doğru bir pipetle steril bir ucu ile taşıyarak damga yüzeyi boyunca protein çözeltisi yayılırdamga. </li><li> , Steril bir başlık altında 60 dakika boyunca PDMS damga adsorbe etmek için protein çözeltisi bırakın. Protein zarar görmesini önlemek için lambalarını kapatın. </li><li> , Steril bir başlık altında, bir Petri kutusu içine (adım 2.13 den temin edilebilir), hidroksi-PAAm kaplı lamelleri aktarın. </li><li> Steril koşullar altında düşük bir azot akımı ile hidroksi-PAAm alt tabakaların yüzeyine aşırı PBS çıkarın. Kısa jel yüzeyde duran su olduğuna dair bir kanıt olarak görülmektedir işlemi durdurun. Jel, bu aşamada iyice kurutulmuştur olmamalıdır. </li><li> Kuru dikkatle PDMS yapılandırılmış yüzey, yüksek saflıkta bir azot gazı akımı ile sürekli bir damga. </li><li> Pansuman doku forseps ile, protein kaplı damgası tutun ve kurutuldu hidrojel yüzeyi ile temas edecek şekilde yapılandırılmış yüzey yerleştirin. Pul microfeatures ve hidrojel yüzeyi arasında iyi bir temas sağlamak için PDMS damga üstündeki cımbız ucu ile kısa bir basınç noktaları uygulanır. </li><li> Th PDMS damga bırakınoda sıcaklığında 1 saat e hidrojel yüzeyi. </li><li> Yavaşça soyunma doku forseps ile hidroksi-PAAm hidrojellerin PDMS pulları kaldırmak ve damga temizlemek için adım 4.1 izleyin. </li><li> Değişimi başına 10 dakika boyunca PBS içerisinde, steril koşullar 3 değişimi (pH = 7.4) ile yoğun bir şekilde hidroksi-damgalı PAAm hidrojeller yıkayın. </li><li> İsteğe Bağlı Diğer ECM proteinlerinin ek Micropatterns adımlarını 4,5-4,11 izleyerek hidroksi-PAAm yüzeye eklenebilir. </li><li> Sallanan plaka üzerinde hafif ajitasyon altında 4 ° C de bir gece boyunca PBS içinde 5 mg / ml BSA içinde steril bir çözelti ile Pasif yapma basılı olmayan bölgeleri. </li><li> Değişimi başına 10 dakika boyunca PBS içerisinde, steril koşullar 3 değişimi (pH = 7.4) ile iyice yıkayın. Bu aşamada, damgalı hidroksi-PAAm hidrojeller bir haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> Micropatterned hidroksi-PAAm Hidrojeller 5. Hücre Birikimi <ol><li> Önce kaplama c 30-45 dakika boyunca hücre ortamındaki hücre lamelleri inkübearşın. </li><li> 37 ° C&#39;de steril PBS ile 75 cm 2 kültürü şişesi içinde kültürlenmiş yapışmayan hücreler yıkanır ve 10 dakika boyunca tripsin-EDTA 3 ml ya da Accutase ile çıkarınız. </li><li> G müstakil hücreleri ihtiva eden şişe içine cep hattı için önceden ısıtılmış tam büyüme ortamı uygun istenen miktarda aktarın ve x, 650 ° C&#39;de 3 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> Mikropipet ile süpernatantı ve 15-20,000 hücre / ml komple kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 1-2 saat için nem (Kademe 5.1 de elde edilmiş), bir lamel micropatterned hücre çözeltisi 4 ml ilave edilir ve hücre yer kaplı bir lamel kültürü inkübatöründe 37 ° C&#39;de ve% 5. </li><li> Aspire hafifçe bekâr hücreleri ve kültür ortamı değiştirin. Inkübatör bağlı hücreleri dönün ve onları (hücre tipine bağlı olarak, 3-6 saat) tam olarak yayılmasına izin. </li></ol>

<ol>
	<li>Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+route+to+functionalize+polyacrylamide+gels+for+the+independent+tuning+of+mechanotransduction+cues.">A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues.</a> Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).</li><li>Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Th&#233;odoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+investigation+reveals+distinct+roles+for+actin+cytoskeleton+and+myosin+II+activity+in+capillary+leukocyte+trafficking.">Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking.</a> Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).</li><li>Atmanli, A., Domian, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+aligned+functional+myocardial+tissue+through+microcontact+printing.">Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing.</a> J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).</li><li>Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Th&#233;odoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+microfluidic+method+to+select,+isolate,+and+manipulate+single-cells+in+mechanical+and+biochemical+assays.">A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays.</a> Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).</li><li>Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+control+of+nuclear+confinement+identifies+a+threshold+deformation+leading+to+lamina+rupture+and+induction+of+specific+genes.">Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes.</a> Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).</li><li>Rundqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fidelity+functional+patterns+of+an+extracellular+matrix+protein+by+electron+beam-based+inactivation.">High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).</li><li>Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+generation+of+proteins+micropatterns+for+neuron+culture+applications.">Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications.</a> Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).</li><li>Holden, M. A., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activated+patterning+of+dye-labeled+molecules+on+surfaces.">Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).</li><li>Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-assisted+surface+chemical+patterning+for+single-cell+culture.">Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture.</a> Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).</li><li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+gold+having+micrometer+to+centimeter+dimensions+can+be+formed+through+a+combination+of+stamping+with+an+elastomeric+stamp+and+an+alkanethiol+"ink"+followed+by+chemical+etching.">Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching.</a> Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).</li><li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Polydimethylsiloxane+Substrates+with+Tunable+Elastic+Modulus+to+Study+Cell+Mechanobiology+in+Muscle+and+Nerve.">Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve.</a> PLoS ONE. 7, e51499 (2012).</li><li>Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Phosphorylcholine+hydrogels+as+tunable+and+versatile+platforms+for+mechanobiology.">PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology.</a> Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+hydroxy-PAAm+hydrogels+and+sylgard+184+silicone+elastomers+with+tunable+elastic+moduli.">Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli.</a> Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+towards+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses.</a> Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li><li>Hemphill, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+integrin+signaling+in+diffuse+axonal+injury.">A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).</li><li>Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamide+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays.">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays.</a> BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li><li>Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cell+growth+on+protein-functionalized+hydrogel+surfaces.">Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+coordination+between+cell+and+nuclear+shape+within+micropatterned+endothelial+cells.">Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells.</a> Nat. Commun. 3, 671 (2012).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Confinement:+Putting+the+squeeze+on+the+nucleus.">Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus.</a> Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).</li><li>Trappman, B., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+extracellular+matrix+stiffness:+a+material's+perspective.">How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Modern hücre biyolojisi, in vitro gözlemler çoğu, çoğunlukla ECM proteinleri veya RGD sekansı ihtiva eden sentetik peptitler, ince bir tabaka ile kaplanmış katı bir cam lameller üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu temel kültür alt-tabakalar hücresel süreçler üzerinde çalışılması için mekanotransdüksiyon doğru bir model sağlamaz ve böylece ECM&#39;nin bütün fizikokimyasal ve karmaşıklığını büyük ölçüde özetleyebildiğini yoktur. Bu sorunu çözmek için, biz istenilen miktarda ve ECM proteinleri doğa ile iki boyutlu hidrojeller fonksiyonelleştirilmesi basit bir alternatif önermek. Bu yöntem, matris sertlik, hücresel morfoloji ve lohusalık ya da hücre-ligand yoğunluğu gibi önemli mekanotransdüksiyon ipuçlarının, bağımsız kontrolünü sağlar. Buna ek olarak, hidroksi-PAAm hidrojeller hareketsiz hale getirmek için, birden fazla ECM proteininde uzamsal dağılımını kontrol etmek için yetersizliğidir mevcut işlevselleştirme yöntemlerin en büyük sınırlandırmalardan biri üstesinden gelir. Nedeniyle hidro yüksek afinitexy-PAAm biyomoleküllerin, bir herhangi bir ilave ekipman gerektirmeyen sıralı microprintings kullanarak aynı yüzey üzerinde çeşitli ECM proteinlerinin uzaysal dağılımının, bağımsız olarak matris sertliğini kontrol edebilir hidrojellerinin. Biz maliyet veya uzmanlık minimal gereksinimleri ile kendi içsel olmayan yapıştırıcı özelliklerini aşmak için akrilamid hidrojellere içinde hidroksil gruplarının dahil dayalı yeni bir yöntem öneriyoruz. Hidrojeller proteinleri desenlendirme için mevcut teknikler ile karşılaştırıldığında, hidroksi-PAAm yöntem kuvvetli toksik kimyasal maddeler (örneğin, hidrazin hidrat), pahalı ve fotoreaktif çapraz bağlayıcılar (örneğin, sülfo-SANPAH) ve UV lamba gücünün ve konumlandırma bağımlılık kullanılmasını önler yumuşak hidrojeller işlevselleştirmek. Hidroksi-PAAm hidrojeller, birkaç hafta stabil kalır ve aktif kütle elde edilebilir, kolayca mikro basılı ve biyomoleküller için yüksek afinite sinerjistik etkilerini araştırmak sağlarhücresel fonksiyonları üzerine konjuge ECM proteinleri. Buna ek olarak, hidroksi-PAAm hidrojeller nicel olarak mikro-çevresindeki bir hücre tarafından uygulanan sıkışma kuvvetleri miktarını araştırmak için kullanılabilir. Gerçekten de, floresan boncuk kolayca değiştirme alanının ölçülmesi için hücre çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) kullanmak için, hidroksi-PAAm hidrojeller gömülebilir ve ökaryotik hücre tarafından uygulanan çekme edilen alan üzerine kaplanmıştır tahmin, daha önce 1,20 göstermiştir iki boyutlu Micropatterns. Diğer birçok microprinting dayalı yöntemler, hidroksi-PAAm hidrojellerin başlıca sınırlaması proteini microfeatures uzaysal çözünürlüğü ile ilgilidir. Sert hidrojeller (E&gt; 10 kPa) üzerine, uzaysal çözünürlüğü bir mikrometre civarındadır ve özellikle silikon kalıp imal etmek için kullanılan litografi tekniğine bağlı olarak damga kararı ile belirlenir. Yumuşak hidrojel, uzaysal çözünürlüğü kısmen th tarafından belirlenir halemikrometre mekansal çözüme ulaşmak için başlıca sınırlama olur protein transferi sırasında e yüzey deformasyonu. Burada sunulan yaklaşım, şu anda iki boyutlu alt-tabakalar ile sınırlıdır. Ancak bu yöntem son derece ölçeklenebilir ve daha fazla çalışma, üç boyutlu yapılar için bu yöntemi genişletmek için laboratuarımızda halen devam etmektedir. Bu hidroksi-PAAm hidrojeller iyice embriyonik gelişme, iltihaplı tepkiler, yara iyileşmesi, nevrit dışa büyümesinin, yetişkin doku da dahil olmak üzere mikro-hücre 21,22 arasında fizyo-kimyasal özellikleri ile ilişkili kompleks hücresel ve doku süreçlerin kilit mekanizmaları deşifre yardımcı olabilir umut homeostazis ve fibrozis ve kanser gibi hastalıkların patogenezi.

Yerel mikro-hücresel birçok yönü (örneğin, sertlik, gözenek boyutu, protein yapısı, ya da hücre-ligand yoğunluğu) böyle bir motilite, hücre proliferasyonu, farklılaşması ve gen sentezlemesi gibi hücresel işlemleri kontrol eden düzenleyici ipuçlarının çalışmalarının oluşturulması sağlar. Hücre dışı ortama fizikokimyasal özelliklerine modifikasyonları, hücreler tarafından algılanan ve hücresel polarizasyon, göç ve farklılaşma dahil olmak üzere farklı deformasyonu fizyolojik sonuçlar, sebep olabilir. Bu hücreleri hücresel biyokimyasal sinyallerin içine ECM değişiklikleri tercüme Ancak, ne kadar belirsizliğini koruyor. Bu nedenle, büyük öneme mekanotransdüksiyon yollarını incelemek için hücreler ile bunların mikro çevreleri arasındaki etkileşimleri üretebileceği in vitro mikro çevrelerinde kontrol Mühendisi etmektir. Bu sorunu çözmek için, biz son zamanlarda kolayca iki kuruş oluşturmak için, hidroksi-PAAm hidrojeller denilen yeni bir yöntem 1, girmiştikburadakilerin yumuşak bağımsız önemli mekanotransdüksiyon ipuçlarını kontrol etmek izin matrisler: matris sertlik, hücre geometrisi ve lohusalık, protein ve hücre-ligand yoğunluğunun doğası. ECM morphogens -degradeler aracılığıyla hücresel süreçleri (kemotaksisini), yapışkan proteinleri (haptotaxis) ve sertlik (durotaxis) yönlendirir. Son birkaç yıldır, in vitro platformlarda ileri hücreler fizyolojik süreçlere 2-5 içine biyokimyasal ve biyofizik özellikleri çeviremez nasıl didiklemek için bu hücre dışı ipuçlarını izole etmek için geliştirilmiştir. Elektron ışın 6, 7 fotolitografi, fotokimyasal hareketsizlik 8, ya da plazma destekli teknikleri 9 micropatterned substratlar üzerinde yaşayan hücrelerin büyümesini yönlendirmek için geliştirilmiştir. Bu teknikler önemli sonuçlar vermiştir rağmen, çoğu hücre davranışı farklı ipuçlarının bireysel etkisi arasındaki ayrımcılığa izin vermezve onlar birkaç laboratuvarları gelemez teknik olanaklar gerektirir. Bu teknikler arasında, microcontact baskı (μCP), hücre-yapışkan mikro-adalar 10 oluşturmak için sağlam ve erişilebilir bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Daha yakın zamanda, bu alanda harcanan çabaların 11-14 canlı dokularda gözlenen katılıklarının geniş yeniden üretilmesi için ayarlanabilir bükülmezliklerde hidrojel μCP geliştirilmesi için girişimlerde bulunulmuştur. Bu yapıtlar arasında, poliakrilamid (PAAm) 15 popüler hale zaten hücre biyomekanik analizleri için en yaygın olarak kullanılan polimer esaslı matrisler biridir. PAAm yüzeylerinin, N-sülfosükinimidil-6-[4&#39;-azido-2&#39;-nitrophenylamido] (sülfo-SANPAH) ve ECM proteinlerinin sülfo-SANPAH nitrofenil UV aktivasyonu ile yüzeye bağlı olan heterobifonksiyonel çapraz bağlayıcı ile işlevselleştirilen azid gruplarının 16. Bir başka teknik, ciddi bir şekilde okside edilmiş proteinlere bağlanma hidrazin oluşurperiodat ile 17. Hynd ve arkadaşları bir acroyl-streptavidin monomer 18 varlığında fotopolimerizasyonu gerektirir protein ve peptitler ile biomimetic hidrojel yüzeyleri desenlendirme için bir tekniği tanıttı. Daha yakın zamanda, Tseng ve ark. 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür ile aktif hale Pensilvanya jeller inkübe gerektiren bir optik kuvars maske aracılığıyla PAAM derin, UV&#39;ye maruz dayalı yeni bir yöntem micropatterning 19 (EDC) bildirmişlerdir ve N-hidroksisukinimid (NHS) su solüsyonları, önceki protein ekleyin. Uzun sentez yöntemleri (örneğin, diyaliz, liyofilizasyon, vb), pahalı kimyasal bileşikleri (örneğin, hiyaluronik asit, sülfo-SANPAH) ya da derin UV: homojen ve yeniden üretilebilir bir proteinler micropatterns oluşturmak için bu tekniklerin yeteneği rağmen, çoğu büyük sınırlamaları acı ışınlama. Buna ek olarak, bu teknikler, alt-tabaka sertliği mikrodesenlerle bağımsız modülasyonuna izin vermezGeometri, ECM protein yapısı ve hücre-ligand yoğunluğu. Dikkate bu sınırlamaları alırsak, biz yumuşak hidrojel proteinlerin ve biyomoleküllerin çeşitli immobilizasyon sağlar ve hücresel fonksiyonlarda rollerini deşifre etmek için mekanotransdüksiyon ipuçlarının bağımsız ayar veren bir roman ve basit akrilamid-temelli bir yaklaşım geliştirdik. Bunun yerine sert kimyasal bileşikler ile tedavi edilmesi için PAAm hidrojeller, biz PAAm polimerizasyon sırasında hidroksil grupları ile ticari bir akrilamid getirmektedir. Bu basit işlem herhangi diğer teknik gereksinimleri olmadan PAAm hidrojellerin içsel anti-yapışkan özelliği üstesinden gelir. Hidroksil gruplarının varlığı hidrojen bağı etkileşimlerini oluşturan proteinler ve biyomoleküllerin hidroksi-PAAm hidrojellerin yüksek afinite yol açar. ΜCP ile birlikte, hidroksi-PAAm hidrojeller bağımsız kontrolü olan iki boyutlu bir kültür platformunun hızlı bir üretimini mümkün kılmakmekanotransdüksiyonu eğitimi için güçlü bir platform olması öngörülen matriks katılık, ECM proteinleri türü, hücre-ligand yoğunluğu ve sınırlı yapışabilmede, üzerinde. Bu protokolün amacı, kolaylıkla malzeme bilimleri herhangi uzmanlığı olmadan hidroksi-PAAm hidrojeller yapmak için gerekli bilgileri sağlamaktır. Araştırmacılar patofizyolojik mekanizmaları içinde yer mekanotransdüksiyon yollarının daha iyi anlaşılmasına yol açabilir hücresel ve doku düzeyinde fizyolojik ilgili soru sormak için nihai hedefi bir araç sağlamaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">UV/Ozone Photoreactor</td>
			<td style="width:71px;">Ultra-Violet Products</td>
			<td style="width:119px;">Model PR-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Rocking plate</td>
			<td style="width:71px;">IKAcWerke</td>
			<td style="width:119px;">Model KS 130 Basic</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Vortexer</td>
			<td style="width:71px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:119px;">Model Vortex Genie2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Vacuum degassing chamber</td>
			<td style="width:71px;">Applied Vacuum Engineering</td>
			<td style="width:119px;">DP- 8-KIT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Stainless steel forceps with fine tip</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z225304-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dressing tissue forceps</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F4392-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Petri dishes in polystyrene</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5731-500EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Aluminium foil, thickness 0.5&#160;mm</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">266574-3.4G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Isopore membrane filter (0,2 &#181;m pore size)</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">GTTP Filter code</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Round glass coverslip (22 mm diameter)</td>
			<td style="width:71px;">Neuvitro</td>
			<td style="width:119px;">GG-22</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Round glass coverslip (25 mm diameter)</td>
			<td style="width:71px;">Neuvitro</td>
			<td style="width:119px;">GG-25</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Variable volume micropipette</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z114820</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Protein microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z666505-100EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Scalpel handles</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2896-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2771-100EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cell culture flasks (75 cm2)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS430641</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z613983-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Polydimethylsiloxane&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Acrylamide (powder)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3553</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">N,N&#8217;-Methylenebis(acrylamide)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">146072</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">N-Hydroxyethylacrylamide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">697931</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Amonium PerSulfate (APS)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3678</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1805</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Human Plasma Fibronectin</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">FC010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Laminin from EHS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sodium hydroxyde</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221465-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Double-distilled water (ddH2O)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Endothelial cell growth medium</td>
			<td style="width:71px;">Cells Applications</td>
			<td style="width:119px;">211K-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C-003-5C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Accutase</td>
			<td style="width:71px;">PAA laboratories</td>
			<td style="width:119px;">L11-007</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">HEPES buffer solution 1M in H20</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83264-500ML-F</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Antibiotics-antimycotics</td>
			<td style="width:71px;">PAA laboratories</td>
			<td style="width:119px;">P11-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Phosphate Buffer Saline solution</td>
			<td style="width:71px;">PAA laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H15-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phaloidin</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-vinculin antibody produced in mouse</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">V9131</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">T-2762</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Fibronectin</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">F3648</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">(rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">41469</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Laminin antibody</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">L9393</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">(rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-rabbit IgG-FITC</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7512</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3924-100ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459844-2.5L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of hydroxy-paam hydrogels for decoupling the effects of mechanotransduction cues

Şimdi de, hücresel işlevleri, hücre dışı matris (ECM), çevre fizikokimyasal ve mekanik hissi veren hücre etkileşimleri düzenlenir olduğu saptanmıştır. Ökaryotik hücreler sürekli biyokimyasal sinyallerin içine ECM fiziksel değişiklikler transdüksivonu için yüzey mechanosensors yoluyla kendi yerel mikroortam duygusu ve gen ifadesi belirli değişiklikleri gerçekleştirmek için bu sinyalleri entegre. İlginç bir şekilde, birbirleriyle ECM kutu çift fizikokimyasal ve mekanik belirleyici değerleri saptanmış, hücre kaderine düzenler. Bu nedenle, mekanotransdüksiyonu anlamak için bir anahtar hücresel fonksiyonları ECM ipuçlarının göreceli katkısını decouple etmektir. Burada hızlı ve kolay bir in vitro mekanotransdüksiyon ipuçlarının bağımsız ayarlama için biyolojik ilgili hidrojeller oluşturmak için detaylı bir deneysel protokol mevcut. Biz kimyasal olarak modifiye poliakrilamid hidrojeller (PAAm) kendi özünde olmayan ADHES aşmak içinPolimerizasyon sırasında Hidroksil-fonksiyonu akrilamid monomerleri içeren göre özellikleri ive. Bu ECM proteinleri arzu edilen herhangi bir doğada hareketsizleştirilmesine olanak hidroksi-PAAm olarak adlandırılan yeni bir PAAm hidrojel, elde edilmiştir. Microcontact baskı bağımsız olarak, tek-hücre morfolojisi, matris sertlik, doğası ve ECM proteinlerinin yoğunluğunu kontrol etmek için kullanılmasına olanak hidroksi-PAAM kombinasyonu hidrojellerinin. Bu in vitro hücre mekanotransdüksiyon işlemlerinde incelemek için her biyoloji laboratuarda ayarlanabilir basit ve hızlı bir yöntem sağlar. Biz ECM sertlik ve çekirdeği arasındaki mekanik bir bağlantıya göstermek endotel hücreleri üzerinde deneyler yaparak bu romanına iki boyutlu bir platform doğrulamak.

Şekil 1A ile akrilamidin kopolimerleştirme (akrilamid) ve bisakrilamid (bis-akrilamid), N-sunulur hydroxyethylacrylamide gömülü hidroksil grupları ile rastgele radikal polimerizasyonu ile poliakrilamid, su-teşekkül eden bir primer hidroksil ihtiva eden (HEA) monomerler, (hidroksi-PAAm) . Bu protokol, HEA bir ağırlık 65 mg HEPES 1 ml&#39;lik bir hacim içinde seyreltilmelidir. HEA yoğunluğu birine kabaca eşit olduğunu bilerek, biz 1.065 ul (HEA + HEPES) bir çalışma hacmi elde varsayalım. Tablo 1 &#39;de görüldüğü gibi, AAm 400 ul ve bisAAm 50 ul 1.065 ul toplam eklenmesi 1515 ul&#39;lik bir hacme yol açar. Bu nedenle HEPES 3485 ul&#39;lik bir hacmi, 5 ml lik bir son hacme çözeltinin ayarlamak için gereklidir. Adım 2.6 &#39;de belirtildiği gibi, 22 mm&#39; lik cam lamel yüzeyi neden olmadan ortadan kaldırılması için UV / Ozon 7 dakika boyunca aktive edilmiş olmalıdırhidrojel yüzeye herhangi bir hasar. Gerçekten de, söz konusu cam yüzeyleri, UV / ozon tedavi sonrası daha hidrofilik hale gelir ve bu nedenle suda çok kolay tüm sistemi daldırılmasıyla çıkarılabilir. Buna ek olarak, UV / ozon tedavisi hidrojel yüzeyi ile doğrudan temas halinde olan 22 mm&#39;lik bir örtücü cam, kimyasal kirlenmesini önler. Bu teknik, bir izin cam lamel bağlanmış bir düz ve yuvarlak bir poliakrilamid yüzey (22 mm çapında) (çapı 25 mm) elde edilmiştir. Şekil 1B &#39;de görüldüğü gibi, protein Micropatterns mikrokontak baskı, hidroksi-PAAm hidrojellerin yüzeyi üzerinde oluşturulabilir. Bu deneysel prosedürde, UV / Ozon riskler yüzeyinde silanol gruplarını oluşturarak geçici PDMS pulları içsel hidrofobikliğini azaltmak için izin verir. 254 nm hattı atomik oksijen ozon dönüştürür Nitekim, 185 nm çizgi moleküler oksijen ozon üretir. Bu reaktif türevler, siloksan ba saldırırPDMS ckbone oksijen açısından zengin bir SiOx silika benzeri tabaka ve Si-OH, yüzey grupları oluşturur. Oksitlenmiş PDMS yüzeyi, yüzeye, toplu faz düşük molekül ağırlıklı çapraz bağlanmamış polimer zincirlerinin göç havaya maruz bırakıldıktan sonraki birkaç saat içinde kendi hidrofob geri bilinmektedir. Bu strateji, PDMS damga yüzeyi üzerinde protein çözeltinin yayılmasını sağlar. Bu yöntemin en önemli avantajlarından biri, bağımsız bir şekilde matriks sertliği (Şekil 2A), mikrodesenlerle geometrisini (Şekil 2B), hücre-ligand yoğunluğu (Şekil 2C), ve protein yapısı (Şekil 3A ve 3B) modüle etmektir. Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi, hidroksi-PAAm hidrojeller hücresel mikro-sertliği ince tekrar yaratılmasına izin verecek birkaç düzine kPa kPa&#39;dan az çapraz bağlayıcı konsantrasyonuna elastik modülünün doğrusal bir bağımlılık göstermektedir. Şekil 2B </strOng&gt;. açık mikrodesenlerle geometrisi ve sertliği matris bağımsız ayarlama gösteren üç çeşitli sertlikte (2.5, 15, ve 40 kPa)-hidroksi-PAAm hidrojeller üzerinde biriken Laminin (LM) bir epifluorescent görüntü dikdörtgen micropatterns, sunulur Şekil 2C, hücre olduğunu göstermektedir -ligand yoğunluğu PDMS pulları inkübe için kullanılan protein çözeltisinin konsantrasyonu değiştirilerek modüle edilebilir. 3 ardışık mikrokontak baskılar kullanılarak, laminin ve fibronektin hatları üzerine basılmış kollajen hatları bir floresan görüntü sunar Şekil. Okuyucular çeşitli boyutlarda ve micropatterns şekilleri, verimli olursa olsun hidrojel sertlik damgalanmış olan dikkat etmesi ilginçtir. Biz hiçbir majo olduğunu gösteren, başarılı keskin kenarlar (örneğin, üçgenler ve yıldızlı) ve düz (örneğin, çizgiler), ya da eğri (örneğin, daireler) şekiller ile proteinlerin microfeatures çoğaltılamazdesen karmaşıklığı r sınırlama. Tek hücre deneyde, micropattern yüzey alanı 400 ve 2500 mikron 2, tek bir hücre canlılığının sınıra karşılık gelen düşük bir değer arasında değişir. Diğer birçok microprinting tabanlı yöntemler olarak, sunulan yöntemin ana sınırlama onun uzaysal çözünürlüğü ile ilgilidir. &quot;Yumuşak&quot; hidrojeller üzerine, çözünürlük sınırı kısmen sırasında oluşabilecek yüzey deformasyon tarafından belirlenir hale oysa, sert hidrojeller (E&gt; 10 kPa) üzerine, uzaysal çözünürlüğü mikrometre civarındadır ve özellikle damga kararı ile belirlenir Protein transferi. Hidroksi-PAAm hidrojellerin toksisite homojen bir şekilde kaplı üzerinde kültür içerisinde 1, 2, ve 3 gün boyunca birincil kaplama, endotel hücrelerinin canlılığı ve mikro basılı yumuşak hidroksi-PAAm hidrojeller (Şekil 4A) nicelleştirilmesiyle incelenmiştir. HUVEC&#39;lerin yaklaşık% 80 muhafaza micropatterned yumuşak hidroksi-PAAm hidrojel kaplamahidroksi-PAAm bir biyouyumluluk gösteren üç gün boyunca kendi canlılığı, hücre kültürü için hidrojellerinin. İlginç bir şekilde, benzer bir canlılığı kortikal nöron hücreleri ile laboratuar ortamında elde edildi. Buna ek olarak, primer endotel hücreleri, bu yöntem katılıklarının geniş bir dizi hücre çoğalmasını incelemek için uygun bir mikro-ortam sağladığını belirtmektedir, &quot;yumuşak&quot; (25 kPa) ile alt-tabakalar (Şekil 4B) ile karşılaştırıldığında (500 kPa) &quot;sert&quot; üzerinde çoğalır . Mechanotransduction Alt tabaka sertliğinin etkisi ve yayılma alanı ayrılması için primer endotel hücreleri (HUVECler) dikdörtgen FN-kaplanmış micropatterns ekildi üç çeşitli sertlikte (2.5, 8.5 hidroksi-PAAm hidrojeller üzerinde biriken (1.200 mikron 2 sabit bölge) ve 25 kPa). Memenin için kullanılan Sonra, HUVECler, standart immünositokimya prosedürüyle aktin filamentler, vinkülin ve DNA için boyandıcam alt-tabakalar üzerine kaplanmıştır Lian hücreleri. Sert yüzeylerde, aktin lifleri daha düz ve daha kalın ve çekirdek deforme (Şekil 5) ise yumuşak yüzeylerde, HUVECler, düşük aktin lif yoğunluğu ve yuvarlak bir çekirdek sergiler. Sabit yayılma alanı yüzey sertliği değişiklikler çekirdeğin yeniden sonuçlanan aktin stres liflerinin gerginlik ve dağıtımı, modüle. Bu gözlem matris sertlik, hücre iskeleti ve çekirdeği arasındaki mekanik bir bağlantıya işaret etmektedir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nihai AAm / bisAAm oranı </td><td> Akrilamid% 40 (ul) </td><td> HEA ağırlığı 1 mi HEPES (mg) çözmek için </td><td> bis akrilamid (% 2) (Ul) </td><td> HEPES (ul) </td><td> Young modülü (10 3 Pa) </td></tr><tr><td> 0.2 / 50 0.5 / 50 1/50 2/50 3/50 </td><td> 400 400 400 400 400</td><td> 65 65 65 65 65 </td><td> 50 125 250 500 750 </td><td> 3.485 3.410 3.285 3.035 2.785 </td><td> ~ 1.4 ~ 3.6 ~ 8.7 ~ 17.2 ~ 25 </td></tr></tbody></table> Hidroksi-PAAm Tablo 1. Hazırlık çeşitli bükülmezliklerde hidrojellerinin. Çalışma çözümler 1,4 ila 25 kPa aralığındaki nihai sertliğe sahip hidroksi-PAAm hidrojelleri hazırlamak. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51010/51010fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. (A) akrilamid (AAm, siyah), N, N&#39;-metilenbisakrilamid (mavi bis-akrilamid) ve N-hydroxyethylacrylamide (HEA, kırmızı) hidroksi oluşturmak için bir arada karıştırılmıştır<html> PAAm hidrojeller. (B) hidroksi-PAAm hidrojel micropatterning prosedürün farklı adımları şematik gösterimi. Protein çözeltisi ilk önce bir microstamp (aşama # 1) yapısı yüzünde, 1 saat boyunca inkübe edilir. Hidrojel yüzeyi üzerine nazikçe bir azot akışı (aşama # 2) ile kurutulur. Microstamp sonra 1 saat (3. aşama) sırasında hidroksi-PAAm yüzeyi ile resmi temas edecek şekilde yerleştirilir. Birbirini takip eden yıkamadan sonra, mikro basılı yüzey 4 ° C (Adım 5) basılı olmayan bölgeleri bloke etmek O / N kaplı steril bir BSA çözeltisi ile pasive edildiğini göstermektedir. Son olarak, mikro basılı hidroksi-PAAm yüzey steril PBS ile birkaç kez yıkanır ve hücre tohumlama (adım # 6). Için hazır olduğunu <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51010/51010fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> 1010 / 51010fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Şekil 2. (A) hidroksi-PAAm hidrojellerin sertliğinin evrimi doğrusal bis-akrilamid çapraz bağlayıcı (kırmızı çizgi R 2 = 0995 olan bir lineer regresyon) miktarı ile orantılıdır. (B) Floresans görüntülerin çeşitli sertlikte (B = 2.5, 15, ve 40 kPa)-hidroksi-PAAm hidrojeller damgalı dikdörtgen, laminin mikro özellikleri. Ölçek çubukları, (A) 65 um, (B), 80 um, ve (C) karşılık gelen 50 um. (C), 15 mm genişlik, 25 kPa biçimde hidroksi-PAAm hidrojel bir LM degrade paralel çizgiler, evrimi ile gösterildiği gibi floresan yoğunluk profilinin. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51010/51010fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> n &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 51010 / 51010fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; 90 ° geçti çizgili (yeşil) Şekil 3. (A) İmmünofloresan Fibronektinin görüntü (kırmızı) ve laminin. (B) (kırmızı), fibronektin, laminin (yeşil) ve çizgili (mavi) kollajen Multilabeling mikro basılı daha sonra, bir 25 kPa hidrojel PAAm alt-tabaka üzerinde. Ölçek çubukları 30 um gelmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51010/51010fig3large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51010/51010fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. (A), hücre canlılığının miktar 24, 48 en iyi şekilde hücre yaşamım gösterdi ve üzerine kaplanmış ve 72 saat sonra, homojen bir şekilde kaplı ve hidroksi-PAAm yüzeyleri Micropatterned. Numara ile gösterilenHer çubuğun alt. kalım deneyi için sayılan toplam hücre sayısına karşılık gelen 1 (beyaz çubuklar) ve 25 sonra 500 kPa homojen kaplanmış alt-tabakalar üzerinde HUVECler proliferasyon (B) miktarının belirlenmesi ve 7 (karma bar) kültürün gün. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51010/51010fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51010/51010fig5highres.jpg" width="500" /> Yeşil Floresan Şekil 5. 2.5 kPa, 8.5 kPa hidroksi-PAAm hidrojeller üzerine biriktirilmiştir dikdörtgen FN kaplı micropatterns, kültüre immüno-primer endotel hücreleri görsel ve 25 (soldan sağa) kPa. Aktin stres fiberler ( ) Alexa Fluor 488 falloidinle, fokal yapışmalarda (kırmızı) fare polyclo ile boyandı ile boyandınal birincil antikor ve bir kırmızı floresan IgG sekonder antikor ile DNA ile etiketlenmiş DAPI ile mavi ile boyanmıştır. Ölçek çubukları 17 mikron karşılık gelmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51010/51010fig5highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues at JoVE.com

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Biz minimum maliyetle veya uzmanlık ECM proteinlerinin doğrudan bağlanma sağlar hidroksi-PAAm adında yeni bir poliakrilamid hidrojel, sunuyoruz. Microcontact baskı hücresel mechanostransduction eğitim için doğal hücre mikroçevresinin birçok ipuçlarının bağımsız kontrolünü kolaylaştırır ile hidroksi-PAAm kombinasyonu hidrojellerinin.

Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

preparation-hydroxy-paam-hydrogels-for-decoupling-effects

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.2K Görüntüleme.  Université de Mons.  Biz minimum maliyetle veya uzmanlık ECM proteinlerinin doğrudan bağlanma sağlar hidroksi-PAAm adında yeni bir poliakrilamid hidrojel, sunuyoruz. Microcontact baskı hücresel mechanostransduction eğitim için doğal hücre mikroçevresinin birçok ipuçlarının bağımsız kontrolünü kolaylaştırır ile hidroksi-PAAm kombinasyonu hidrojellerinin. 

Video: Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

Dinamik Maske Projeksiyon Fotolitografi kullanarak Sinir Kültür Sistemleri Micropatterned Hidrojeller Fabrikasyon

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Biyomühendislik

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Biyomarker Discovery için Mezogözenekli Silika İnce Filmler üzerine düşük molekül ağırlıklı Protein Zenginleştirme

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific molecular mechanisms are identified, new therapeutic strategies can be developed to treat abnormalities in specific behaviors caused by degenerative diseases or aging of the nervous system. The marine snail Aplysia californica is well suited for the investigations of cellular and molecular basis of behavior because neural circuitry underlying a specific behavior could be easily determined and the individual components of the circuitry could be easily manipulated. These advantages of Aplysia have led to several fundamental discoveries of neurobiology of learning and memory. Here we describe a preparation of the Aplysia nervous system for the electrophysiological and molecular analyses of individual neurons. Briefly, ganglion dissected from the nervous system is exposed to protease to remove the ganglion sheath such that neurons are exposed but retain neuronal activity as in the intact animal. This preparation is used to carry out electrophysiological measurements of single or multiple neurons. Importantly, following the recording using a simple methodology, the neurons could be isolated directly from the ganglia for gene expression analysis. These protocols were used to carry out simultaneous electrophysiological recordings from L7 and R15 neurons, study their response to acetylcholine and quantitating expression of CREB1 gene in isolated single L7, L11, R15, and R2 neurons of Aplysia.

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Marine snail Aplysia californica has been widely used as a neurobiology model for the studies on cellular and molecular basis of behavior. Here a methodology is described for exploring the nervous system of Aplysia for the electrophysiological and molecular analyses of single neurons of identified neural circuitry.

Aplysia Tek Nöronların Elektrofizyolojik ve Moleküler Analizleri için Gangliyon Hazırlama

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

Tedavi Uygulamaları için bir alet olarak RGD-fonksiyonelleştirilmiş Hidrojeller Sentezi

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Su Arıtma Membranlar olarak Zehirli Özelliklere Sahip Hidrojeller Sentezi

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical environment. During this process, mechanosensitive osteocytes regulate the opposing responses between the catabolic osteoclasts and anabolic osteoblasts. To better understand the highly intricate signaling pathways that regulate this process, our lab has developed a foundationary lab-on-a-chip (LOC) platform for analyzing functional outcomes (formation and resorption) of bone remodeling within a small scale system. As bone remodeling is a lengthy process that occurs on the order of weeks to months, we developed long-term cell culturing protocols within the system. Osteoblasts and osteoclasts were grown on functional activity substrates within the LOC and maintained for up to seven weeks. Afterward, chips were disassembled to allow for the quantification of bone formation and resorption. Additionally, we have designed a 3D printed mechanical loading device that pairs with the LOC platform and can be used to induce osteocyte mechanotransduction by deforming the cellular matrix. We have optimized cell culturing protocols for osteocytes, osteoblasts, and osteoclasts within the LOC platform and have addressed concerns of sterility and cytotoxicity. Here, we present the protocols for fabricating and sterilizing the LOC, seeding cells on functional substrates, inducing mechanical load, and disassembling the LOC to quantify endpoint results. We believe that these techniques lay the groundwork for developing a true organ-on-a-chip for bone remodeling.

Here, we present protocols for analyzing bone remodeling within a lab-on-a-chip platform. A 3D printed mechanical loading device can be paired with the platform to induce osteocyte mechanostransduction by deforming the cellular matrix. The platform can also be used to quantify bone remodeling functional outcomes from osteoclasts and osteoblasts (resorption/formation).