1. تلوين خلايا مع مجموعة الاستمرارية طالي -- الميت الكاشف خلية الأحمر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبدأ هذا الإجراء مع الخلايا U2OS (كوكتيل الثقافة الأمريكية نوع) التي تم transduced باستخدام CellLight نيوكليوس - GFP BacMam * 2.0 *. (ملاحظة : يمكن أيضا أن تكون خلايا نسج أسفل ومعلق في المتوسط ​​أو برنامج تلفزيوني). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لصبغ الخلايا الميتة مع PI ، ونقل 100 ميكروليتر من الخلايا لأنبوب microcentrifuge جديدة. علما بأن ينصح بتركيز 1 × 05 حتي 01 أكتوبر مل / س 10 7 خلايا لهذا الاختبار ، على الرغم من أن التركيز لم يكن على وجه الدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القادم ، وصمة عار على الخلايا الميتة ، إضافة 1 ميكروليتر من كاشف طالي PI المستندة إلى خلية الميت الأحمر. لفترة وجيزة إلى دوامة المزيج. احتضان الأحمر الميت طالي خلية الكاشف وخليط الخلايا في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 1-5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة ، الشروع فورا في تحليل العينة على عداد الكريات يستند إلى صورة تالي. </li></ol> 2. إجراء الفحص بقاء الخلية باستخدامكاحل يستند إلى صورة عداد الكريات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويستخدم عداد الكريات طالي البلاستيكية الخلوية تحليل الشرائح طالي التي تناسب تحديدا في عداد الكريات ويمكن أن تعقد عينتين 25μL في غرف مغلقة منفصلة (A و B). عند التعامل مع الشريحة ، ومن المؤكد أن تعقد دائما من قبل الجانبين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحميل الشرائح ، ماصة 25 ميكروليتر من عينة ببطء في نصف القمر على شكل نموذج منطقة التحميل ، مع الحرص على تجنب تشكيل فقاعات أو الظهر ترشيش. لا تزيد ولا تقل عن ملئه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا ، يتم تحميل خلايا تحكم (غير ملوثين ، وعدم transduced) في القاعة ألف والملون ، معربا عن GFP. يتم تحميل خلايا باء في غرفة العينة السيطرة ستساعد على تحديد مستوى تألق ذاتي عند تحليل البيانات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء فحص السلامة ، المس GFP / RFP على الشاشة الرئيسية للعداد الكريات. سوف تظهر الخيارات مقايسة ثم على اليمين. حدد GFP + الاستمرارية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، على سبيل المثال سلسلة عينة ، اضغط اسم الآن </strong&gt;. ثم ، وذلك باستخدام شاشة تعمل باللمس ، واكتب اسم سلسلة العينة ، ووفر الصحافة. (ملاحظة : الاسم في وقت لاحق لتحديد تلقائيا تعيين اسم لكل عينة من سلسلة التاريخ والوقت.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تسمية العينة ، فإن عداد الكريات طالي مسبقا تلقائيا إلى الشاشة قياس. اضغط على التبويب الخلفية في أسفل النصف الأيمن من الشاشة قياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، مع عينة التحكم (أ) التي تواجه بعيدا عن عداد الكريات ، إدراج شريحة في مرفأ التحميل حتى تتوقف. لا تطبق بالقوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الشاشة الخلفية ، اضغط على لمسة إدراج خلية جديدة للمراقبة غير ملوثين. سيتم تلقائيا الشريحة يتم سحبها في عداد الكريات ، وسوف يتم عرض صورة حية من الخلايا التي تظهر على الشاشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقبض التركيز ، وجعل هذه الخلايا في الطائرة السليم للعرض. ينبغي أن تكون مظلمة الخلايا بشكل موحد مع هالة مشرقة حول كل خلية (الشكل 1 ، يسار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخليةقد يكون قلل ق عند الانتقال بين الخلفية وحواف الخلايا هو غامض ، بحيث لا حدود واضحة المعالم الخلية (الشكل 1 ، ومركز). قد يكون overcounted الخلايا عندما يكون لديهم مراكز مشرق ومحيط الظلام (الشكل 1 ، يمين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لرؤية أفضل للسكان الخلية مع التركيز ، حرك المؤشر أحمر الزر لتكبير 4X أو 16X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم جلب الخلايا في التركيز ، اضغط على لتشغيل لمسة غير ملوثين التحكم الخلية لقياس مضان الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف عداد الكريات تلقائيا التقاط الصور وتحليل العينة. يستغرق حوالي 1 دقيقة لالتقاط وتحليل الصور في الافتراضي (9 الصورة) واسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم عرض الصور المصغرة في كل مجال الرؤية كما يتم القبض عليهم وشريط تقدم تحديثا مستمرا. بعد التقاط الصورة كاملة ، وإخراج عداد الكريات تلقائيا الشريحة ويوفر البيانات من تحليل الصور الملتقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">سيتم عرض البيانات المخزنة في القائمة المنسدلة من علامة التبويب الخلفية في عداد الكريات. وسيتم تعيين عينة تحكم خلفية نفس اسم أنه بالنظر إلى التجربة وسوف يتم استيرادها من القائمة المنسدلة. ملاحظة : إذا لم يتم تشغيل التحكم الخلفية ، عداد الكريات تلقائيا بتعيين عتبة مضان. ويمكن تغيير هذا يدويا بعد إجراء الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشغيل العينة PI الملطخة transduced ، وإزالة الشريحة من عداد الكريات ، والوجه حولها ومعاودة مع العينة التي تواجه transduced بعيدا عن الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على التبويب نموذج ، ثم اضغط على اتصال إدراج نموذج جديد. عندما تظهر الصورة على الشاشة ، استخدم مفتاح التكيف الصورة لجعل الخلايا في التركيز كما كان من قبل. اللمس ثم اضغط على تشغيل نموذج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التقاط الصورة كاملة ، والبيانات من التحليل يظهر تحت علامة التبويب نموذج والتلقائي عداد الكرياتحليف إخراج الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصرف بشكل مناسب من التحليل طالي الشرائح الخلوية كنفايات biohazardous. لا يمكن تحليل الشرائح كاحل الخليوي يمكن استخدامها. </li></ol> 3. تحديد العتبات وغيتس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد تشغيل العينة ، ويمكن الآن عتبات يتم تطبيقها على عينة من المنزل على السكان في خلية معينة. هنا ، وسوف نقوم بتعديل العتبات لتحديد نسبة الخلايا الحية والميتة في GFP - transduced الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت علامة التبويب نموذج ، يتم عرض عدد ونسبة الخلايا معربا عن GFP ، والخلايا الحية والميتة معربا عن GFP ، البقاء الإجمالي ، متوسط ​​حجم الخلية ، وعدد الخلايا عدها ، وتركيز الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض قطع الرسم البياني عرض حجم الخلية ، ومضان أخضر ، أحمر ومضان (PI) في أسفل الشاشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعيين البوابة حجم الخلية ، تلمس حجم الخلية المصغرة لفتح الرسم البياني حجم الخلية. في حين أن الخلايا مثقف ونادرا ما يكون دebris ، قد تحتوي على عينات أخرى الحطام الذي هو أكبر أو أصغر من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستبعاد هذا الحطام ، الشريحة أزرار زرقاء على شريط التمرير لاستبعاد الأحداث الكبيرة والصغيرة على حد سواء. ثم ، لمسة على تطبيق لإعادة تحليل البيانات واستكمال النتائج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، إضافة إلى مضان GFP للتحليل ، لمسة للإبهام GFP الرسم البياني لفتحه. حرك الشريط الأزرق لضبط عتبة عادل لليمين الأكثر خفوت الذروة ، وذلك باستخدام عينة السيطرة كدليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح هذا التحليل ليشمل الخلايا GFP إيجابية ، ولكنها تستبعد الخلايا autofluorescent. ويلاحظ في كثير من الأحيان عندما تألق ذاتي متحمسون الجزيئات البيولوجية داخل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتصال لتأكيد تطبيق والعودة إلى الشاشة السابقة. وينبغي أن البيانات المعروضة تحت علامة التبويب عينة تعكس الآن على أبواب وعتبات المحدد لكلتا القناتين مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، لفصل الخلايا PI الملون من تألق ذاتي ، اضغط رانه PI المصغرة الرسم البياني لفتح الرسم البياني PI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة أخرى ، سيتم عرض عينة ذروة السيطرة باعتبارها ذروة رمادية على الرسم البياني. ذروة الأحمر هو مضان العينة. يتم عرض مضان الخلفية باعتبارها ذروة الأقرب إلى القيمة 0 على هذا RFU عداد الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للقضاء على مضان الخلفية في قناة بي ، حرك الزر الأزرق على شريط التمرير لضبط عتبة استبعاد تمثل ذروة مضان الخلفية ، وذلك باستخدام ذروة الرمادية من العينة تحكم كمرجع. اتصال لتأكيد تطبيق والعودة إلى الشاشة السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، لتأكيد بصريا الذي تم تعيينه بشكل صحيح كل خلية ، حدد حقل القبض على النظر للمراجعة عن طريق الضغط على الصورة المصغرة للصورة في التبويب التكبير ، ثم الضغط على علامة التبويب الطبقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، اضغط على زر أو GFP PI ، لعرض الصور الملتقطة من خلال هذه القناة خاصة. اضغط على نفس الزر مرة أخرى لإزالة طبقة من العرض ، أو ، إلى فرض طبقات ، طبقة لمسة زر متعددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد كيف يتم عد الخلايا من خلال قناة خاصة ، الدوائر التي تعمل باللمس. الخلايا التي تم عدها من خلال القناة الوحيدة مشرق الميدان ، والتي لا تعبر عن وسيتم مضان دائري باللون الأزرق. هذا يشير إلى أن تلك الخلية خاص هو العيش (أي بي سالب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيتبين GFP معربا عن الخلايا في القناة GFP ، وسيتم دائري باللون الأخضر. سيتبين الخلايا الميتة ملطخة الأحمر الميت الخليوي في قناة بي ، وسوف يكون دائريا في الحمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسيتم فرز الخلايا في القناة على حد سواء أحمر وأخضر دائري باللون الأصفر ، وهذا يشير إلى أن الخلايا عن GFP ، ولكن أيضا مع PI الملون وبالتالي فهو ميت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أحيانا ، الدوائر السوداء سوف تظهر على الشاشة ، وهذه هي الأشياء التي تم تحديدها ، ولكن تم استبعادها من التحليل القائم على حجم الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تواصل فايشمال شرق توليف على عتبة المدرج مضان باستخدام الخطوات الموضحة فقط حتى يتم حلقت كل خلية التي يتم التعبير عن مضان مع اللون المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تلقائيا حفظ جميع المعلمات تحت علامة التبويب تحليل البيانات. يمكن تخزين بيانات عداد الكريات طالي الملفات من تشغيل ما يقرب من 500 عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل الملفات المخزنة في التبويب البيانات المتاحة لإعادة التحليل. وذلك بتحديد ملف من علامة التبويب بيانات يمكن فتحه ورسوم بيانية وجميع طبقات تصبح نشطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأرشفة البيانات وتوليد التقارير ، قد يكون نقل البيانات المخزنة في عداد الكريات إلى كمبيوتر باستخدام محرك أقراص USB. </li></ol> 4. ممثل النتائج : تم استخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات لقياس مستوى بروتين فلوري التعبير في الخلايا التي تم transduced مع النووية التي تستهدف بناء BacMam GFP التعبير 2.0. وكانت transduced أربعة أنواع الخلايا ممثل (U2OS ، 293MSR ، HEKn وS - CHO).لهذه خطوط الخلايا ، تم الابلاغ عن عدد من الخلايا التي تم التعبير عن GFP من عداد الكريات تالي وبالمقارنة مع بيانات من نفس العينات على تحليل تدفق عداد الكريات. بالإضافة إلى ذلك ، تم صبغ الخلايا مع كاشف خلية الأحمر الميت باستخدام أدوات لتحديد الجدوى طالي السكان خلية ميتة سواء في عداد الكريات تالي وعلى تدفق عداد الكريات. ورسوما بيانية تظهر في الشكل 2 في المئة من مجموع السكان لكل نوع من الخلايا التي تم التعبير عن GFP. هذه المعطيات تدل على أن عداد الكريات طالي تنتج بيانات قابلة للمقارنة على البيانات التي يولدها تدفق عداد الكريات. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig1.jpg" /> الشكل 1. وينبغي أن تركز الخلايا بشكل صحيح قبل التحليل. الشرائح طالي التحليل الخلوي مع تركيزات الخلية المناسبة للتحليل (ينصح 1 × 05-01 أكتوبر 7 × 10 خلايا) (يسار) في تركيز الخلايا د موحدقد يكون قلل الفلك في جميع أنحاء الخلية ، مع هالة مشرقة حول كل خلية خلايا (في الوسط) عند الانتقال بين الخلفية وحواف من الخلايا هي الخلايا غامض وغير معروف لها حدود (يمين) خلايا overcounted ربما عندما يكون لديهم مشرق محيط المراكز والظلام. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig2.jpg" /> الشكل 2. الفلورسنت البيانات بروتين تعبير عن عداد الكريات طالي يستند إلى صورة غير قابلة للمقارنة لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام التدفق الخلوي. مقارنة جنبا إلى جنب النتائج GFP التعبير عن محسوب في 4 خطوط مختلفة من الخلايا في الخلايا قابلة للحياة.

<ol>
	<li>Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementarity+of+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Microscopy.">Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy.</a> Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).</li><li>Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+analysis+by+open-source+software+for+affordable+cytometry.">Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry.</a> Scanning. 33, 33-40 (2011).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li><li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+apoptosis:+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system.">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-654 (2002).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Koopman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+V+for+flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+B+cells+undergoing+apoptosis.">Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis.</a> Blood. 84, 1415-1420 (1994).</li><li>Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+fluorochromes+to+ethidium+bromide+for+automated+read+out+of+cytotoxicity+tests.">Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests.</a> J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).</li><li>King, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+dead+cells+and+measurement+of+cell+killing+by+flow+cytometry.">Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).</li><li>Jones, K. H., Kniss, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+as+a+nuclear+counterstain+for+immunofluorescence+studies+on+cells+in+culture.">Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).</li><li>Dell'Arciprete, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+expression+gene+cloning+by+flow+cytometry.">High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry.</a> J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).</li><li>Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+quantitative+and+inexpensive+method+for+detecting+apoptosis+by+flow+cytometry+in+transiently+transfected+cells.">A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).</li><li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li></ol>

كريسي Remple وستون لوريل والعاملين في تقنيات الحياة الذي أنتج الأداة المستخدمة في هذه المقالة. وقد رعت الحياة تكنولوجيز إنتاج هذه المادة عن طريق الفيديو.

وقد فصلنا مجرد إجراء لأداء بحساب الجدوى وتقييم التعبير GFP باستخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات. باستخدام نفس الإجراء ، وهذا هو عداد الكريات قادرة على أداء عدد من فحوصات أخرى ومنها : موت الخلايا المبرمج ، وخلية التحليل RFP جدوى استخدام المنظمات غير transduced الخلايا. أصبحت المقايسات Fluorometric من بقاء الخلية ، والتعبير الجيني والخلايا الرئيسية في منهجيات البحوث الطبية الحيوية 7-12. في الأجهزة ، في الماضي منفصلة تم استخدامها للحصول على معلومات كمية والبصرية حول الخلايا. في حين تم المعلومات الكمية حول الخلايا ضمن مجموعة من السكان غير متجانسة حصل من خلال استخدام التدفق الخلوي ، وقد تم جمع المعلومات المرئية أو نوعية من خلال استخدام المجهر مضان 1-4. هنا ، نقدم التكنولوجيا التي تسد الفجوة بين السكان ودراسات الخلايا الفردية. استخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات والكمية داويمكن جمع البيانات وتا الخلايا البصرية حول الخلايا الفردية أو السكان الخلية في وقت واحد. يمكن استخدام أداة طالي لمجموعة من التطبيقات بما في ذلك تقييم التعبير الجيني ، المقايسات موت الخلايا المبرمج ، ودراسات نجاعة الأدوية ، وتقييم تطور المرض. ويستند إلى صورة طالي يلتقط عداد الكريات مشرق وتحليلات ميدانية ، مضان أحمر والصور مضان أخضر ، مما يتيح الحصول على معلومات عن المجموعات السكانية الفرعية من الخلايا. على سبيل المثال ، في هذا الاختبار ، كنا قادرين على التمييز بين الخلايا الميتة من الخلايا الحية داخل GFP ، معربا عن سكان الخلية باستخدام صبغة الأحمر الميت الخلية. وهذا يعطي دقة في قياس خلايا قابلة للحياة معربا عن GFP ، ويحدد عدد السكان من الخلايا يمكن استخدامها لمعالجة المصب. ومن المهم أن نلاحظ أن الخلايا الميتة في عدد السكان يمكن أن تنشأ من مصادر مختلفة ، بما في ذلك موت الخلايا الطبيعية في الثقافة أو موت الخلية الناجمة عن الظروف البيئية (على سبيل المثال ، أو بحكم trypsinizationATH الناجم عن الأسلوب ترنسفكأيشن / تنبيغ المختار). نحن هنا لشرح استخدام عداد الكريات طالي U2OS مع الخلايا. لا يمكن أن يؤديها أساليب مماثلة باستخدام خلايا معظم الثدييات والحشرات. لكل خط الخلية ، أنتجت كمية البيانات عداد الكريات طالي GFP التعبير ، التي هي غير ممكنة مع الفحص البصري من الخلايا باستخدام المجهر مضان القياسية. على الرغم من أن هذه النتائج قابلة للمقارنة مع التدفق الخلوي ، يتم جمعها في جزء من الوقت. في عداد الكريات قادر على الفرز بين الخلايا بدقة 5 ميكرون إلى 60 ميكرون في القطر ، وبشكل مثالي في تركيز 1 × 05-1 أكتوبر الخلايا 7 × 10 / مل. من المهم أن نشير إلى أن معظم البروتوكولات تلطيخ القياسية ، بما في ذلك البروتوكول خلية تلوين الأحمر الميت الموصوفة هنا ، استخدم يوديد propidium للتمييز بين الخلايا الحية والميتة. هذا يمثل تحديا عند تقييم الجدوى في الخلايا التي تم permeabilized عن شaining علامات داخل الخلايا ، حيث سيكون وصمة عار PI مع أي خلية غشاء خطر. حيث يمكن تحليل أي صبغة الفلورسنت أو البروتين الذي يمكن اكتشافه مع القنوات مضان أخضر أو أحمر على عداد الكريات يستند إلى صورة تالي ، قد الدراسات المستقبلية استكشاف استخدام الأصباغ البديلة ، مثل الأمينات الأصباغ بقاء رد الفعل 4. ووجدت دراسة عام 2006 من قبل وآخرون Perfetto (12). هذه الأصباغ لتكون سهلة الاستخدام وقابلة للتكرار في تمييز السكان الخلية الحية والميتة. علما بأن طالي والقيود فيما يتعلق أنواع المقايسات أنها يمكن أن تؤدي. على سبيل المثال ، لأن الهدف المستخدمة من قبل الصك 4X ، وتقتصر عمليات الفرز على أنواع أكبر خلية : شبه الخلوية هياكل مثل الميتوكوندريا أو حويصلات ، ولا يمكن أن يكون كميا الخلايا البكتيرية. نلاحظ أيضا أن تقتصر قنوات الكشف في تالي إلى fluorophores التي سوف تثير وتنبعث منها داخل القنوات. بينما YFP ومشرق mCherry ج إشاراتيتم الكشف عن ، يمكن باهتة إشارات mCherry لا. أخيرا ، طالي التحليلات فقط الخلايا في التعليق. فإنه لا يحسب بدقة خلايا الانضمام إلى شريحة. وعلاوة على ذلك ، في حين أن هناك قدرة محدودة لفرز الخلايا التي تتشكل بصورة غير نظامية ، بما في ذلك بعض الخمائر والخلايا الأولية. بالإضافة إلى ذلك ، سوف تتناول الدراسات المستقبلية المحتمل استخدام هذا النظام في تقييم التعبير من علامات داخل الخلايا. يمكن التحقق من الأصباغ الفردية للتداخل مع القنوات الطيفية المجاورة ، وذلك باستخدام أداة لInvitrogen SpectraViewer الانترنت ( <a href="http://www.invitrogen.com/spectraviewer">www.invitrogen.com / spectraviewer</a> ). نظرا لحداثة هذه التكنولوجيا ، ومجموعة كاملة من التطبيقات لم يتم اكتشافها. باختصار ، صورة القائم على طالي عداد الكريات تظاهر هنا يقدم تكنولوجيا جديدة تسمح لتصور في وقت واحد وتحليل للسكان الخلية ، مما يتيح تقييم الخلايا الفردية ، وكذلك سلل السكان في شكل التعاقد مع سير عمل بسيطة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> كاحل يستند إلى صورة عداد الكريات </td><td> Invitrogen </td><td> T10796 </td></tr><tr><td> الشرائح كاحل التحليل الخلوي ، 50 الشرائح </td><td> Invitrogen </td><td> T10794 </td></tr><tr><td> الشرائح كاحل التحليل الخلوي ، 500 الشرائح </td><td> Invitrogen </td><td> T10795 </td></tr><tr><td> كاحل كيت الاستمرارية -- الميت الاحمر الخليوي </td><td> Invitrogen </td><td> A10786 </td></tr><tr><td> كاحل كيت الاستمرارية -- الميت الخضراء الخلية </td><td> Invitrogen </td><td> A10787 </td></tr><tr><td> كاحل الأبوطوزيس كيت </td><td> Invitrogen </td><td> A10788 </td></tr><tr><td> خلايا U2OS </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of gfp expression and viability using the tali image-based cytometer

ويتم الحصول على عادة وحيدة الخلية والمعلومات السكانية إما عن طريق الفحص المجهري أو التدفق الخلوي مضان. ومع ذلك ، فإن هذه طريقتين تقديم معلومات مختلفة. التدفق الخلوي يعطي كمية متعددة بارامترية من المعلومات حول الخصائص الفيزيائية وتلطيخ أو التعبير ، ولكن لا يسمح التصور. قائمة بذاتها المجهري مضان توفر بيانات مرئية ، لكنها لا تسمح للقياسات الكمية المباشرة 1. الصورة القائمة على الخلوي الجسور الفجوة بين هاتين الطريقتين ، وتمكين التصور سريعة والتحليل الكمي في وقت واحد الالاف من الخلايا في السكان غير متجانسة 2. هنا ، نقدم طريقة لأداء وقابلية الخلية الخضراء الفلورية المقايسات البروتين التعبير (GFP) باستخدام عداد الكريات طالي يستند إلى صورة 3. الصك تالي هو مقايسة الفوق 3 قناة (حقل مشرق ، ومخضر ، مضان أحمر) منصة الخاص بشركةمزايا عديدة عبر التمرير التدفق الخلوي ، والفحص المجهري مضان. في عداد الكريات تالي هو اقل كلفة ، ويأخذ مساحة أقل مقاعد البدلاء ، وتتطلب صيانة أقل ، ولقد تم تبسيط تدفق العمل بحيث العملية والتحليل هو أبسط من ذلك بكثير وأسرع. في عداد الكريات طالي غير قادرة على أداء مجموعة من الخلية المقايسات مقرها التعليق ، بما GFP والحمراء ببروتين التعبير (RFP) ، وموت الخلايا المبرمج 4-6 خلية تحليل الجدوى مع يوديد propidium (PI) 7-11. هنا ، ونحن لشرح استخدام الأداة طالي في أداء مقايسة بقاء الخلية في الخلايا معربا عن GFP. هي ملطخة GFP - transduced الخلايا باستخدام أدوات الاستمرارية طالي -- الميت الاحمر الخلية. وpipetted ثم الخلايا في تحليل طالي الشرائح الخلوية وتحميلها في عداد الكريات. يتم التقاط مجال مشرق ، ومضان أحمر وأخضر مضان الصور وتحليلها باستخدام خوارزميات مقايسة محددة. ثم يتم إنشاء رسوم بيانية لعرض حجم الخلية ، PI fluorescence الكثافة ، وGFP كثافة مضان. ويمكن بعد ذلك أن هذه المعلمات thresholded إلى منزل على السكان في خلية معينة. وجنبا إلى جنب مقارنة من عداد الكريات طالي يستند إلى صورة والتقليدية التدفق الخلوي يدل على أن الطريقتين توفير بيانات قابلة للمقارنة بشأن سلامة الخلية وبروتين تعبير. ومع ذلك ، فإن الصك طالي يوفر معلومات بصرية إضافية حول السكان الخلية التي لا يمكن الحصول عليها باستخدام عداد الكريات التدفق.

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer at JoVE.com

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

هذا البروتوكول يصف كيفية تنفيذ بقاء الخلية المقايسات والتعبير مضان باستخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات.

تقييم التعبير GFP واستمرار استخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

assessment-gfp-expression-viability-using-tali-image-based

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K Views.  Life Technologies. هذا البروتوكول يصف كيفية تنفيذ بقاء الخلية المقايسات والتعبير مضان باستخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات.

Video: Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

استهدفت التعبير عن GFP في بصيلات الشعر عن طريق خارج الجسم تنبيغ الفيروسية

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

العد وتحديد صلاحية خلايا مثقف

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

تقييم وظائف الميتوكوندريا وبقاء الخلية في خلايا الكلى البروتين Overexpressing نظائر الانزيمات C كيناز

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

تحليل دورة الخلية الحية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة باستخدام الصوتية أقلم التركيز عداد الكريات وVybrant DyeCycle البنفسج الحمض النووي وصمة عار

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

قياس معدل الأيض في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; باستخدام قياس التنفس

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

تصوير الاتجار بين الخلايا من APP مع GFP Photoactivatable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...