1. Tali Canlılık Kiti ile boyanarak Hücreleri - Ölü Hücre Kırmızı Reaktif <ol><li> CellLight Nucleus-GFP * BacMam 2.0 kullanarak transduced U2OS hücreleri (Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu) ile bu yordama başlamadan *. (Not: Hücreler aynı zamanda aşağı döndü ve orta ya da PBS içinde yeniden süspanse olabilir). </li><li> PI ile ölü hücreleri leke için, yeni bir mikrosantrifüj tüpü 100 mcL hücrelerinin transferi. 1 x 10 5 1 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon tayini için önerildiğini unutmayın, ama konsantrasyonu tam olarak sahip değildir. </li><li> Daha sonra, ölü hücreleri leke PI tabanlı Tali Ölü Hücre Kırmızı reaktif 1 mcL ekleyin. Vortex kısa bir süre karıştırın. 1-5 dakika karanlıkta, oda sıcaklığında Tali Ölü Hücre Kırmızı reaktif ve hücre karışımı inkübe edin. </li><li> Inkübasyon sonrasında, hemen Tali Görüntü Tabanlı Sitometre numune analizi geçin. </li></ol> 2. Hücre Canlılık Testi Sahne kullanmaTali Görüntü Tabanlı Sitometre <ol><li> Tali sitometresinin, özellikle sitometresinin sığacak ve iki ayrı kapalı odaları (A ve B) 25μL örnekleri tutabilir tek kullanımlık plastik Tali Hücresel Analiz Slaytlar kullanır. Slayt tutarken, her iki tarafın da onu tutmak için emin olun. </li><li> Yavaş yavaş, yarım ay biçimli bir örnek yükleme alanı içine slayt, pipet 25 mcL örnek oluşturan kabarcık veya geri sıçramak özen yüklemek için. Veya dolgu altında bırakmayın. </li><li> Burada, kontrol hücreleri (lekesiz, non-transduced) odasında yüklenir A ve lekeli GFP ifade hücreleri kontrol örneği verileri analiz ederken otofloresans düzeyi belirlemek yardımcı olacaktır kamara B. yüklenir. </li><li> Sitometresinin ana ekranda bir canlılığı testi, dokunmatik GFP / TÇD gerçekleştirmek için. Tahlil seçenekleri sonra sağ tarafta görünecektir. GFP + Canlılık seçin. </li><li> Daha sonra, örnek bir dizi isim, Şimdi Adı basın </strong&gt;. Sonra, dokunmatik ekranı kullanarak, örnek serisi adını yazın ve Kaydet tuşuna basın. (Not: Seç Adı daha sonra tarihi ve saati otomatik olarak her bir numune serisi için bir isim atamak için .) </li><li> Örnek adlandırma sonra, Tali sitometresinin Ölçü ekranına otomatik olarak ilerler. Ölçü ekranın sağ alt yarısında Arka Plan sekmesine basınız. </li><li> Sonra, durana kadar (A) Sitometre uzakta karşı karşıya kontrol örneği ile yükleme noktası slayt eklemek. Kuvvet uygulamayın. </li><li> Arka plan ekran, dokunmatik Yeni lekesiz Hücre Kontrol Ekle tuşuna basın. Slayt otomatik olarak sitometresinin içine çekilebilir ve hücrelerin canlı bir görüntü ekranda görüntülenir. </li><li> Odak düğmesini kullanarak, doğru düzlemde hücreleri getirmek. Hücreler her hücre etrafında parlak bir hale (Şekil 1, Sol) ile düzgün koyu renkli olmalıdır. </li><li> Hücrearka plan ve hücrelerin kenarları arasındaki geçiş bulanık s hücre sınırları iyi tanımlanmış değildir (Şekil 1-Merkez), böylece undercounted olabilir. Hücreler overcounted parlak merkezleri ve karanlık çevrelerinin (Şekil 1, sağ) olduğunda olabilir. </li><li> Odaklanarak hücre popülasyonu daha iyi görmek için, 16X 4X ya da kırmızı Zoom göstergesi düğmesini kaydırın . </li><li> Hücreleri odak noktası haline getirilmiştir sonra, arka plan floresan ölçmek için lekesiz Hücre Kontrolü Çalıştır düğmesine dokunun. </li><li> Sitometresinin otomatik olarak yakalama ve örnek görüntüleri analiz eder. (Resim 9) modu, varsayılan görüntü yakalama ve analiz etmek için yaklaşık 1 dakika sürer. </li><li> Thumbnails görünümü her alanda esir olarak görüntülenir ve ilerleme çubuğu, devam eden bir güncelleştirme sağlar. Görüntü yakalama işlemi tamamlandıktan sonra, sitometresinin otomatik olarak slayt çıkarıyor ve çekilen görüntülerin analiz verileri sağlar. </li><li>Depolanan veri sitometresinin Arka Plan sekmesini menüsü açılan gözükecektir. Arka plan kontrolü örnek deney verilen ve açılır menüden ithal edilecek aynı adı tahsis edilecektir. Not: bir arka plan kontrolü değilse, sitometresinin otomatik olarak bir floresan eşik atar. Bu tahlil yaptıktan sonra elle değiştirilebilir. </li><li> PI lekeli transduced örneği çalıştırmak için, sitometresinin slayt kaldırmak etrafında çevirin ve transduced numune cihaz uzak bakacak şekilde yeniden takın. </li><li> Örnek sekmesine basınız ve daha sonra Yeni Örnek Ekle tuşuna basın dokunmatik . Görüntü ekranda belirdiğinde görüntü ayar düğmesi hücreler, daha önce olduğu gibi odak noktası haline getirmek için kullanın. Sonra Örnek Çalıştır düğmesine dokunun. </li><li> Görüntü yakalama işlemi tamamlandıktan sonra, veri analiz örnek sekmesi ve sitometresinin otomatik altında görünürmüttefiki slayt çıkar. </li><li> Uygun Tali Hücresel Analiz Slide biyolojik tehlikeli atık olarak bertaraf. Tali Hücresel Analiz Slaytlar tekrar edilemez. </li></ol> 3. Ayar Eşikler ve Gates <ol><li> Örnek çalıştırıldıktan sonra, eşikler artık belirli bir hücre popülasyonu üzerinde ev için örnek olabilir. Burada, biz, hücreler transduced-GFP canlı ve ölü hücrelerin yüzdesi belirlemek için eşikleri ayarlayabilirsiniz. </li><li> Örnek sekmesi altında, GFP ifade hücreler, GFP, toplam canlılığı, ortalama hücre boyutu, sayılır hücrelerinin sayısı ve hücre konsantrasyonunu ifade canlı ve ölü hücreleri sayı ve yüzde olarak gösterilir. </li><li> Buna ek olarak, hücre boyutu, yeşil floresans, kırmızı floresans (PI) gösteren histogram araziler, ekranın alt kısmında görüntülenir. </li><li> Hücre boyutunu kapısı ayarlamak için, Hücre Boyutu Küçük resim hücre boyutu histogram açmak için dokunun. Kültür hücreleri d nadiren olsa daebris, diğer örnekleri hücrelere oranla daha büyük ya da küçük kalıntılar içerebilir. </li><li> Bu enkaz dışlamak için, hem küçük hem de büyük olaylar hariç, kaydırma çubuğu üzerindeki mavi düğmeleri doğru kaydırın. Sonra, dokunma, verileri yeniden analiz uygulayın ve sonuçları güncelleyecektir . </li><li> Sonra, GFP floresan analize eklemek için, açmak için GFP histogram minik dokunmayın. Kontrol örneği bir kılavuz olarak kullanarak, sadece en belirsiz tepe sağ eşik ayarlamak için mavi çubuğunu kaydırın. </li><li> Bu analiz, GFP pozitif hücreler içerir, ancak autofluorescent hücreleri hariç sağlar. Biyolojik moleküllerin hücre içinde heyecanlıyız Otofloresans sık görülmektedir. </li><li> Onaylayın ve bir önceki ekrana dönmek için Uygula dokunun. Örnek sekmesi altında görüntülenen veriler artık her iki floresan kanal için belirlenen kapı ve kapı eşikleri yansıtmalıdır . </li><li> Daha sonra, otofloresansı basın t PI boyanan hücrelerin ayrıPI histogram minik PI histogram açmak için. </li><li> Yine, kontrol örneği zirve histogram üzerinde gri bir zirve olarak görünecektir. Kırmızı tepe örnek floresan. Eşiğe bu sitometresinde 0 RFU değerine yakın bir tepe olarak görüntülenir. </li><li> PI kanalı arka plan floresan ortadan kaldırmak için, bir referans olarak kontrol örneği gri pik kullanarak, arka plan floresan temsil eden zirve dışlamak için eşik ayarlamak için kaydırma çubuğunu mavi düğme hareket. Onaylayın ve bir önceki ekrana dönmek için Uygula dokunun. </li><li> Sonra, sonra Katmanlar tab tuşuna basarak görsel, her hücre doğru atanmış olduğunu onaylamak Zoom sekmesinde görüntünün küçük resmini basarak, incelenmek üzere yakalanan bir alan seçin. </li><li> Sonra, bu özel kanal aracılığıyla çekilen görüntü ekranı, GFP veya PI düğmesine basın .. Ekrandaki tabakayı kaldırmak için aynı düğmeye tekrar basın; veya katmanları üst üste, Çoklu Katman düğmesine dokunun. </li><li> Hücreleri belirli bir kanal, dokunmatik Çemberleri ile nasıl sayılır tanımlamak için. Floresan mavi çember olacak ifade yok sadece parlak bir alan kanal, üzerinden sayıldı hücreleri. Bu belirli bir hücre (yani PI negatif) canlı olduğunu gösterir. </li><li> Hücreler ifade GFP GFP kanal olacak ve yeşil daire olacak. PI kanal Ölü Hücre Kırmızı ile boyanmış ölü hücreleri görülebilir ve kırmızı daire içine alınmış olacak. </li><li> Sarı, kırmızı ve yeşil kanal sayılır Hücreler daire olacak, bu hücre, GFP ifade ettiğini gösterir, aynı zamanda PI ile boyanmış ve bu nedenle öldü. </li><li> Bazen, siyah daireler, ekranda görünecek, bu nesneleri tespit edilmiştir, ancak hücre boyutuna göre analiz dışında tutulmuştur. </li><li> Fi devamne ayar floresan ifade her hücre uygun bir renk ile daire kadar açıklanan adımları kullanarak floresan histogram eşik. </li><li> Tüm analiz parametreleri otomatik olarak veri sekmesi altında kaydedilir. Tali sitometresinin örnek çalışan yaklaşık 500 veri dosyalarını saklayabilir. </li><li> Veri sekmesinde saklanan Her dosya reanalysis kullanılabilir. Veri sekmesinden dosya seçerek açtı ve tüm histogramlar ve katmanları aktif hale olacaktır. </li><li> Arşiv verileri ve raporları oluşturmak, Sitometre saklanan verileri bir bilgisayara bir USB sürücü kullanarak transfer edilebilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Tali Görüntü Tabanlı Sitometre bir nükleer hedefli GFP BacMam 2.0 ifade inşa transduced hücrelerin floresan protein ekspresyon seviyesi ölçmek için kullanılmıştır. Dört temsili hücre tipleri (U2OS, 293MSR, HEKn ve CHO-S) transduced edildi.Bu hücre hatları için, GFP ifade edildi hücrelerinin sayısı Tali sitometresinin tarafından bildirilen ve aynı örneklerinden bir akış sitometresinde analiz verileri ile karşılaştırıldığında. Ayrıca, hücreler Ölü Hücre Kırmızı reaktif Tali sitometresinde ve bir akış sitometresinde hem ölü hücre popülasyonu tespit Tali Canlılık kiti kullanılarak boyandı. Şekil 2&#39;de grafik GFP ifade vardı, her hücre tipi için toplam nüfusun yüzde göstermektedir. Bu veriler, Tali sitometresinin bir akış sitometresinde tarafından oluşturulan verilerin karşılaştırılabilir veri üretmektedir göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig1.jpg" /> Şekil 1. Hücreler düzgün analizinden önce odaklı olmalıdır. Tali Hücresel Analiz slaytlar analizi için uygun (1 x 10 1 - 5 x 10 7 hücreleri tavsiye edilir) hücre konsantrasyonları ile (SOL) odak hücrelerin düzgün darka plan arasındaki geçiş ve hücrelerin kenarları bulanık ve hücrelere parlak olduğunda Hücreler belki overcounted tanımlanmamış sınırları (SAĞ) olduğunda, her bir hücre (MERKEZ) Hücreler etrafında parlak bir hale ile hücre boyunca gemisinin, undercounted olabilir merkezleri ve karanlık çevrelerinin. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig2.jpg" /> Şekil 2. Tali Görüntü Tabanlı Sitometre floresan protein ekspresyonu verileri flow sitometri kullanılarak elde edilen karşılaştırılabilir canlı hücreler 4 farklı hücre hatları hesaplanan GFP-ifade sonuçlarının yan yana karşılaştırma.

<ol>
	<li>Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementarity+of+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Microscopy.">Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy.</a> Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).</li><li>Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+analysis+by+open-source+software+for+affordable+cytometry.">Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry.</a> Scanning. 33, 33-40 (2011).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li><li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+apoptosis:+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system.">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-654 (2002).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Koopman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+V+for+flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+B+cells+undergoing+apoptosis.">Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis.</a> Blood. 84, 1415-1420 (1994).</li><li>Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+fluorochromes+to+ethidium+bromide+for+automated+read+out+of+cytotoxicity+tests.">Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests.</a> J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).</li><li>King, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+dead+cells+and+measurement+of+cell+killing+by+flow+cytometry.">Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).</li><li>Jones, K. H., Kniss, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+as+a+nuclear+counterstain+for+immunofluorescence+studies+on+cells+in+culture.">Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).</li><li>Dell'Arciprete, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+expression+gene+cloning+by+flow+cytometry.">High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry.</a> J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).</li><li>Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+quantitative+and+inexpensive+method+for+detecting+apoptosis+by+flow+cytometry+in+transiently+transfected+cells.">A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).</li><li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li></ol>

Krissy Remple ve Laurel Stone Bu makalede kullanılan araç üretmiş Life Teknolojileri çalışanı vardır. Yaşam Teknolojileri, bu video makale üretimi sponsor oldu.

Biz sadece, canlılığı sayımları yerine ve Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP ifade değerlendirmek için bir prosedür ayrıntılı var. Aynı prosedürü kullanarak, bu sitometresinin diğer testleri de dahil olmak üzere bir dizi performans yeteneğine sahip olmayan transduced hücreleri kullanarak, apoptoz, RFP ve hücre canlılığı analiz. Hücre canlılığı, gen ekspresyonu ve apoptosis Florimetrik testleri 7-12 biyomedikal araştırmaların temel yöntemler haline gelmiştir. Geçmişte, ayrı enstrümantasyon, hücreler hakkında nicel ve görsel bilgi almak için kullanılmaktadır. Heterojen bir nüfus içinde hücreleri hakkında kantitatif bilgi akış sitometri kullanımı yoluyla topladı olsa da, görsel ya da nitel bilgiler floresan mikroskobu 1-4 kullanımı yoluyla toplanmıştır. Burada, biz, halk ve tek tek hücre çalışmaları arasında bir köprü bir teknoloji sunuyoruz. Tali Görüntü Tabanlı Sitometre, kantitatif da kullanarakta ve aynı anda, tek tek hücrelerin veya hücre popülasyonlarının hakkında görsel hücre veri toplanabilir. Tali enstrüman, gen ekspresyonu, apoptozis testlerin değerlendirilmesi, ilaç etkinlik çalışmaları ve hastalığın ilerlemesi değerlendirilmesi de dahil olmak üzere bir dizi uygulamalar için kullanılabilir. Tali Görüntü Tabanlı Sitometre yakalar ve elde edilecek hücrelerin alt popülasyonlar hakkında bilgi sağlayan, parlak alan, kırmızı floresans ve yeşil floresan görüntüleri analiz eder. Örneğin, bu testte, Ölü Hücre Kırmızı boya kullanarak GFP ifade hücre popülasyonu içinde canlı hücrelerin ölü hücreleri ayırt etmek mümkün. Bu canlı hücreler, GFP ifade ölçüm doğruluğu ve sonraki işlemlerde kullanışlı hücreleri nüfus tanımlar. Nüfus içindeki ölü hücreler kültürde çevre koşulları (örneğin, trypsinization veya neden normal hücre ölümü ya da hücre ölümü de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan gelen ortaya çıkabileceği unutulmamalıdır.seçilen transfeksiyon / transdüksiyon yöntemi ile indüklenen sporcudan). İşte biz U2OS hücreleri ile Tali sitometresinin kullanımını göstermektedir. Benzer yöntemler, en memeli ve böcek hücreleri kullanılarak yapılabilir. Her bir hücre hattı için, Tali sitometresinin, nicel GFP ifade veriler, standart bir floresan mikroskop kullanılarak hücrelerin görsel bir inceleme ile mümkün değildir. Bu sonuçlar flow sitometri ile karşılaştırılabilir olmasına rağmen, zamanının bir kısmını tahsil edilir. Sitometresinin ideal 1 x 10 1 - 5 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon, çapı 5 mikron ile 60 mikron arasında doğru sayma hücreleri yeteneğine sahiptir . Ölü Hücre Kırmızı boyama protokolü, burada açıklanan dahil olmak üzere çoğu standart boyama protokolleri, işaret etmek önemli, canlı ve ölü hücrelerden ayırt propidium iyodür kullanın. St permeabilize hücreleri canlılığını ölçerken bir meydan okuma sunuyorPI, kuşkulu bir membran ile, herhangi bir hücreyi leke, hücre içi belirteçlerin aining. , Yeşil ya da kırmızı floresan kanalları ile tespit edilebilir herhangi bir floresan boya veya protein Tali Görüntü Tabanlı Sitometre analiz edilebilir, gelecekteki çalışmalar amin reaktif canlılığı boyalar 4 gibi alternatif boyaların kullanımı, keşfedebilirsiniz. 2006 Perfetto ve ark tarafından yapılan bir çalışmada 12, bu boyalar, canlı ve ölü hücre popülasyonlarının ayrımcılık kullanımı kolay ve tekrarlanabilir olduğu bulundu. Tali gerçekleştirebilirsiniz testlerinin türleri açısından sınırlamalar olduğunu unutmayın. Örneğin, cihaz tarafından kullanılan objektif 4X olduğundan, sayma işlemleri büyük hücre tipleri sınırlıdır: mitokondri veya veziküller gibi alt hücresel yapılar, bakteri hücrelerinin sayısal olamaz. Ayrıca Tali tespit kanalları heyecanlandırmak ve kanalları içinde yayacaktır fluorophores sınırlı olduğunu unutmayın. Iken YFP ve parlak mCherry sinyalleri cbir tespit, dimmer mCherry sinyalleri olamaz. Son olarak, Tali sadece süspansiyon hücreleri analiz. Bu doğru bir slayt yapışan hücreler sayılmaz. Ayrıca, bazı maya ve birincil hücreler de dahil olmak üzere, düzensiz şekilli hücre sayımı için sadece sınırlı bir yeteneği vardır. Buna ek olarak, gelecekteki çalışmalarda, büyük olasılıkla intrasellüler belirteçlerin ifade değerlendirmek bu sistemin kullanımı ele alınacaktır. Bireysel boyalar Invitrogen Kullanıcı online SpectraViewer aracı (kullanarak komşu kanalları ile spektral örtüşme için kontrol edilebilir <a href="http://www.invitrogen.com/spectraviewer">www.invitrogen.com / spectraviewer</a> ). Bu teknolojinin yeniliği göz önüne alındığında, tam kapsamlı uygulamalar henüz keşfedilmeyi. Özetle, Tali Görüntü Tabanlı Sitometre gösterdi, tek tek hücrelerin değerlendirilmesi yanı sıra cel sağlayan hücre popülasyonlarının eşzamanlı görselleştirme ve analizi için olanak sağlayan yeni bir teknoloji sunuyorl nüfusu basit bir iş akışı ile kompakt bir biçimde.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Tali Görüntü Tabanlı Sitometre </td><td> Invitrogen </td><td> T10796 </td></tr><tr><td> Tali Hücresel Analiz Slaytlar, 50 Slaytlar </td><td> Invitrogen </td><td> T10794 </td></tr><tr><td> Tali Hücresel Analiz Slaytlar, 500 slaytlar </td><td> Invitrogen </td><td> T10795 </td></tr><tr><td> Tali Canlılık Kit - Ölü Hücre Kırmızı </td><td> Invitrogen </td><td> A10786 </td></tr><tr><td> Tali Canlılık Kit - Ölü Hücre Yeşil </td><td> Invitrogen </td><td> A10787 </td></tr><tr><td> Tali Apoptoz Kiti </td><td> Invitrogen </td><td> A10788 </td></tr><tr><td> U2OS hücreleri </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of gfp expression and viability using the tali image-based cytometer

Tek hücreli ve nüfus bilgileri flow sitometri veya floresan mikroskobu yaygın olarak elde edilir. Ancak, bu iki yöntem farklı bilgiler sağlar. Flow sitometri, fiziksel özellikleri ve boyanması veya ifade hakkında nicel çok parametrik bilgiler verir, ancak görselleştirme için izin vermiyor. Stand-alone floresan mikroskopi görsel veri sağlar, ancak basit nicel ölçümleri 1 için izin vermez. Heterojen popülasyonları 2 görüntü tabanlı sitometri binlerce hücre hızlı görselleştirme ve eş zamanlı kantitatif analiz sağlayarak, bu iki yöntem arasında bir köprü . Burada, Tali Görüntü Tabanlı Sitometre 3 kullanılarak hücre canlılığı ve yeşil flüoresan protein (GFP) ifade testleri gerçekleştirmek için bir yöntem sunar. Tali enstrüman, 3-kanal (parlak bir alan, yeşil floresans, kırmızı floresans) benchtop tahlil platformu olduğunu Offers flow sitometri ve floresan mikroskobu üzerinde çeşitli avantajları. Tali sitometresinin, daha az pahalı, daha az tezgah yer kaplıyor, daha az bakım gerektirir ve iş akışı çalışma ve analizler çok daha basit ve hızlı böylece basitleştirilmiş oldu. Tali sitometresinin GFP ve kırmızı floresan proteini (RFP) ifadesi, apoptosis 4-6 ve propidium iyodür ile hücre canlılığı analizi (PI) 7-11 dahil olmak üzere süspansiyon hücre tabanlı testlerin bir dizi gerçekleştirme yeteneğine sahiptir. Burada, GFP ifade hücrelerinde hücre canlılığı tahlil yapmak Tali araç kullanımını göstermek. Ölü Hücre Kırmızı - GFP transduced hücreleri Tali Canlılık kiti kullanılarak boyandı. Bu hücreler daha sonra bir Tali Hücresel Analiz Slayt pipetlenir ve sitometresinin içine yüklenir. Aydınlık alan, kırmızı floresans ve yeşil floresan görüntü yakalanır ve tahlil özel algoritmalar kullanılarak analiz edilmektedir. Histogramlar sonra hücre boyutu, PI fluo görüntülemek için oluşturulanrescence yoğunluğu ve GFP floresan. Bu parametreler daha sonra, belirli bir hücre popülasyonu evine eşiklenir olabilir. Bir yan yana karşılaştırma Tali Görüntü Tabanlı Sitometre ve geleneksel akış sitometri, iki yöntem hücre canlılığı ve protein ekspresyonu ilişkin karşılaştırılabilir veriler sağlamaktadır olduğunu göstermektedir. Ancak, Tali enstrüman, bir akış sitometre kullanılarak elde edilemeyen hücre popülasyonu hakkında ek görsel bilgi sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer at JoVE.com

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Bu protokol Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak hücre canlılığı ve floresan ifade deneyleri nasıl gerçekleştirileceği açıklanır.

Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP İfade ve Canlılık Değerlendirilmesi

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

assessment-gfp-expression-viability-using-tali-image-based

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K Görüntüleme.  Life Technologies. Bu protokol Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak hücre canlılığı ve floresan ifade deneyleri nasıl gerçekleştirileceği açıklanır.

Video: Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

Ex Vivo Viral İletimi Saç Folikül GFP Hedeflenen İfade

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Biyoloji

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Doku ve Hücre Sayım ve Canlılık Belirlenmesi

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

Canlı Hücre Döngüsü Analizi<em&gt; Drosophila</emAkort Akustik Odaklama Sitometreyi ve Vybrant DyeCycle Violet DNA Leke kullanarak&gt; Dokular

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Metabolik Oranı Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Respirometrik kullanarak

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

Photoactivatable GFP ile APP Hücre içi Ticareti Görüntüleme

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...