Isolamento di cellule epiteliali primarie del tubulo prossimale umano e loro utilizzo nella creazione di un modello microfisiologico del tubulo prossimale renale

Presentiamo un protocollo ottimizzato per l'elaborazione di interi reni umani per isolare e coltivare cellule epiteliali del tubulo prossimale renale primario e l'applicazione di queste cellule in una piattaforma microfluidica tridimensionale, microfluidica e microfisiologica per ricapitolare il tubulo prossimale renale.

Le malattie renali colpiscono oltre 850 milioni di persone in tutto il mondo, tra cui 37 milioni di americani. I fattori di rischio per la malattia renale cronica includono influenze ambientali, predisposizioni genetiche, condizioni mediche coesistenti e una storia di danno renale acuto. Questi fattori spesso impiegano mesi o anni per svilupparsi, complicando gli studi longitudinali dell'eziologia e della fisiopatologia della malattia. Sono necessari modelli renali avanzati per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi della malattia e migliorare la previsione della nefrotossicità nello sviluppo di farmaci. Le cellule epiteliali dei tubuli prossimali (PTEC) nel rene svolgono un ruolo fondamentale nella clearance degli xenobiotici e delle tossine, nonché nel riassorbimento dei nutrienti essenziali. Abbiamo precedentemente dimostrato che le piattaforme di sistemi microfisiologici (MPS) tridimensionali (3D), popolate con PTEC primari isolati, possono essere utilizzate per studiare le interazioni farmacologiche renali, valutare la nefrotossicità dei composti e prevedere la clearance dei farmaci. Qui presentiamo i protocolli per isolare e coltivare PTEC primari da reni umani interi e per seminarli in una piattaforma MPS 3D che imita la fisiologia renale in vivo . Questo protocollo consente studi a lungo termine a supporto della vitalità di PTEC, della morfologia fisiologica e della polarizzazione funzionale delle principali proteine trasportatrici nei dispositivi MPS per un massimo di 6 mesi.

Il rene svolge un ruolo fondamentale nell'eliminazione e nell'eliminazione di un'ampia gamma di xenobiotici, tossine e composti endogeni dal corpo. Ciò si ottiene filtrando il sangue per rimuovere i prodotti di scarto e regolando l'equilibrio elettrolitico, i livelli di liquidi e il pH. Ogni rene umano contiene circa un milione di nefroni, le unità strutturali e funzionali del rene¹. All'interno di questi nefroni, le cellule epiteliali specializzate nei tubuli prossimali, note come cellule epiteliali dei tubuli prossimali (PTEC), sono responsabili del riassorbimento di molecole essenziali come glucosio, aminoacidi e ioni, nonché della secrezione di substrati farmacologici e sostanze potenzialmente tossiche nelle urine ^2,3,4. In alcuni casi, i PTEC possono anche riassorbire i composti dall'urina nel flusso sanguigno⁴. A causa del loro ruolo critico nelle interazioni tra farmaci e tossine, i PTEC primari isolati da reni umani forniscono uno strumento prezioso per lo studio delle interazioni farmacologiche renali (DDI) e per la valutazione della nefrotossicità dei composti.

La nefrotossicità indotta da farmaci rappresenta una sfida clinica significativa, in quanto può portare a danno renale acuto e malattia renale cronica⁵. Pertanto, una comprensione più approfondita della fisiologia del tubulo prossimale renale è essenziale per prevedere e caratterizzare con precisione il potenziale nefrotossico di farmaci e tossine. I modelli tradizionali in vitro, comprese le linee cellulari renali immortalizzate (ad esempio, RPTEC-TERT1, HK-2), hanno limitazioni nell'imitare la complessa struttura e funzione dei tubuli prossimali umani⁶, che operano in presenza di un flusso laminare dinamico (con un basso numero di Reynolds) e di una matrice extracellulare uniforme (ECM) in vivo ^7,8. Inoltre, i tradizionali modelli bidimensionali (2D) spesso non riescono ad esprimere funzionalmente i principali trasportatori renali (ad esempio, il trasportatore di anioni organici 1 e 3 (OAT1 e OAT3), il trasportatore di cationi organici 2 (OCT2)) a causa della rapida degradazione e internalizzazione di queste proteine 6,9,10,11 . I modelli animali, sebbene informativi, potrebbero non replicare completamente la fisiologia renale umana e spesso mancano di traducibilità a causa delle differenze di specie nell'espressione e nell'attività del trasportatore¹². Ad esempio, mOct1 è espresso basolateralmente nei PTEC di topo, mentre nell'uomo, l'espressione proteica di membrana di OCT1 nel rene non è rilevabile^13,14.

I progressi nei sistemi microfisiologici (MPS) e nelle tecnologie organ-on-a-chip hanno permesso ai ricercatori di sviluppare modelli in vitro che imitano da vicino l'architettura tridimensionale (3D) e le condizioni di flusso dinamico dei fluidi degli organi umani¹⁵. Il nostro gruppo ha precedentemente caratterizzato due modelli di MPS con PTEC^16,17 e ha utilizzato questi modelli per condurre studi di tossicità 18,19,20 e prevedere con precisione la disposizione dei farmaci²¹. L'uso di PTEC primari in questi modelli offre vantaggi significativi grazie alla loro capacità di mantenere le caratteristiche funzionali osservate in vivo.

Qui, presentiamo i protocolli per l'isolamento dei PTEC umani da un rene umano intatto ottenuto da un donatore deceduto tramite un'organizzazione di approvvigionamento di organi approvata dalla United Network for Organ Sharing (UNOS) e l'applicazione di questi PTEC umani in coltura all'interno di una piattaforma MPS.

Tutto il lavoro è stato condotto in conformità con le linee guida per la manipolazione dei tessuti umani dell'Università di Washington. I donatori idonei soddisfano i seguenti requisiti: meno di 36 ore di tempo ischemico freddo (CIT), nessuna storia nota di malattie renali, dialisi o altre condizioni mediche (ad esempio, diabete mellito di tipo 1 o 2, epatite B, epatite C, virus dell'immunodeficienza umana (HIV), meningite virale/batterica, infezione da Staphylococcus aureus resistente alla meticillina, sifilide, sepsi o Covid-19). L'intero rene umano utilizzato in questo studio è stato acquistato attraverso un OPO approvato dall'UNOS.

1. Preparazione della cabina di biosicurezza

1. Spruzzare la cappa con etanolo al 70%. Decontamina tutte le superfici e gli oggetti all'interno dell'armadio per creare un ambiente sterile.
2. Stendere i tamponi assorbenti blu. Eseguire tutto il lavoro sui tessuti su questi tamponi.
3. Assicurarsi che l'attrezzatura necessaria sia disponibile nella cabina di biosicurezza e adeguatamente sterilizzata (lame di rasoio, puntali per pipette sierologiche, pistola per pipette sierologiche, filtri cellulari da 100 μm, puntali p1000, micropipetta da 1000 μl, piastre di coltura circolari da 15 cm e provette coniche).

2. Preparazione alla pre-elaborazione del rene

1. Preparare la soluzione per la digestione dei reni aggiungendo 0,75 mg/mL di collagenasi IV + 0,75 mg/mL di dispasi II nella soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbco con calcio e magnesio. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a membrana sterile da 0,2 μm.
   NOTA: Per un rene umano adulto intero, sono necessarie circa 14 provette coniche da 50 mL, ciascuna contenente ~35 mL di soluzione digestiva (per un totale di 500 mL).
2. Preparare i terreni PTEC aggiungendo 4,425 g di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 in polvere senza glucosio, 0,5 g di D-glucosio in polvere, 0,6 g di bicarbonato di sodio in polvere, 5 ml di integratore 100x di insulina-transferrina-selenio (contenente 1000 mg/L di insulina, 550 mg/L di transferrina e 0,67 mg/L di selenito di sodio), 0,5 mL di 50 μM di idrocortisone e 5 mL di soluzione antibiotico-antimicotica 100x (contenente 10000 unità/mL di penicillina G sodica, 10000 μg/mL di streptomicina solfato e 25 μg/mL di amfotericina B in soluzione fisiologica allo 0,85%) in 500 mL di acqua ultrapura (Tipo 1) sterile autoclavata. Filtrare il mezzo attraverso un filtro a membrana sterile da 0,2 μm. Scongelare il siero fetale bovino (FBS) e produrre 10 mL di aliquote in 14 provette coniche da 50 mL.
3. Raccogliere ed etichettare un set aggiuntivo di provette coniche da 50 ml. A questo punto, assicurarsi che ci siano 3 set di 14 provette da 50 ml.
4. Preriscaldare l'agitatore orbitale a 37 °C.

3. Isolamento dei PTEC dall'intero rene

1. Utilizzando una tecnica sterile, posizionare il contenitore di spedizione con il campione di tessuto nella cappa di biosicurezza. Togli il sacchetto dalla scatola e spruzza l'esterno con etanolo al 70% prima di metterlo nel cappuccio.
2. Posizionare il rene su un piatto di coltura rotondo di 15 cm. Aspirare/Scartare il fluido rimanente.
3. Rimuovere il grasso circostante e la capsula renale utilizzando lame di rasoio sterili. Incidere delicatamente la capsula renale per creare una fessura al centro.
4. Usando una pinzetta, estrarre la capsula e utilizzare le lame di rasoio per tagliare il grasso attaccato al rene. Scartare sia la capsula che il grasso in un altro piatto di coltura da 15 cm.
5. Separare la corteccia (~1 cm di spessore) dal midollo. Scartare il midollo.
   NOTA: La corteccia ha un colore giallo-brunastro più chiaro rispetto al midollo.
6. Usando una lama di rasoio, tritare il fazzoletto in <1 cm³ pezzi fino a ottenere un aspetto simile a un impasto.
7. Aggiungere una piccola quantità di tampone per la digestione renale nel piatto e trasferire l'impasto nella prima serie di provette da 50 mL contenenti 35 mL di soluzione per la digestione renale. Distribuire uniformemente e non superare un volume totale di 45 ml per ogni provetta.
8. Trasferire tutte le provette sull'agitatore orbitale a 37 °C e incubare per 30 minuti alla massima velocità che non provochi la caduta delle provette. Trasferire nuovamente le provette nella cabina di biosicurezza dopo averle spruzzate con etanolo al 70%.
9. Capovolgere i tubi per mescolare e lasciare che i pezzi di tessuto più grandi si depositino sul fondo. Trasferire la maggior parte possibile della soluzione nelle provette coniche da 50 mL contenenti 10 mL di siero fetale bovino (FBS) senza trasferire tessuto intatto. Distribuire uniformemente e non superare un volume totale di 45 ml per ogni provetta.
10. Centrifugare le provette a 200 g per 7 min. Spostare nuovamente le provette nella cabina di biosicurezza dopo averle spruzzate con etanolo al 70%.
11. Aspirare con cura il surnatante. Aggiungere 10 mL di terreno PTEC in ciascuna provetta e risospendere i pellet.
12. Filtrare le sospensioni cellulari risultanti attraverso filtri cellulari da 100 μm in nuove provette coniche da 50 mL.
13. Centrifugare i filtrati cellulari risultanti a 400 g per 5 minuti. Spostare nuovamente le provette nella cabina di biosicurezza dopo averle spruzzate con etanolo al 70%.
14. Lavare i pellet con 5 mL di DPBS. Risospendere i pellet utilizzando una punta p1000.
15. Centrifugare le provette a 400 g per 5 min. Spostare nuovamente i tubi nell'armadio di biosicurezza dopo averli spruzzati con etanolo al 70%, quindi aspirare i surnatanti.
16. Ripetere il passaggio 3.15 altre due volte per un totale di tre lavaggi. Quindi, risospendere i pellet cellulari con 15 mL di terreno PTEC e piastrarle su fiasche sterili per colture cellulari T-75.
17. Etichettare i palloni in modo appropriato e lasciare che le cellule crescano in un incubatore sterile a 37 °C e 5% di CO₂. Lasciare che i PTEC crescano indisturbati nell'incubatore per 48 ore prima del primo cambio del terreno.

4. Modifiche ai media

1. Aspirare il fluido dai matracci.
2. Lavare le celle con 5 mL di DPBS preriscaldato.
3. Aggiungere 5 mL di terreno PTEC preriscaldato ai matracci T-25.
4. Rimetti il pallone nell'incubatrice.
5. Cambiare il supporto ogni 48 ore fino a quando il pallone raggiunge almeno il 70% di confluenza per il passaggio o l'uso negli esperimenti.

5. Superamento dei PTEC

1. Aspirare il fluido dal pallone. Aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,05% in ciascun pallone T-25 e incubare a 37 °C per 1 o 2 minuti per consentire la digestione della tripsina.
2. Una volta staccate le cellule, neutralizzare la tripsina con 5 mL di soluzione preriscaldata di inibitore della tripsina definito.
3. Risospendere 5 volte per rimuovere le celle ancora attaccate al pallone. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in provette coniche da 15 mL e centrifugare a 400 g per 5 minuti.
4. Aspirare il surnatante.
   NOTA: Fermati qui per crioconservare i PTEC e passare a quel protocollo.
5. Risospendere i pellet cellulari con 14 mL di terreno PTEC per provetta. Trasferire le sospensioni cellulari in palloni T-75 (1 provetta per pallone).
6. Eseguire un agitazione a T per distribuire uniformemente le cellule sul pallone. Monitora le celle e cambia i supporti ogni 48 ore.

6. PTEC crioconservanti

1. Dopo il passaggio 5.6., risospendere i pellet cellulari in 2 mL di DMSO al 10% e PTEC a basso contenuto di glucosio al 90% per ogni provetta conica da 15 mL e trasferire 1 mL in un crioviale.
2. Trasferire i crioviali in un contenitore di congelamento cellulare che consenta il congelamento a temperatura controllata e porre il contenitore in un congelatore a -80 °C per 24 ore. Dopo 24 ore a -80 °C, trasferire i crioviali in un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

7. Scongelamento dei PTEC

1. Scongelare il flaconcino da -80 °C nel bagnomaria a 37 °C. Non scongelare a temperatura ambiente (RT). Una volta che il flaconcino è stato parzialmente scongelato (dovrebbe essere visibile un piccolo pezzo di ghiaccio), aggiungere 1 mL di sospensione cellulare a una provetta conica da 15 mL con 10 mL di terreno PTEC preriscaldato.
2. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 g per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 5 mL di terreno PTEC a basso contenuto di glucosio preriscaldato.
3. Trasferire la sospensione cellulare da 5 mL in un matraccio T-25 ed eseguire un agitazione a T per distribuire uniformemente le cellule nel pallone. Da qui, segui la sezione 4 per le modifiche ai supporti.

8. Rivestimento del dispositivo MPS con matrice di collagene di tipo I

1. Aspirare il PBS dal dispositivo MPS e rimuovere il dispositivo dalla confezione. Asciugare il dispositivo con salviette mediche ed etichettarlo come desiderato.
2. Collocare il dispositivo MPS in una piastra di coltura circolare da 15 cm e posizionarlo a 4 °C fino al momento dell'uso. Tenere le salviette mediche sul fondo del piatto per evitare che l'umidità si depositi sul dispositivo MPS.
3. Conservare le siringhe da 1 ml con 22 G di aghi Luer-Lok attaccati a -20 °C fino all'uso per l'iniezione di collagene I.
4. Per ogni quattro dispositivi MPS che devono essere riempiti, tenere una provetta conica da 15 ml sul ghiaccio. Utilizzare una siringa da 1 ml con l'ago smussato inserito per ogni provetta conica da 15 ml.
5. Utilizzando una tecnica sterile in una cappa di biosicurezza, aprire tutte le porte del dispositivo MPS. Assicurarsi che le fessure nella parte superiore di ciascuna valvola a vite siano allineate verticalmente con la porta.
6. Utilizzando una siringa/ago da 1 mL, lavare la camera ECM con 1 mL di etanolo nelle porte #1, #3 e #6. Aspirare l'etanolo e lasciarlo evaporare completamente (almeno 30 s) in modo che non penetri nel dispositivo MPS dalle porte #2, #4 e #5.
7. Riposizionare il dispositivo MPS a 4 °C e mantenere il supporto PTEC, M199 e 1 N NaOH sul ghiaccio.
8. Calcolare la composizione della matrice per 1 mL della miscela di collagene di tipo I per circa quattro dispositivi MPS secondo la Tabella 1 (scala secondo necessità). Nella cappa di biosicurezza, miscelare i terreni PTEC, M199 e 1 N NaOH in questo ordine, secondo i calcoli di cui sopra, e mantenere tutte le provette sul ghiaccio.
9. Aggiungere con cautela il brodo di collagene di tipo I con una siringa da 1 ml alla miscela preconfezionata. Mescolare la miscela di collagene pipettando su e giù fino a quando la miscela non avrà un colore rosa-arancio salmone stabile.
10. Centrifugare brevemente la provetta per raccogliere la soluzione sul fondo. Assicurarsi che non ci siano bolle nella soluzione.
11. Posizionare le siringhe pre-raffreddate da 1 ml con smussatori per aghi Luer-Lok da 22 G e il dispositivo MPS nella cabina di biosicurezza e sul ghiaccio. Riempire la siringa pre-raffreddata da 1 ml con la miscela di collagene ed evitare completamente la formazione di bolle.
12. Iniettare molto lentamente e delicatamente la soluzione di collagene nelle porte #1, #3 e #6 delle camere del dispositivo raffreddato. Tenere il dispositivo verticalmente con le porte rivolte verso il basso per consentire alle bolle d'aria di fluire verso l'alto e fuori dalle porte #2, #4 e #5.
    NOTA: Dovrebbe esserci una gocciolina della miscela di collagene alle porte #2, #4 e #5, che indica che le camere sono completamente rivestite.
13. Rimuovere la siringa e rimetterla nella provetta da 15 ml con ghiaccio. Ruotare la valvola a vite per le porte #2, #4 e #5 per sigillare il chip riempito e posizionare il chip sulla piastra di coltura a 4 °C per 30 minuti.
14. Dopo 30 minuti, trasferire la patatina con la piastra nella camera di biosicurezza in modo sterile e distribuire le patatine in modo uniforme e individuale in modo che si riscaldino uniformemente.
15. Metti una salvietta medica inumidita in ogni piatto (per evitare che la matrice di collagene I si secchi e si stacchi dalle pareti del dispositivo MPS) e sigilla i piatti con una pellicola sigillante flessibile semitrasparente. Lasciare che il collagene polimerizzi durante la notte a RT.

9. Creazione di un lume tubulare con collagene di tipo IV come ECM in un dispositivo MPS

1. Sterilizzare i tubi C-flex lavandoli con acqua ultrapura (Tipo 1) ed etanolo puro, quindi sterilizzare in autoclave l'intera linea di tubi.
2. Nella cabina di biosicurezza, aprire tutte le porte del dispositivo MPS riempito di collagene di tipo I (la valvola a vite sarà verticale con le porte) e rimuovere il filo che sporge dalle porte #1, #3 e #6 per formare i lumi tubolari.
3. Inserire gli accoppiatori metallici nelle porte #1, #3 e #6.
4. Preparare una soluzione da 10 mL di 5 μg/mL di collagene di tipo IV in terreni PTEC.
5. Inserire 24 pollici di tubo C-flex sterile sui blunt metallici che sporgono dalle porte #1, #3 e #6.
6. Riempire siringhe da 1 ml dotate di ago smussato Luer-Lok da 22 g con 0,5 ml di soluzione di collagene di tipo IV.
7. Posizionare la siringa piena su una pompa per infusione a siringa e collegare il tubo dalla porta #1 alla siringa. Ripetere questo passaggio per le porte #3 e #6.
8. Utilizzando la pompa a siringa, erogare la soluzione di collagene di tipo IV nelle porte MPS a una velocità di 10 μl/min per 30 minuti. Una volta che le porte sono state infuse, lasciare solidificare il collagene in un'incubatrice a 37 °C per una notte prima di utilizzarle il giorno successivo.
   NOTA: I dispositivi MPS rivestiti di collagene di tipo IV possono essere conservati fino a 1 settimana a 4 °C.

10. Seeding dei PTEC primari in un dispositivo MPS

1. Ispezionare il dispositivo MPS al microscopio per assicurarsi che il lume si sia formato correttamente.
2. Inserire una siringa pre-sterilizzata da 5 ml con un ago da 22 g in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di etanolo.
3. Ottenere un pellet di cella PTEC in una provetta conica da 15 mL da un pallone T-25 seguendo i passaggi 5.1. al punto 5.3. Aggiungere 80 μl di terreno PTEC al pellet della cella e risospendere delicatamente.
4. Trasferire la sospensione cellulare in una microprovetta da 1,5 mL.
5. Estrarre la capsula contenente il dispositivo MPS dall'incubatrice e inserirla nella cappa di biosicurezza. Chiudere le porte #2, #4 e #5 e ruotare la valvola a vite orizzontalmente verso le porte.
6. Muovere delicatamente il tubo contenente PTEC per risospendere le cellule. Riempire la siringa con le cellule e inserire l'ago nella porta di iniezione più lontana dalle porte delle valvole a vite.
7. Spingere con cautela verso il basso lo stantuffo della siringa per iniettare le cellule. Visualizzare le cellule dopo l'iniezione al microscopio.
   NOTA: Le cellule dovrebbero muoversi attraverso il lume. Se non si osservano cellule nel lume, controllare che l'ago sia stato inserito saldamente nella porta di iniezione e reinserire l'ago se necessario. Una siringa piena di cellule può riempire tutti e tre i lumi del dispositivo.
8. Continuare le iniezioni cellulari con le altre due porte. Dopo le iniezioni, chiudere le porte #2, #4 e #5 e riposizionare il dispositivo MPS nell'incubatore a 37 °C. Mantenere la piastra a livello in modo che le cellule non si spostino dal lume per gravità.
9. Per ulteriori dispositivi MPS, lavare la siringa con etanolo dopo che è stata svuotata e lavare con DPBS prima di aspirare le cellule.
10. Lasciare che i dispositivi MPS rimangano indisturbati per tutta la notte.
11. Il giorno successivo, collegare i dispositivi MPS alle pompe a siringa.
12. Nella cabina di biosicurezza, riempire le siringhe da 5 ml con terreno PTEC. Quindi, montare i blunt della punta Luer-Lok da 22 G con la sezione da 24 pollici del tubo C-flex attaccata alle siringhe.
13. Posizionare le siringhe caricate con terreno PTEC nella pompa a siringa. Adescare le linee per rimuovere eventuali bolle d'aria.
14. Collegare le linee dei tubi innescate alle porte #1, #3 e #6 e ruotare le valvole a vite in posizione verticale per introdurre il flusso del fluido.
15. Impostare la portata della pompa a siringa a 0,5 μl/min. Prima di iniziare l'esperimento, riposizionare la capsula con il dispositivo MPS nell'incubatore a 37 °C e lasciare che le cellule formino tubuli (entro 5-7 giorni) in perfusione continua del terreno.

Morfologia e confluenza di PTEC primari isolati nel tempo in coltura 2D
Dopo l'isolamento dalla corteccia renale, i PTEC sono stati lasciati crescere indisturbati per almeno 48 ore prima del primo cambio di media. Circa una settimana dopo la coltura delle cellule, piccoli lotti di PTEC dovrebbero apparire in tutto il pallone di coltura con una morfologia epiteliale uniforme, simile a un ciottolo (Figura 1A, B). A seconda dei tassi di crescita dei PTEC provenienti da diversi donatori, la confluenza cellulare dovrebbe raggiungere circa il 50%-60% dopo 10 giorni in coltura (in media) (Figura 1C). Dopo circa 14 giorni di coltura, le cellule dovrebbero raggiungere la piena confluenza (Figura 1D) e sono pronte per essere trasportate, crioconservate o seminate in un dispositivo MPS. In media, un intero rene umano è in grado di fornire 14 fiasche piene di PTEC. Per prevenire la contaminazione, è essenziale utilizzare tecniche sterili e includere antibiotici nei terreni durante il periodo di coltura.

Iniezione di PTEC in un dispositivo MPS
Dopo che i dispositivi MPS sono stati rivestiti con collagene di tipo I e IV, sono pronti per la coltura di PTEC in formato 3D. Come mostrato nel Video 1 e nella Figura 2, i PTEC possono essere visti fluire nel lume dalla porta di iniezione (Figura 3). Se non sono osservate cellule, ciò potrebbe indicare una perdita o un disallineamento dell'iniezione e dell'ago della siringa smussato. Come dimostrato negli studi^17-28 pubblicati in precedenza, i tubuli PTEC si formano circa una settimana dopo l'iniezione in un dispositivo MPS.

Figura 1: Morfologia e confluenza delle cellule epiteliali del tubulo prossimale primario isolate (PTEC) nel tempo. I PTEC isolati da un singolo rene adulto sono tipicamente placcati in 14 fiasche di coltura cellulare T-75. (A) Per questo rene rappresentativo, dopo 6 giorni di coltura, è stato possibile osservare piccole chiazze di PTEC (inscatolate in rosso) con aspetto epiteliale e simile a ciottoli in tutto il pallone di coltura cellulare, con cellule del sangue ancora visivamente presenti. (B) Il giorno 8, sono comparsi patch PTEC definiti con cellule del sangue ridotte dopo il cambio del terreno. (C) La confluenza ha raggiunto in media il 50-60% entro il giorno 10 e (D) ha raggiunto circa il 100% circa 2 settimane dopo l'isolamento e sono pronti per essere trasportati, crioconservati o utilizzati in un dispositivo MPS. Le immagini sono state scattate con un ingrandimento 4x utilizzando un microscopio. Le barre della scala rappresentano 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Panoramica del flusso di lavoro per la creazione di un modello di tubulo prossimale utilizzando PTEC in una piattaforma MPS. Questo diagramma di flusso descrive il flusso di lavoro generale per l'utilizzo dei PTEC in un dispositivo MPS. In genere, sono necessarie circa 3 settimane per isolare i PTEC dai reni umani per creare un tubulo prossimale 3D in vitro maturo e stabile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: PTEC dopo essere stati iniettati in un dispositivo MPS. Dopo la formazione del lume nel dispositivo MPS con collagene I e IV, i PTEC possono essere iniettati. Come mostrato in questa figura e nel video, dopo aver iniettato correttamente i PTEC, si potevano vedere le cellule fluire attraverso il lume dalla porta di iniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Esempi di calcolo per la preparazione di 1 mL della miscela di rivestimento MPS al collagene di tipo I. Il volume di stock di collagene necessario deve essere regolato in base alla concentrazione di stock. Il volume dei terreni PTEC può essere regolato per aumentare o diminuire il volume totale a circa 1 mL.

Video 1: PTEC che fluiscono nel lume dalla porta di iniezione. Clicca qui per scaricare questo video.

Le MPS, o tecnologie organ-on-a-chip, offrono una piattaforma in vitro altamente rilevante per ricapitolare aspetti chiave della fisiologia umana, riducendo così la dipendenza da modelli animali nello sviluppo di farmaci e nelle valutazioni tossicologiche. Recentemente, l'FDA Modernization Act 2.0 (2022) ha consentito l'inclusione delle MPS, tra le altre alternative, nelle domande di nuovi farmaci sperimentali²⁹. Questo protocollo descrive in dettaglio una procedura operativa standard per la dissociazione dei PTEC dal tessuto corticale di un donatore umano e il loro successivo utilizzo in piattaforme MPS, con l'obiettivo di modellare la funzione del tubulo prossimale umano e valutare le risposte tossicologiche renali agli xenobiotici (Figura 2).

Un fattore importante per mantenere un'elevata vitalità del PTEC è la riduzione al minimo del tempo ischemico caldo (WIT). Si consiglia di utilizzare reni con meno di 1 ora di WIT. Mentre la CIT inferiore a 24 ore è l'ideale, fino a 36 ore possono essere tollerate quando la disponibilità di rene è limitata. Un altro passaggio critico è la corretta preparazione dei tessuti, che include la rimozione delle membrane esterne, del grasso viscerale e la separazione completa della corteccia dal midollo per massimizzare la purezza del PTEC. Abbiamo scoperto che digerire il tessuto con collagenasi IV e dispasi piuttosto che con la sola collagenasi I 10,11,30,31 offre una dissociazione più delicata che preserva l'integrità della membrana cellulare. Inoltre, altre miscele o l'inclusione di DNasi possono essere utili quando ci sono detriti cellulari significativi o aggregazione cellulare nella sospensione. È inoltre essenziale tritare i fazzoletti in pezzi di meno di 1^cm3 e mantenerli freddi su ghiaccio o a 4 °C subito dopo la digestione per evitare eccessivi danni cellulari.

Per le applicazioni a breve termine dei PTEC in piattaforme di coltura statiche come i transwell, la rimozione della maggior parte dei globuli rossi durante la lavorazione dei tessuti è fondamentale per prevenire lo stress ossidativo causato dall'emoglobina^{libera 32}. Diversi tipi di cellule nella corteccia renale, comprese le cellule del sangue, possono essere separati utilizzando un gradiente di Percoll³³. In alternativa, le cellule del sangue possono essere lisate selettivamente utilizzando un tampone a base di cloruro di ammonio³⁴. D'altra parte, quando si utilizzano i PTEC nei dispositivi MPS, possono essere tollerati livelli moderati di cellule ematiche contaminanti, poiché questi PTEC devono essere coltivati in un formato di coltura standard fino alla confluenza. Inoltre, la digestione prolungata oltre un'ora dovrebbe essere evitata, in quanto può aumentare drasticamente il rischio di contaminazione che potrebbe non essere risolto con la semplice aggiunta di agenti antimicrobici. Una digestione di 30 minuti generalmente fornisce adeguate sospensioni di singole cellule e, se la resa è inferiore al previsto, il lavaggio del tessuto digerito una o due volte in più con tamponi isotonici come il PBS può spesso liberare PTEC che aderiscono al tessuto parzialmente digerito. Se la vitalità cellulare è bassa o l'aderenza è ritardata, è consigliabile riesaminare la digestione, garantire un WIT minimo e confermare che le condizioni del terreno di coltura (ormonalmente definito, privo di siero, 1 g/L di glucosio) siano corrette. Verificare che le fasi post-digestione vengano eseguite su ghiaccio o a 4 °C (fino alla placcatura) è anche essenziale per ridurre lo stress cellulare. Per la successiva semina cellulare nelle piattaforme MPS, è importante non introdurre bolle d'aria durante il rivestimento con soluzioni di collagene per mantenere una ECM uniforme affinché i PTEC formino tubuli strutturati. Le tecniche sterili sono particolarmente importanti durante l'installazione di MPS, poiché la natura multicompartimentale dei dispositivi MPS aumenta il rischio di contaminazione.

Uno dei principali limiti di questo protocollo è la dipendenza dai tessuti dei donatori, che possono variare in qualità e disponibilità. Un WIT prolungato o un CIT elevato possono ridurre la resa cellulare vitale e limitare la riproducibilità sperimentale. Un'altra limitazione è la durata finita dei PTEC primari, che in genere può essere mantenuta per 3 o 4 passaggi prima che si verifichi la senescenza cellulare. Infine, questo metodo produce inizialmente una popolazione mista di cellule, che contiene sia PTEC che cellule epiteliali dei tubuli distali (DTEC), dopo la digestione della corteccia renale. Anche se questo potrebbe non essere l'ideale per applicazioni a breve termine, lo scopo è quello di propagare i PTEC per un uso successivo nelle piattaforme MPS. Poiché impieghiamo un terreno di coltura definito senza siero, altri tipi di cellule con percentuali molto più basse, vale a dire le cellule mesangiali e i fibroblasti, non cresceranno a un ritmo significativo. Inoltre, utilizzando la citometria a flusso e la colorazione immunoistochimica (IHC), abbiamo precedentemente dimostrato che la maggior parte delle cellule primarie coltivate con questo metodo sono PTEC, con una minoranza di cellule che esprimono marcatori DTEC basati sui dati di colorazione dei marcatori delle cellule epiteliali renali. In particolare, i PTEC in coltura 3D formano tubuli polarizzati con fenotipo citometrico a flusso PTEC per neprilisina (CD10) e alanina aminopeptidasi (CD13)²³. I dati di colorazione IHC hanno anche dimostrato che queste cellule, sia in formato 2D che 3D, esprimono marcatori PTEC lectina tetragonolobus loto (LTL), co-trasportatore sodio-glucosio 2 (SGLT2) e acquaporina-1 (AQP1), con un'espressione minima di marcatori nefroni distali, tra cui prominina-2 (PROM2), uromodulina (UMOD) e acquaporina 2 (AQP2)¹⁶. Ciò è previsto poiché è stato dimostrato che i DTEC si dedifferenziano e si transdifferenziano verso i PTEC nella coltura 2D³⁰.

Sebbene le colture di cellule renali statiche e le linee cellulari immortalizzate siano ampiamente utilizzate, spesso non riescono a replicare i livelli fisiologici di stress da taglio e l'architettura tridimensionale presente nel rene. Al contrario, le piattaforme MPS 3D approssimano meglio l'ambiente del tubulo prossimale in vivo incorporando scaffold di flusso e ECM, migliorando così l'accuratezza predittiva per le valutazioni della nefrotossicità, come abbiamo dimostrato in precedenza 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27^,28. L'uso di PTEC primari piuttosto che di linee immortalizzate conferisce una maggiore rilevanza fisiologica, poiché queste cellule conservano trasportatori ed enzimi chiave essenziali per il metabolismo e la clearance degli xenobiotici. La combinazione di un'attenta manipolazione dei tessuti, di una digestione enzimatica ottimizzata e di condizioni di coltura adeguate garantisce che questo metodo MPS sia in linea con gli obiettivi generali di ridurre i test sugli animali, migliorando al contempo il valore traslazionale della ricerca renale preclinica²⁹.

Questo protocollo consente la creazione di robusti modelli di tubuli prossimali umani in dispositivi microfisiologici, facilitando così lo screening dei farmaci, le previsioni di nefrotossicità e le indagini dettagliate sulla fisiopatologia renale, in particolare per i meccanismi di clearance renale, le interazioni farmaco-trasportatore e le vie di danno renale. Riducendo o sostituendo l'uso di modelli animali, questi approcci primari alle MPS basate sull'uomo promuovono il principio delle 3R (ridurre, perfezionare, sostituire) e possono accelerare le pipeline di sviluppo dei farmaci. Allo stesso tempo, le MPS specifiche per il paziente sono promettenti per le applicazioni della medicina di precisione, come lo screening personalizzato dei farmaci e la profilazione della tossicità. Nel complesso, questo metodo riproducibile per isolare e coltivare PTEC da tessuti di donatori umani fornisce passaggi critici per preservare la vitalità e la funzionalità cellulare e, se combinato con le piattaforme MPS 3D, migliora significativamente il potere predittivo dei modelli renali in vitro , facendo progredire la ricerca tossicologica e la scoperta di farmaci.

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse o divulgazioni finanziarie rilevanti per questo studio.

Parti di questo lavoro sono state supportate dal contratto 80ARC023CA001 della NASA, dal National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) (U2CTR004867, UH3TR000504, UG3TR002158), congiuntamente dal NCATS e dal Center for the Advancement of Science in Space (CASIS) (UG3TR002178), dal National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (P30ES00703), dal National Institute of General Medical Sciences (T32GM007750), da una donazione illimitata da parte dei Northwest Kidney Centers alla ricerca sui reni e la Scuola di Farmacia dell'Università di Washington (Ji-Ping Wang Award e Bradley Fellowship).