Primer İnsan Proksimal Tübül Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Renal Proksimal Tübülün Mikrofizyolojik Modelinin Oluşturulmasında Kullanımı

Primer renal proksimal tübül epitel hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için tüm insan böbreklerinin işlenmesi ve bu hücrelerin renal proksimal tübülü özetlemek için üç boyutlu, mikroakışkan, mikrofizyolojik bir platformda uygulanması için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Böbrek hastalığı, 37 milyon Amerikalı da dahil olmak üzere dünya çapında 850 milyondan fazla insanı etkilemektedir. Kronik böbrek hastalığı için risk faktörleri arasında çevresel etkiler, genetik yatkınlıklar, birlikte var olan tıbbi durumlar ve akut böbrek hasarı öyküsü yer alır. Bu faktörlerin gelişmesi genellikle aylar veya yıllar alır ve hastalık etiyolojisi ve patofizyolojisi ile ilgili uzunlamasına çalışmaları karmaşıklaştırır. Hastalık mekanizmalarını daha iyi anlamamızı sağlamak ve ilaç geliştirmede nefrotoksisite tahminini geliştirmek için gelişmiş böbrek modellerine ihtiyaç vardır. Böbrekteki proksimal tübül epitel hücreleri (PTEC'ler), ksenobiyotik ve toksin klirensinin yanı sıra temel besin maddelerinin yeniden emilmesinde kritik bir rol oynar. Daha önce, izole edilmiş primer PTEC'lerle doldurulmuş üç boyutlu (3D) mikrofizyolojik sistem (MPS) platformlarının, renal ilaç etkileşimlerini araştırmak, bileşiklerin nefrotoksisitesini değerlendirmek ve ilaç klerensini tahmin etmek için kullanılabileceğini göstermiştik. Burada, tüm insan böbreklerinden birincil PTEC'leri izole etmek ve kültürlemek ve bunları in vivo böbrek fizyolojisini taklit eden bir 3D MPS platformuna tohumlamak için protokoller sunuyoruz. Bu protokol, MPS cihazlarında 6 aya kadar PTEC canlılığını, fizyolojik morfolojisini ve anahtar taşıyıcı proteinlerin fonksiyonel polarizasyonunu destekleyen uzun vadeli çalışmalara olanak tanır.

Böbrek, çok çeşitli ksenobiyotiklerin, toksinlerin ve endojen bileşiklerin vücuttan temizlenmesinde ve ortadan kaldırılmasında kritik bir rol oynar. Bu, atık ürünleri uzaklaştırmak için kanın filtrelenmesi ve elektrolit dengesinin, sıvı seviyelerinin ve pH'ın düzenlenmesiyle elde edilir. Her insan böbreği, böbreğin yapısal ve işlevsel birimleri olan yaklaşık bir milyon nefron içerir¹. Bu nefronlar içinde, proksimal tübül epitel hücreleri (PTEC'ler) olarak bilinen proksimal tübüllerdeki özel epitel hücreleri, glikoz, amino asitler ve iyonlar gibi temel moleküllerin yeniden emilmesinden ve ayrıca ilaç substratlarının ve potansiyel olarak toksik maddelerin idrara salgılanmasından sorumludur ^2,3,4. Bazı durumlarda, PTEC'ler ayrıca idrardaki bileşikleri kan dolaşımına geri emebilir⁴. İlaç ve toksin etkileşimlerindeki kritik rolleri nedeniyle, insan böbreklerinden izole edilen primer PTEC'ler, renal ilaç-ilaç etkileşimlerini (DDI'ler) incelemek ve bileşiklerin nefrotoksisitesini değerlendirmek için değerli bir araç sağlar.

İlaca bağlı nefrotoksisite, akut böbrek hasarına ve kronik böbrek hastalığına yol açabileceğinden önemli bir klinik zorluk teşkil etmektedir⁵. Bu nedenle, ilaçların ve toksinlerin nefrotoksik potansiyelini doğru bir şekilde tahmin etmek ve karakterize etmek için renal proksimal tübül fizyolojisinin daha derin bir şekilde anlaşılması esastır. Ölümsüzleştirilmiş renal hücre hatları (örneğin, RPTEC-TERT1, HK-2) dahil olmak üzere geleneksel in vitro modeller, dinamik, laminer akış (düşük Reynolds sayısı ile) ve in vivo^7,8 altında çalışan insan proksimal tübüllerinin⁶ karmaşık yapısını ve işlevini taklit etmede sınırlamalara sahiptir. Ek olarak, geleneksel iki boyutlu (2D) modeller, bu proteinlerin hızlı bozunması ve içselleştirilmesi nedeniyle genellikle ana böbrek taşıyıcılarını (örneğin, organik anyon taşıyıcı 1 ve 3 (OAT1 ve OAT3), organik katyon taşıyıcı 2 (OCT2)) işlevsel olarak ifade edemez ^6,9,10,11. Hayvan modelleri, bilgilendirici olmakla birlikte, insan böbrek fizyolojisini tam olarak kopyalayamayabilir ve taşıyıcı ekspresyonu ve aktivitesindeki tür farklılıkları nedeniyle genellikle çevrilebilirlikten yoksundur¹². Örneğin, mOct1 fare PTEC'lerinde bazolateral olarak eksprese edilirken, insanlarda böbrekte OCT1'in membran protein ekspresyonu tespit edilemez^13,14.

Mikrofizyolojik sistemlerdeki (MPS) ve çip üzerinde organ teknolojilerindeki gelişmeler, araştırmacıların insan organlarının üç boyutlu (3D) mimarisini ve dinamik sıvı akış koşullarını yakından taklit eden in vitro modeller geliştirmelerini sağlamıştır¹⁵. Grubumuz daha önce PTEC'ler^16,17 ile iki MPS modelini karakterize etmiş ve bu modelleri toksisite çalışmaları 18,19,20 yapmak ve ilaç dağılımını doğru bir şekilde tahmin etmek için kullanmıştır²¹. Bu modellerde birincil PTEC'lerin kullanılması, in vivo olarak gözlemlenen fonksiyonel özellikleri koruma yetenekleri nedeniyle önemli avantajlar sağlar.

Burada, Birleşik Organ Paylaşımı Ağı (UNOS) onaylı bir organ tedarik organizasyonu aracılığıyla vefat etmiş bir donörden elde edilen sağlam bir insan böbreğinden insan PTEC'lerinin izolasyonu ve bu kültürlenmiş insan PTEC'lerinin bir MPS platformu içinde uygulanması için protokolleri sunuyoruz.

Tüm çalışmalar, Washington Üniversitesi'nin insan dokusu işleme yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür. Uygun donörler aşağıdaki gereksinimleri karşılar: 36 saatten az soğuk iskemik zaman (CIT), bilinen böbrek hastalığı öyküsü, diyaliz veya başka herhangi bir tıbbi durum (ör., diabetes mellitus tip 1 veya 2, hepatit B, hepatit C, insan immün yetmezlik virüsleri (HIV), viral/bakteriyel menenjit, metisiline dirençli Staphylococcus aureus enfeksiyonu, sifiliz, sepsis veya Covid-19). Bu çalışmada kullanılan tüm insan böbrekleri, UNOS onaylı bir OPO aracılığıyla elde edildi.

1. Biyogüvenlik kabini hazırlığı

1. Kaputa %70 etanol püskürtün. Steril bir ortam oluşturmak için kabinin içindeki tüm yüzeyleri ve eşyaları dekontamine edin.
2. Mavi emici pedleri yere koyun. Tüm doku işlemlerini bu pedler üzerinden gerçekleştirin.
3. Biyogüvenlik kabininde gerekli ekipmanların mevcut olduğundan ve uygun şekilde sterilize edildiğinden emin olun (tıraş bıçakları, serolojik pipet uçları, serolojik pipet tabancası, 100 μm hücre süzgeçleri, p1000 uçlar, 1000 μL mikropipet, 15 cm dairesel kültür kapları ve konik tüpler).

2. Böbrek ön işleme hazırlığı

1. Kalsiyum ve magnezyum ile Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin'ine (DPBS) 0.75 mg / mL kollajenaz IV + 0.75 mg / mL dispas II ekleyerek böbrek sindirim solüsyonu hazırlayın. Çözeltiyi 0,2 μm steril membran filtreden süzün.
   NOT: Bütün bir insan yetişkin böbreği için, her biri ~ 35 mL sindirim çözeltisi (toplam 500 mL) içeren yaklaşık 14 adet 50 mL konik tüp gereklidir.
2. 4.425 g Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) / F12 tozu, 0.5 g D-glikoz tozu, 0.6 g sodyum bikarbonat tozu, 5 mL 100x insülin-transferrin-selenyum takviyesi (1000 mg / L insülin, 550 mg / L transferrin ve 0.67 mg / L sodyum selenit içerir), 0.5 mL 50 μM hidrokortizon ve 5 mL 100x antibiyotik-antimikotik çözelti (10000 birim / mL penisilin G sodyum içeren) ekleyerek PTEC ortamını hazırlayın, 10000 μg/mL streptomisin sülfat ve %0.85 tuzlu su içinde 25 μg/mL amfoterisin B) 500 mL steril otoklavlanmış ultra saf (Tip 1) su içine. Ortamı 0,2 μm steril membran filtreden süzün. Fetal sığır serumunu (FBS) çözün ve 14 50 mL konik tüpte 10 mL alikot yapın.
3. Ek bir 50 mL konik boru seti toplayın ve etiketleyin. Bu adımda, 3 set 14 50 mL tüp olduğundan emin olun.
4. Orbital çalkalayıcıyı 37 °C'ye önceden ısıtın.

3. PTEC'lerin tüm böbrekten izolasyonu

1. Steril bir teknik kullanarak, doku numunesinin bulunduğu nakliye konteynerini biyogüvenlik başlığına yerleştirin. Torbayı kutudan çıkarın ve davlumbaza koymadan önce dışına% 70 etanol püskürtün.
2. Böbreği 15 cm'lik yuvarlak bir kültür kabına yerleştirin. Kalan ortamı aspire edin/atın.
3. Steril tıraş bıçağı kullanarak çevredeki yağı ve böbrek kapsülünü çıkarın. Merkezde bir yarık oluşturmak için böbrek kapsülünü nazikçe çizin.
4. Cımbız kullanarak kapsülü çıkarın ve böbreğe bağlı yağları kesmek için tıraş bıçağı kullanın. Hem kapsülü hem de yağı 15 cm'lik başka bir kültür kabına atın.
5. Korteks (~ 1 cm kalınlığında) medulladan ayırın. Medullayı atın.
   NOT: Korteks, medullaya kıyasla daha açık kahverengimsi sarı bir renge sahiptir.
6. Bir tıraş bıçağı kullanarak, bulamaç benzeri bir görünüm elde edene kadar dokuyu <1 cm³ parçaya bölün.
7. Tabağa az miktarda böbrek sindirim tamponu ekleyin ve bulamacı 35 mL böbrek sindirim solüsyonu içeren ilk 50 mL tüp setine aktarın. Eşit olarak dağıtın ve her tüp için toplam 45 mL hacmi aşmayın.
8. Tüm tüpleri 37 °C orbital çalkalayıcıya aktarın ve tüplerin düşmesine neden olmayacak en yüksek hızda 30 dakika inkübe edin. Tüpleri %70 etanol püskürttükten sonra tekrar biyogüvenlik kabinine aktarın.
9. Karıştırmak için tüpleri ters çevirin ve daha büyük doku parçalarının dibe çökmesine izin verin. Sağlam dokuyu transfer etmeden 10 mL fetal sığır serumu (FBS) içeren 50 mL'lik konik tüplere mümkün olduğunca çok çözelti aktarın. Eşit olarak dağıtın ve her tüp için toplam 45 mL hacmi aşmayın.
10. Tüpleri 200 g'da 7 dakika santrifüjleyin. Tüpleri %70 etanol püskürttükten sonra tekrar biyogüvenlik kabinine taşıyın.
11. Süpernatanı dikkatlice aspire edin. Her tüpe 10 mL PTEC ortamı ekleyin ve peletleri yeniden süspanse edin.
12. Elde edilen hücre süspansiyonlarını 100 μm hücre süzgeçlerinden yeni 50 mL'lik konik tüplere süzün.
13. Elde edilen hücre filtratlarını 400 g'da 5 dakika santrifüjleyin. Tüpleri %70 etanol püskürttükten sonra tekrar biyogüvenlik kabinine taşıyın.
14. Peletleri 5 mL DPBS ile yıkayın. Bir p1000 ucu kullanarak peletleri yeniden askıya alın.
15. Tüpleri 400 g'da 5 dakika santrifüjleyin. Tüpleri %70 etanol püskürttükten sonra biyogüvenlik kabinine geri koyun, ardından süpernatanları aspire edin.
16. Toplam üç yıkama için adım 3.15'i iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, hücre peletlerini 15 mL PTEC ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücreleri steril hücre kültürü T-75 şişeleri üzerine yerleştirin.
17. Şişeleri uygun şekilde etiketleyin ve hücrelerin 37 °C ve% 5 CO_2'de steril bir inkübatörde büyümesine izin verin. İlk ortam değişiminden önce PTEC'lerin inkübatörde 48 saat boyunca rahatsız edilmeden büyümesine izin verin.

4. Medya değişiklikleri

1. Şişelerden ortamı aspire edin.
2. Hücreleri 5 mL önceden ısıtılmış DPBS ile yıkayın.
3. T-25 şişelerine 5 mL önceden ısıtılmış PTEC ortamı ekleyin.
4. Şişeyi inkübatöre geri koyun.
5. Şişe, geçiş veya deneylerde kullanım için en az% 70 birleşime ulaşana kadar ortamı her 48 saatte bir değiştirin.

5. PTEC'leri Geçirme

1. Şişeden ortamı aspire edin. Her bir T-25 şişesine 5 mL önceden ısıtılmış %0,05 Tripsin-EDTA ekleyin ve tripsin sindirimine izin vermek için 37 °C'de 1 ila 2 dakika inkübe edin.
2. Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsini 5 mL önceden ısıtılmış tanımlanmış tripsin inhibitörü çözeltisi ile nötralize edin.
3. Şişeye hala bağlı olan hücreleri çıkarmak için 5 kez yeniden askıya alın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 15 mL konik tüplere aktarın ve 5 dakika boyunca 400 g'da santrifüjleyin.
4. Süpernatanı aspire edin.
   NOT: PTEC'leri dondurarak saklamak için burada durun ve bu protokole geçin.
5. Hücre peletlerini tüp başına 14 mL PTEC ortamı ile yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonlarını T-75 şişelerine aktarın (şişe başına 1 tüp).
6. Hücreleri şişeye eşit olarak dağıtmak için bir T-shake yapın. Hücreleri izleyin ve ortamı her 48 saatte bir değiştirin.

6. Kriyoprezervasyon PTEC'ler

1. Adım 5.6'dan sonra, hücre peletlerini her 15 mL konik tüp için 2 mL %10 DMSO ve %90 düşük glikozlu PTEC ortamında yeniden süspanse edin ve 1 mL'yi bir kriyoviyal içine aktarın.
2. Kriyoviyalleri, sıcaklık kontrollü dondurmaya izin veren bir hücre dondurma kabına aktarın ve kabı 24 saat boyunca -80 °C'lik bir dondurucuya koyun. -80 °C'de 24 saat sonra, kriyoviyalleri uzun süreli depolama için sıvı nitrojen tankına aktarın.

7. PTEC'lerin çözülmesi

1. Şişeyi -80 °C'den 37 °C su banyosunda çözdürün. Oda sıcaklığında (RT) çözdürmeyin. Flakon kısmen çözüldükten sonra (görünür küçük bir buz parçası olmalıdır), 10 mL önceden ısıtılmış PTEC ortamı ile 15 mL'lik konik bir tüpe 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
2. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 400 g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 5 mL önceden ısıtılmış düşük glikozlu PTEC ortamında yeniden süspanse edin.
3. 5 mL hücre süspansiyonunu bir T-25 şişesine aktarın ve hücreleri şişe boyunca eşit olarak dağıtmak için bir T-shake gerçekleştirin. Buradan, medya değişiklikleri için bölüm 4'ü takip edin.

8. MPS cihazının Tip I Kollajen matrisi ile kaplanması

1. PBS'yi MPS cihazından aspire edin ve cihazı paketinden çıkarın. Cihazı tıbbi mendillerle kurulayın ve istediğiniz gibi etiketleyin.
2. MPS cihazını 15 cm'lik dairesel bir kültür kabına yerleştirin ve kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de bekletin. MPS cihazındaki nemi önlemek için tıbbi mendilleri tabağın dibinde tutun.
3. Kollajen I enjeksiyonu için kullanılana kadar -20 ° C'de 22 G Luer-Lok iğne köreltleri takılı 1 mL şırıngaları saklayın.
4. Doldurulması gereken her dört MPS cihazı için bir adet 15 mL'lik konik tüpü buz üzerinde tutun. Her 15 mL'lik konik tüp için iğne köreltilmiş bir 1 mL şırınga kullanın.
5. Biyogüvenlik kabininde steril bir teknik kullanarak, MPS cihazındaki tüm bağlantı noktalarını açın. Her vidalı valfin üst kısmındaki yarıkların bağlantı noktasıyla dikey olarak hizalandığından emin olun.
6. 1 mL'lik bir şırınga/iğne künt tertibatı kullanarak, ECM odasını 1 mL etanol ile Bağlantı Noktaları #1, #3 ve #6'ya yıkayın. Etanolü aspire edin ve tamamen buharlaşmasına izin verin (en az 30 s), böylece MPS cihazına Bağlantı Noktaları #2, #4 ve #5'ten nüfuz etmez.
7. MPS cihazını tekrar 4 °C'ye getirin ve PTEC ortamını, M199'u ve 1 N NaOH'yi buz üzerinde tutun.
8. Tablo 1'e göre yaklaşık dört MPS cihazı için Tip I kollajen karışımının 1 mL'si için matris bileşimini hesaplayın (gerektiği gibi ölçeklendirin). Biyogüvenlik kabininde PTEC ortamı, M199 ve 1 N NaOH'yi yukarıdaki hesaplamalara göre bu sırayla karıştırın ve tüm tüpleri buz üzerinde tutun.
9. Tip I kollajen stoğunu 1 mL'lik bir şırınga ile önceden hazırlanmış karışıma dikkatlice ekleyin. Kollajen karışımını, karışım sabit bir somon turuncu-pembe rengine sahip olana kadar yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
10. Çözeltiyi altta toplamak için tüpü kısaca santrifüjleyin. Solüsyonda kabarcık olmadığından emin olun.
11. Önceden soğutulmuş 1 mL'lik şırıngaları 22 G Luer-Lok iğne köreltleri ve MPS cihazını biyogüvenlik kabinine ve buzun üzerine yerleştirin. Önceden soğutulmuş 1 mL şırıngayı kollajen karışımıyla doldurun ve kabarcıkları tamamen önleyin.
12. Kollajen solüsyonunu soğutulmuş cihaz odalarının #1, #3 ve #6 numaralı portlarına çok yavaş ve nazikçe enjekte edin. Hava kabarcıklarının Bağlantı Noktaları #2, #4 ve #5'ten yukarı ve dışarı akmasına izin vermek için cihazı bağlantı noktaları aşağı bakacak şekilde dikey olarak tutun.
    NOT: #2, #4 ve #5 numaralı Bağlantı Noktalarında bir damla kollajen karışımı olmalıdır, bu da odaların tamamen kaplandığını gösterir.
13. Şırıngayı çıkarın ve buz üzerindeki 15 mL'lik tüpe geri yerleştirin. Doldurulmuş çipi kapatmak için #2, #4 ve #5 numaralı Bağlantı Noktaları için vidalı valfi çevirin ve çipi 4 dakika boyunca 30 °C'de kültür kabına yerleştirin.
14. 30 dakika sonra, çipi çanakla birlikte steril bir şekilde biyogüvenlik kabinine aktarın ve talaşları eşit ve ayrı ayrı yayın, böylece eşit şekilde ısınırlar.
15. Her tabağa nemli bir tıbbi mendil koyun (kollajen I matrisinin kurumasını ve MPS cihaz duvarlarından soyulmasını önlemek için) ve bulaşıkları yarı saydam esnek bir sızdırmazlık filmi ile kapatın. Kollajenin RT'de gece boyunca polimerize olmasına izin verin.

9. Bir MPS cihazında ECM olarak Tip IV Kollajen ile boru şeklinde bir lümen oluşturma

1. Tüpleri ultra saf (Tip 1) su ve saf etanol ile yıkayarak C-flex borularını sterilize edin, ardından tüm boru hattını otoklavlayın.
2. Biyogüvenlik kabininde, Tip I kollajen dolgulu MPS cihazının tüm portlarını açın (vidalı valf, portlarla birlikte dikey olacaktır) ve boru şeklindeki lümenleri oluşturmak için #1, #3 ve #6 numaralı Portlardan çıkıntı yapan kabloyu çıkarın.
3. Metal kuplörleri #1, #3 ve #6 Bağlantı Noktalarına yerleştirin.
4. PTEC ortamında 10 mL'lik 5 μg/mL Tip IV kollajen çözeltisi hazırlayın.
5. 24 inç steril C-flex boruyu Bağlantı Noktaları #1, #3 ve #6'dan çıkıntı yapan metal köreltlerin üzerine yerleştirin.
6. 22 G Luer-Lok iğne ile donatılmış 1 mL şırıngaları 0.5 mL Tip IV kollajen solüsyonu ile köreltin.
7. Doldurulmuş şırıngayı bir şırınga infüzyon pompasına yerleştirin ve boruyu Port #1'den şırıngaya bağlayın. Bağlantı Noktaları #3 ve #6 için bu adımı tekrarlayın.
8. Şırınga pompasını kullanarak, Tip IV kollajen solüsyonunu 30 dakika boyunca 10 μL/dk hızında MPS portlarına verin. Portlar infüze edildikten sonra, ertesi gün kullanmadan önce kollajenin gece boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde katılaşmasına izin verin.
   NOT: Tip IV kollajen kaplı MPS cihazları 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.

10. Bir MPS cihazında birincil PTEC'lerin tohumlanması

1. Lümenin doğru şekilde oluştuğundan emin olmak için MPS cihazını mikroskop altında inceleyin.
2. 22 G iğne ile önceden sterilize edilmiş 5 mL'lik bir şırıngayı 5 mL etanol içeren 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
3. 5.1 adımlarını izleyerek bir T-25 şişesinden 15 mL'lik bir konik tüpte bir PTEC hücre peleti elde edin. 5.3'e kadar. Hücre peletine 80 μL PTEC ortamı ekleyin ve yavaşça yeniden süspanse edin.
4. Hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.
5. MPS cihazını içeren kabı kuvözden çıkarın ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin. #2, #4 ve #5 Bağlantı Noktalarını kapatın ve vidalı valfi bağlantı noktalarına yatay olarak çevirin.
6. Hücreleri yeniden süspanse etmek için PTEC içeren tüpü hafifçe vurun. Şırıngayı hücrelerle doldurun ve iğneyi vidalı valflerin bağlantı noktalarından en uzak olan enjeksiyon portuna yerleştirin.
7. Hücreleri enjekte etmek için şırınganın pistonunu dikkatlice aşağı doğru bastırın. Enjeksiyondan sonra hücreleri mikroskop altında görselleştirin.
   NOT: Hücreler lümen boyunca hareket etmelidir. Lümende herhangi bir hücre gözlenmezse, iğnenin enjeksiyon portuna güvenli bir şekilde yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol edin ve gerekirse iğneyi yeniden takın. Tam bir hücre şırıngası, cihazdaki üç lümeni de doldurabilir.
8. Diğer iki port ile hücre enjeksiyonlarına devam edin. Enjeksiyonlardan sonra #2, #4 ve #5 numaralı Bağlantı Noktalarını kapatın ve MPS cihazını tekrar 37 °C inkübatöre yerleştirin. Plakayı düz tutun, böylece hücreler yerçekimi ile lümenden dışarı çıkmaz.
9. Ek MPS cihazları için, şırıngayı boşaltıldıktan sonra etanol ile yıkayın ve hücreleri çekmeden önce DPBS ile yıkayın.
10. MPS cihazlarının gece boyunca rahatsız edilmeden oturmasına izin verin.
11. Ertesi gün, MPS cihazlarını şırınga pompalarına bağlayın.
12. Biyogüvenlik kabininde 5 mL'lik şırıngaları PTEC ortamı ile doldurun. Ardından, şırıngalara takılı 22 inçlik C-flex boru bölümü ile 24 G Luer-Lok uç köreltlerini takın.
13. PTEC medya yüklü şırıngaları şırınga pompasına yerleştirin. Hava kabarcıklarını gidermek için çizgileri astarlayın.
14. Doldurulmuş boru hatlarını Bağlantı Noktaları #1, #3 ve #6'ya takın ve ortam akışını sağlamak için vidalı valfleri dikey konuma çevirin.
15. Şırınga pompası akış hızını 0,5 μL/dk'ya ayarlayın. Çanağı MPS cihazıyla birlikte 37 °C inkübatöre geri yerleştirin ve bir deneye başlamadan önce hücrelerin sürekli ortam perfüzyonu altında tübüller oluşturmasına izin verin (5 ila 7 gün içinde).

2D kültürde zaman içinde izole edilmiş primer PTEC'lerin morfolojisi ve birleşmesi
Böbrek korteksinden izolasyonun ardından, PTEC'lerin ilk ortam değişikliğinden önce en az 48 saat boyunca rahatsız edilmeden büyümesine izin verildi. Hücrelerin kültürlenmesinden yaklaşık bir hafta sonra, kültür şişesi boyunca tek tip bir epitelyal, parke taşı benzeri morfoloji ile küçük PTEC partileri görünmelidir (Şekil 1A,B). Farklı donörlerden gelen PTEC'lerin büyüme oranlarına bağlı olarak, hücre birleşmesi kültürde 10 gün sonra (ortalama olarak) yaklaşık% 50 -% 60'a ulaşmalıdır (Şekil 1C). Kültürde yaklaşık 14 gün sonra, hücreler tam birleşmeye ulaşmalıdır (Şekil 1D) ve bir MPS cihazında geçişe, dondurularak saklanmaya veya tohumlanmaya hazır olmalıdır. Ortalama olarak, bütün bir insan böbreği, PTEC'lerle dolu 14 tam T-75 şişesi sağlayabilir. Kontaminasyonu önlemek için steril tekniklerin kullanılması ve kültür döneminde besiyerine antibiyotiklerin dahil edilmesi esastır.

PTEC'lerin bir MPS cihazına enjeksiyonu
MPS cihazları Tip I ve Tip IV kollajen ile kaplandıktan sonra, PTEC'leri 3D formatında kültürlemeye hazır hale gelirler. Video 1 ve Şekil 2'de gösterildiği gibi, PTEC'lerin enjeksiyon portundan lümende aktığı görülebilir (Şekil 3). Gözlenen hücre yoksa, bu, enjeksiyonun sızıntısını veya yanlış hizalandığını ve şırınga iğnesinin köreldiğini gösterebilir. Daha önce yayınlanmış çalışmalarda ^17-28 gösterildiği gibi, PTEC tübülleri bir MPS cihazına enjeksiyondan yaklaşık bir hafta sonra oluşacaktır.

Şekil 1: İzole edilmiş primer proksimal tübül epitel hücrelerinin (PTEC'ler) zaman içinde morfolojisi ve birleşmesi. Tek bir yetişkin böbrekten izole edilen PTEC'ler tipik olarak 14 T-75 hücre kültürü şişesinde kaplanır. (A) Bu temsili böbrek için, kültürde 6 gün sonra, hücre kültürü şişesi boyunca epitel ve parke taşı benzeri görünüme sahip küçük PTEC yamaları (kırmızı kutulu) gözlenebilir ve kan hücreleri hala görsel olarak mevcuttur. (B) 8. günde, ortam değişikliğinden sonra azalmış kan hücreleri ile tanımlanmış PTEC yamaları ortaya çıktı. (C) Konflusension ortalama olarak 10. günde %50 ila 60'a ulaştı ve (D) izolasyondan yaklaşık 2 hafta sonra yaklaşık %100'e ulaştı ve geçişe, dondurularak saklanmaya veya bir MPS cihazında kullanılmaya hazırdır. Görüntüler mikroskop kullanılarak 4x büyütme ile çekildi. Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bir MPS platformunda PTEC'leri kullanarak bir proksimal tübül modeli oluşturmak için iş akışına genel bakış. Bu akış şeması, bir MPS cihazında PTEC'leri kullanmak için genel iş akışını açıklar. Genel olarak, olgun ve stabil bir in vitro 3D proksimal tübül oluşturmak için PTEC'leri insan böbreklerinden izole etmek yaklaşık 3 hafta sürer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Bir MPS cihazına enjekte edildikten sonra PTEC'ler. Kollajen I ve IV ile MPS cihazında lümen oluşumu sağlandıktan sonra PTEC'ler enjekte edilebilir. Bu şekilde ve videoda gösterildiği gibi, PTEC'leri doğru bir şekilde enjekte ettikten sonra, hücrelerin enjeksiyon portundan lümenden aktığı görülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Tip I kollajen MPS kaplama karışımından 1 mL hazırlamak için numune hesaplamaları. İhtiyaç duyulan kollajen stok hacmi, stok konsantrasyonuna göre ayarlanmalıdır. PTEC ortamının hacmi, toplam hacmi yaklaşık 1 mL'ye çıkarmak veya azaltmak için ayarlanabilir.

Video 1: Enjeksiyon portundan lümende akan PTEC'ler. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

MPS veya çip üzerinde organ teknolojileri, insan fizyolojisinin temel yönlerini özetlemek için son derece ilgili bir in vitro platform sunar ve böylece ilaç geliştirme ve toksikolojik değerlendirmelerde hayvan modellerine olan bağımlılığı azaltır. Son zamanlarda, FDA Modernizasyon Yasası 2.0 (2022), diğer alternatiflerin yanı sıra MPS'nin Araştırma Amaçlı Yeni İlaç uygulamalarına dahil edilmesine izin vermiştir²⁹. Bu protokol, insan proksimal tübül fonksiyonunu modellemeyi ve ksenobiyotiklere renal toksikolojik yanıtları değerlendirmeyi amaçlayan, PTEC'lerin insan donör kortikal dokusundan ayrılması ve daha sonra MPS platformlarında kullanılması için standart bir işletim prosedürünü detaylandırır (Şekil 2).

Yüksek PTEC canlılığını korumak için önemli bir faktör, sıcak iskemik zamanı (WIT) en aza indirmektir. 1 saatin altında WIT içeren böbrekleri kullanmanızı öneririz. 24 saatin altındaki CIT ideal iken, böbrek mevcudiyeti sınırlı olduğunda 36 saate kadar tolere edilebilir. Diğer bir kritik adım, PTEC saflığını en üst düzeye çıkarmak için dış zarların, viseral yağın çıkarılmasını ve korteksin medulladan tamamen ayrılmasını içeren uygun doku hazırlığıdır. Dokuyu tek başına kollajenaz I yerine kollajenaz IV ve dispas ile sindirmenin 10,11,30,31 hücre zarı bütünlüğünü koruyan daha nazik bir ayrışma sağladığını bulduk. Ek olarak, diğer karışımlar veya DNazın dahil edilmesi, süspansiyonda önemli hücresel kalıntı veya hücre kümelenmesi olduğunda faydalı olabilir. Aşırı hücre hasarını önlemek için dokuları 1^cm3'ten daha küçük parçalar halinde doğramak ve sindirimden hemen sonra buz üzerinde veya 4 °C'de soğuk tutmak da önemlidir.

PTEC'lerin transwelller gibi statik kültür platformlarında kısa süreli uygulamaları için, doku işleme sırasında çoğu kırmızı kan hücresinin uzaklaştırılması, serbest hemoglobin^32'nin neden olduğu oksidatif stresi önlemenin anahtarıdır. Kan hücreleri de dahil olmak üzere böbrek korteksindeki farklı hücre tipleri, bir Percoll gradyanı³³ kullanılarak ayrılabilir. Alternatif olarak, kan hücreleri, amonyum klorür bazlı bir tampon³⁴ kullanılarak seçici olarak parçalanabilir. Öte yandan, MPS cihazlarında PTEC'ler kullanılırken, bu PTEC'lerin birleşene kadar standart bir kültür formatında büyütülmesi gerektiğinden, orta düzeyde kontamine kan hücreleri tolere edilebilir. Ek olarak, sadece antimikrobiyal ajanlar eklenerek çözülemeyen kontaminasyon riskini büyük ölçüde artırabileceğinden, bir saatten uzun süreli sindirimden kaçınılmalıdır. 30 dakikalık bir sindirim genellikle yeterli tek hücreli süspansiyonlar sağlar ve verim beklenenden düşükse, sindirilmiş dokuyu PBS gibi izotonik tamponlarla bir veya iki kez daha yıkamak, kısmen sindirilmiş dokuya yapışan PTEC'leri serbest bırakabilir. Hücre canlılığı düşükse veya uyum gecikirse, sindirimin yeniden incelenmesi, minimum WIT'in sağlanması ve kültür ortamı koşullarının (hormonal olarak tanımlanmış, serumsuz, 1 g / L glikoz) doğru olduğunun doğrulanması tavsiye edilir. Sindirim sonrası adımların buz üzerinde veya 4 °C'de (kaplamaya kadar) gerçekleştirildiğini doğrulamak da hücresel stresi azaltmak için çok önemlidir. MPS platformlarında müteakip hücre tohumlaması için, PTEC'lerin yapılandırılmış tübüller oluşturması için tek tip bir ECM sağlamak için kollajen çözeltileri ile kaplama yapılırken herhangi bir hava kabarcığı oluşmaması önemlidir. MPS cihazlarının çok bölmeli yapısı kontaminasyon riskini artırdığından, steril teknikler MPS kurulumu sırasında özellikle önemlidir.

Bu protokolün önemli bir sınırlaması, kalite ve kullanılabilirlik açısından değişebilen donör dokulara güvenmektir. Uzun süreli WIT veya yüksek CIT, canlı hücre verimini azaltabilir ve deneysel tekrarlanabilirliği sınırlayabilir. Diğer bir sınırlama, hücre yaşlanması meydana gelmeden önce tipik olarak 3 ila 4 geçiş boyunca korunabilen birincil PTEC'lerin sonlu ömrüdür. Son olarak, bu yöntem başlangıçta renal korteksin sindirimini takiben hem PTEC'leri hem de distal tübül epitel hücrelerini (DTEC'ler) içeren karışık bir hücre popülasyonu verir. Bu, kısa süreli uygulamalar için ideal olmasa da, amaç, PTEC'leri MPS platformlarında daha sonraki kullanım için yaymaktır. Serum olmadan tanımlanmış bir kültür ortamı kullandığımızdan, çok daha düşük yüzdelere sahip diğer hücre tipleri, yani mezanjiyal hücreler ve fibroblastlar önemli bir oranda büyümeyecektir. Ek olarak, akış sitometrisi ve immünohistokimyasal (IHC) boyama kullanarak, daha önce bu yöntemi kullanarak kültürlenen birincil hücrelerin çoğunluğunun PTEC'ler olduğunu ve renal epitel hücre belirteçlerinin boyama verilerine dayalı olarak DTEC belirteçlerini ifade eden hücrelerin azınlığının olduğunu gösterdik. Spesifik olarak, 3D kültürlenmiş PTEC'ler, neprilizin (CD10) ve alanin aminopeptidaz (CD13^{) için} PTEC akış sitometrik fenotipine sahip polarize tübüller oluşturur23. IHC boyama verileri ayrıca, bu hücrelerin hem 2D hem de 3D formatlarda, PTEC belirteçleri lotus tetragonolobus lektin (LTL), sodyum-glikoz ko-taşıyıcı 2 (SGLT2) ve aquaporin-1'i (AQP1) eksprese ettiğini ve prominin-2 (PROM2), üromodulin (UMOD) ve aquaporin 2 (AQP2) dahil olmak üzere distal nefron belirteçlerinin minimal ekspresyonu ile ^{göstermiştir16}. DTEC'lerin 2B kültürde PTEC'lere doğru farklılaştığı ve farklılaştığı gösterildiğinden, bu beklenen bir durumdur³⁰.

Statik renal hücre kültürleri ve ölümsüzleştirilmiş hücre hatları yaygın olarak kullanılsa da, genellikle fizyolojik kesme gerilimi seviyelerini ve böbrekte bulunan üç boyutlu mimariyi taklit etmekte başarısız olurlar. Buna karşılık, 3D MPS platformları, daha önce 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 ^,28. Ölümsüzleştirilmiş çizgiler yerine birincil PTEC'lerin kullanılması, bu hücreler ksenobiyotik metabolizma ve klerens için gerekli olan anahtar taşıyıcıları ve enzimleri koruduğundan, gelişmiş fizyolojik alaka düzeyi sağlar. Dikkatli doku kullanımı, optimize edilmiş enzimatik sindirim ve uygun kültür koşullarının kombinasyonu, bu MPS yönteminin, klinik öncesi böbrek araştırmalarının translasyonel değerini artırırken hayvanlar üzerinde yapılan testlerin azaltılmasına yönelik genel hedeflerle uyumlu olmasını sağlar²⁹.

Bu protokol, mikrofizyolojik cihazlarda sağlam insan proksimal tübül modellerinin oluşturulmasını sağlar, böylece ilaç taramasını, nefrotoksisite tahminlerini ve özellikle renal klirens mekanizmaları, ilaç-taşıyıcı etkileşimleri ve böbrek hasarı yolakları için böbrek patofizyolojisinin ayrıntılı araştırmalarını kolaylaştırır. Bu birincil insan bazlı MPS, hayvan modellerinin kullanımını azaltarak veya değiştirerek 3R ilkesini (azalt, iyileştir, değiştir) daha da ileri götürür ve ilaç geliştirme boru hatlarını hızlandırabilir. Aynı zamanda, hastaya özgü MPS, kişiselleştirilmiş ilaç taraması ve toksisite profili oluşturma gibi hassas tıp uygulamaları için umut vaat etmektedir. Genel olarak, insan donör dokularından PTEC'leri izole etmek ve yetiştirmek için bu tekrarlanabilir yöntem, hücre canlılığını ve işlevselliğini korumak için kritik adımlar sağlar ve 3D MPS platformlarıyla birleştirildiğinde, toksikolojik araştırmaları ve ilaç keşfini ilerletirken in vitro renal modellerin tahmin gücünü önemli ölçüde artırır.

Yazarlar, bu çalışma ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması veya finansal açıklama yapmadıklarını beyan ederler.

Bu çalışmanın bazı bölümleri, NASA sözleşmesi 80ARC023CA001, Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi (NCATS) (U2CTR004867, UH3TR000504, UG3TR002158), NCATS ve Uzayda Bilimin İlerlemesi Merkezi (CASIS) (UG3TR002178), Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS) (P30ES00703), Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (T32GM007750), Kuzeybatı Böbrek Merkezlerinden Böbrek Araştırmalarına sınırsız bir hediye tarafından desteklenmiştir. Enstitü ve Washington Üniversitesi Eczacılık Okulu (Ji-Ping Wang Ödülü ve Bradley Bursu).