عزل الخلايا الظهارية الأنبوبية البشرية القريبة الأولية واستخدامها في إنشاء نموذج فيزيولوجي مجهري للأنبوب الكلوي القريب

نقدم بروتوكولا محسنا لمعالجة الكلى البشرية الكاملة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية للنبيبات الكلوية القريبة الأولية وتطبيق هذه الخلايا في منصة ثلاثية الأبعاد ، ميكروفلويديك ، فيزيولوجية دقيقة لتلخيص النبيبات الكلوية القريبة.

يصيب مرض الكلى أكثر من 850 مليون شخص على مستوى العالم ، بما في ذلك 37 مليون أمريكي. تشمل عوامل الخطر لأمراض الكلى المزمنة التأثيرات البيئية ، والاستعدادات الوراثية ، والحالات الطبية المصاحبة ، وتاريخ إصابة الكلى الحادة. غالبا ما تستغرق هذه العوامل شهورا أو سنوات لتطويرها ، مما يعقد الدراسات الطولية لمسببات المرض والفيزيولوجيا المرضية. هناك حاجة إلى نماذج الكلى المتقدمة لتحسين فهمنا لآليات المرض وتعزيز التنبؤ بالسمية الكلوية في تطوير الأدوية. تلعب الخلايا الظهارية النبيبية القريبة (PTECs) في الكلى دورا مهما في إزالة الكائنات الحيوية والسموم بالإضافة إلى إعادة امتصاص العناصر الغذائية الأساسية. لقد أثبتنا سابقا أن منصات نظام الفيزيولوجيا الدقيقة ثلاثية الأبعاد (3D) (MPS) ، المأهولة ب PTECs الأولية المعزولة ، يمكن استخدامها للتحقيق في التفاعلات الدوائية الكلوية ، وتقييم السمية الكلوية للمركبات ، والتنبؤ بإزالة الأدوية. هنا ، نقدم بروتوكولات لعزل واستزراع PTECs الأولية من الكلى البشرية الكاملة ولبذرها في منصة MPS ثلاثية الأبعاد تحاكي فسيولوجيا الكلى في الجسم الحي . يتيح هذا البروتوكول إجراء دراسات طويلة الأجل تدعم جدوى PTEC ، والتشكل الفسيولوجي ، والاستقطاب الوظيفي لبروتينات النقل الرئيسية في أجهزة MPS لمدة تصل إلى 6 أشهر.

تلعب الكلى دورا مهما في إزالة وإزالة مجموعة واسعة من الكائنات الغريبة الحيوية والسموم والمركبات الذاتية من الجسم. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصفية الدم لإزالة الفضلات وتنظيم توازن الإلكتروليت ومستويات السوائل ودرجة الحموضة. تحتوي كل كلية بشرية على حوالي مليون نفرون ، الوحدات الهيكلية والوظيفية للكلية¹. داخل هذه النيفرون ، تكون الخلايا الظهارية المتخصصة في الأنابيب القريبة ، والمعروفة باسم الخلايا الظهارية للأنابيب القريبة (PTECs) ، مسؤولة عن إعادة امتصاص الجزيئات الأساسية مثل الجلوكوز والأحماض الأمينية والأيونات ، وكذلك عن إفراز ركائز الدواء والمواد السامة المحتملة في البول^2،3،4. في بعض الحالات ، قد تعيد PTECs أيضا امتصاص المركبات من البول مرة أخرى إلى مجرى^{الدم 4}. نظرا لدورها الحاسم في تفاعلات الأدوية والسموم ، توفر PTECs الأولية المعزولة من الكلى البشرية أداة قيمة لدراسة التفاعلات بين الأدوية الكلوية والأدوية (DDIs) وتقييم السمية الكلوية للمركبات.

تشكل السمية الكلوية التي تسببها الأدوية تحديا سريريا كبيرا ، حيث يمكن أن تؤدي إلى إصابة حادة في الكلى وأمراض الكلى^{المزمنة 5}. لذلك ، فإن الفهم الأعمق لفسيولوجيا النبيبات الكلوية القريبة أمر ضروري للتنبؤ بدقة وتوصيف إمكانات السمية الكلوية للأدوية والسموم. النماذج التقليدية في المختبر ، بما في ذلك خطوط الخلايا الكلوية الخالدة (على سبيل المثال ، RPTEC-TERT1 ، HK-2) ، لها قيود في تقليد الهيكل المعقد ووظيفة الأنابيب القريبة البشرية⁶ ، والتي تعمل في ظل تدفق ديناميكي رقائقي (مع رقم رينولدز منخفض) ومصفوفة موحدة خارج الخلية (ECM) في الجسم الحي^7،8. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تفشل النماذج التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) في التعبير وظيفيا عن الناقلات الكلوية الرئيسية (على سبيل المثال ، ناقل الأنيون العضوي 1 و 3 (OAT1 و OAT3) ، ناقل الكاتيون العضوي 2 (OCT2)) بسبب التحلل السريع واستيعاب هذه البروتينات^6،9،10،11. على الرغم من أن النماذج الحيوانية غنية بالمعلومات ، قد لا تكرر بشكل كامل فسيولوجيا الكلى البشرية وغالبا ما تفتقر إلى قابلية الترجمة بسبب اختلافات الأنواع في تعبير الناقل^{ونشاطه 12}. على سبيل المثال ، يتم التعبير عن mOct1 بشكل جانبي في PTECs للفأر ، بينما في البشر ، لا يمكن اكتشاف تعبير البروتين الغشائي ل OCT1 في الكلى^13،14.

مكنت التطورات في أنظمة الفيزيولوجيا الدقيقة (MPS) وتقنيات الأعضاء على الرقاقة الباحثين من تطوير نماذج في المختبر تحاكي عن كثب الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) وظروف تدفق السوائل الديناميكية للأعضاء البشرية¹⁵. قامت مجموعتنا سابقا بتمييز نموذجين من MPS باستخدام PTECs^16،17 ، واستخدمت هذه النماذج لإجراء دراسات السمية^18،19،20 والتنبؤ بالتخلص من الدواء بدقة²¹. يوفر استخدام PTECs الأولية في هذه النماذج مزايا كبيرة نظرا لقدرتها على الاحتفاظ بالخصائص الوظيفية التي لوحظت في الجسم الحي.

هنا ، نقدم بروتوكولات عزل PTECs البشرية عن كلية بشرية سليمة تم الحصول عليها من متبرع متوفى عبر منظمة شراء الأعضاء المعتمدة من الشبكة المتحدة لمشاركة الأعضاء (UNOS) وتطبيق هذه المعالجات المؤقتة البكتيرية البشرية المثقفة داخل منصة MPS.

تم إجراء جميع الأعمال وفقا لإرشادات جامعة واشنطن للتعامل مع الأنسجة البشرية. يستوفي المتبرعون المناسبون المتطلبات التالية: أقل من 36 ساعة من وقت الإقفار البارد (CIT) ، ولا يوجد تاريخ معروف لأمراض الكلى ، أو غسيل الكلى ، أو أي حالات طبية أخرى (على سبيل المثال ، داء السكري من النوع 1 أو 2 ، أو التهاب الكبد B ، أو التهاب الكبد C ، أو فيروسات نقص المناعة البشرية (HIV) ، أو التهاب السحايا الفيروسي / الجرثومي ، أو عدوى المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين ، أو مرض الزهري ، أو الإنتان ، أو Covid-19). تم الحصول على الكلى البشرية بأكملها المستخدمة في هذه الدراسة من خلال OPO المعتمد من UNOS.

1. إعداد خزانة السلامة الحيوية

1. رش غطاء المحرك بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بتطهير جميع الأسطح والعناصر الموجودة داخل الخزانة لخلق بيئة معقمة.
2. ضع وسادات ماصة زرقاء. قم بإجراء جميع أعمال الأنسجة على هذه الفوط.
3. تأكد من توفر المعدات اللازمة في خزانة السلامة الحيوية وتعقيمها بشكل صحيح (شفرات الحلاقة، وأطراف الماصة المصلية، ومسدس الماصة المصلي، ومصافي الخلايا 100 ميكرومتر، وأطراف p1000، وماصة دقيقة سعة 1000 ميكرولتر، وأطباق استزراع دائرية مقاس 15 سم، وأنابيب مخروطية).

2. تحضير المعالجة المسبقة للكلى

1. تحضير محلول هضم الكلى عن طريق إضافة 0.75 مجم / مل كولاجيناز IV + 0.75 مجم / مل ديسباز II في محلول ملحي بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco مع الكالسيوم والمغنيسيوم. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح غشاء معقم 0.2 ميكرومتر.
   ملاحظة: بالنسبة للكلية البشرية البالغة بأكملها ، يلزم وجود ما يقرب من 14 أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل ، يحتوي كل منها على ~ 35 مل من محلول الهضم (إجمالي 500 مل).
2. تحضير وسائط PTEC بإضافة 4.425 جم من مسحوق Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 بدون جلوكوز ، و 0.5 جم من مسحوق D-glucose ، و 0.6 جم من مسحوق بيكربونات الصوديوم ، و 5 مل من مكمل الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم 100x (يحتوي على 1000 مجم / لتر من الأنسولين ، و 550 مجم / لتر ترانسفيرين ، و 0.67 مجم / لتر سيلينيت الصوديوم) ، و 0.5 مل من 50 ميكرومتر من الهيدروكورتيزون ، و 5 مل من محلول المضادات الحيوية المضادة للفطريات 100x (يحتوي على 10000 وحدة / مل من البنسلين G الصوديوم ، 10000 ميكروغرام / مل كبريتات الستربتومايسين ، و 25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب في محلول ملحي 0.85٪) في 500 مل من الماء المعقم فائق النقاء (النوع 1). قم بتصفية الوسائط من خلال مرشح غشاء معقم 0.2 ميكرومتر. قم بإذابة مصل الأبقار الجنينية (FBS) وصنع 10 مل من الحصص في 14 50 مل من الأنابيب المخروطية الشكل.
3. اجمع وتسمية مجموعة إضافية من الأنابيب المخروطية سعة 50 مل. في هذه الخطوة ، تأكد من وجود 3 مجموعات من 14 50 أنابيب مل.
4. قم بتسخين الخلاط المداري مسبقا إلى 37 درجة مئوية.

3. عزل PTECs من الكلى بأكملها

1. باستخدام تقنية معقمة ، ضع حاوية الشحن مع عينة الأنسجة في غطاء السلامة الحيوية. أخرج الكيس من الصندوق ورش الجزء الخارجي بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل وضعه في الغطاء.
2. ضع الكلية في طبق استزراع دائري مقاس 15 سم. شفط / تجاهل الوسائط المتبقية.
3. قم بإزالة الدهون المحيطة والكبسولة الكلوية باستخدام شفرات حلاقة معقمة. قم بتقطيع الكبسولة الكلوية برفق لإنشاء شق في المنتصف.
4. باستخدام الملقط ، اسحب الكبسولة واستخدم شفرات الحلاقة لتقطيع أي دهون ملتصقة بالكلى. تخلص من كل من الكبسولة والدهون في طبق آخر بحجم 15 سم.
5. افصل القشرة (~ 1 سم) عن النخاع. تخلص من النخاع.
   ملاحظة: القشرة لها لون أصفر بني فاتح مقارنة بالنخاع.
6. باستخدام شفرة حلاقة ، افرم المنديل إلى <1 سم³ قطع حتى يصبح مظهره يشبه الملاط.
7. أضف كمية صغيرة من محلول هضم الكلى إلى الطبق وانقل الملاط إلى المجموعة الأولى من أنابيب سعة 50 مل تحتوي على 35 مل من محلول هضم الكلى. وزعي بالتساوي ولا تتجاوز الحجم الإجمالي 45 مل لكل أنبوب.
8. انقل جميع الأنابيب إلى شاكر المداري 37 درجة مئوية واحتضنه لمدة 30 دقيقة بأعلى سرعة لا تتسبب في سقوط الأنابيب. انقل الأنابيب مرة أخرى إلى خزانة السلامة الحيوية بعد رشها بنسبة 70٪ من الإيثانول.
9. اقلب الأنابيب للخلط واترك القطع الكبيرة من الأنسجة تستقر في الأسفل. نقل أكبر قدر ممكن من المحلول إلى الأنابيب المخروطية سعة 50 مل التي تحتوي على 10 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) دون نقل الأنسجة السليمة. وزعي بالتساوي ولا تتجاوز الحجم الإجمالي 45 مل لكل أنبوب.
10. جهاز الطرد المركزي للأنابيب عند 200 جم لمدة 7 دقائق. انقل الأنابيب مرة أخرى إلى خزانة السلامة الحيوية بعد رشها بنسبة 70٪ من الإيثانول.
11. استنشق بعناية من المادة الطافية أضف 10 مل من وسائط PTEC في كل أنبوب وأعد تعليق الكريات.
12. قم بتصفية معلقات الخلية الناتجة من خلال مصافي خلية 100 ميكرومتر في أنابيب مخروطية جديدة سعة 50 مل.
13. الطرد المركزي ، يتم ترشيح الخلية الناتجة عند 400 جم لمدة 5 دقائق. انقل الأنابيب مرة أخرى إلى خزانة السلامة الحيوية بعد رشها بنسبة 70٪ من الإيثانول.
14. اغسل الكريات ب 5 مل من DPBS. أعد تعليق الكريات باستخدام طرف p1000.
15. الطرد المركزي الأنابيب عند 400 جم لمدة 5 دقائق. انقل الأنابيب مرة أخرى إلى خزانة السلامة الحيوية بعد رشها بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم استنشق المواد الطافية
16. كرر الخطوة 3.15 مرتين أخريين ليصبح المجموع ثلاث غسلات. بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق كريات الخلايا ب 15 مل من وسائط PTEC وقم بوضع الخلايا على قوارير T-75 لزراعة الخلايا المعقمة.
17. قم بتسمية القوارير بشكل مناسب واسمح للخلايا بالنمو في حاضنة معقمة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. اسمح ل PTECs بالنمو دون إزعاج في الحاضنة لمدة 48 ساعة قبل تغيير الوسائط الأول.

4. تغييرات الوسائط

1. استنشق الوسائط من القوارير.
2. اغسل الخلايا ب 5 مل من DPBS الدافئ مسبقا.
3. أضف 5 مل من وسائط PTEC الدافئة مسبقا إلى قوارير T-25.
4. أعد القارورة إلى الحاضنة.
5. قم بتغيير الوسائط كل 48 ساعة حتى تصل القارورة إلى 70٪ على الأقل للمرور أو استخدامها في التجارب.

5. تمرير PTECs

1. استنشق الوسائط من القارورة. أضف 5 مل من 0.05٪ Trypsin-EDTA الدافئ مسبقا في كل قارورة T-25 واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 إلى 2 دقيقة للسماح بهضم التربسين.
2. بمجرد فصل الخلايا ، قم بتحييد التربسين باستخدام 5 مل من محلول مثبط التربسين المحدد مسبقا.
3. قم بتعليق 5 مرات لإخراج أي خلايا لا تزال متصلة بالقارورة. بعد ذلك ، قم بنقل تعليق الخلية إلى أنابيب مخروطية سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي عند 400 جم لمدة 5 دقائق.
4. استنشق الطاف.
   ملاحظة: توقف هنا لحفظ PTECs بالتبريد والانتقال إلى هذا البروتوكول.
5. قم بتعليق كريات الخلية ب 14 مل من وسائط PTEC لكل أنبوب. انقل معلقات الخلية إلى قوارير T-75 (أنبوب واحد لكل قارورة).
6. قم بإجراء T Jer لتوزيع الخلايا عبر القارورة بالتساوي. مراقبة الخلايا وتغيير الوسائط كل 48 ساعة.

6. PTECs الحفظ بالتبريد

1. بعد الخطوة 5.6 ، أعد تعليق كريات الخلية في 2 مل من وسائط PTEC منخفضة الجلوكوز بنسبة 10٪ و 90٪ لكل أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وانقل 1 مل إلى أنبوب مبرد واحد.
2. انقل المبردات إلى حاوية تجميد الخلايا التي تسمح بالتجميد بالتحكم في درجة الحرارة وضع الحاوية في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة عند -80 درجة مئوية ، انقل المبردات إلى خزان النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.

7. ذوبان PTECs

1. قم بإذابة القارورة من -80 درجة مئوية في حمام مائي 37 درجة مئوية. لا تذوب في درجة حرارة الغرفة (RT). بمجرد إذابة القارورة جزئيا (يجب أن تكون هناك قطعة صغيرة من الثلج مرئية) ، أضف 1 مل من تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل مع 10 مل من وسائط PTEC الدافئة مسبقا.
2. قم بتدوير معلق الخلية عند 400 جم لمدة 5 دقائق. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من وسائط PTEC منخفضة الجلوكوز الدافئة مسبقا.
3. انقل معلق الخلية سعة 5 مل إلى قارورة T-25 وقم بإجراء اهتزاز على شكل حرف T لتوزيع الخلايا عبر القارورة بالتساوي. من هنا، اتبع القسم 4 للاطلاع على تغييرات الوسائط.

8. طلاء جهاز MPS بمصفوفة الكولاجين من النوع الأول

1. استنشق PBS من جهاز MPS وقم بإزالة الجهاز من العبوة. امسح الجهاز حتى يجف بمناديل طبية وقم بتسميتها حسب الرغبة.
2. ضع جهاز MPS في طبق ثقافة دائري مقاس 15 سم وضعه في 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام. احتفظ بمناديل طبية في قاع الطبق لمنع الرطوبة على جهاز MPS.
3. احتفظ بمحاقن 1 مل مع 22 جم من إبرة Luer-Lok متصلة عند -20 درجة مئوية حتى استخدامها لحقن الكولاجين I.
4. لكل أربعة أجهزة MPS تحتاج إلى التعبئة ، احتفظ بأنبوب مخروطي واحد سعة 15 مل على الجليد. استخدم حقنة واحدة سعة 1 مل مع إبرة حادة متصلة لكل أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
5. باستخدام تقنية معقمة في خزانة السلامة الحيوية ، افتح جميع المنافذ الموجودة على جهاز MPS. تأكد من محاذاة الشقوق الموجودة في الجزء العلوي من كل صمام لولبي عموديا مع المنفذ.
6. باستخدام مجموعة حادة من حقنة / إبرة سعة 1 مل ، قم بغسل غرفة ECM ب 1 مل من الإيثانول في المنافذ # 1 و # 3 و # 6. استنشق الإيثانول واتركه يتبخر تماما (30 ثانية على الأقل) حتى لا يخترق جهاز MPS من المنافذ # 2 و # 4 و # 5.
7. ضع جهاز MPS مرة أخرى عند 4 درجات مئوية ، واحتفظ بوسائط PTEC و M199 و 1 N NaOH على الجليد.
8. احسب تكوين المصفوفة ل 1 مل من خليط الكولاجين من النوع الأول لما يقرب من أربعة أجهزة MPS وفقا للجدول 1 (المقياس حسب الحاجة). في خزانة السلامة الحيوية ، امزج وسائط PTEC و M199 و 1 N هيدروكسيد الصوديوم بهذا الترتيب ، وفقا للحسابات المذكورة أعلاه ، واحتفظ بجميع الأنابيب على الجليد.
9. أضف بعناية مرق الكولاجين من النوع الأول مع حقنة 1 مل إلى المزيج الجاهز. اخلطي خليط الكولاجين عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل حتى يصبح لون السلمون البرتقالي والوردي مستقر.
10. لفترة وجيزة ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لجمع المحلول في الأسفل. تأكد من عدم وجود فقاعات في المحلول.
11. ضع المحاقن المبردة مسبقا سعة 1 مل مع حادة إبرة 22 G Luer-Lok وجهاز MPS في خزانة السلامة الحيوية وعلى الثلج. املأ المحقنة المبردة مسبقا سعة 1 مل بخليط الكولاجين وتجنب الفقاعات تماما.
12. قم بحقن محلول الكولاجين ببطء شديد وبرفق في المنافذ # 1 و # 3 و # 6 من غرف الجهاز المبرد. أمسك الجهاز عموديا بحيث تكون المنافذ متجهة لأسفل للسماح لفقاعات الهواء بالتدفق لأعلى والخارج من المنافذ #2 و#4 و#5.
    ملاحظة: يجب أن يكون هناك قطرة من خليط الكولاجين في المنافذ # 2 و # 4 و # 5 ، مما يشير إلى أن الغرف مغلفة بالكامل.
13. قم بإزالة المحقنة وضعها مرة أخرى في أنبوب 15 مل على الثلج. أدر الصمام اللولبي للمنافذ # 2 و # 4 و # 5 لإغلاق الشريحة المملوءة ووضع الشريحة على طبق الثقافة عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
14. بعد 30 دقيقة ، انقل الشريحة مع الطبق إلى خزانة السلامة الحيوية بطريقة معقمة وافرد الرقائق بالتساوي والفردي حتى تسخن بشكل موحد.
15. ضع منديلا طبيا مبللا في كل طبق (لمنع مصفوفة الكولاجين I من الجفاف والتقشير بعيدا عن جدران جهاز MPS) وأغلق الأطباق بغشاء مانع للتسرب مرن شبه شفاف. اسمح للكولاجين بالبلمرة طوال الليل في RT.

9. إنشاء تجويف أنبوبي باستخدام الكولاجين من النوع الرابع كوحدة التحكم في الميكروفون في جهاز MPS

1. تعقيم أنابيب C-flex عن طريق شطف الأنابيب بماء فائق النقاء (النوع 1) والإيثانول النقي ، ثم قم بتعقيم خط الأنابيب بالكامل.
2. في خزانة السلامة الحيوية ، افتح جميع منافذ جهاز MPS المملوء بالكولاجين من النوع الأول (سيكون الصمام اللولبي عموديا مع المنافذ) وقم بإزالة السلك البارز من المنافذ # 1 و # 3 و # 6 لتشكيل التجويف الأنبوبي.
3. أدخل قارنات التوصيل المعدنية في المنافذ #1 و#3 و#6.
4. قم بإعداد محلول 10 مل من 5 ميكروغرام / مل من النوع الرابع من الكولاجين في وسائط PTEC.
5. أدخل 24 بوصة من الأنابيب المرنة C المعقمة على الحواد المعدنية البارزة من المنافذ # 1 و # 3 و # 6.
6. املأ 1 مل من المحاقن المزودة بإبرة Luer-Lok 22 جم مع 0.5 مل من محلول الكولاجين من النوع الرابع.
7. ضع المحقنة المملوءة على مضخة ضخ حقنة وقم بتوصيل الأنبوب من المنفذ # 1 بالمحقنة. كرر هذه الخطوة للمنفذين #3 و#6.
8. باستخدام مضخة الحقنة، قم بتوصيل محلول الكولاجين من النوع الرابع إلى منافذ MPS بمعدل 10 ميكرولتر/دقيقة لمدة 30 دقيقة. بمجرد غرس المنافذ ، اترك الكولاجين يتجمد في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل قبل استخدامها في اليوم التالي.
   ملاحظة: يمكن تخزين أجهزة MPS المطلية بالكولاجين من النوع الرابع لمدة تصل إلى أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية.

10. بذر PTECs الأولية في جهاز MPS

1. افحص جهاز MPS تحت المجهر للتأكد من تكوين التجويف بشكل صحيح.
2. ضع حقنة معقمة مسبقا سعة 5 مل بإبرة 22 جم في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من الإيثانول.
3. احصل على حبيبات خلية PTEC في أنبوب مخروطي سعة 15 مل من قارورة T-25 باتباع الخطوات 5.1. إلى 5.3. أضف 80 ميكرولتر من وسائط PTEC إلى حبيبات الخلية وأعدها برفق.
4. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل.
5. قم بإزالة الطبق الذي يحتوي على جهاز MPS من الحاضنة وضعه في خزانة السلامة الحيوية. أغلق المنافذ #2 و#4 و#5، وأدر الصمام اللولبي أفقيا إلى المنافذ.
6. قم بنقر الأنبوب المحتوي على PTEC برفق لإعادة تعليق الخلايا. املأ المحقنة بالخلايا وأدخل الإبرة في منفذ الحقن الأبعد عن منافذ الصمامات اللولبية.
7. اضغط بعناية على مكبس المحقنة لحقن الخلايا. تصور الخلايا بعد الحقن تحت المجهر.
   ملاحظة: يجب أن تتحرك الخلايا عبر التجويف. إذا لم يتم ملاحظة أي خلايا في التجويف ، فتحقق مما إذا كانت الإبرة قد تم إدخالها بإحكام في منفذ الحقن وأعد إدخال الإبرة إذا لزم الأمر. يمكن أن تملأ حقنة كاملة من الخلايا جميع اللومن الثلاثة على الجهاز.
8. استمر في حقن الخلايا مع المنفذين الآخرين. بعد الحقن، أغلق المنافذ #2 و#4 و#5 وأعد جهاز MPS إلى الحاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. حافظ على مستوى اللوحة حتى لا تتحرك الخلايا خارج التجويف عن طريق الجاذبية.
9. بالنسبة لأجهزة MPS الإضافية ، اغسل المحقنة بالإيثانول بعد إفراغها واغسلها باستخدام DPBS قبل سحب الخلايا.
10. اسمح لأجهزة MPS بالجلوس طوال الليل دون إزعاج.
11. في اليوم التالي ، قم بتوصيل أجهزة MPS بمضخات الحقنة.
12. في خزانة السلامة الحيوية ، املأ محاقن سعة 5 مل بوسائط PTEC. بعد ذلك ، قم بتركيب 22 G Luer-Lok مع قسم 24 بوصة من الأنابيب C-flex المرفقة بالمحاقن.
13. ضع المحاقن المحملة بالوسائط PTEC في مضخة المحقنة. قم بتجهيز الخطوط لإزالة أي فقاعات هواء.
14. قم بتوصيل خطوط الأنابيب المعدة بالمنافذ # 1 و # 3 و # 6 وقم بتدوير الصمامات اللولبية إلى وضع رأسي لإدخال تدفق الوسائط.
15. اضبط معدل تدفق مضخة الحقنة على 0.5 ميكرولتر / دقيقة. ضع الطبق مع جهاز MPS مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية واسمح للخلايا بتكوين أنابيب (في غضون 5 إلى 7 أيام) تحت نضح الوسائط المستمر قبل بدء التجربة.

مورفولوجيا وتقاء PTECs الأولية المعزولة بمرور الوقت في ثقافة ثنائية الأبعاد
بعد العزلة عن قشرة الكلى ، سمح ل PTECs بالنمو دون إزعاج لمدة 48 ساعة على الأقل قبل أول تغيير للوسائط. بعد أسبوع تقريبا من زراعة الخلايا ، يجب أن تظهر دفعات صغيرة من PTECs في جميع أنحاء قارورة الاستزراع مع مورفولوجيا ظهارية موحدة تشبه الحصى (الشكل 1 أ ، ب). اعتمادا على معدلات نمو PTECs من مانحين مختلفين ، يجب أن يصل التقاء الخلايا إلى حوالي 50٪ -60٪ بعد 10 أيام في الثقافة (في المتوسط) (الشكل 1C). بعد حوالي 14 يوما في المزرعة ، يجب أن تصل الخلايا إلى التقاء كامل (الشكل 1 د) وتكون جاهزة إما للمرور أو الحفظ بالتبريد أو البذر في جهاز MPS. في المتوسط ، تكون الكلية البشرية الكاملة قادرة على توفير 14 قارورة T-75 كاملة مليئة ب PTECs. لمنع التلوث ، من الضروري استخدام تقنيات معقمة وإدراج المضادات الحيوية في الوسائط خلال فترة الاستزراع.

حقن PTECs في جهاز MPS
بعد طلاء أجهزة MPS بالكولاجين من النوع الأول والنوع الرابع ، تصبح جاهزة لزراعة PTECs بتنسيق ثلاثي الأبعاد. كما هو موضح في الفيديو 1 والشكل 2 ، يمكن رؤية PTECs تتدفق في التجويف من منفذ الحقن (الشكل 3). إذا لم يتم ملاحظة أي خلايا ، فقد يشير ذلك إلى تسرب أو اختلال محاذاة الحقن وإبرة المحقنة غير حادة. كما هو موضح في الدراسات المنشورة^{سابقا 17-28} ، ستتشكل أنابيب PTEC بعد أسبوع تقريبا من الحقن في جهاز MPS.

الشكل 1: مورفولوجيا وملتقى الخلايا الظهارية النبيبية الأولية القريبة المعزولة (PTECs) بمرور الوقت. عادة ما يتم طلاء PTECs المعزولة من كلية واحدة بالغة في 14 قارورة لزراعة الخلايا T-75. (أ) بالنسبة لهذه الكلية التمثيلية ، بعد 6 أيام في المزرعة ، يمكن ملاحظة بقع صغيرة من PTECs (محاصرة باللون الأحمر) ذات مظهر ظهاري وشبيه بالحصى في جميع أنحاء قارورة زراعة الخلية ، مع استمرار وجود خلايا الدم بصريا. (ب) في اليوم الثامن ، ظهرت بقع PTEC المحددة مع انخفاض خلايا الدم بعد تغيير الوسائط. (ج) وصل التقاء إلى 50 إلى 60٪ بحلول اليوم 10 في المتوسط و (د) وصل إلى حوالي 100٪ بعد أسبوعين تقريبا من العزل وتكون جاهزة إما للمرور أو الحفظ بالتبريد أو استخدامها في جهاز MPS. تم التقاط الصور بتكبير 4x باستخدام المجهر. تمثل أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: نظرة عامة على سير العمل لإنشاء نموذج أنبوب قريب باستخدام PTECs في منصة MPS. يصف هذا المخطط الانسيابي سير العمل العام لاستخدام PTECs في جهاز MPS. بشكل عام ، يستغرق الأمر حوالي 3 أسابيع لعزل PTECs من الكلى البشرية لإنشاء نبيبات قريبة ناضجة ومستقرة في المختبر ثلاثية الأبعاد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: PTECs بعد حقنها في جهاز MPS. بعد تكوين التجويف في جهاز MPS بالكولاجين الأول والرابع ، يمكن حقن PTECs. كما هو موضح في هذا الشكل والفيديو ، بعد حقن PTECs بشكل صحيح ، يمكن رؤية الخلايا تتدفق عبر التجويف من منفذ الحقن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: عينة من الحسابات لتحضير 1 مل من خليط طلاء الكولاجين MPS من النوع الأول. يجب تعديل حجم مخزون الكولاجين المطلوب وفقا لتركيز المخزون. يمكن ضبط حجم وسائط PTEC لرفع أو خفض الحجم الإجمالي إلى حوالي 1 مل.

فيديو 1: PTECs تتدفق في التجويف من منفذ الحقن. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

توفر MPS ، أو تقنيات الأعضاء على الرقاقة ، منصة مختبرية ذات صلة كبيرة لتلخيص الجوانب الرئيسية لعلم وظائف الأعضاء البشري ، وبالتالي تقليل الاعتماد على النماذج الحيوانية في تطوير الأدوية والتقييمات السمية. في الآونة الأخيرة ، سمح قانون تحديث إدارة الغذاء والدواء 2.0 (2022) بإدراج MPS ، من بين بدائل أخرى ، في تطبيقات الأدوية الجديدة^{التجريبية 29}. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل إجراء تشغيل قياسي لتفكك PTECs عن الأنسجة القشرية للمتبرع البشري واستخدامها اللاحق في منصات MPS ، بهدف نمذجة وظيفة النبيبات القريبة البشرية وتقييم الاستجابات السمية الكلوية لمضادات الأجانب الحيوية (الشكل 2).

أحد العوامل المهمة للحفاظ على جدوى PTEC العالية هو تقليل الوقت الإقفاري الدافئ (WIT). نوصي باستخدام الكلى مع أقل من 1 ساعة من الذكاء الاصطناعي. في حين أن CIT أقل من 24 ساعة مثالية ، يمكن تحمل ما يصل إلى 36 ساعة عندما يكون توافر الكلى محدودا. خطوة أخرى حاسمة هي التحضير المناسب للأنسجة ، والذي يتضمن إزالة الأغشية الخارجية والدهون الحشوية وفصل القشرة تماما عن النخاع لزيادة نقاء PTEC. لقد وجدنا أن هضم الأنسجة باستخدام الكولاجيناز IV والتباين بدلا من الكولاجيناز الأول وحده^{10،11،30،31} يوفر تفككا ألطف يحافظ على سلامة غشاء الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون الخلطات الأخرى أو إدراج DNase مفيدة عندما يكون هناك حطام خلوي كبير أو تكتل خلوي في المعلق. من الضروري أيضا فرم الأنسجة إلى قطع أقل من 1 سم³ وإبقائها باردة على الجليد أو عند 4 درجات مئوية مباشرة بعد الهضم لمنع تلف الخلايا المفرط.

بالنسبة للتطبيقات قصيرة المدى ل PTECs في منصات الاستزراع الثابتة مثل transwells ، فإن إزالة معظم خلايا الدم الحمراء أثناء معالجة الأنسجة هي المفتاح لمنع الإجهاد التأكسدي الناجم عن الهيموجلوبين^{الحر 32}. يمكن فصل أنواع الخلايا المختلفة في قشرة الكلى ، بما في ذلك خلايا الدم ، باستخدام تدرج بيركول³³. بدلا من ذلك ، يمكن تحلل خلايا الدم بشكل انتقائي باستخدام محلول عازل قائم على كلوريد^{الأمونيوم 34}. من ناحية أخرى ، عند استخدام PTECs في أجهزة MPS ، يمكن تحمل مستويات معتدلة من خلايا الدم الملوثة حيث يجب زراعة هذه الخلايا في شكل مزرعة قياسية حتى التقاء. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تجنب الهضم لفترات طويلة لأكثر من ساعة واحدة ، لأنه يمكن أن يزيد بشكل كبير من مخاطر التلوث التي قد لا يتم حلها بمجرد إضافة عوامل مضادة للميكروبات. يوفر الهضم لمدة 30 دقيقة بشكل عام معلقات مناسبة أحادية الخلية ، وإذا كان العائد أقل من المتوقع ، فإن غسل الأنسجة المهضومة مرة أو مرتين إضافيتين باستخدام مخازن مؤقتة متساوية التوتر مثل PBS يمكن أن يؤدي في كثير من الأحيان إلى تحرير PTECs التي تلتصق بالأنسجة المهضومة جزئيا. إذا كانت صلاحية الخلية منخفضة أو تأخر الالتصاق ، فمن المستحسن إعادة فحص الهضم ، وضمان الحد الأدنى من الذكاء ، والتأكد من صحة ظروف وسط الثقافة (محددة هرمونيا ، خالية من المصل ، 1 جم / لتر جلوكوز). يعد التحقق من أن خطوات ما بعد الهضم يتم إجراؤها على الجليد أو عند 4 درجات مئوية (حتى الطلاء) أمرا ضروريا أيضا لتقليل الإجهاد الخلوي. بالنسبة لتلقيح الخلايا اللاحق في منصات MPS ، من المهم عدم إدخال أي فقاعات هواء عند الطلاء بمحاليل الكولاجين للحفاظ على ECM موحد ل PTECs لتشكيل أنابيب منظمة. تعتبر التقنيات المعقمة مهمة بشكل خاص أثناء إعداد MPS لأن الطبيعة متعددة الأجزاء لأجهزة MPS تزيد من خطر التلوث.

أحد القيود الرئيسية لهذا البروتوكول هو الاعتماد على أنسجة المتبرع بها ، والتي قد تختلف في الجودة والتوافر. يمكن أن يقلل الذكاء الاصطناعي المطول أو CIT العالي من إنتاجية الخلايا القابلة للحياة ويحد من قابلية التكاثر التجريبي. قيد آخر هو العمر المحدود ل PTECs الأولية ، والذي يمكن الحفاظ عليه عادة لمدة 3 إلى 4 ممرات قبل حدوث شيخوخة الخلية. أخيرا ، تنتج هذه الطريقة مجموعة مختلطة من الخلايا في البداية ، والتي تحتوي على كل من PTECs والخلايا الظهارية النبوبية البعيدة (DTECs) ، بعد هضم القشرة الكلوية. في حين أن هذا قد لا يكون مثاليا للتطبيقات قصيرة المدى ، إلا أن الغرض هو نشر PTECs للاستخدام اللاحق في منصات MPS. نظرا لأننا نستخدم وسط ثقافة محدد بدون مصل ، فإن أنواع الخلايا الأخرى ذات النسب المئوية الأقل بكثير ، وهي الخلايا المتوسطة والخلايا الليفية ، لن تنمو بمعدل كبير. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام قياس التدفق الخلوي والتلوين الكيميائي المناعي (IHC) ، أظهرنا سابقا أن غالبية الخلايا الأولية المستنبتة باستخدام هذه الطريقة هي PTECs ، مع وجود أقلية من الخلايا التي تعبر عن علامات DTEC بناء على بيانات تلطيخ علامات الخلايا الظهارية الكلوية. على وجه التحديد ، تشكل PTECs المزروعة ثلاثية الأبعاد أنابيب مستقطبة مع النمط الظاهري الخلوي لتدفق PTEC للنيبريليسين (CD10) وألانين أمينو ببتيداز (CD13) ²³. أظهرت بيانات تلطيخ IHC أيضا أن هذه الخلايا ، في كل من تنسيقات 2D و 3D ، تعبر عن علامات PTEC لوتس رباعي اللونولوبوس ليكتين (LTL) ، والناقل المشترك للصوديوم والجلوكوز 2 (SGLT2) ، و aquaporin-1 (AQP1) ، مع الحد الأدنى من التعبير عن علامات النيفرون البعيدة ، بما في ذلك prominin-2 (PROM2) و uromodulin (UMOD) و aquaporin 2 (AQP2) ¹⁶. هذا متوقع نظرا لأنه ثبت أن DTECs تتمايز وتتحول إلى PTECs في ثقافة^{2D 30}.

بينما تستخدم مزارع الخلايا الكلوية الثابتة وخطوط الخلايا الخالدة على نطاق واسع ، فإنها غالبا ما تفشل في تكرار المستويات الفسيولوجية لإجهاد القص والهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد الموجودة في الكلى. في المقابل ، تقترب منصات MPS ثلاثية الأبعاد بشكل أفضل من بيئة الأنابيب القريبة في الجسم الحي من خلال دمج سقالات التدفق و ECM ، وبالتالي تعزيز الدقة التنبؤية لتقييمات السمية الكلوية ، كما أوضحنا من قبل^{17،18،19،20،21،22،23،24،25،26،27، 28}. يمنح استخدام PTECs الأولية بدلا من الخطوط الخالدة أهمية فسيولوجية معززة ، حيث تحتفظ هذه الخلايا بالناقلات والإنزيمات الرئيسية الضرورية لعملية التمثيل الغذائي للأجانب الحيوية وإزالتها. يضمن الجمع بين التعامل الدقيق مع الأنسجة والهضم الأنزيمي المحسن وظروف الثقافة المناسبة توافق طريقة MPS هذه مع الأهداف الشاملة المتمثلة في تقليل التجارب على مع تعزيز القيمة الانتقالية لأبحاث الكلى قبل^{السريرية 29}.

يتيح هذا البروتوكول إنشاء نماذج قوية للأنابيب القريبة البشرية في أجهزة الفيزيولوجيا الدقيقة ، وبالتالي تسهيل فحص الأدوية ، وتنبؤات السمية الكلوية ، والتحقيقات التفصيلية للفيزيولوجيا المرضية للكلى ، خاصة بالنسبة لآليات التصفية الكلوية ، وتفاعلات ناقل الأدوية ، ومسارات إصابة الكلى. من خلال تقليل استخدام النماذج الحيوانية أو استبدالها ، فإن MPS الأساسي القائم على الإنسان يتعامل مع مبدأ 3Rs (تقليل ، صقل ، استبدال) ويمكن أن يسرع خطوط أنابيب تطوير الأدوية. في الوقت نفسه ، يبشر نظام MPS الخاص بالمريض بتطبيقات الطب الدقيق ، مثل فحص الأدوية الشخصية وتوصيف السمية. بشكل عام ، توفر هذه الطريقة القابلة للتكرار لعزل وزراعة PTECs من أنسجة المتبرعين البشريين خطوات حاسمة للحفاظ على بقاء الخلية ووظائفها ، وعند دمجها مع منصات MPS ثلاثية الأبعاد ، تعمل بشكل كبير على تحسين القوة التنبؤية لنماذج الكلى في المختبر مع تطوير أبحاث السموم واكتشاف الأدوية.

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح أو إفصاحات مالية ذات صلة بهذه الدراسة.

تم دعم أجزاء من هذا العمل من خلال عقد ناسا 80ARC023CA001 ، والمركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية (NCATS) (U2CTR004867 ، UH3TR000504 ، UG3TR002158) ، بالاشتراك مع NCATS ومركز تقدم العلوم في الفضاء (CASIS) (UG3TR002178) ، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية (NIEHS) (P30ES00703) ، والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (T32GM007750) ، وهدية غير مقيدة من مراكز الكلى الشمالية الغربية لأبحاث الكلى معهد وكلية الصيدلة بجامعة واشنطن (جائزة جي بينغ وانغ وزمالة برادلي).