1. Células coradas com o Kit de Viabilidade Tali - Reagente Celular Red Dead <ol><li> Iniciar este procedimento com células U2OS (Coleção American Type Culture) que foram transduzidas usando CellLight Núcleo-GFP * BacMam 2,0 *. (Nota: As células podem também ser girado para baixo e ressuspenso em médio ou PBS). </li><li> Para manchar as células mortas com a PI, a transferência de 100 L das células para um tubo de microcentrífuga novo. Note-se que uma concentração de 1 x 10 5 a 1 x 10 7 células / ml é recomendado para este ensaio, embora a concentração não tem que ser exato. </li><li> Em seguida, a manchar as células mortas, adicionar 1 mL do reagente de PI baseada celular Tali Red Dead. Vortex brevemente para misturar. Incubar a Tali reagente Red Dead Cell e mistura de células em temperatura ambiente no escuro por 1-5 minutos. </li><li> Após a incubação, imediatamente proceder à análise da amostra no citómetro Tali Image-Based. </li></ol> 2. Realizar um ensaio de viabilidade celular Usando umTali Citómetro Baseado na Imagem <ol><li> O citômetro de Tali usa o plástico descartável Tali Slides Análise Cellular que especificamente se encaixam no citômetro e pode armazenar duas amostras 25μL em separado câmaras fechadas (A e B). Ao manusear o slide, não se esqueça de sempre mantê-la pelos lados. </li><li> Para carregar o slide, pipetar 25 mL da amostra lentamente na metade da área de carga em forma de lua amostra, tomando cuidado para evitar bolhas se formando ou para trás splatter. Não sobre ou sob a preencher. </li><li> Aqui, as células controle (sem manchas, não transduzidas) são carregados na câmara A ea GFP manchada células que expressam são carregados na câmara B. A amostra de controlo vai ajudar a determinar o nível de autofluorescência ao analisar os dados. </li><li> Para realizar um ensaio de viabilidade, toque GFP / RFP na tela inicial do citômetro. As opções de ensaio aparecerá à direita. Selecione GFP Viabilidade +. </li><li> Em seguida, para o nome da série de amostras, pressione Nome Agora </strong&gt;. Então, usando a tela sensível ao toque, digite o nome da série de amostras, e pressione Salvar. (Nota: Selecionar Nome Mais tarde, para atribuir automaticamente um nome para cada série de amostras por data e hora). </li><li> Depois de nomear a amostra, o citômetro de Tali avançará automaticamente para a tela Medida. Pressione a guia Plano de fundo na metade inferior direita da tela Medida. </li><li> Em seguida, com a amostra controle (A) de costas para o citómetro, inserir o slide no porto de carregamento até que ele pare. Não aplique força. </li><li> Na tela de fundo, toque Prima para Inserir controlo celular New corado. O slide irá automaticamente ser puxado para o citómetro e uma imagem ao vivo das células será exibido na tela. </li><li> Usando o botão de foco, trazer as células para o plano adequado de vista. As células devem ser uniformemente escuro, com um halo brilhante em torno de cada célula (Figura 1, esquerda). </li><li> Células pode ser undercounted quando a transição entre o fundo e as bordas das células é difuso, de modo que os limites da célula não são bem definidos (Figura 1, Centro). Células podem ser overcounted quando eles têm centros de brilhante e perímetros escuro (Figura 1, direita). </li><li> Para melhor visualizar a população de células enquanto se concentra, deslize o botão indicador vermelho Zoom de 4X ou 16X. </li><li> Quando as células foram trazidos para o foco, toque Prima para Run controlo celular não corado para medir a fluorescência de fundo. </li><li> O citômetro automaticamente capturar e analisar as imagens da amostra. Demora cerca de um minuto para capturar e analisar as imagens no padrão (9 imagem) mode. </li><li> Miniaturas de cada campo de visão são exibidos como eles são capturados ea barra de progresso fornece uma atualização em andamento. Após a captura de imagem estiver concluído, o citômetro de ejecta automaticamente o slide e fornece os dados a partir da análise das imagens capturadas. </li><li>Os dados armazenados serão exibidos no menu drop-down da guia de fundo no citômetro. A amostra controle de fundo será atribuído o mesmo nome que deu à experiência e será importado no menu suspenso. Nota: Se um controle de fundo não é executado, o citômetro atribui automaticamente um limiar de fluorescência. Isto pode ser alterado manualmente após a realização do ensaio. </li><li> Para executar o exemplo PI-transduzidas manchada, remova a lâmina do citômetro, lançá-lo ao redor e reinseri-lo com a amostra transduzidas de costas para o instrumento. </li><li> Pressione a aba da amostra, e em seguida, toque Prima para Inserir nova amostra. Quando a imagem aparece na tela, use o botão de ajuste de imagem para trazer as células em foco como antes. Em seguida, toque de Imprensa to Run Sample. </li><li> Após a captura da imagem estiver concluído, os dados da análise aparece sob a guia da amostra eo automática citómetroaliado ejeta o slide. </li><li> Adequadamente dispor do slide Análise Tali Cellular como resíduos perigosos. Slides Análise Tali celulares não podem ser reutilizados. </li></ol> 3. Limiares configuração e Gates <ol><li> Uma vez que a amostra foi executado, os limiares podem ser aplicados à amostra em casa, em uma população de células específicas. Aqui, vamos ajustar os limiares para determinar a porcentagem de células vivas e mortas no GFP-transduzidas células. </li><li> Sob a guia de amostra, o número ea porcentagem de células expressando GFP, as células vivas e mortas expressando GFP, viabilidade total, tamanho da célula média, número de células contadas, e concentração de células são exibidos. </li><li> Além disso, histograma mostrando o tamanho da célula, a fluorescência verde e fluorescência vermelha (PI) são exibidas na parte inferior da tela. </li><li> Para definir o tamanho da célula portão, toque na miniatura Tamanho da Célula para abrir o histograma do tamanho das células. Enquanto as células cultivadas raramente têm debris, outras amostras podem conter restos que é maior ou menor do que as células. </li><li> Para excluir os entulhos, deslize os botões azuis na barra de deslocamento para excluir eventos grandes e pequenos. Em seguida, toque em Aplicar para re-analisar os dados e atualizar os resultados. </li><li> Em seguida, adicionar a fluorescência da GFP para a análise, toque na miniatura histograma GFP para abri-lo. Deslize a barra azul para definir o limite à direita do pico mais escuras, usando a amostra de controlo como um guia. </li><li> Isso permite que a análise para incluir as células GFP positivas, mas excluem as células autofluorescent. Autofluorescência é freqüentemente observada quando as moléculas dentro das células biológicas são animado. </li><li> Toque em Aplicar para confirmar e voltar à tela anterior. Os dados exibidos na guia Sample agora deve refletir as portas e limiares definidos para ambos os canais de fluorescência. </li><li> Em seguida, para separar as células manchadas de autofluorescência PI, pressione tele PI histograma de miniaturas para abrir o histograma PI. </li><li> Mais uma vez, o pico de amostra de controlo será exibido como um pico de cinza no histograma. O pico de fluorescência vermelha é a amostra. A fluorescência de fundo é exibida como um pico mais próximo do valor RFU 0 nesta citômetro. </li><li> Para eliminar a fluorescência de fundo no canal PI, mova o botão azul na barra de controle deslizante para ajustar o limite de excluir o pico representando fluorescência de fundo, utilizando o pico de cinza a partir da amostra de controlo como uma referência. Toque em Aplicar para confirmar e voltar à tela anterior. </li><li> Em seguida, para confirmar visualmente que cada célula é corretamente atribuída, selecione um campo de vista capturados para revisão, pressionando a miniatura da imagem no separador Zoom, em seguida, pressionando a aba Layers. </li><li> Em seguida, pressione o botão ou GFP PI, para exibir a imagem capturada através desse canal em particular. Pressione o mesmo botão novamente para remover a camada da tela, ou, para sobrepor camadas, toque no botão de múltiplas camadas. </li><li> Para identificar como as células são contadas através de um canal particular, Círculos toque. As células que foram contados por meio apenas o canal brilhante-campo, que não expressam de fluorescência serão circuladas em azul. Isso indica que essa célula em particular é ao vivo (ou seja, PI negativo). </li><li> Células GFP expressando será visto no canal de GFP, e será circulada em verde. Células mortas coradas com Red Dead Cell será visto no canal de PI, e será circulada em vermelho. </li><li> Células contadas em ambos os canais do vermelho e verde serão circulados em amarelo, isso indica que a célula expressa GFP, mas também é corado com PI e, portanto, está morto. </li><li> Ocasionalmente, círculos pretos aparecerá na tela, estes são objetos que foram identificados, mas foram excluídos da análise com base no tamanho da célula. </li><li> Continuar a fine ajustar o limite no histograma de fluorescência usando as etapas acima descritas, até que cada célula que está expressando fluorescência é circulado com a cor apropriada. </li><li> Todos os parâmetros de análise são salvos automaticamente na guia dados. O citômetro de Tali pode armazenar arquivos de dados de aproximadamente 500 corre amostra. </li><li> Cada arquivo armazenado na guia de dados está disponível para reanálise. Ao selecionar o arquivo a partir do separador de dados será aberta e todos os histogramas e camadas tornam-se ativos. </li><li> Para arquivar dados e gerar relatórios, os dados armazenados no citômetro podem ser transferidos para um computador usando um drive USB. </li></ol> 4. Resultados representativos: A Imagem-Baseado Tali Citómetro foi usado para medir o nível de expressão de proteínas fluorescentes em células que foram transduzidas com um BacMam GFP nuclear-alvo construir expressão 2.0. Quatro tipos de células representativas foram transduzidas (U2OS, 293MSR, HEKn e CHO-S).Para estas linhas celulares, o número de células que estavam expressando GFP foi relatado pelo citômetro de Tali e comparados com os dados das mesmas amostras analisadas em um citômetro de fluxo. Além disso, as células foram coradas com o reagente Celular Red Dead usando o Kit de Viabilidade Tali para identificar a população de células mortas tanto no citômetro de Tali e em um citômetro de fluxo. As representações gráficas na Figura 2 mostra o percentual da população total para cada tipo de célula que estavam expressando GFP. Estes dados demonstram que o citómetro Tali produz dados comparáveis ​​aos dados gerados por um citômetro de fluxo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig1.jpg" /> Figura 1. Células devem ser devidamente focado antes da análise. Slides Análise Tali celular com concentrações célula apropriada para a análise (1 x 10 5 a 1 x 10 7 células são recomendados). (LEFT) em foco células são uniformemente darca toda a célula, com um halo brilhante em torno de cada célula de células. (CENTER) pode ser undercounted quando a transição entre o fundo e as bordas das células são difusas e as células têm limites indefinidos (RIGHT) Células talvez overcounted quando têm brilhantes centros e perímetros escuro. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig2.jpg" /> Figura 2. Dados proteína fluorescente expressão do Citómetro Tali baseada em imagem é comparável à obtida por citometria de fluxo. A comparação lado a lado de cálculo GFP-expressão resulta em 4 linhas de células diferentes em células viáveis.

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Krissy Remple Laurel e Pedra são funcionários da Life Technologies, que produziu o instrumento utilizado neste artigo. Life Technologies tem patrocinado a produção deste vídeo-artigo.

Temos apenas um procedimento detalhado para a realização de contagens de viabilidade e avaliar a expressão do GFP utilizando a imagem baseada em Tali citómetro. Usando o mesmo procedimento, este citómetro é capaz de realizar uma série de outros ensaios, incluindo: apoptose, RFP e análise de viabilidade celular utilizando células não-transduzidas. Ensaios fluorimétricos de viabilidade celular, expressão gênica e apoptose tornaram-se metodologias de chave na pesquisa biomédica 7-12. Na instrumentação, separados passado foi usado para obter informações quantitativas e visuais sobre as células. Embora as informações quantitativas sobre células dentro de uma população heterogênea tem sido garnered através do uso de citometria de fluxo, a informação visual ou qualitativa foi recolhida através do uso de microscopia de fluorescência 1-4. Aqui, apresentamos uma tecnologia que faz a ponte entre população e estudos de células individuais. Usando o Tali Citómetro Image-Based, quantitativa data e os dados das células visuais sobre células individuais ou populações de células podem ser coletados simultaneamente. O instrumento Tali pode ser usado para uma variedade de aplicações incluindo a avaliação da expressão gênica, ensaios de apoptose, estudos de eficácia de drogas e avaliação da progressão da doença. A Imagem-Baseado Tali captura citómetro e análises de campo brilhante fluorescência, vermelho e verde imagens de fluorescência, permitindo que informações sobre subpopulações de células a serem obtidos. Por exemplo, neste ensaio, fomos capazes de distinguir as células mortas de células vivas dentro do GFP-expressando população de células usando células mortas corante Vermelho. Isso dá a precisão na medição de células viáveis ​​expressando GFP, e identifica a população de células utilizável para o processamento de downstream. É importante notar que as células mortas da população podem surgir de várias fontes, incluindo a morte de células normais em cultura ou morte celular causada por condições ambientais (por exemplo tripsinização, ou death induzida pelo método de transfecção / transdução escolhido). Aqui mostramos o uso do citômetro de Tali com células U2OS. Métodos semelhantes podem ser realizadas usando a maioria das células de mamíferos e insetos. Para cada linhagem celular, o citômetro de Tali produzidos dados quantitativos GFP expressão, que não é possível com uma inspeção visual das células usando um microscópio padrão de fluorescência. Embora estes resultados são comparáveis ​​aos de citometria de fluxo, são coletados em uma fração do tempo. O citômetro é capaz de precisão células contagem entre 5 mm a 60 m de diâmetro, de preferência em uma concentração de 1 x 10 5 a 1 x 10 7 células / mL. É importante ressaltar que os protocolos de coloração mais uniforme, incluindo o protocolo de coloração Morto Red Cell descritas aqui, use iodeto de propídio para distinguir as células vivas e mortas. Isto representa um desafio ao avaliar a viabilidade das células que foram permeabilizadas para staining de marcadores intracelulares, uma vez que PI vai manchar qualquer célula com uma membrana comprometida. Uma vez que qualquer corante fluorescente ou proteína que pode ser detectada com os canais verde ou vermelho de fluorescência podem ser analisadas no citômetro de Tali Image-Based, estudos futuros podem explorar o uso de corantes alternativos, tais como aminas corantes reativos viabilidade 4. Um estudo de 2006 por Perfetto et al. 12 encontraram estes corantes para ser fácil de usar e reprodutível em discriminar populações de células vivas e mortas. Note que o Tali tem limitações no que diz respeito aos tipos de testes ele pode executar. Por exemplo, já que o objetivo utilizada pelo instrumento é 4X, operações de contagem são limitados a tipos maiores célula: sub-celular das estruturas, tais como mitocôndrias ou vesículas e células bacterianas não podem ser quantificados. Observe também que os canais de detecção em Tali estão limitados a fluoróforos que vão animar e emitem dentro dos canais. Enquanto YFP e brilhante mCherry sinais cum ser detectado, os sinais de dimmer mCherry não pode. Finalmente, a Tali analisa somente as células em suspensão. Ele não vai contar com precisão células aderindo a um slide. Além disso, enquanto há apenas uma capacidade limitada para a contagem de células que estão de forma irregular, incluindo algumas leveduras e células primárias. Além disso, estudos futuros provavelmente vai abordar o uso deste sistema na avaliação da expressão de marcadores intracelulares. Corantes individuais podem ser verificados para sobreposição espectral com canais adjacentes, utilizando a ferramenta da Invitrogen SpectraViewer online ( <a href="http://www.invitrogen.com/spectraviewer">www.invitrogen.com / spectraviewer</a> ). Dada a novidade desta tecnologia, a gama completa de aplicações ainda não foi descoberto. Em resumo, a Tali Citómetro Imagem Baseada demonstrado aqui apresenta uma nova tecnologia que permite a visualização simultânea e análise de populações de células, permitindo a avaliação de células individuais, bem como celpopulações l em um formato compacto, com um fluxo de trabalho simples.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Tali Citómetro Baseado na Imagem </td><td> Invitrogen </td><td> T10796 </td></tr><tr><td> Tali Cellular Slides Análise, 50 Slides </td><td> Invitrogen </td><td> T10794 </td></tr><tr><td> Tali Cellular Slides Análise, 500 slides </td><td> Invitrogen </td><td> T10795 </td></tr><tr><td> Tali Kit de Viabilidade - Red Dead Cell </td><td> Invitrogen </td><td> A10786 </td></tr><tr><td> Tali Kit de Viabilidade - Green Dead Cell </td><td> Invitrogen </td><td> A10787 </td></tr><tr><td> Tali Apoptosis Kit </td><td> Invitrogen </td><td> A10788 </td></tr><tr><td> Células U2OS </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of gfp expression and viability using the tali image-based cytometer

De uma única célula e informações da população são comumente obtido por citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência. No entanto, estes dois métodos fornecem informações diferentes. Citometria de fluxo fornece informações multi-paramétricas quantitativas sobre características físicas e coloração ou expressão, mas não permite a visualização. Stand-alone microscopia de fluorescência fornece dados visual, mas não permite simples medições quantitativas 1. Com base em imagens de citometria faz a ponte entre estes dois métodos, permitindo a visualização rápida e análise quantitativa simultânea de milhares de células em populações heterogêneas 2. Aqui, apresentamos um método para a realização de viabilidade celular e ensaios proteína fluorescente verde (GFP) usando a expressão Citómetro Tali Baseado na Imagem 3. O instrumento Tali é um 3-channel (campo claro, fluorescência verde, fluorescência vermelha), plataforma de ensaio de bancada que Offers várias vantagens sobre citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. O citômetro de Tali é menos caro, ocupa menos espaço em banco, requer menos manutenção, e o fluxo de trabalho foi simplificado para que a operação e análise é muito mais simples e mais rápido. O citômetro de Tali é capaz de realizar uma série de suspensão de células baseado em ensaios, incluindo GFP e vermelho proteína fluorescente expressão (RFP), apoptose 4-6 e análise de viabilidade celular com iodeto de propídio (PI) 11/07. Aqui, nós demonstrar o uso do instrumento Tali na realização de um ensaio de viabilidade celular em células expressando GFP. GFP-transduzidas células são coradas utilizando o Kit de Viabilidade Tali - Red Dead Cell. As células são então pipetado em um slide Análise Tali Celular e carregado no citômetro. De campo claro, fluorescência vermelha e verde imagens de fluorescência são capturados e analisados ​​utilizando algoritmos de ensaio específico. Histogramas são então gerados para mostrar o tamanho da célula, PI fluointensidade de fluorescência, e intensidade de fluorescência da GFP. Estes parâmetros podem ser thresholded em casa, em uma população de células específicas. A comparação lado a lado do Citómetro Tali Image-Based e citometria de fluxo tradicional demonstra que os dois métodos fornecem dados comparáveis ​​relativos à viabilidade celular e expressão da proteína. No entanto, o instrumento Tali fornece informações visuais adicionais sobre a população de células que não podem ser obtidos através de um citômetro de fluxo.

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Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Este protocolo descreve como executar a viabilidade celular e ensaios de fluorescência usando a expressão Tali Citómetro Image-Based.

Avaliação da GFP Expressão e Viabilidade Usando o Tali Citómetro Baseado na Imagem

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

assessment-gfp-expression-viability-using-tali-image-based

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K visualizações.  Life Technologies. Este protocolo descreve como executar a viabilidade celular e ensaios de fluorescência usando a expressão Tali Citómetro Image-Based.

Vídeo: Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

Expressão alvo de GFP no folículo piloso Usando Transdução Vivo Ex Viral

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Biologia

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Contagem e determinação da viabilidade das células em cultura

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

Análise do Ciclo de células vivas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos usando o acústico Attune Focando Cytometer e Vybrant DyeCycle Violeta DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

A medição da taxa metabólica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Usando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

Imaging o tráfego intracelular de APP com GFP fotoactivável

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...