1. Färben von Zellen mit der Tali Viability Kit - Dead Cell Red Reagent <ol><li> Beginnen Sie diese Prozedur mit U2OS Zellen (American Type Culture Collection), die transduziert wurden mit CellLight Nucleus-GFP * BacMam 2,0 *. (Hinweis: Es können auch Zellen zentrifugiert und resuspendiert in Medium oder PBS). </li><li> Um Flecken abgestorbenen Zellen mit PI, Transfer 100 ul der Zellen, um eine neue Mikrozentrifugenröhrchen. Beachten Sie, dass eine Konzentration von 1 x 05 bis 1 OKTOBER x 10 7 Zellen / ml für diesen Test wird empfohlen, wenn die Konzentration nicht um genau zu sein. </li><li> Weiter, um Flecken auf den toten Zellen, fügen Sie 1 ul der PI-basierte Tali Dead Cell Red-Reagenz. Vortex kurz zu mischen. Inkubieren Sie die Tali Dead Cell Red Reagenz und Zelle bei Raumtemperatur im Dunkeln für 1-5 Minuten. </li><li> Nach der Inkubation sofort zur Analyse der Probe fahren auf dem Tali Image-Based Cytometer. </li></ol> 2. Performing a Cell Viability Assay unter Verwendung einesTali Image-Based Cytometer <ol><li> Die Tali Durchflusszytometer verwendet die Einweg-Kunststoff-Tali Cellular Analysis Folien, die speziell in die Zytometer fit und kann zwei 25 &amp;mgr; l Proben in separaten geschlossenen Kammern (A und B) zu halten. Beim Umgang mit der Folie, achten Sie darauf, halten Sie es an den Seiten. </li><li> Um die Folie, Pipette 25 ul der Probe langsam in die halbmondförmige Probe Ladefläche zu laden, wobei darauf zu achten Bildung von Blasen oder zurück Splatter zu vermeiden. Nicht über oder unter zu füllen. </li><li> Hier sind Kontroll-Zellen (ungefärbt, nicht-transduzierten) in Kammer geladen A und die Kirchenfenster GFP-exprimierenden Zellen sind in Kammer B geladen Die Kontrollprobe wird dazu beitragen, bestimmen den Grad der Autofluoreszenz bei der Analyse der Daten. </li><li> So führen Sie eine Lebensfähigkeit Assay, berühren GFP / RFP auf dem Startbildschirm des Zytometer. Der Test-Optionen werden dann auf der rechten Seite angezeigt. Wählen Sie GFP + Lebensfähigkeit. </li><li> Weiter, um den Namen der Probe Serie, drücken Sie Name Now </strong&gt;. Dann über den Touchscreen, geben Sie den Namen der Probe Serie, und drücken Sie auf Speichern. (Hinweis: Wählen Sie Namen später automatisch einen Namen zuweisen für jede Probe Serie von Datum und Uhrzeit.) </li><li> Nach der Benennung der Probe wird die Tali Zytometer automatisch an die Messen Bildschirm zu wechseln. Drücken Sie auf die Registerkarte Hintergrund in der rechten unteren Hälfte des Bildschirms messen. </li><li> Als nächstes mit der Kontrollprobe (A) abgewandten Zytometer, legen Sie die Folie in den Verladehafen bis zum Anschlag. Bitte keine Gewalt anwenden. </li><li> Vor dem Hintergrund angezeigt wird, drücken Touch New Ungefärbte Cell Control einfügen. Die Folie wird automatisch in die Zytometer gezogen werden und ein Live-Bild der Zellen wird auf dem Bildschirm angezeigt werden. </li><li> Mit dem Fokus-Knopf, bringen die Zellen in die richtige Ebene zu sehen. Die Zellen sollten gleichmäßig dunkel mit einem hellen Schein um jede Zelle (Abb. 1, links). </li><li> Zelles kann niedrig beziffert, wenn der Übergang zwischen dem Hintergrund und die Ränder der Zellen ist unscharf, so dass Zellgrenzen sind nicht genau definiert (Abbildung 1, Mitte). Zellen können overcounted, wenn sie helle und dunkle Zentren Perimeter (Abb. 1, rechts) haben werden. </li><li> Um bessere Sicht der Zellpopulation bei gleichzeitiger Konzentration, schieben Sie die rote Taste, um Zoom-Anzeige 4X oder 16X. </li><li> Sobald die Zellen in den Fokus gebracht worden sein, berühren Sie drücken, um Ungefärbte Cell Control Run auf die Hintergrund-Fluoreszenz zu messen. </li><li> Der Durchflusszytometer wird automatisch erfassen und analysieren die Bilder von der Probe. Es dauert ca. 1 Minute zu erfassen und zu analysieren, die Bilder in der Standard-(9 Bilder) Modus. </li><li> Thumbnails der einzelnen Felder der Ansicht angezeigt werden, wie sie erfasst werden und die Fortschrittsanzeige gibt einen ständigen Aktualisierung. Nach der Aufnahme von Bildern abgeschlossen ist, die Zytometer automatisch ausgeworfen die Folie und stellt die Daten aus der Analyse der aufgenommenen Bilder. </li><li>Die gespeicherten Daten werden in dem Dropdown-Menü der Registerkarte Hintergrund am Zytometer angezeigt werden. Der Hintergrund Kontrollprobe den gleichen Namen zugewiesen, das sich auf das Experiment gegeben und wird in dem Dropdown-Menü importiert werden. Hinweis: Wenn ein Hintergrund-Steuerelement nicht ausgeführt wird, das Zytometer automatisch eine Fluoreszenz-Schwelle. Dies kann manuell nach Durchführung des Tests geändert werden. </li><li> Zum Ausführen des PI-gefärbten transduzierten Probe, entfernen Sie die Folie aus der Zytometer, drehen Sie sie um und setzen Sie ihn mit den transduzierten Probe abgewandten das Instrument. </li><li> Drücken Sie die Probe Reiter und anschließend drücken, um New Musters der Beilage. Wenn das Bild auf dem Bildschirm erscheint, verwenden Sie das Bild Einstellknopf, um die Zellen in den Fokus zu bringen wie zuvor. Berühren Sie dann Drücken Sie, um Beispiel auszuführen. </li><li> Nach der Aufnahme von Bildern abgeschlossen ist, werden die Daten aus der Analyse unter der Registerkarte Muster und die Zytometer automatischeVerbündeter wirft die Folie. </li><li> Entsprechend der Tali Cellular Analysis Slide als biologisch gefährlichen Abfall entsorgen. Tali Cellular Analysis Dias können nicht wiederverwendet werden. </li></ol> 3. Festlegen von Schwellenwerten und Tore <ol><li> Sobald die Probe laufen, können Schwellenwerte nun auf die Probe zu Hause in einem bestimmten Zellpopulation angewandt werden. Hier werden wir Schwellenwerte anpassen, um den Prozentsatz von lebenden und toten Zellen in Zellen GFP-transduzierten bestimmen. </li><li> Unter der Registerkarte Muster, sind die Anzahl und der Prozentsatz von Zellen, die GFP, lebenden und toten Zellen, die GFP insgesamt Lebensfähigkeit, durchschnittliche Zellgröße, Anzahl der Zellen gezählt und Zellkonzentration angezeigt. </li><li> Darüber hinaus sind Histogramm Anzeige Zellgröße, grüne Fluoreszenz, und rote Fluoreszenz (PI) am unteren Rand des Bildschirms angezeigt. </li><li> So legen Sie die Größe der Zellen Tor, berühren Sie die Zellengröße Vorschaubild, um die Größe der Zellen Histogramm geöffnet. Während kultivierten Zellen haben nur selten debris, können andere Proben enthalten Trümmer, die größer oder kleiner als die Zellen ist. </li><li> So schließen Sie diese Trümmer, schieben Sie die blauen Tasten auf den Schieberegler, um große und kleine Veranstaltungen auszuschließen. Berühren Sie dann auf Übernehmen, um wieder die Daten analysieren und aktualisieren Sie die Ergebnisse. </li><li> Weiter, um die GFP-Fluoreszenz zur Analyse hinzuzufügen, berühren Sie die GFP-Histogramm Vorschaubild, um es zu öffnen. Schieben Sie den blauen Balken auf der Schwelle, nur um das Recht der dunkelste Spitze gesetzt, mit der Kontrollprobe als Leitfaden. </li><li> Dies ermöglicht die Analyse der GFP-positiven Zellen umfassen, sind jedoch ausgeschlossen autofluoreszierenden Zellen. Autofluoreszenz ist häufig zu beobachten, wenn die biologische Moleküle innerhalb der Zellen angeregt werden. </li><li> Berühren Übernehmen, um zu bestätigen und zum vorherigen Bildschirm zurück. Die Daten unter den Sample Registerkarte angezeigt werden soll, zeigt nun den Toren und Schwellenwerte für Fluoreszenz-Kanäle eingestellt. </li><li> Als nächstes zur Trennung der PI gefärbten Zellen aus Autofluoreszenz, drücken Sie tEr PI Histogramm Miniaturansicht zu öffnen PI Histogramm. </li><li> Auch hier wird die Kontrollprobe Gipfel als graue Gipfel im Histogramm angezeigt werden. Die rote Spitze ist die Probe Fluoreszenz. Die Hintergrund-Fluoreszenz ist als Peak am nächsten an die 0 RFU Wert auf dieser Zytometer angezeigt. </li><li> Zur Beseitigung der Hintergrundfluoreszenz in der PI-Kanal, bewegen Sie den blauen Knopf auf den Schieberegler, um die Schwelle anzupassen, um den Gipfel vertreten Hintergrundfluoreszenz auszuschließen, mit dem grauen Spitzen aus der Kontrollprobe als Referenz. Berühren Übernehmen, um zu bestätigen und zum vorherigen Bildschirm zurück. </li><li> Weiter, um visuell zu bestätigen, dass jede Zelle korrekt zugewiesen ist, wählen Sie einen gefangenen Sichtfeld für die Überprüfung durch Drücken der Miniaturansicht des Bildes in der Registerkarte Zoom, drücken Sie dann die Registerkarte Layer. </li><li> Anschließend drücken Sie die GFP-oder PI-Taste, um das Bild durch die jeweiligen Kanal erfasst Display. Drücken Sie die Taste erneut, um die Schicht aus der Anzeige zu entfernen, oder die Schichten überlagern, berühren Sie die Multiple-Layer-Taste. </li><li> Um herauszufinden, wie die Zellen durch einen bestimmten Kanal, berühren Circles gezählt. Die Zellen, die nur durch die Hellfeld-Kanal, der nicht exprimieren Fluoreszenz in blau eingekreist werden gezählt wurden. Dies deutet darauf hin, dass bestimmte Zelle zu leben (dh PI negativ) ist. </li><li> Zellen, die GFP wird in den GFP-Kanal zu sehen ist, und wird in grün eingekreist. Tote Zellen mit Dead Cell Red angefärbt wird in der PI-Kanal zu sehen ist, und wird in rot eingekreist. </li><li> Cells sowohl in der roten und grünen Kanal gezählt in gelb eingekreist werden, bedeutet dies, dass die Zelle GFP exprimiert, sondern ist auch mit PI gefärbt und somit tot ist. </li><li> Gelegentlich schwarze Kreise auf dem Bildschirm erscheinen, werden diese Objekte, die identifiziert wurden, haben aber von der Analyse über die Zellgröße Basis ausgeschlossen. </li><li> Weiter zu fine Melodie die Schwelle auf die Fluoreszenz-Histogramm mit der soeben beschriebenen, bis jede Zelle, die Expression Fluoreszenz wird mit der entsprechenden Farbe eingekreist ist. </li><li> Alle Analysen werden automatisch unter der Registerkarte gespeichert. Die Tali Zytometer Dateien von rund 500 Probe läuft zu speichern. </li><li> Jede Datei in der Registerkarte Daten gespeichert ist für Reanalyse. Durch die Auswahl der Datei aus der Registerkarte Daten wird geöffnet und alle Histogramme und Schichten aktiv zu werden. </li><li> So archivieren Sie Daten und Berichte zu generieren, können die Daten im Durchflusszytometer gespeichert werden, um einen Computer mit einem USB-Laufwerk übertragen werden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Die Tali Image-Based Cytometer wurde verwendet, um das fluoreszierende Protein Expression in Zellen, die mit einem nuklear gezielte GFP BacMam 2.0 Ausdruck konstruieren transduziert wurden zu messen. Vier Vertreter Zelltypen wurden transduziert (U2OS, 293MSR, HEKn und CHO-S).Für diesen Zelllinien wurde die Anzahl der Zellen, die GFP wurden von den Tali Zytometer berichtet und im Vergleich mit Daten aus der gleichen Proben auf einem Durchflusszytometer analysiert. Zusätzlich wurden die Zellen mit Dead Cell Red-Reagenz mit der Tali Viability Kit, um die Toten Zellpopulation sowohl auf der Tali Durchflusszytometer und am Durchflusszytometer identifizieren gefärbt. Die grafischen Darstellungen in Abbildung 2 zeigen die Prozent der Gesamtbevölkerung für jeden Zelltyp, dass die GFP wurden. Diese Daten zeigen, dass die Tali Zytometer Daten vergleichbar mit Daten, die von einem Durchflusszytometer generiert produziert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig1.jpg" /> Abbildung 1. Cells richtig konzentrieren sollten vor der Analyse. Tali Cellular Analysis Dias mit Zellkonzentrationen geeignet für Analyse (1 x 05 bis 1 Oktober x 10 7 Zellen werden empfohlen). (Links) im-Fokus-Zellen gleichmäßig dArche in der Zelle, mit einem hellen Schein um jede Zelle. (CENTER) Zellen können niedrig beziffert, wenn der Übergang zwischen dem Hintergrund und die Ränder der Zellen fuzzy sind und die Zellen haben undefined Grenzen (RIGHT) Cells vielleicht overcounted, wenn sie hell haben Zentren und dunklen Perimeter. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig2.jpg" /> Abbildung 2. Fluorescent Protein-Expression Daten aus dem Tali Image-Based Cytometer ist vergleichbar mit der unter Verwendung der Durchflusszytometrie. A side-by-Side-Vergleich der berechneten GFP-Expression zu 4 verschiedenen Zelllinien in lebenden Zellen.

<ol>
	<li>Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementarity+of+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Microscopy.">Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy.</a> Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).</li><li>Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+analysis+by+open-source+software+for+affordable+cytometry.">Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry.</a> Scanning. 33, 33-40 (2011).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li><li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+apoptosis:+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system.">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-654 (2002).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Koopman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+V+for+flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+B+cells+undergoing+apoptosis.">Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis.</a> Blood. 84, 1415-1420 (1994).</li><li>Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+fluorochromes+to+ethidium+bromide+for+automated+read+out+of+cytotoxicity+tests.">Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests.</a> J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).</li><li>King, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+dead+cells+and+measurement+of+cell+killing+by+flow+cytometry.">Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).</li><li>Jones, K. H., Kniss, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+as+a+nuclear+counterstain+for+immunofluorescence+studies+on+cells+in+culture.">Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).</li><li>Dell'Arciprete, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+expression+gene+cloning+by+flow+cytometry.">High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry.</a> J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).</li><li>Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+quantitative+and+inexpensive+method+for+detecting+apoptosis+by+flow+cytometry+in+transiently+transfected+cells.">A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).</li><li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li></ol>

Krissy Remple und Laurel Stein sind die Mitarbeiter von Life Technologies, der das Instrument in diesem Artikel verwendeten produziert. Life Technologies hat die Produktion dieses Video-Artikel gesponsert.

Wir haben gerade ein Verfahren zur Durchführung Lebensfähigkeit zählt und Beurteilung GFP-Expression mit der Tali Image-Based Cytometer detailliert. Nach dem gleichen Verfahren, ist dies Zytometer der Lage, eine Reihe weiterer Tests, einschließlich: Apoptose, RFP und die Lebensfähigkeit der Zellen Analyse unter Verwendung von nicht-transduzierten Zellen. Fluorometric Assays der Lebensfähigkeit der Zellen, Genexpression und Apoptose sind zu den wichtigsten Methoden in der biomedizinischen Forschung 7-12. In der Vergangenheit getrennte Instrumentierung wurde verwendet, um quantitative und visuelle Informationen über Zellen zu erhalten. Während quantitative Informationen über die Zellen innerhalb einer heterogenen Bevölkerung hat durch den Einsatz der Durchflusszytometrie wurden sammelte, hat Seh-oder qualitative Informationen durch den Einsatz von Fluoreszenz-Mikroskopie 1-4 zusammengetragen. Hier präsentieren wir eine Technologie, die die Lücke zwischen Bevölkerung und einzelne Zelle Studien Brücken. Mit der Tali Image-Based Cytometer, quantitative data und visuelle Zelle Daten über einzelne Zellen oder Zellpopulationen können gleichzeitig erfasst werden. Die Tali Gerät kann für eine Vielzahl von Anwendungen einschließlich der Beurteilung von Genexpression, Apoptose-Assays, Studium der Wirksamkeit von Medikamenten und Beurteilung des Fortschreitens der Erkrankung verwendet werden. Die Tali Image-Based Cytometer erfasst und analysiert Hellfeld, rote Fluoreszenz und grünen Fluoreszenz-Bildern, so dass Informationen über Subpopulationen von Zellen zu erhalten. Zum Beispiel in diesem Test konnten wir tote Zellen von lebenden Zellen innerhalb der GFP-exprimierende Zellpopulation mit Dead Cell Red Farbstoff zu unterscheiden. Dies ermöglicht eine Genauigkeit bei der Messung an lebenden Zellen, die GFP, und identifiziert die Population von Zellen, einsetzbar für Downstream-Processing. Es ist wichtig zu beachten, dass die toten Zellen in der Bevölkerung könnten aus verschiedenen Quellen, einschließlich der normalen Zelltod in der Kultur oder der Zelltod durch Umgebungsbedingungen (zB Trypsinierung oder de verursacht wurde,ath hervorgerufen durch die Transfektion / Transduktion gewählten Methode). Hier zeigen wir die Verwendung des Tali Zytometer mit U2OS Zellen. Ähnliche Verfahren können durchgeführt unter Verwendung der meisten Säuger-und Insektenzellen werden. Für jede Zelllinie produziert die Tali Zytometer quantitative GFP-Expression Daten, die nicht mit einer visuellen Inspektion der Zellen mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop möglich. Obwohl diese Ergebnisse vergleichbar mit der Durchflusszytometrie sind, werden sie in einem Bruchteil der Zeit gesammelt. Das Durchflusszytometer ist in der Lage genau zu zählen Zellen zwischen 5 um bis 60 um im Durchmesser, idealerweise in einer Konzentration von 1 x 5 bis 1 Oktober x 10 7 Zellen / ml. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass die meisten Standard-Färbeprotokollen, einschließlich der Dead Cell Red Färbeprotokoll hier beschriebenen Nutzung Propidiumiodid zu lebenden und toten Zellen zu unterscheiden. Dies stellt eine Herausforderung bei der Beurteilung der Lebensfähigkeit in Zellen, die für st wurden permeabilisiertaining intrazellulärer Marker, da PI wird jede Zelle mit einem kompromittierten Membran Fleck. Da jeder Fluoreszenzfarbstoff oder Protein, das mit dem grünen oder roten Fluoreszenz-Kanäle nachgewiesen werden kann auf der Tali Image-Based Durchflusszytometer analysiert werden kann, zukünftige Studien untersuchen den Einsatz von alternativen Farbstoffen, wie Amin reaktiven Lebensfähigkeit Farbstoffe vier. Eine 2006 durchgeführte Studie von Perfetto et al. 12 fand diese Farbstoffe einfach zu bedienen sein und reproduzierbare in anspruchsvollen lebenden und toten Zell-Populationen. Beachten Sie, dass die Tali Grenzen hat in Bezug auf die Arten von Tests es leisten kann. Zum Beispiel, weil das Ziel durch das Instrument verwendet wird 4X, sind Zähloperationen größere Zelltypen beschränkt: sub-zellulären Strukturen wie Mitochondrien oder Vesikel und Bakterienzellen nicht quantifiziert werden können. Beachten Sie auch, dass der Nachweis Kanäle in Tali, um Fluorophore, die begeistern und emittieren innerhalb der Kanäle begrenzt sind. Während YFP und helles mCherry Signale cein erkannt werden, können Dimmer mCherry Signale nicht. Schließlich ist die Tali nur Analysen Zellen in Suspension. Es wird nicht genau zählen haftenden Zellen auf einen Objektträger. Darüber hinaus, während es nur eine begrenzte Fähigkeit zum Zählen Zellen, die unregelmäßig geformt sind, darunter auch einige Hefe und Primärzellen bewirkt. Darüber hinaus werden zukünftige Studien wahrscheinlich auf die Verwendung dieses Systems bei der Beurteilung der Expression von intrazellulären Markern. Individuelle Farben können für spektrale Überlappung mit benachbarten Kanälen, mit Invitrogen Online SpectraViewer Werkzeug (überprüft werden <a href="http://www.invitrogen.com/spectraviewer">www.invitrogen.com / spectraviewer</a> ). Angesichts der Neuheit dieser Technologie hat die gesamte Palette der Anwendungen noch zu entdecken gilt. Zusammenfassend zeigten die Tali Image-Based Cytometer hier präsentiert eine neue Technologie, die für die gleichzeitige Visualisierung und Analyse von Zell-Populationen ermöglicht, wodurch Beurteilung einzelner Zellen sowie cell Populationen in einem kompakten Format mit einem einfachen Workflow.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Tali Image-Based Cytometer </td><td> Invitrogen </td><td> T10796 </td></tr><tr><td> Tali Cellular Analysis Folien, 50 Folien </td><td> Invitrogen </td><td> T10794 </td></tr><tr><td> Tali Cellular Analysis Slides, 500 Dias </td><td> Invitrogen </td><td> T10795 </td></tr><tr><td> Tali Viability Kit - Dead Cell Red </td><td> Invitrogen </td><td> A10786 </td></tr><tr><td> Tali Viability Kit - Dead Cell Grün </td><td> Invitrogen </td><td> A10787 </td></tr><tr><td> Tali Apoptosis Kit </td><td> Invitrogen </td><td> A10788 </td></tr><tr><td> U2OS Zellen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of gfp expression and viability using the tali image-based cytometer

Single-Zelle und der Bevölkerung Informationen werden in der Regel entweder durch Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie erhalten. Allerdings bieten diese beiden Methoden unterschiedliche Informationen. Die Durchflusszytometrie ermöglicht quantitative multi-parametrischen Informationen über physikalische Eigenschaften und Färbung oder einen Ausdruck, nicht aber für die Visualisierung zu ermöglichen. Stand-alone-Fluoreszenzmikroskopie bietet visuelle Daten, aber nicht für einfache quantitative Messungen 1 zu ermöglichen. Image-basierte Zytometrie schließt die Lücke zwischen diesen beiden Methoden, so dass die schnelle Visualisierung und gleichzeitige quantitative Analyse von Tausenden von Zellen in heterogenen Populationen 2. Hier stellen wir ein Verfahren zur Durchführung Lebensfähigkeit der Zellen und grün fluoreszierende Protein (GFP)-Expression Assays mit der Tali Image-Based Cytometer 3. Die Tali Instrument ist ein 3-Kanal-(Hellfeld, grüne Fluoreszenz, rote Fluoreszenz) Benchtop-Assay-Plattform, die Offers mehrere Vorteile gegenüber der Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie. Die Tali Zytometer ist weniger teuer, nimmt weniger Platz, weniger wartungsintensiv und die Arbeitsabläufe vereinfacht worden, so dass der Betrieb und die Analyse sehr viel einfacher und schneller ist. Die Tali Zytometer ist der Lage, eine Reihe von Federung zell-basierte Assays, einschließlich GFP und rot fluoreszierendes Protein (RFP) Ausdruck, Apoptose 4-6 und die Lebensfähigkeit der Zellen Analyse mit Propidiumiodid (PI) 7-11. Hier zeigen wir die Verwendung des Tali Instrument bei der Durchführung einer Lebensfähigkeit der Zellen Assay in Zellen, die GFP. GFP-transduzierten Zellen gefärbt mit der Tali Viability Kit - Dead Cell Red. Die Zellen werden dann in eine Tali Cellular Analysis Slide pipettiert und in das Durchflusszytometer. Hellfeld, rote Fluoreszenz und grüne Fluoreszenz Bilder werden erfasst und analysiert mit Assay-spezifischen Algorithmen. Histogramme werden dann generiert, um Zellgröße, PI fluo-DisplayFluoreszenzintensität und GFP-Fluoreszenz-Intensität. Diese Parameter können dann zu Hause in einem bestimmten Zellpopulation Schwellenwert werden. Ein Side-by Side-Vergleich der Tali Image-Based Cytometer und traditionelle Durchflusszytometrie zeigt, dass die beiden Methoden vergleichbare Daten über die Lebensfähigkeit der Zellen und Protein-Expression bieten. Allerdings sieht der Tali Instrument zusätzliche visuelle Informationen über die Zellpopulation, die nicht erhalten werden kann mit einem Durchflusszytometer werden.

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer at JoVE.com

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Lebensfähigkeit der Zellen-und Fluoreszenz-Expressions-Assays mit der Tali Image-Based Cytometer durchzuführen.

Beurteilung der GFP Expression und Lebensfähigkeit Mit der Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

assessment-gfp-expression-viability-using-tali-image-based

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K Aufrufe.  Life Technologies. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Lebensfähigkeit der Zellen-und Fluoreszenz-Expressions-Assays mit der Tali Image-Based Cytometer durchzuführen.

Serie: Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

Gezielte Expression von GFP in den Haarfollikel mit Ex Vivo viralen Transduktion

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Forschung

Biologie

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Zählen und Bestimmung der Lebensfähigkeit von kultivierten Zellen

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

Beurteilung der mitochondrialen Funktionen und Zellviabilität in Renal Überexpression Protein Kinase C-Isoenzyme

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

Live Cell Cycle Analysis von<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe mit dem Attune Acoustic Fokussierung Cytometer und Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Messung der Stoffwechselrate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Mit Respirationstest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

Abbilden des intrazellulären Transport von APP mit Photoaktivierbare GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...