Biz gelişmekte olan ve bu sürüm 10 dayandığı orijinal protokol öğretmek için Aida de la Cruz teşekkür ederim. Buttitta Laboratuarı&#39;nda çalışma NIH hibe GM086517 tarafından desteklenmektedir.

1. Yetiştiriciliği Fly <ol><li> Çapraz 10 ml Maya-Glikoz Orta 3 veya seçtiğiniz diğer proteinden zengin medya ile dar plastik şişeleri istenen genotip uçar. In vivo floresan protein ekspresyonu ile izleme doku spesifik ifade ve soy için uygun geniş bir Drosophila transgenik başka araçlar 4,5 detaylı bir şekilde tarif edilmektedir. 24 saat döl koleksiyon serisi elde etmek için her gün taze şişeleri için anne transfer, ya da daha kesin evreleme için, agar plakaları üzerinde embriyo toplamak ve 10 açıklandığı gibi şişeleri için yeni yumurtadan larva transferi. Deney boyunca tek şartları yürütülmesini sağlamak ve aşırı kalabalık önlemek için, tek bir şişe içinde F1 döl toplam sayısı en fazla 100 olmalıdır. Deney genetik tasarımına bağlı olarak, istenilen gelişimsel aşamada kadar uygun bir inkübatör şişeleri tutun. </li><li> Deney hayvanları toplayın: Eğer 3. larva az olgun larva gerekirdoğru pupa evreleme için larva diseksiyonu veya beyaz prepupa (RES) için geliştirme 110-120 yaklaşık saatte evre (L3). Olmayan bir proliferatif durumuna bir geçiş dahil olmak üzere dramatik bir hücre döngüsü değişiklikleri, metamorfoz 12,13 sırasında farklı zaman noktalarında meydana gelir. Pupa Bu nedenle doğru evreleme (gelişim 1 saat içinde) Başkalaşım sırasında tekrarlanabilir hücre döngüsü veri için gereklidir. Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi WPP (0 saat APF) pupa oluşumu sonra 0 saat karşılık, panel ben. Bazı nem korumak için su 2.5 ml ıslak katlanmış bir Kimwipe bir 35 mm Petri kabındaki WPP toplayın. Yaş pupa kadar uygun sıcaklıkta aşamasında (saat APF) istenen. Gelişme 29 de 1.2 kat daha hızlı ilerler unutmayın 18 daha yavaş ° C ile 2.2 kat ° standart 25 ° C 14 daha C. </li><li> 9,11 gerekirse klonlar soy-izleme için ısı şok flipase (hs-flp) bağlı rekombinasyon etkinleştirmek için ısı-şok hayvanlar. Larva, batırmayın sıcağında-şokbir su banyosu (37 ° C olarak belirlenmiştir) ve larvaları sağlamak içinde şişeleri tamamen batık. Pupa sıcağında-şok, Parafilm ve tam batığın bu su banyosu içine ile Petri kabı mühür. Hayvan hayatta kalmak için yeterli oksijen alışverişi sağlamak için, ısı-şok sonra Parafilm kaldırmak emin olun. Isı-şok süresi flipase kullanılan transgen ve arzu edilen klonların sayısı aktivitesine bağlıdır. Biz rutin olarak hs-flp transgen ederken, hs-flp ilk kromozom üzerinde transgen ve 35 mm yemekleri pupa ısı şoku için 2-4 dk ile larvaları klonlar 15 izleme soy &quot;flipout&quot; uyaran için 7-8 dk kullanın ikinci kromozom bir 20 dakika gerektirir. ısı şok klonların benzer numaraları almak için. </li></ol> Hücre bölünmesi ve diseksiyon zamanlaması oranı her dokuda klon boyutunu belirler. Normal şartlar altında, biz klonlar bir 20 dakika ısı şok (ikinci kromozom üzerindeki hs-flp transgen kullanarak) ve diseksiyon ile larva kanadında neden bulmakted 48 saat sonra, klon başına dört hücre etrafında ortalama, klon başına 10 hücrelerinden klon başına iki hücre arasında değişen boyutları ile yaklaşık 20-30 iyi ayrılmış klonlar içerir. Buna karşılık, 0 saat APF bir Petri kabındaki pupa, aynı hs-flp transgen ile 7 dk ısı-şok 36 saat sonra disseke, verimi iyi bir ortalama birinden dört hücre kadar (yaklaşık 15-25) klonlar ayrılmış Klon başına 2.2 hücre. Bu tür veriler, incelenen doku için ortalama hücre iki katına çıkma süresi belirlemek için kullanılabilir. 2. Teşrih <ol><li> Yavaşça 1X PBS içeren temiz bir cam diseksiyon çanak larva / pupa aktarın. </li><li> Bir mikroskop ve bol ışık kullanarak, hafifçe, keskin Inox 5. forcep ile karın tarafından bir larva kavramak mikro-makas ile ön üçüncü kesim ve larva tutarken arka doğru ağız bölgesinde içe doğru iterek ön üçüncü ters manikür sabit (Şekil 1A). Dikkatlice opaqu kaldırmakE vücut yağ ve bu kanat, göz veya beyin istediğiniz gibi dokular, görünürlüğünü artırmak için kalan gut. İstenilen dokular incelemek, temiz forseps, ağız kanca gözleri, ya da göz (Şekil 1G) için beyin ile trakea ve manikür kanat kaldırma. </li><li> Pupa diseksiyon için; pupa içinde (Şekil 1C) zarar görmemesi için, bir hava kabarcığı olduğu yerde hafifçe pupa davanın ön ucu ile bir pupa kavramak için bir forcep kullanın. Karşı el forseps ya da mikro-makas uygun kavrama için pozisyon yüzen pupa yardımcı olmak için kullanılabilir. Temiz mikro-makas ile pupa arka ucu kesti. Bu enine kesit kesilmiş göğüs ve kafa istenen dokulara histolyzed yağ zorlamadan iç basıncı serbest bırakmak için, hayvanın sırt tarafına doğru hafif bir açıyla yapılmalıdır. Kanat ve ön göz-beyin karmaşık kaçınarak, dorsal medyan boyunca dikkatli bir şekilde kesin. Dikkatlice pupa gelen pupa çıkarınpupa epidermisin arka kenarı açgözlü ve pupa durumda (Şekil 1D) dışarı çekerek durumda. Forseps ile göz-beyin kompleksine manikür ön küçük bir delik Poke. Bir lastik ampul ile bir cam Pasteur pipet kullanarak, yavaşça histolyzed yağ ve kalan bağırsak dokusu kaldırmak için kısmen disseke pupa ile PBS diseksiyon çözüm yıkayın. Bu aynı zamanda etkin bir şekilde daha sonra cam pipet iç yapışmasını disseke dokuların insidansını azaltır lipid ve proteinler, ile cam pipet yağlar. </li><li> Pupa kanat elde etmek için, manikür kanat saran ve kanat kendisi pupa (Şekil 1E) den pried gerekir. Bu yan onu yerini değiştirmemek önce ya da kanat manikür en arka ucu kavramak için başka bir forcep kullanarak ve çekerek veya menteşe yakın kanatları altında forcep manevra sırasında bir forcep ile başkanı tarafından pupa basılı tutarak yapılabilir karkas (FŞEKIL 1E). Kanat sonra kesmek veya vücuttan çıkarın ve uzak karkas ve diğer malzemeden bir yığın koymak için menteşe yırtılmış olabilir. </li><li> Göz-beyin karmaşık yerinden oynamış ve pupa (Şekil 1F, 1 H) ücretsiz hale gelinceye kadar pupa göz veya beyin elde etmek için, pupa yıkayın. Bir forcep kullanarak, yavaşça beyin uzak pupa göz çekin ve istenilen doku kaydedin. </li><li> Sonuç uzun hücreler hayvanlara açıldıktan sonra PBS içinde kalan daha az hassas hale gelir, her bir örnek incelemek için 45 dakika daha uzun zaman yoktur. </li></ol> 3. Doku Ayrılma ve DNA Boyama <ol><li> Bir yağlanmış Pasteur pipeti kullanarak, dikkatli bir şekilde 5 ml polistiren tüpü (Şekil 1G) Canlı DNA boyama çözeltinin 0.5 ml&#39;lik parçalara doku aktarın. DNA Leke Çözüm içine mümkün olduğunca az PBS olarak transferi (en az 300 ul), tripsin seyreltme olarak doku ayrışma engeller. </li><li> Shaki ile inkübe edinng 23 500 rpm (biz bir Eppendorf Thermomixer kullanın) ° C. </li><li> Bir orta hız (5 ayar) az 5 saniye hafifçe sonra vorteks 70 dakika, inkübe edin. Altında-vorteks hücre kümeleri yol açacaktır ise aşırı vorteks, hücre parçalama ve form enkaz neden olur. 23 sallayarak örnekleri dönüş hızı 5 ° C&#39;de, 5 saniye için bir kere daha vorteks önce ek 15-20 dakika boyunca 500 rpm&#39;de C. </li><li> Beyin ve 36hAPF daha eski pupa gözler için, değiştirilmiş bir protokol gereklidir. 1.7 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde 45-60 dakika boyunca 500 rpm&#39;de 23 ° C&#39;de DNA&#39;nın leke çözüm dokuların ayrıştırmaları. Sonra bir-bir elle yaklaşık 50 ul DNA Leke Çözüm ve hızlı bir elle çizilmiş Pasteur pipeti 16 (yaklaşık 100-150 mikron açma) ile yukarı ve aşağı pipetleme ile birlikte diseksiyon çanak aktararak doku büyük boyutta ayırmak. 5 ml&#39;lik bir tüp içine DNA boyama Çözüm 0.5 ml geri kalanı ile, her numune ayrışmış aktarın. Ek bir 45 inkübe23 -30 dakika (toplam inkübasyon süresi en fazla 90 dakika) ° 500 rpm&#39;de sallayarak ile C kümeleri kadar artık görülebilir. </li><li> Not acellular şeffaf pupa kanat manikür ayırmak olmaz rağmen tamamen ayrışmış örnekleri, doku çok az büyük görünür boyutta olmalıdır. </li></ol> 4. Sitometrisi <ol><li> Akort sitometresinde açın ve Attune yazılımını açın. Sitometresinin lazerler başlangıç ​​menüsünden açık olması gerekir, ve bir günlük performans testi veri toplama her günü önce yeterli puanları ile Performans İzleme Boncuk ile yapılmalıdır. Sıvı seviyeleri en az yarısı dolu ve performans test öncesi boşaltılması atık olmalıdır. Akort devreye, uygun kalibrasyon ve çalışma için Detayları Attune Kullanım Kılavuzu (bulunabilir <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf" target="_blank">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf</a> ) </li><li> Yeni te Tasarımparametreleri 4.3 belirtilen boş bir çalışma alanında 4 nokta araziler ve 2 histogramlar oluşturarak mplate, ya da deney için uygun önceden tasarlanmış şablonu seçin, ve toplanacak numune sayısını gösterir. Biz Vybrant DyeCycle Mor ve GFP veya Ek I&#39;de TTT ifade ile canlı Drosophila hücre döngüsü analizi için Attune şablonları (. Almak formatındaki dosyaları) sağladı </li><li> Resim şablonları, Şekil 2&#39;de belirtilen parametreleri ile dört nokta araziler ve iki histogramları. Tespiti için Kanallar şunlardır: FSC ve SSC - hücre boyutu ve membran karmaşıklığı, VL1 yüksekliği (H), genişlik (W) ve alan (A) gösteren forward scatter ve yan dağılım - DyeCycle Violet boyama belirten Menekşe lazer uyarma DNA ve BL1 -A - GFP floresan gösteren Mavi lazer Kanal 1 Alanı,. TTT analizi için sağlanan şablonu Optimize olan mavi lazer kanal 3 (BL3-A), kullanması dışında, GFP analizi için bir şablon ile aynıdırRFP tespiti için zed. </li><li> Şablonlar nokta araziler istenen nüfus analiz kısıtlamak için ve analizi (Şekil 2) enkaz ve hücre kümeleri sınırlamak kapıları var. Gate 1 enkaz ve SSC vs FSC (Şekil 2A) dayalı kümeleri hariç. Kapı 2 singlet (VL1Area genel VL1Width) (Şekil 2B) belirlenmesi dayalı boyanmamış hücreler, alt G1 apoptotik hücre ve hücre kümeleri dışlar. Gate 3 kapılar 1 ve 2 içinde hücreleri kapsayan, türetilmiş bir kapısı ve GFP (veya RFP) negatif hücreler vs VL1Height (Şekil 2C) dayalı DNA içeriği tanımlar. Gate 4 kapılar 1 ve 2 içinde hücreleri kapsayan, türetilmiş bir kapısı ve GFP (veya RFP) DNA içeriği (Şekil 2C) vs pozitif hücreleri tanımlayan. GFP (veya RFP) karşı ileri dağılım (FSC) tarafından ölçülen hücre boyutu nokta araziler kapılar 5 ve 6 (Şekil 2B) oluşturmak için kullanılır. Y-axi üzerinde X ekseni ve hücre sayısı üzerinde iki histogramlar arsa DNA içeriğiGate 3 ve Gate 4 tarafından tanımlanan nüfus için s. Istenirse (Şekil 2E ve 2F) Histogramlar (gösterilmemiş olan) hücre boyutu için dahil edilebilir. Hücre boyutu histogram için, nüfus X ekseni ve y-ekseninde sayıları FSC komplo, Gates, 5 ve 6 olarak ayarlanmalıdır. </li><li> 10.000 GFP veya RFP olumlu olaylar (bu Gate 4, Gate 1 türetilmiş Kapısı, Gate 2 ve GFP veya RFP olumlu kapısı olacak) durdurmak için kayıt ayarlayın. 6.000 arasında değişmektedir - 10.000 GFP pozitif olayların geleneksel olarak yayın kalitesi profilleri 9,11 için hedef olmuştur. Biz kaliteli profilleri için 4 etkinlik 10 yeterli Gate elde etmek için pozitif yaklaşık% 50 GFP 15 kanat veya gözlerde az, kullanmanızı öneririz. Ancak, başarılı bir şekilde 6 kanatları (Şekil 3A) gibi az gelen ilk hücre döngüsü analizi için net veriler elde edilmiştir. 300 ul için ise elde etme seviyesini ayarlamak, bu toplam 0.5 ml örnek 460 ul hakkında kullanacaktır. TaÇizelge 2, Şekil 2&#39;de, örneğin şablon sağlanan uygun bir eşik değeri ve voltaj ayarlar gösterilmektedir. </li><li> Standart hassasiyet veya 100 ul / dak ve kayıt hassasiyeti yüksek numune çalıştırın. Biz farklı hassasiyet seviyesi ile analizinde fark çok az buluyorum. Hücrelerin odaklama akustik nedeniyle, bu sitometresinin doğru çok yüksek debilerde örnekleri ölçebilirsiniz. Geleneksel sitometrelerinde aksine, saniyede 1.500 olaylara hızlarda alarak bir veri uzlaşma bulmak. Akort yazılım tarafından oluşturulan kaydedilen veri dosyaları en hücre döngüsü modelleme yazılımı ile uyumludur. Fcs biçiminde bulunmaktadır. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> GFP (veya RFP) için hücre boyutu ve DNA içeriği histogramları pozitif ve negatif popülasyonları karşılaştırılabilir. Bunlar elle kopyalama ve Adobe Photoshop yazılımı kullanarak yapıştırarak katmanlı olabilir. Y ekseni otomatik olarak ayarlanırsa, Y ekseni h dönüşebilecekHer numune için ighest sayılır. Otomatik ölçekli için Y ekseni seti ile iki grafik kaplayan her nüfus için global maksimum için belirlenen eksen ile histogramlar bir bindirme oluşturur. Bu (Şekil 3B örneğin) GFP pozitif ve GFP negatif nüfus toplam hücre sayıları eşdeğer değildir bile, aşamalı hücre döngüsü göreceli değişiklikler için kolay görsel karşılaştırma sağlar. Alternatif olarak, özel bir y ekseni (y-ekseni manuel seçeneği) histogramlar için sabit bir değere ayarlanabilir. Bu durumda iki farklı popülasyonlar için nispi hücre sayıları karşılaştırılabilir. Akort çalıştırmak başına örnek belirli bir hacmi kullanır gibi, toplam nüfusun yüzde her kapı her çalıştırmak için hücrelerin mutlak ölçümü, Şekil 3F de çalışma alanında çalışma (örneğin sırasında otomatik olarak oluşturulan istatistikler tablodan elde edilebilir .) Nokta araziler ve histogramlar de kolayca sadece inci farklı örnekleri sürükleyip bırakarak, Attune yazılım katmanlı olabilirkarşılaştırma için açık bir örnek istenilen grafik üzerine sağ E örnek dosya menüsü. Ancak tek bir örnek (aynı örnek içinde negatif yani GFP pozitif ve GFP) içinde alt popülasyonlar bindirmek için, biz Photoshop kullanın. </li><li> Iki yöntem bir popülasyon için, hücre döngüsünün çeşitli evrelerinde görece yüzdeleri bulmak için de kullanılabilir. Yaklaşım yöntemi G1, S, G2 ve&gt; G2 doruklarına sınırlarını tanımlamak için kullanıcı tanımlı bölgelere dayanmaktadır. Bu yöntem, kullanıcı tanımlı bölgelerde yüzdeleri hızlı ve kolay tahminleri (Şekil 3E) sağlar. Biz Etinil-dezoksiuridin (EDU) Kuruluş kullanarak S-faz için etiketli Drosophila Kc hücreleri ile doğrudan testi, dayalı bizim bölge ayarlayın. İkinci yöntem, hücre devri dağılımı tahmini için üçüncü taraf modelleme yazılımı kullanır. Biz, Şekil 3F, örneğin ModFitLT (Verity Software House) yazılımı kullanılmıştır. </li></ol>

<ol>
	<li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+measurement+and+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry.">DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).</li><li>Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content+histogram+and+cell-cycle+analysis.">DNA content histogram and cell-cycle analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).</li><li>Ashburner, M., Roote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila:+the+laboratory+setup.">Culture of Drosophila: the laboratory setup.</a> CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).</li><li>del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li><li>McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gene+expression+targeting+with+the+TARGET+and+gene-switch+systems+in+Drosophila.">Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila.</a> Sci STKE. 2004, pl6 (2004).</li><li>Calvi, B. R., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+BrdU+labeling+and+nuclear+flow+sorting+of+the+Drosophila+ovary.">Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary.</a> Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).</li><li>Bjorklund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pathways+regulating+cell+size+and+cell-cycle+progression+by+RNAi.">Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi.</a> Nature. 439, 1009-1013 (2006).</li><li>Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+and+cell+division+in+the+Drosophila+wing.">Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing.</a> Cell. 93, 1183-1193 (1998).</li><li>de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+Drosophila+cells.">Flow cytometric analysis of Drosophila cells.</a> Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).</li><li>Reis, T., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+dE2F1+by+cyclin-dependent+kinases+controls+cell+cycle+timing.">Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing.</a> Cell. 117, 253-264 (2004).</li><li>Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+and+patterned+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+during+metamorphosis.">Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).</li><li>Schubiger, M., Palka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+spatial+patterns+of+DNA+replication+in+the+developing+wing+of+Drosophila.">Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila.</a> Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).</li><li>Theodosiou, N. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FLP/FRT+system+to+study+Drosophila+development.">Use of FLP/FRT system to study Drosophila development.</a> Methods. 14, 355-365 (1998).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.H+Exit+from+mitosis+in+Drosophila+syncytial+embryos+requires+proteolysis+and+cyclin+degradation,+and+is+associated+with+localized+dephosphorylation.">P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation.</a> Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada tarif edilen protokole, hücre döngüsü, göreli hücre boyutu ve nispi hücre sayısı, çeşitli gelişim aşamalarında Drosophila canlı dokularda analizi için olanak sağlar. Bu analiz hücre türüne özgü floresan protein ifade veya izleme soy bağlandığı zaman, detaylı bilgi gizli hücre döngüsü veya büyüme tedirginlikler hücresel yanıtları hakkında elde edilebilir. Beyin hücreleri tutuklandı 90% G1 üzerinde normal olduğunda ilkesinin kanıtı olarak, biz (3D Şekil) bir gelişim aşamasında anormal DNA replikasyonu yol açan, GFP etiketli hücre klonlar G1-S hücre döngüsü düzenleyicileri ifade ederek pupa sinek beyinde sükunet kesintiye . Ancak bu canlı hücre döngüsü analizi yöntemi için bazı önemli sınırlamalar vardır. İlk olarak, burada tarif edilen protokol kullanılarak mitoz çeşitli aşamalarında hücreleri arasında ayrım yapamaz. Bu nedenle, burada açıklanan analizleri imm ile takviye edilmelidirilgi dokularda mitotik indeks ölçmek için bu Ser10-fosforile Histon H3 18 gibi bir mitoz işaretleyici, için unofluorescence boyama. Ayrıca yöntem her iki devlet aynı DNA içeriği gibi, bir G0 tutuklama vs G1 hücreleri ayırt edemez Burada anlatılan. DyeCycle menekşe canlı hücreler tarafından alınır yana sonra apoptotik aşamalarında hücrelerin belirlenmesi da sınırlıdır. Son olarak, ileri dağılım dayalı hücre boyutu ölçümleri yerine büyüklüğü mutlak miktar daha göreceli hücre boyutu ölçümleri olduğunu not etmek önemlidir. Hücre boyutu mutlak ölçümü için böyle bir Coulter Sayaç (Beckman Coulter) kullanılan bu kadar bir hacim yaklaşımı öneriyoruz. Hücre döngüsü faz ve boyutu veri hücresi iki katına zaman, hücre döngüsü hakkında ayrıntılı bilgi ve ölçmek için izleme soy bağlandığı zaman büyüme, G1 uzunluğu, S ve G2 fazları ve hücre büyüme oranı 9,11 olarak, hesaplanabilir </&gt; destek. In vivo hücre döngüsü düzenleyicilerinin gizli genetik manipülasyonlar ile birleştiğinde hücre döngüsü ve kantitatif hücre döngüsü, hücre büyümesi ve doku morfolojilerinden modelleme için büyüme düzenleme hakkında ayrıntılı bilgi sağlayabilir.

Akış sitometri hücre canlılığı, nispi hücre boyutu, DNA içeriği ve canlı hücre popülasyonunda floresan proteini ifade ölçümü için kullanılabilir. S-fazı, bir hücre popülasyonunda DNA içeriği hakkında bilgi boyunca nükleer DNA çoğaltma bağlı olarak farklı hücre döngüsü faz 1-3 görece yüzdeleri belirlemek için de kullanılabilir. Bu yöntem, mayadan memelilere modeli sistemlerinde hücre döngüsü analizi bir taşı haline gelmiştir. Meyve sineği Drosophila melanogaster hücre döngüsünün düzenlenmesi in vivo analizlerde genetik için mükemmel bir model sistem haline gelmiştir. Sinekler mevcut geniş genetik araçları vivo floresan protein bazlı soy 4-6 izleme ile birlikte hücre döngüsü düzenleyicileri zarif doku özel ve geçici olarak düzenlenir manipülasyonlar için izin verir. Akış sitometri endorepl da dahil olmak üzere, Drosophila hücre tipleri arasında bir dizi DNA içeriği incelemek için kullanılmıştırhücreleri ve kültür mitotik hücreler 7,8 icating. In vivo hücre döngüsü çalışmalar için önemli bir ilerleme canlı diploid Drosophila hayali diskler 9,10 akış sitometrik analizi, birçok laboratuvar tarafından kullanılan ve adapte edilmiş bir protokol için bir protokol gelişimi ile, de la Cruz ve Edgar tarafından yapıldı. Indüklenebilir floresan protein ekspresyonu ve doku özel etiketleme ile izleme in vivo soy genetik ile birlikte bu teknik,, in vivo 9 bir genel hücre katına çıkma süresi, hücre boyutu gen manipülasyonu etkileri hakkında bilgi edinmek için ve hücre döngüsü aşamalarının hassas zamanlama belirlemenize olanak sağlar , 11. Bununla birlikte, bu yöntem, bugüne kadar kullanıcılar verici Hoechst boya yeteneğine sahip bir UV lazer sitometre akmaya sınırlı olan canlı hücreler, DNA leke ve ölçmek için hücrenin kullanımını geçirgen Hoechst 33.342 DNA intercalating boya dayanmıştır. Bunlar genellikle sadece seçmeler (yani BD FACS Vanta bulunurge, BD FACSAria) veya pahalı çok renkli masa üstü sistemleri (yani BD LSR), kurumsal akış çekirdek tesisleri tarafından genellikle gerektiren destek. Biz Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet yeni bir canlı hücre DNA boya kullanmak için Hoechst-tabanlı protokol değiştirdiniz. Bu boya daha küçük masa üstü analiz yaygın ve küçük bağımsız masa üstü analizörü, Sitometre Odaklama Attune Akustik mevcut bir mor 405 nm lazer ile uyumludur. Burada DyeCycle menekşe ve Akort kullanılarak çeşitli gelişim aşamalarında hücre tipi, hücre boyutu, hücre sayısı ve Drosophila dokularının çeşitli soy analizi ile akuple edilebilir hücre döngüsü analizi için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu protokol Drosophila dokuları ile bu analiz için uygun sitometrelerinde sayısı genişletir ve canlı hücre döngüsü analizi bu tür ek doku tipleri ve gelişim evreleri için değiştirilebilir nasıl örnekleri sağlar.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube </td>
 <td>BD Falcon </td>
 <td>352058 </td>
 <td>5 ml tubes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Acoustic Focusing Cytometer</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4445315</td>
 <td>Blue / Violet configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Cytometer Software (version 1.2.5)</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>Free </td>
 <td>PC only</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) </td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4449754 </td>
 <td>For daily performance test</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 Inox forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11251-20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embryo dishes 
 30 mm x 12mm </td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70543-30 </td>
 <td>Glass dissection dishes </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>022670051 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T4174 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vannas-T&uuml;bingen Spring Scissors </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15003-08 </td>
 <td>Straight 5mm Cutting Edge </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vybrant DyeCycle Violet Stain</td>
 <td>Life Technologies/ Invitrogen</td>
 <td>V35003 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Required reagents and instruments.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Live DNA Stain Solution (10 ml):
 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 
 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 
 5 &mu;l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)
 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
 </td>
</tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FSC</td>
 <td>SSC</td>
 <td>BL1</td>
 <td>VL1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Threshold (x1000)</td>
 <td>100</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Voltage (mV)</td>
 <td>2950</td>
 <td>4250</td>
 <td>1800</td>
 <td>1150</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain

Flow sitometri çok farklı hücre döngüsü aşamalarında göre yüzde anlaması için, bir hücre nüfus DNA içeriği hakkında bilgi edinmek için kullanılır olmuştur. Bu teknik başarılı in vivo hücre döngüsü düzenleme genetik çalışmalar için model organizma Drosophila melanogaster mitotik dokulara uzatıldı. Hücre türüne özgü floresan protein ekspresyonu ve genetik manipülasyonlar ile birleştiğinde, bir hücre sayısı, hücre boyutu ve in vivo olarak aşamalı hücre döngüsü üzerindeki etkileri hakkında ayrıntılı bilgi edinebilirsiniz. Ancak bu canlı hücre yöntemi UV lazer ile donatılmış akış sitometrelerinde kullanıcıları sınırlayıcı, hücre geçirgen Hoechst 33.342 DNA-intercalating boya kullanımı güvendi. Biz daha yaygın mor 405nm lazer ile uyumlu yeni bir canlı hücre DNA boya, Vybrant DyeCycle Violet, kullanmak için bu protokol değiştirdiniz. Burada sunulan protokol, hücre ile birlikte verimli bir hücre döngüsü analizi sağlarDrosophila dokularda çeşitli tip, göreli hücre boyutu ve hücre sayısı bilgiler. Bu protokol tek laboratuvar ölçekte çalışan ve korunabilir bir küçük masa üstü analiz için canlı Drosophila dokular için yararlı hücre döngüsü analizi tekniği, Attune Akustik Odaklama Sitometreyi, uzanır.

Şekil 2 sağlanan GFP şablonu kullanarak, doku arka yarısında GFP ifade, bir larva kanat örnek temsilcisi sonuçları gösterir. Benzer sonuçlar, aynı doku tipindeki ve verilen TTT şablon (Şekil 3A) kullanılarak TTT için ekspresyon modeli ile elde edilir. Resim şablonları ve gerilimleri (Tablo 2) larva gözde (Şekil 3B), beyin ve kanatların yanı sıra, pupa gözler, beyinleri (Şekil 3B) ve kanatların analizi için uygundur. Kapılar 5 ve 6 popülasyonlar için FSC çizilmesi ile sağlanan nispi hücre boyutu Histogramlar (Şekil 3C) oluşturulabilir. Kapılar bağlı olarak farklı dokularda veya farklı GFP veya RFP transgen için floresan yoğunluğu farklılıklar için hücre boyutu farklılıklar hafifçe ayarlanması gerekebilir. Örnek küçük bir test hacmi (50-100 ul) çalışırken Bu kayıt isabet önce, yapılabilir. BirAkort yazılım otomatik ölçekli hücre döngüsü veya hücre boyutu histogram için y ekseni (sayıları) (y-ekseni ölçeği otomatik olarak ayarlanır) llowing, her nüfus için global maksimum gösteren histogramlar ile sonuçlanır. Şekil 3B-3D gösterir y ekseni ile GFP pozitif ve GFP negatif histogramlar ile temsilcisi sonuçları her nüfus için global maksimum ayarlanır. Belirli bir y-ekseni en büyük (y-ekseni ölçekli bir kullanıcı tanımlı değeri manuel ayarlanır), Ayar çoğalması oranlarını karşılaştıran için yararlı olabilir nüfus arasında kesin rakamlar karşılaştırılması için izin verir, ama zor aşamalı hücre döngüsü karşılaştırması yapılabilir GFP negatif hücreler vs GFP pozitif hücrelerin sayısı çok farklıdır nüfus. Şekil 3B GMR-Gal4, UAS-GFP transgenlerin kullanarak arka GFP ifade, larva gözünde GFP pozitif ve negatif hücreler için hücre döngüsü profillerini göstermektedir. Bindirme hücre döngüsü s farklılıkları ortayasentezleyici hücrelerin arka GFP hasing. Şekil 3C gösterir B GFP pozitif ve negatif hücreleri arasında hücre boyutu göreceli değişim, FSC ile ölçülen hücre boyutuna işaretlenmesiyle. Şekil 3B 46H APF az pupa beyinlerinden elde edilmiş bir hücre döngüsü profili gösterir. GFP pozitif hücreler G1-S düzenleyiciler Siklin D ve sükunet bozabilir ve S-faz giriş yol E2F ifade soy izleme klonlar, kırmızı ok ile gösterilen ve Edu dahil edilmesi (Şekil 3D ilave) ile S-faz etiketleme ile teyit vardır. Bu, bu aşamada normal G1 (siyah iz, Şekil 3D) olarak tutuklandı olmayan ifade GFP negatif hücreler, aksine bulunmaktadır. En hücre döngüsü profilleri farklı hücre döngüsü aşamalarında bir nüfus yüzdeleri hakkında bilgi elde etmek için kullanılır. Bu G1, S ve G2 fazları (&lt;sınırlarını belirleyen histogramlar kullanıcı tanımlı bölgeler oluşturarak Attune yazılımında yaklaşık olarak hesaplanabilirstrong&gt; Şekil 3E). Akort yazılım otomatik olarak kullanıcı tanımlı bölgeler ve yüzdeleri (Şekil 3F) içinde hücrelerin mutlak sayıları veren, her çalışma için bir istatistik tablosu oluşturur. Bir kontrol ve deneysel nüfus arasındaki faz dağılımındaki göreceli değişiklikler karşılaştırırken bu yöntem iyi çalışır. Alternatif olarak, modelleme yazılımı her bir faz olarak apoptotik hücre yüzdesi tahmin etmek için de kullanılabilir. Biz doğrudan alıştırmak yazılım tarafından oluşturulan. Fcs veri dosyalarını açabilirsiniz Şekil 3G ModFitLT (Verity Software House), kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/50239/50239fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50239/50239fig1highres.jpg" /> Şekil 1. 110 larva diseksiyonu ve larva ve pupa dokuların evreleme. A. Diseksiyon (genotip 1118 w gösterilir)kalkınma saat önce ön üçüncü gösteren (üst) ve (alt) inversiyon sonra. Beyaz ok ucu larva manikür ve bir kırmızı ok ucu bağlı bir kanat beyin B. Wings konumunu gösterir gösterir (beyaz ok ucu; solda not kanat bir bacak diske bağlı, sağ kanat dorsal notum da yırtılmış), göz (sarı) ve beyin (kırmızı) larvaları kaldırılır. pupa D. Pupa kaldırmak için yıkamadan önce manikür kaldırılır baş (kırmızı noktalı çizgi) için ön hava sahasını yer forseps ile kesim pozisyonlarını gösteren C. Diseksiyon yağ ve gut . E. pupa F. pupa (kırmızı ve sarı ok başları) kanat gösteren (noktalı) ve kısmen göz-beyin karmaşık kaldırıldı Temizlenmiş kaldırılması için kanat kaldırma işlemi gösteren temizlenmelidir. G. larva kanat ve transfer için pipet gösteren gözleri Dissected. H. Dissected post-mitotik pupa göz-beyin karmaşık. I. </strong&gt; larva / prepupa geçiş de hayvanların doğru evreleme; hayvan 1 hala hareket ve çok genç olduğunu, hayvan 2 beyaz ve hareketsiz (pupa oluşumundan sonra), 0hAPF toplamak için doğru aşamadadır; 3 hayvan çok eski , manikür koyulaşması toplamak için 1hAPF ile açıktır, hayvan 4 zaten 2hAPF de tabaklanmış toplamak için çok eski. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50239/50239fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/50239/50239fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50239/50239fig2highres.jpg"/> Şekil 2. Vybrant DyeCycle Mor ve Attune kullanarak GFP ifade dokuların Temsilcisi hücre döngüsü analizi. Temsilcisi çalışma alanı, 4 nokta araziler ve 2 histogramlar içeren bir engrail tarafından yönlendirilen, arka kanat GFP ve Siklin D ifade eden bir larva kanat örnek gösterilirGate 1 ile hücre boyutu ed-Gal4 transgen. A. Nokta arsa enkaz ve kümeleri dışlamak için. B. Nokta arsa lekesiz hücreleri, alt-G1 DNA içeriği (apoptoz) ve kümeleri dışlamak için Gate 2 atlet ayrımcılık. C. GFP vs DNA içerik nokta arsa. GFP negatif (Geçit 3) ve pozitif (Geçit 4) hücreleri ayırt edici ve 2N olabilir ve 4N DNA muhtevasına GFP genel ileri dağılım (FSC) tarafından ölçülen hücre boyutu x-ekseni. D. nokta arsa boyunca olan konuma bağlı olarak belirgindir Kapılar 5 ve 6 oluşturmak için. Gate1 içindeki hücrelerin DNA içeriği vs GFP veya RFP negatif (Gate 3 ayarlı nüfus) için sayar. E. Histogram Bu dağılım çizim kapıları 5 ve 6 belirlenmesinde görsel yardım için renkli kırmızı olduğunu unutmayın. DNA içeriği F. Histogram GFP veya RFP pozitif (Gate 4 olarak ayarlanmış nüfus) için vs sayar. Histogramlar, arzu edildiği takdirde de hücre boyutu için dahil edilebilir. Hücre boyutu histogram için, nüfus omuzd Gates, 5 ve 6 olarak ayarlanmalıdır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50239/50239fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/50239/50239fig3.jpg" alt="Şekil 3," fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50239/50239fig3highres.jpg" /> Şekil 3,. Hücre döngüsü ve çeşitli gelişim evreleri ve dokular için hücre boyutu analizi Temsilcisi histogramlar. (A) Temsilcisi histogram verileri DyeCycle Violet (RFP floresan vs DNA içeriği ilave gösterir dağılım çizim ile TTT ifade kullanarak belirli hücre tiplerinde hücre döngüsü karşılaştırmak için gösterilir .) Bu örnek bir engrailed-Gal4 transgen tarafından yönlendirilen posterior TTT, ifade larva kanatları içerir. (B) GMR-gal4 pr ile tahrik GFP ifade ile larva gözünde GFP pozitif vs GFP negatif DNA içeriği histogramlar KaplamalarG1 en GFP pozitif hücreler arası omoter 17,. (C) GMR tahrik GFP arasında küçük nispi hücre boyutuna + hücreleri kapılar 5 ve 6 ile ileri dağılım ile ölçülmüş olarak, GFP kontroller ile karşılaştırıldığında. (D) pupa beyin olarak, GFP pozitif hücreler içinde anormal S-faz giriş (kırmızı ok ucu) neden aşırı ifade eden G1-S hücre döngüsü düzenleyicileri Siklin D ve E2F, 2. larva sırasında uyarılan flp-out yöntemi 5 ile izleme klonlar soy bağlı ısı şoku gösterir normal postmitotic G1 doku tutuklandı. Akış sitometrisi ile gözlenen anormal S fazı giriş S fazı (ilave) hücreleri etiketler edu dahil edilmesi ile de teyit edilmiştir. G1, S ve G2 fazda görece yüzdeleri tahmin etmek için kullanılan bölge (e), Örnek. Sınırlar ayrı bir deney ile Drosophila hücreleri edu S-fazı esas dayalı olarak tahmin edilmiştir. Attun tarafından üretilen (F), istatistik Örnek tablosue yazılım tanımlı bölgelerde göreceli yüzde gösteren. (G) ModFitLT kullanarak temsil Attune veri hücre döngüsü modelleme örneği. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50239/50239fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain at JoVE.com

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Canlı hücre döngüsü analizi için bir protokol<em&gt; Drosophila</emAkort Akustik Odaklama Sitometre kullanarak&gt; dokular açıklanmıştır. Bu protokol, eş zamanlı olarak ya da floresan nesilli izleme proteinlerin doku spesifik ifade yoluyla göreli hücre boyutu ile ilgili bilgi, hücre sayısı, DNA içeriği hücre tipi içerir<em&gt; In vivo</em&gt;.

Canlı Hücre Döngüsü Analizi<em&gt; Drosophila</emAkort Akustik Odaklama Sitometreyi ve Vybrant DyeCycle Violet DNA Leke kullanarak&gt; Dokular

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

live-cell-cycle-analysis-drosophila-tissues-using-attune-acoustic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

13.6K Görüntüleme.  University of Michigan. Canlı hücre döngüsü analizi için bir protokol Drosophila dokular açıklanmıştır. Bu protokol, eş zamanlı olarak ya da floresan nesilli izleme proteinlerin doku spesifik ifade yoluyla göreli hücre boyutu ile ilgili bilgi, hücre sayısı, DNA içeriği hücre tipi içerir In vivo.

Video: Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Hazırlanması Drosophila</emAsma Bırak Protokolü kullanarak Canlı Görüntüleme> Embriyolar

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Biyoloji

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide different information. Flow cytometry gives quantitative multi-parametric information about physical characteristics and staining or expression, but doesn't allow for visualization. Stand-alone fluorescence microscopy provides visual data, but doesn't allow for straightforward quantitative measurements1.
Image-based cytometry bridges the gap between these two methods, enabling the quick visualization and simultaneous quantitative analysis of thousands of cells in heterogeneous populations2. Here, we present a method for performing cell viability and green fluorescent protein (GFP) expression assays using the Tali Image-Based Cytometer3. The Tali instrument is a 3-channel (bright field, green fluorescence, red fluorescence) benchtop assay platform that offers several advantages over flow cytometry and fluorescence microscopy. The Tali cytometer is less expensive, takes up less bench space, requires less maintenance, and the work flow has been simplified so that the operation and analysis is much simpler and quicker. The Tali cytometer is capable of performing a range of suspension cell-based assays, including GFP and red fluorescent protein (RFP) expression, apoptosis4-6 and cell viability analysis with propidium iodide (PI)7-11.
Here, we demonstrate the use of the Tali instrument in performing a cell viability assay in cells expressing GFP. GFP-transduced cells are stained using the Tali Viability Kit - Dead Cell Red. The cells are then pipetted into a Tali Cellular Analysis Slide and loaded into the cytometer. Bright field, red fluorescence and green fluorescence images are captured and analyzed using assay specific algorithms. Histograms are then generated to display cell size, PI fluorescence intensity, and GFP fluorescence intensity. These parameters can then be thresholded to home in on a specific cell population.
A side-by side comparison of the Tali Image-Based Cytometer and traditional flow cytometry demonstrates that the two methods provide comparable data regarding cell viability and protein expression. However, the Tali instrument provides additional visual information about the cell population that cannot be obtained using a flow cytometer.

This protocol describes how to perform cell viability and fluorescence expression assays using the Tali Image-Based Cytometer.

Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP İfade ve Canlılık Değerlendirilmesi

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptör Hücreler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Prototip Minyatür Akış Sitometresi ve Companion mikroakışkan Karıştırma Teknoloji İndirimli-gravite Çevre Donanım Gösterileri

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

LDL kolesterol alımını tahlil canlı hücre analizi ile hücre Imaging kullanarak sistem durumu izleme

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...