המחברים מבקשים להודות ל: ד&quot;ר פרנק ג&#39;יאנג, ד&quot;ר דוד לין, ד&quot;ר ברנרד Yurke וד&quot;ר עודאי Chippada על תרומתם בפיתוח טכנולוגית ג&#39;ל DNA; ד&quot;ר Norell Hadzimichalis, סמיט השאה, קימברלי פיטרמן, רוברט Arter להערות והעריכות של כתב היד הזה שלהם; מקורות מימון כולל ועדת ניו ג&#39;רזי על חוט השדרה המחקר (גרנט # 07Â-019-SCR1, מעבדת המאיץ הלאומי) וניו ג&#39;רזי Neuroscience מכון (MLP); ומוציאים לאור של הנדסת רקמות, חלק א &#39;לאישור להדפיס מחדש איורים 2 ו 4 וBiomaterials רשות להדפיס מחדש את איור 3.

<ol>
	<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+focal+adhesion+assembly+A+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates.">Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).</li><li>Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+equilibrium+swelling+behaviour+of+ph-sensitive+hydrogels+containing+2-hydroxyethyl+methacrylate.">Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate.</a> Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).</li><li>Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+elastomeric+biomaterials+based+on+resilin-like+polypeptides.">Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides.</a> Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).</li><li>Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+behavior+on+shape+memory+polymer+substrates.">Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates.</a> Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repositioning+of+cells+by+mechanotaxis+on+surfaces+with+micropatterned+youngs+modulus.">Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus.</a> J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).</li><li>Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ions+on+the+dynamic+behavior+of+an+electrodriven+ionic+polymer+hydrogel+membrane.">Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane.</a> Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).</li><li>Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+swelling+of+polyacrylate+hydrogels+in+physiological+salt+solutions.">Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).</li><li>Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+outgrowth+on+a+DNA+crosslinked+hydrogel+with+tunable+stiffnesses.">Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses.</a> Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).</li><li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+dynamic+stiffness+of+the+substrates+on+neurite+outgrowth+by+using+a+DNA-crosslinked+hydrogel.">Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).</li><li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+fibroblast+growth+and+the+dynamic+stiffnesses+of+a+DNA+crosslinked+hydrogel.">The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel.</a> Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).</li><li>Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+photodegradable+hydrogels+as+dynamically+tunable+cell+culture+platforms.">Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).</li><li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+a+reversible,+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogel.">Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel.</a> J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).</li><li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+rigid+spherical+inclusions+in+young's+moduli+determination:+Application+to+DNA-crosslinked+gels.">Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels.</a> J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).</li><li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+immobilization+of+biomolecules+to+agarose+hydrogels+for+controlled+cellular+response.">Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response.</a> Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).</li><li>Marklein, R. A., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+controlled+hydrogel+mechanics+to+modulate+stem+cell+interactions.">Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions.</a> Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).</li><li>Pelham Jr, R. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogels+with+increasing+crosslinker+density.">Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density.</a> BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).</li><li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+substrate+stiffness+and+cell+density+on+primary+hippocampal+cultures.">Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures.</a> J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).</li><li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dendrite+arborization+by+substrate+stiffness+is+mediated+by+glutamate+receptors.">Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors.</a> Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).</li><li>Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+morphology+on+dynamic+softening+of+hydrogels.">Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels.</a> Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).</li><li>Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+characterization+of+the+injured+spinal+cord+after+lateral+spinal+hemisection+injury+in+the+rat.">Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat.</a> J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+growth+in+3d+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties.">Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).</li><li>Wozniak, M. A., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+in+development+A+growing+role+for+contractility.">Mechanotransduction in development A growing role for contractility.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).</li><li>Wuerfel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mr-elastography+reveals+degradation+of+tissue+integrity+in+multiple+sclerosis.">Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis.</a> Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).</li><li>Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymerization+in+microfluidic+gradient+generators+Microscale+control+of+substrate+compliance+to+manipulate+cell+response.">Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response.</a> Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

היכולת של ג&#39;לי DNA כדי לרכך או להקשיח לפני ואחרי הידבקות התא הופכת אותם למודל אידיאלי כדי ללמוד את התפקיד של קשיחות רקמה דינמית על תפקוד תא. כל שלושה העיצובים שנעשו שימוש במחקרים מכאניים וביולוגיים. עם זאת, יש את כל שלושת העיצובים גמישויות דומות בשיעורי crosslink שונים, המצביעים על אורך crosslink אינו משפיע על אלסטיות ג&#39;ל DNA (טבלה 2). בניגוד לכך, ריכוז acrylamide משפיע גמישות. עיצובים אלו עשויים להיות שונים בקינטיקה crosslinking מאז נטיות התפוצצות ג&#39;ל, או הנטייה של ג&#39;לים לפזר בתקשורת או חיץ, יורד עם עלייה באורך crosslink. מידע עם זאת הקינטית על ג&#39;לי DNA הוא מוגבל, אבל אנחנו יודעים 30% נוספים מcrosslinking מתרחש יומיים לאחר לידת L2 לג&#39;לי DNA 50% 11. אף על פי כן, הדור של כוחות מרחיב והתכווצות מריכוך ג&#39;ל והתקשות, בהתאמה, הוא בלתי נמנע ולא ניתן decoupled18,21. 100 → 70 ג&#39;לי% מייצר כ 0.5 אבא של מתח 21, בעוד ג&#39;לי 50 → 100% ליצור רק על 0.04 אבא של מתח מאז נדרשת יותר אנרגיה כדי ליצור קשרים בין שלושת היציעים של ssDNA 18. לכן, הפרשנות של תוצאות דורשת השיקול של לחץ ומתח שנוצר על ידי ההתקשות והריכוך של ג&#39;לי. אתגרים טכניים יכולים להתעורר בעת הכנת ג&#39;לי DNA. הבעיה הטכנית הנפוצה ביותר היא התפוצצות ג&#39;ל. התפוצצות ג&#39;ל יכולה להתרחש במהלך מספר שלבים של הכנת ג&#39;ל DNA כוללים נפיחות ג&#39;ל, אחסון, וצמיחת תאים. התפוצצות ג&#39;ל נגרמת על ידי גורמים מרובים. ראשית, התפוצצות ג&#39;ל יכולה להיות תוצאה של הרכב פתרון לא תקין. טעויות נפוצות כוללות המסה מספקת של ssDNA lyophilized וpipetting לא תקין של הנוזלים צמיגים. כדי להימנע משגיאות pipetting, להעלות את טמפרטורת החימום כדי להפחית את צמיגות ג&#39;ל לpipetting קל יותר של פתרונות או aliquot בבוקר נדרשount של SA1 ופתרון polymerized SA2 לפני הצעד המבעבע חנקן השני. כמו כן, חימום חוזר ונשנה של פתרונות polymerized יכול באופן חלקי להתאדות הפתרון ולהגדיל את צמיגות פתרון. הוספה כמה מיקרוליטר של חיץ TE יכול לעזור להפחית את הצמיגות. שנית, התפוצצות ג&#39;ל יכולה להיות תוצאה של איכות DNA עניה. דיווחי QA / QC חייבים להיבדק בתדירות גבוהה. אם דיווחי QA / QC הם מקובלים והתפוצצות ג&#39;ל עדיין מתרחשת, ssDNA המטוהר HPLC יכול לשפר את איכות DNA. שלישית, התפוצצות ג&#39;ל יכולה לנבוע מחישול DNA מספיק. יש לנו הפחתנו את השכיחות של התפוצצות הג&#39;ל על ידי כולל צעדי חישול וצעדי rehybridization בפרוטוקול המקורי (ראה 1.3.6 צעדים ו2.8; 1.3.8 ו2.10, בהתאמה). התפוצצות ג&#39;ל עשויה למנוע על ידי הארכת חישול וקירור פעמים. עם זאת, חשיפה נוספת לחום יכול להתאדות מים לגרום לעליה בניתוק ג&#39;ל מהזכוכית כאשר ג&#39;לי מחדש תפחו. אם הניתוק הוא מוגזם לכל עת חישול, אןניתן לבטל את צעדי אילינג (1.3.6 ו2.8). עוד בעיה טכנית תכופה נתקלה בה היא הידבקות תא מספיק. ג&#39;לים הנפוח הם רכים יותר מהג&#39;לי הבלתי הפגוע הידבקות תא קבלת 18 (2 טבלה) קשה. יתר על כן, מאחר ולכל סוג תא מגיב בצורה שונה לרקמות נוקשות, כמה סוגי תאים עלולים להיתקל דילמה טכנית זה בעוד סוגי תאים אחרים לא. כדי לפתור בעיות הידבקות חלק מהצעדים המעקב יש לשקול: (1) להשתמש בצפיפות גבוהה ציפוי, (2) להחליף את חלבוני ECM מצומדת לsulfo-SANPAH, (3) לווסת את הפרמטרים הנוקשות, (4) להגדיל את חלבון ECM או ריכוז sulfo-SANPAH, ו( 5) להגדיל פעמים דגירה. סוכנים רעילים שיורית כגון מונומר acrylamide, APS, וTEMED יכולים גם לתרום לחוסר הידבקות והמוות של תאים על ג&#39;לים. אנחנו לא חווינו בעיה זו מאז שוטף הנרחב שולב הפרוטוקול הוכיח מספיק, אבל אנחנו ממליצים Performing שלב אופציונאלי 3.2 אם בעיה זו מתרחשת. יכול להיות מנוצל ג&#39;לי DNA ללמוד בצורה יעילה יותר במגוון של פונקציות תא בתנאים דינמיים או סטטי. אנחנו הראינו כי fibroblasts ותאי עצב גדל על ג&#39;לי DNA מושפעים אפנון אלסטיות ג&#39;ל. מאז אינטראקציות תא מטריצה ​​הן בדרך כלל ממשקים תלת ממדים, מידע ממחקרי מטריצה ​​דינמית תלת ממדיים יעזור לייצר יותר מבחינה ביולוגית הנתונים רלוונטיים. לכן, אנחנו נמצאים כרגע תרגום בטכנולוגיה זו לפיגום תלת ממדי. אנחנו מפתחים טכניקה שמחליפה את עמוד השדרה polyacrylamide עם חומר ביולוגית יותר, תוך שמירה על טכנולוגית crosslinking DNA. פיגום חדש זה ישמש כמודל תלת ממדים, דינמי ופיגום הנדסת רקמות. biocompatibility יפתח הזדמנויות עבור יישומי מכשיר רפואיים.

מצעים סטטי ודינמיים שתי קטגוריות של חומרים ביולוגיים שפותחו כדי לחקור את ההשפעות של גמישות רקמות או נוקשות בתפקוד תא. מצעי סטטי אינם מסוגלים לשנות את התכונות הפיזיות שלהם אחרי שהם מפוברקים ו / או פעם תאים מצופה. Polyacrylamide ג&#39;לים (הרשות הפלסטינית) היו מצעים הראשונים דו ממדים, סטטי שהיו מסונתזים לחקירות mechanobiology 5,17. ג&#39;לי הרשות הפלסטינית הם קל להכנה, זול, תכליתי, והוא יכול להיות מפוברק עם מגוון רחב של moduli אלסטי. למרות יתרונות הטכניים אלה הופכים את הרשות הפלסטינית ג&#39;לי מצע נפוץ מיושם, מצעי סטטי אינם מעידים על האופי הדינמי של מטריצת חוץ תאית (ECM) וסביבה סלולרית המקיפה in vivo. לדוגמא, ECM עובר שינויי נוקשות כתוצאה מפגיעה, פיתוח, או מחלה. מצעים דינמיים ולכן הם העדיפו כמודלים מצע מחקה רקמות במחקרי mechanobiology <sup&gt; 22,24,25. סינטטי רב, דו ממדי חומרים ביולוגיים טבעיים,, תלת ממדים, סטטי, ודינמיים פותחו כדי לחקות רקמות נוקשות 1,3,6,16,23,26. כמה מצעים דינמיים דורשים חום, UV, זרם חשמלי, יונים, ושינויי pH לשנות התכונות מכאניות שלהם 2,4,7,8,12,15,16, אך גירויים אלה יכולים להגביל ביו היישום של הידרוג&#39;ל. הידרוג-crosslinked DNA polyacrylamide (ג&#39;לים DNA) הם מצעי אלסטי דו ממדים דינמיים. crosslinks DNA מאפשר לאפנון מרחב, בזמן, והפיך של ג&#39;ל DNA נוקשות על ידי תוספת של DNA חד גדילים (ssDNA) לתקשורת או חיץ 9-11,13,14,18,21. שלא כמו ג&#39;לי הדינמי האמור שבו גירויים מוחלים לאפנון של גמישות, ג&#39;לים DNA מסתמך על דיפוזיה של ssDNA שימושי לשינוי של גמישות. לכן, המשטח העליון ג&#39;ל, שבו תאים גדלים, הוא האזור הראשון המווסת בגלל o השיעוראפנון גמישות f תלוי בעובי ג&#39;ל. ג&#39;לי DNA דומה לעמיתיהם ג&#39;ל הרשות שביש להם עמוד שדרה polyacrylamide, לעומת זאת crosslinks bis-acrylamide מוחלף בcrosslinks המורכב מדנ&quot;א (איור 1). שתי ssDNAs (SA1 וSA2) להכליא עם גדיל crosslinker (L2) כדי לפצות crosslinks DNA של ג&#39;ל. SA1 וSA2 יש רצפים שונים ששניהם מכילים שינוי Acrydite בסוף 5&#39;להתאגדות אפקטיבית לרשת של הרשות הפלסטינית. להכנת ג&#39;לי, SA1 וSA2 הם polymerized בנפרד לתוך עמוד השדרה של הרשות הפלסטינית ו, לאחר מכן, SA1 וSA2 polymerized מעורבבים יחד. L2, crosslinker, מתווסף לSA1 ותערובת SA2. רצף בסיס L2 הוא משלים לשני רצפי SA1 וSA2 וL2 hybridizes עם SA1 בתוספת SA2 כדי ליצור את crosslinks DNA. גמישות ראשונית, ג&#39;ל DNA נקבעה על ידי שני ריכוזי L2 וcrosslinking (לוחות 1 </strong&gt; ו2). ג&#39;לי DNA המכיל כמויות stoichiometric שווה של L2, SA1, וSA2 הוא ג&#39;לי הנוקש בגלל SA1 וSA2 100% crosslinked ידי L2 (מיועד כג&#39;לי 100%). ריכוזים נמוכים של תוצאת L2 בשיעור נמוך יותר של crosslinking DNA, ולכן, ג&#39;לים DNA רך יותר. ג&#39;לים נמוך כמו 50% crosslinked (מיועד כג&#39;לי 50%) נבנה 9-11. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig1highres.jpg" /> איור 1 crosslinking ג&#39;ל DNA ו9-11,13,14,18,21 סכמטי uncrosslinking שלב 1:. SA1 (אדום) וSA2 (כחול) הם polymerized בנפרד לתוך עמוד השדרה polyacrylamide (שחור). לאחר פילמור, פתרונות polymerized SA1 וSA2 מעורבבים יחד. שלב 2: L2 (ירוק) הוא הוסיף וhybridizes עם SA1 בתוספת SA2 כדי ליצור את crosslinks של ג&#39;ל. שלב 3: R2 hybridizes עם tהוא דריסת הרגל של L2. שלב 4: הכלאת דריסת רגל של R2 מניעה את הרוכסן של L2 מSA1 וSA2. שלא כמו ג&#39;לי הרשות הפלסטינית, ג&#39;לים DNA יכול להקשיח ולרכך לאחר סינתזה. מסיבה זו, תאים שגודל על ג&#39;לי DNA יכולים להיות נתונה לשינויים קשיחות דינמיות. כדי להקשיח ג&#39;לי תא חסיד, ניתן להוסיף L2 לתקשורת והתרבות של ג&#39;לים אחוז הנמוך כדי להגדיל את האחוז של crosslinks. כדי לרכך ג&#39;לי תא חסיד, ניתן להסיר L2 כדי להקטין את אחוז crosslinks 10,13,21. יש L2 רצף דריסת רגל נוסף בסוף 3&#39;לאפשר L2 לuncrosslink מSA1 וSA2 (טבלת 1). הסרת L2 מושגת על ידי הכלאה של גדיל היפוך נקרא R2. R2 הוא משלים לכל אורכו של L2 וhybridizes ראשון עם דריסת רגל L2. הכלאה דריסת רגל מניעה את הרוכסן של L2 מSA1 וSA2, אשר מבטל את crosslink ומפחית את נוקשות ג&#39;ל. בדוח זה ו<html> וידאו, צעד אחר צעד הוראות ניתנות להכנת התקשות וריכוך ג&#39;לי DNA. בעוד הכנות ג&#39;ל 100% ו80% ​​מתוארים, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי ליצור ג&#39;לים DNA של אחוזי crosslinked הראשוניים וסופיים אחרים. באופן כללי, ג&#39;לי 100% ו80% ​​מוכנים, משותק על תלושי כיסוי זכוכית, פונקציונליות, וזרע עם תאים. L2 מתווסף לתקשורת של 80 ג&#39;לי% וR2 מתווסף לתקשורת של 100 ג&#39;לי%, 48 שעות לאחר ציפוי. התוספת של L2 לתקשורת מקשיחה 80 ג&#39;לי% ל100% crosslinked, ואילו התוספת של R2 לתקשורת מרככת 100 ג&#39;לי% 80% crosslinked. ג&#39;לים התקשח יועדו כ80 → 100 ג&#39;לי% וג&#39;לים התרכך יועדו כ100 → 80 ג&#39;לי% בטקסט. לשליטה או ג&#39;לים סטטי, ssDNA בהיקף של Ts או כפי שנמסר למערכת נוספת של 100% ו80 ג&#39;לי%. לאחר מינימום של שני ימים הבאים אפנון גמישות, יכולים להיות מעובד תאים ונותחו. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:k</html style=";text-align:right;direction:rtl">יפ-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> crosslink DNA </td><td rowspan="2"> # של בסיסים </td><td> רצף (דריסת רגל) </td><td rowspan="2"> שינוי </td><td rowspan="2"> (T מ &#39;, ° C) טמפרטורת התכה </td><td rowspan="2"> תגובות </td></tr><tr><td> 5 &#39;→ 3&#39; </td></tr><tr><td rowspan="4"> עיצוב 1 </td><td> SA1 </td><td> 10 </td><td> GCA CCT TTG C </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 34.9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 10 </td><td> GTC AGA ATG </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 23.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 30 </td><td> TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG </td><td></td><td> 56 </td><td>רצף דריסת רגל 10 נ&quot;ב כלול. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 30 </td><td> TAG CAA GTG CGC ACC TTT gcg TCA GAA TGA </td><td></td><td></td><td> R2 הוא משלים לL2 </td></tr><tr><td rowspan="4"> עיצוב 2 </td><td> SA1 </td><td> 14 </td><td> CGT GGC ATA GGA CT </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 46.9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 14 </td><td> GTT TCC CAA TCA GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 40.2 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCT GAT TGG GAA AC GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C </td><td></td><td> 65.9 </td><td> דריסת רגל רצף נ&quot;ב 12 כלולה. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 40 </td><td> GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG </td><td></td><td> 65.9 </td><td> R2 הוא משלים לL2 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Design 3 </td><td> SA1 </td><td> 20 </td><td> ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 55 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 20 </td><td> TAG GCT CAT GGA CGA CTG GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 56.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T </td><td></td><td> 68.8 </td><td> דריסת הרגל אינה כלולה. </td></tr><tr><td rowspan="2"> בקרה </td><td rowspan="2"> בקרה </td><td rowspan="2"> 20-40 </td><td> AAA AAA (וכו &#39;) או </td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> TTT TTT (וכו &#39;) </td></tr></tbody></table> .1 רצפי בסיס השולחן לssDNA 9-11,13,14,18,21. נייד ומחקרים מכאניים נצלו כמה דעיצובי crosslink ifferent ליצור ג&#39;לי DNA עם מגוון רחב של תכונות מכאניות סטטי ודינמיות. הפרמטרים מווסת בעיצוב crosslink הם רצף בסיס ואורך רצף או אורך crosslink. גופנים מודגש ונטויים להמחיש זיווג בסיס בין SA1 וL2 ובין SA2 וL2, בהתאמה. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="8"> עיצוב </td></tr><tr><td colspan="3"> 1 </td><td colspan="3"> 2 </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td> ריכוז acrylamide (%) </td><td colspan="3"> 10 </td><td colspan="3"> 10 </td><td> 10 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SA1 בתוספת SA2 הכלאה לL2 (% crosslinked) </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> &lt;strong&gt; אלסטיות (kPa, ממוצע ± SEM) </td><td> 6.6 ± 0.6 </td><td> 17.1 ± 0.8 </td><td> 29.8 ± 2.5 </td><td> 5.85 ± 0.62 </td><td> 12.67 ± 1.33 </td><td> 22.88 ± 2.77 </td><td> 25.2 ± 0.5 </td><td> 10.4 ± 0.6 </td></tr></tbody></table> לוח 2: מודול יאנג (E) של ג&#39;לים DNA 9-11,13,14,18,21. ריכוז Acrylamide, אחוז crosslink, ואורך crosslink יכול להיות מווסת בג&#39;לים DNA. יש עיצובים 1, 2, ו -3 20, 28, ו40 אורכי crosslink נ&quot;ב, בהתאמה. יש לי 100 ג&#39;לי% עבור כל העיצובים moduli דומה המצביע על אורך crosslink אינו משפיע על אלסטיות ג&#39;ל. עם זאת, שינויים בריכוז acrylamide לשנות גמישות ג&#39;ל DNA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ssDNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com</td>
			<td></td>
			<td>Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Tris-EDTA buffer (TE buffer)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>93290</td>
			<td>TBE is a reproductive toxin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td>
			<td>BP14021</td>
			<td>Acrylamide is a toxin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">12-mm diameter round coverglass</td>
			<td rowspan="2">Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com</td>
			<td rowspan="2">12-545-82</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland optical adhesive 72</td>
			<td>Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com</td>
			<td>NOA72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">24-well tissue culture plate</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microcentrifuge tubes</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com or thermofisher.com</td>
			<td>C111 or 22589</td>
			<td>Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37&#176;C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td>
			<td>P6407</td>
			<td>Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com</td>
			<td>13813</td>
			<td>Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 X 60 cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive-displacement pipette</td>
			<td>Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com</td>
			<td>F148504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td>
			<td>11-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/</td>
			<td>NI 5.0UH-R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of dna-crosslinked polyacrylamide hydrogels

Mechanobiology הוא תחום מדעי מתפתח העוסק בתפקיד הקריטי של רמזים פיזיים בהכוונת מורפולוגיה תא ותפקוד. לדוגמא, ההשפעה של גמישות רקמות בתפקוד תא הוא אזור מרכזי של מחקר mechanobiology כי רקמות נוקשות מודולציה עם מחלה, פיתוח, ופציעה. חומרי סטטי מחקה רקמות, או חומרים שלא ניתן לשנות את קשיחות פעם תאים מצופה, המשמשים ברובה כדי לחקור את ההשפעות של רקמות נוקשות בפונקציות תא. בעוד שהמידע שנאסף ממחקרי סטטי הוא בעל ערך, מחקרים אלה אינם מעידים על האופי הדינמי של microenvironment הסלולרי in vivo. כדי לטפל טוב יותר את ההשפעות של קשיחות דינמית על תפקוד תאים, שפיתחנו מערכת crosslinked DNA הידרוג&#39;ל polyacrylamide (ג&#39;לים DNA). שלא כמו מצעים דינמיים אחרים, יש לי ג&#39;לי DNA היכולת להגדיל או להקטין בקשיחות לאחר הייצור ללא גירויים. ג&#39;לים DNA מורכב מcrossl DNAסוגי הדיו שpolymerized לתוך עמוד השדרה polyacrylamide. הוספה והסרה של crosslinks באמצעות משלוח של גדילי דנ&quot;א יחיד מאפשרת מרחב, בזמן, ושליטה הפיכה של גמישות ג&#39;ל. שהראינו בדוחות קודמים שאפנון דינמי של גמישות ג&#39;ל DNA משפיע פיברובלסטים ונוירון התנהגות. בדוח זה ווידאו, אנו מספקים סכמטי המתאר את מנגנוני crosslinking ג&#39;ל DNA והוראות צעד אחר צעד על ג&#39;לי DNA ההכנה.

לפני המחקרים שלנו, אינטראקציות התא-ECM נצפו בחומרים ביולוגיים תואמים סטטי או על מצעים דינמיים בלתי הפיכים וחד כיווני. מצעים אלו אינם משקפים את האופי הדינמי של microenvironment הסלולרי. העבודה שלנו מסיטה את פרדיגמות טכניות הקיימות על ידי מתן מודל פיסיולוגי יותר לחקר אינטראקציות תא ECM על ריכוך והתקשות חומרים ביולוגיים דינמיים. במחקרים קודמים, שנתחנו את ההשפעות של מצעים דינמיים בתאים על ידי בחינת מורפולוגיות תא שונות ופנוטיפים על ג&#39;לים אלה. בדוגמא אחת, אנו קובעים את ההשפעות של התקשות מצע על fibroblasts ידי הערכת מורפולוגיה פיברובלסטים על ג&#39;לי DNA דינמי. L929 תאים, שורת תאי פיברובלסט שמקורם בעכבר, היו מצופים על ג&#39;לי 80% ו100% (איור 3) 11. יומיים לאחר הציפוי, 20% פתרון L2 נוסף התווסף לתקשורת של 80 ג&#39;לי% כדי להקשיח את ג&#39;לי ל100% crosslinked (80 → 100%, פנל מרכז). 100 ג&#39;לי% וקבוצה נוספת של 80 ג&#39;לי% קיבלו שליטת ssDNA להישאר סטטי (מימין ולוח שמאלי, בהתאמה). תמונות מיקרוסקופ אור נתפסו יומיים לאחר המסירה של DNA לתקשורת. טשטוש תמונה, כפי שניתן לראות באיור 3, היה בשל חוסר אחידות משטח ג&#39;ל ואופייני ובלתי נמנע. נפיחות ג&#39;ל והתכווצות, כתוצאה מהתוספת של מאגרים וL2 18,21, תורמים לג&#39;ל חוסר אחידות. מורפולוגיה הוערכה עם תוכנת ImageJ (NIH, Bethesda, MD) ושימשה כסמן של תפקוד. Fibroblasts גדל על (80 → 100%) התקשות ג&#39;לי לא היו שינויים ביחס ממדים, אך הציג שטח הקרנה גדול יותר מאשר fibroblasts גדל על ג&#39;לי 100% 11. מעניין, את המורפולוגיה של fibroblasts גדל על ג&#39;לי סטטי הייתה שונה בהרבה את המורפולוגיה של fibroblasts גדל על ג&#39;לים דינמי. Fibroblasts גדל על 100 ג&#39;לי% היה שטח קטן יותר הקרנה ויחס ממדים גדול יותר מfibroblasts גדל על ג&#39;לי 80%. מחדש אלהיש תוצאות מצביעות על כך שפיברובלסטים ההתנהגות תלויה באופי הדינמי של microenvironment. במחקר אחר, את ההשפעות של מצע ריכוך על נוירונים נקבעו על ידי ניתוח פנוטיפים עצביים כולל מספר דנדריט, אורך דנדריט, ואורך האקסון (איור 4) 10. תאי עצב בחוט השדרה המופקת חולדה גדלו על ג&#39;לי 100% ו50%. ארבעה ימים לאחר הציפוי, 50% R2 התווסף לתקשורת של 100 ג&#39;לי% לרכך את ג&#39;לי ל50% crosslinked (100 → 50%, פנלים במרכז). 50 ג&#39;לי% וקבוצה נוספת של 100 ג&#39;לי% קיבלו שליטת ssDNA להישאר (פנלי ימין ועל שמאל, בהתאמה) סטטי. לאחר שלושה ימים, הנוירונים היו קבועים immunostained עם סמן דנדריטים (MAP2, לוחות העליונים), סמן axonal (טאו, פנלים באמצע), וגרעינים (DAPI, לוחות תחתון) כדי להעריך פנוטיפים. הנוירונים גדלו על ג&#39;לים לריכוך (100 → 50%) לא היו הבדלים במספר דנדריט ראשוני או אורך האקסון, אבל הציגו דנדריטים עיקריים קצרים יותר מאשר תאי עצב o גדלו<html> ג&#39;לי 50% n. כמו במחקרים פיברובלסטים, פנוטיפים עצביים על ג&#39;לי סטטי היו שונים בהרבה פנוטיפים עצביים על ג&#39;לים דינמי. הנוירונים גדלו על 50 ג&#39;לי% היו פחות דנדריטים עיקריים והאקסונים ארוכים יותר מהנוירונים גדלו על ג&#39;ל 100%. לסיכום, תמונות פיברובלסטים ונוירון מראות כי סוגי תאים מרובים ניתן ללמוד על ג&#39;לי DNA דינמי וסטטי, חוסר אחידות ג&#39;ל DNA גורם אתגרי הדמיה, טכניקות מורפולוגיים וimmunostaining סטנדרטיים הן אפשריים, והכי חשוב התנהגותם של תאים תלויה בדינמיקת מצע. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig3highres.jpg" /> Fibroblasts איור 3 גדל על ג&#39;לי DNA סטטי ודינמי. תמונות מיקרוסקופ אור הנציג של L929 fibroblasts גדלו על 80% (פנל משמאל), 80 → 100% (פנל במרכז), ו100 ג&#39;לי% (פנל מימין). סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. נתון זה שונה מ11.href = היעד &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51323/51323fig3large.jpg&quot; = &quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig4highres.jpg" /> נוירונים איור 4 גדלו על ג&#39;לי DNA. תמונות ניאון נציג של תאי עצב בחוט השדרה גדלו על 100% (פנלים משמאל), 100 → 50% (פנלים במרכז), ו50% ג&#39;לי (לוחות מימין). immunostaining MAP2 מציין דנדריטים (פנלים למעלה), immunostaining טאו-1 מציין אקסונים (פנלים באמצע), ומכתים DAPI מציין גרעין (פנלים תחתון). סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. נתון זה שונה מ10. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51323/51323fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels at JoVE.com

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

המעבדה שלנו פיתחה הידרוג-crosslinked DNA polyacrylamide, מערכת הידרוג&#39;ל דינמית, כדי להבין טוב יותר את ההשפעות של ויסות רקמות נוקשות על תפקוד תא. כאן, אנו מספקים שרטוטים, תיאור, ופרוטוקולים להכנת הידרוג אלה.

הכנת-crosslinked DNA polyacrylamide הידרוג

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

preparation-of-dna-crosslinked-polyacrylamide-hydrogels

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Views.  JFK Medical Center.  המעבדה שלנו פיתחה הידרוג-crosslinked DNA polyacrylamide, מערכת הידרוג'ל דינמית, כדי להבין טוב יותר את ההשפעות של ויסות רקמות נוקשות על תפקוד תא. כאן, אנו מספקים שרטוטים, תיאור, ופרוטוקולים להכנת הידרוג אלה. 

Video: Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

פורסים הכנה אופקי של הרשתית

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

הכנת ניתק תרבויות עכבר קליפתיים Neuron

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and high quantitation. Furthermore, it is completely compatible with mass spectrometric protein identification. But despite these advantages, CBB is regarded to be less sensitive than silver or fluorescence stainings and therefore rarely used for the detection of proteins in analytical gel-based proteomic approaches.
Several improvements of the original Coomassie protocol1 have been made to increase the sensitivity of CBB. Two major modifications were introduced to enhance the detection of low-abundant proteins by converting the dye molecules into colloidal particles: In 1988, Neuhoff and colleagues applied 20% methanol and higher concentrations of ammonium sulfate into the CBB G-250 based staining solution2, and in 2004 Candiano et al. established Blue Silver using CBB G-250 with phosphoric acid in the presence of ammonium sulfate and methanol3. Nevertheless, all these modifications just allow a detection of approximately 10 ng protein. A widely fameless protocol for colloidal Coomassie staining was published by Kang et al. in 2002 where they modified Neuhoff's colloidal CBB staining protocol regarding the complexing substances. Instead of ammonium sulfate they used aluminum sulfate and methanol was replaced by the less toxic ethanol4. The novel aluminum-based staining in Kang's study showed superior sensitivity that detects as low as 1 ng/band (phosphorylase b) with little sensitivity variation depending on proteins.
Here, we demonstrate application of Kang's protocol for fast and sensitive colloidal Coomassie staining of proteins in analytical purposes. We will illustrate the quick and easy protocol using two-dimensional gels routinely performed in our working group.

This video shall popularize a colloidal Coomassie G-250 staining protocol according to Kang et al. for the detection of average 4 ng protein in gels. The staining is completed within 2 hours and without any effort. We routinely use Kang's protocol for analytical purposes in gel-based proteomics.

מהיר רגיש Colloidal Coomassie G-250 מכתים עבור חלבונים ג&#39;ל polyacrylamide

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Denaturing polyacrylamide דשן ג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

שיחקרו את ההשפעות של מטריקס נוקשות על פונקציה נייד באמצעות Acrylamide מבוססי הידרוג

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

הכנת Pyrophosphates אינוסיטול איכות

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

גירוי מכאני של הידרוג Chondrocyte-agarose

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...