1차 인간 근위세뇨관 상피 세포의 분리 및 신장 근위세뇨관의 미세생리학적 모델 생성에 사용

우리는 원발성 신근위세뇨관 상피 세포를 분리 및 배양하기 위해 전체 인간 신장을 처리하기 위한 최적화된 프로토콜과 이러한 세포를 3차원, 미세유체, 미세생리학적 플랫폼에서 적용하여 신장 근위세뇨관을 재현하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

신장 질환은 3,700만 명의 미국인을 포함하여 전 세계적으로 8억 5,000만 명 이상의 사람들에게 영향을 미칩니다. 만성 신장 질환의 위험 요인에는 환경적 영향, 유전적 소인, 공존하는 의학적 상태, 급성 신장 손상 병력 등이 있습니다. 이러한 요인은 개발되는 데 종종 몇 달 또는 몇 년이 걸리기 때문에 질병 병인학 및 병태생리학에 대한 종단 연구를 복잡하게 만듭니다. 질병 메커니즘에 대한 이해를 높이고 약물 개발에서 신독성 예측을 향상시키기 위해서는 고급 신장 모델이 필요합니다. 신장의 근위세뇨관 상피세포(PTEC)는 생체이물 및 독소 제거뿐만 아니라 필수 영양소의 재흡수에 중요한 역할을 합니다. 우리는 이전에 분리된 1차 PTEC로 채워진 3차원(3D) 미세생리학적 시스템(MPS) 플랫폼을 사용하여 신장 약물 상호 작용을 조사하고, 화합물의 신독성을 평가하고, 약물 제거를 예측할 수 있음을 입증했습니다. 여기에서는 전체 인간 신장에서 1차 PTEC를 분리 및 배양하고 생체 내 신장 생리학을 모방한 3D MPS 플랫폼에 파종하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 최대 6개월 동안 MPS 장치에서 주요 수송 단백질의 PTEC 생존력, 생리학적 형태 및 기능적 분극을 지원하는 장기 연구를 가능하게 합니다.

신장은 신체에서 다양한 생체이물, 독소 및 내인성 화합물을 제거하고 제거하는 데 중요한 역할을 합니다. 이는 혈액을 여과하여 노폐물을 제거하고 전해질 균형, 체액 수준 및 pH를 조절함으로써 달성됩니다. 인간의 각 신장에는 약 100만 개의 네프론이 포함되어 있는데, 네프론은 신장의 구조적, 기능적 단위이다¹. 이 네프론 내에서 근위세뇨관 상피세포(PTEC)로 알려진 근위세뇨관의 특수 상피 세포는 포도당, 아미노산 및 이온과 같은 필수 분자를 재흡수하고 약물 기질 및 잠재적인 독성 물질을 소변으로 분비하는 역할을 합니다 ^2,3,4. 어떤 경우에는 PTEC가 소변의 화합물을 혈류로 다시 재흡수할 수도 있습니다⁴. 약물 및 독소 상호 작용에서 중요한 역할을 하기 때문에 인간의 신장에서 분리된 1차 PTEC는 신장 약물-약물 상호 작용(DDI)을 연구하고 화합물의 신독성을 평가하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

약물 유발 신독성은 급성 신장 손상 및 만성 신장 질환을 유발할 수 있기 때문에 임상적으로 심각한 문제를 야기한다⁵. 따라서 신장 근위세뇨관 생리학에 대한 더 깊은 이해는 약물 및 독소의 신독성 가능성을 정확하게 예측하고 특성화하는 데 필수적입니다. 불멸화된 신세포주(예: RPTEC-TERT1, HK-2)를 포함한 전통적인 in vitro 모델은 in vivo ^7,8 에서 동적인 층류(낮은 레이놀즈 수) 및 균일한 세포외 기질(ECM)에서 작동하는 인간 근위세뇨관⁶의 복잡한 구조와 기능을 모방하는 데 한계가 있습니다. 또한, 기존의 2차원(2D) 모델은 이러한 단백질의 급격한 분해 및 내재화로 인해 주요 신장 수송체(예: 유기 음이온 수송체 1 및 3(OAT1 및 OAT3), 유기 양이온 수송체 2(OCT2))를 기능적으로 발현하지 못하는 경우가 많습니다 6,9,10,11 . 동물 모델은 유익하기는 하지만 인간의 신장 생리학을 완전히 복제하지 못할 수 있으며, 수송체 발현과 활동의 종 차이로 인해 번역 가능성이 부족한 경우가 많다¹². 예를 들어, mOct1은 마우스 PTEC에서 기저측으로 발현되는 반면, 인간에서는 신장에서 OCT1의 막 단백질 발현이 검출되지 않습니다^13,14.

미세생리시스템(microphysiological system, MPS)과 장기 칩 기술의 발전으로 연구자들은 인간 장기의 3차원(3D) 구조와 동적 유체 흐름 조건을 밀접하게 모방한 체외 모델을 개발할 수 있게 되었습니다¹⁵. 우리 그룹은 이전에 PTEC^16,17로 두 가지 MPS 모델을 특성화했으며, 이러한 모델을 사용하여 독성 연구18,19,20를 수행하고 약물 처분을 정확하게 예측했습니다 ²¹. 이러한 모델에서 1차 PTEC를 사용하면 생체 내에서 관찰된 기능적 특성을 유지할 수 있기 때문에 상당한 이점을 얻을 수 있습니다.

여기에서는 UNOS(United Network for Organ Sharing)가 승인한 장기 조달 기관을 통해 사망한 기증자로부터 얻은 온전한 인간 신장에서 인간 PTEC를 분리하고 MPS 플랫폼 내에서 이러한 배양된 인간 PTEC를 적용하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

모든 작업은 워싱턴 대학교의 인체 조직 취급 지침에 따라 수행되었습니다. 적합한 기증자는 다음 요구 사항을 충족합니다: 한허혈 시간(CIT)이 36시간 미만이어야 하며, 신장 질환, 투석 또는 기타 의학적 상태(예: 당뇨병 1형 또는 2형 당뇨병, B형 간염, C형 간염, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 바이러스성/세균성 뇌수막염, 메티실린 내성 황색포도상구균 감염, 매독, 패혈증 또는 코로나19). 이 연구에 사용된 전체 인간 신장은 UNOS가 승인한 OPO를 통해 공급되었습니다.

1. 생물 안전 캐비닛 준비

1. 후드에 70% 에탄올을 뿌립니다. 캐비닛 내부의 모든 표면과 품목의 오염을 제거하여 멸균 환경을 조성하십시오.
2. 파란색 흡수 패드를 깔아주세요. 이 패드 위에 모든 조직 작업을 수행하십시오.
3. 생물 안전 캐비닛에 필요한 장비를 사용할 수 있고 적절하게 멸균되었는지 확인합니다(면도날, 혈청학적 피펫 팁, 혈청학적 피펫 건, 100μm 세포 여과기, p1000 팁, 1000μL 마이크로피펫, 15cm 원형 배양 접시 및 원뿔형 튜브).

2. 신장 전처리 준비

1. 칼슘 및 마그네슘이 함유된 Dulbecco의 DPBS(Phosphate Buffered Saline)에 0.75mg/mL 콜라겐분해효소 IV + 0.75mg/mL 디스파제 II를 첨가하여 신장 소화 용액을 준비합니다. 0.2μm 멸균 멤브레인 필터를 통해 용액을 여과합니다.
   참고: 완전한 인간 성인 신장의 경우 각각 ~35mL의 소화 용액(총 500mL)을 포함하는 약 14개의 50mL 원뿔형 튜브가 필요합니다.
2. 포도당이 없는 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)/F12 분말 4.425g, D-포도당 분말 0.5g, 중탄산나트륨 분말 0.6g, 100x 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충제 5mL(인슐린 1000mg/L 함유, 550mg/L 트랜스페린 및 0.67mg/L 아셀렌산나트륨 함유), 50μM 하이드로코르티손 0.5mL 및 100x 항생제-항진균 용액 5mL(페니실린 G 나트륨 10000단위/mL 함유, 10000μg/mL 스트렙토마이신 설페이트 및 0.85% 식염수 중 25μg/mL 암포테리신 B)를 500mL의 멸균 오토클레이브 초순수(유형 1) 물에 넣습니다. 0.2μm 멸균 멤브레인 필터를 통해 매체를 필터링합니다. 소 태아 혈청(FBS)을 해동하고 14개의 50mL 원뿔형 튜브에 10mL 부분 표본을 만듭니다.
3. 50mL 코니컬 튜브의 추가 세트를 모아 라벨을 붙입니다. 이 단계에서는 50mL 튜브 14개씩 3세트가 있는지 확인합니다.
4. 오비탈 셰이커를 37°C로 예열합니다.

3. 전체 신장에서 PTEC 분리

1. 멸균 기술을 사용하여 조직 샘플이 담긴 선적 컨테이너를 생물 안전 후드에 넣습니다. 상자에서 가방을 제거하고 후드에 넣기 전에 외부에 70% 에탄올을 뿌립니다.
2. 15cm의 둥근 배양 접시에 신장을 놓습니다. 나머지 미디어를 흡인/폐기합니다.
3. 멸균 면도날을 사용하여 주변 지방과 신낭을 제거합니다. 신낭에 부드럽게 점수를 매겨 중앙을 따라 슬릿을 만듭니다.
4. 핀셋을 사용하여 캡슐을 떼어내고 면도날을 사용하여 신장에 붙어 있는 지방을 잘라냅니다. 캡슐과 지방을 모두 15cm 배양 접시에 버립니다.
5. 수질에서 피질(~1cm 두께)을 분리합니다. 수질은 버립니다.
   참고: 피질은 수질에 비해 더 밝은 갈색-노란색을 띱니다.
6. 면도날을 사용하여 티슈를 슬러리처럼 보일 때까지 <1cm³ 조각으로 다집니다.
7. 접시에 소량의 신장 소화 완충액을 추가하고 슬러리를 35mL의 신장 소화 용액이 들어 있는 50mL 튜브의 첫 번째 세트로 옮깁니다. 고르게 분배하고 각 튜브에 대해 총 부피가 45mL를 초과하지 않도록 합니다.
8. 모든 튜브를 37°C 오비탈 쉐이커에 옮기고 튜브가 빠지지 않는 최고 속도로 30분 동안 배양합니다. 튜브에 70% 에탄올을 분무한 후 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 다시 옮깁니다.
9. 튜브를 뒤집어 섞고 더 큰 조직 조각이 바닥에 가라앉도록 합니다. 온전한 조직을 옮기지 않고 10mL의 소 태아 혈청(FBS)이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 가능한 한 많은 용액을 옮깁니다. 고르게 분배하고 각 튜브에 대해 총 부피가 45mL를 초과하지 않도록 합니다.
10. 튜브를 200g에서 7분 동안 원 심분리합니다. 튜브에 70% 에탄올을 분무한 후 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 다시 옮깁니다.
11. 상층액을 조심스럽게 흡입하십시오. 각 튜브에 10mL의 PTEC 매체를 추가하고 펠릿을 재현탁합니다.
12. 생성된 세포 현탁액을 100μm 세포 스트레이너를 통해 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 변형시킵니다.
13. 생성된 세포를 400g에서 5분 동안 여과액으로 원 심분리합니다. 튜브에 70% 에탄올을 분무한 후 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 다시 옮깁니다.
14. DPBS 5mL로 펠릿을 세척합니다. p1000 팁을 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.
15. 튜브를 400g에서 5분 동안 원 심분리합니다. 튜브에 70% 에탄올을 분무한 후 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 다시 옮긴 다음 상층액을 흡인합니다.
16. 3.15단계를 두 번 더 반복하여 총 세 번 세탁합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 15mL의 PTEC 배지로 재현탁하고 멸균 세포 배양 T-75 플라스크에 세포를 플레이트화합니다.
17. 플라스크에 적절하게 라벨을 붙이고 세포가 37°C 및 5% CO₂의 멸균 인큐베이터에서 성장하도록 합니다. PTEC가 첫 번째 배지가 교체되기 전에 48시간 동안 인큐베이터에서 방해받지 않고 자랄 수 있도록 합니다.

4. 미디어 변경

1. 플라스크에서 매체를 흡입합니다.
2. 예열된 DPBS 5mL로 셀을 세척합니다.
3. 예열된 PTEC 매체 5mL를 T-25 플라스크에 추가합니다.
4. 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
5. 플라스크가 계역 태징 또는 실험에 사용하기 위해 최소 70% 포화도에 도달할 때까지 48시간마다 매체를 교체하십시오.

5. PTEC 패스에이징

1. 플라스크에서 매체를 흡입합니다. 각 T-25 플라스크에 예열된 0.05% 트립신-EDTA 5mL를 추가하고 트립신이 분해될 수 있도록 37°C에서 1-2분 동안 배양합니다.
2. 세포가 분리되면 미리 데워진 정의된 트립신 억제제 용액 5mL로 트립신을 중화합니다.
3. 플라스크에 아직 붙어 있는 세포를 제거하기 위해 5회 재현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 400g에서 5분 동안 원심분리합니다.
4. 상층액을 흡입하십시오.
   참고: PTEC를 동결 보존하려면 여기에서 중지하고 해당 프로토콜로 이동합니다.
5. 튜브당 14mL의 PTEC 배지로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포 현탁액을 T-75 플라스크(플라스크당 튜브 1개)로 옮깁니다.
6. T-쉐이크를 수행하여 플라스크 전체에 세포를 고르게 분포시킵니다. 세포를 모니터링하고 48시간마다 매체를 교체하십시오.

6. PTEC를 동결 보존하는 것

1. 5.6단계 후, 각 15mL 코니컬 튜브에 대해 2mL의 10% DMSO 및 90% 저포도당 PTEC 배지에 세포 펠릿을 재현탁하고 1mL를 하나의 극저온으로 옮깁니다.
2. 냉동 연료를 온도 조절이 가능한 세포 동결 용기로 옮기고 용기를 -80°C 냉동고에 24시간 동안 보관합니다. -80°C에서 24시간 후 냉동 보관을 위해 액체 질소 탱크로 옮깁니다.

7. PTEC 해동

1. 37°C 수조에서 -80°C에서 바이알을 해동합니다. 실온(RT)에서 해동하지 마십시오. 바이알이 부분적으로 해동되면(작은 얼음 조각이 보여야 함) 10mL의 예열된 PTEC 배지가 있는 15mL 원뿔형 튜브에 1mL의 세포 현탁액을 추가합니다.
2. 400g에서 5분 동안 세포 현탁액 을 스핀다운합니다. 상층액을 흡인하고 5mL의 예열된 저포도당 PTEC 배지에 세포를 재현탁합니다.
3. 5mL 세포 현탁액을 T-25 플라스크로 옮기고 T-쉐이크를 수행하여 플라스크 전체에 세포를 고르게 분포시킵니다. 여기에서 미디어 변경에 대한 섹션 4를 따릅니다.

8. MPS 장치를 유형 I 콜라겐 매트릭스로 코팅

1. MPS 장치에서 PBS를 흡인하고 패키지에서 장치를 제거합니다. 의료용 물티슈로 장치를 닦고 원하는 대로 라벨을 붙입니다.
2. MPS 장치를 15cm 원형 배양 접시에 넣고 사용할 준비가 될 때까지 4°C에 놓습니다. MPS 장치에 습기가 묻지 않도록 접시 바닥에 의료용 물티슈를 보관하십시오.
3. 콜라겐 I 주사에 사용할 때까지 -20°C에서 부착된 22G Luer-Lok 바늘 둔기가 있는 1mL 주사기를 보관하십시오.
4. 채워야 하는 MPS 장치 4개마다 15mL 원뿔형 튜브 1개를 얼음 위에 올려 놓습니다. 15mL 원뿔형 튜브마다 바늘 뭉툭한 바늘이 부착된 1mL 주사기 1개를 사용합니다.
5. 생물 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 MPS 장치의 모든 포트를 엽니다. 각 나사 밸브 상단의 슬릿이 포트와 수직으로 정렬되었는지 확인하십시오.
6. 1mL 주사기/바늘 무딘 어셈블리를 사용하여 1mL의 에탄올이 든 ECM 챔버를 포트 #1, #3 및 #6으로 세척합니다. 에탄올을 흡입하고 포트 #2, #4 및 #5에서 MPS 디바이스를 관통하지 않도록 완전히 증발하도록(최소 30초) 합니다.
7. MPS 장치를 다시 4°C에 놓고 PTEC 매체, M199 및 1N NaOH를 얼음 위에 둡니다.
8. 표 1(필요에 따라 스케일)에 따라 약 4개의 MPS 장치에 대한 Type I 콜라겐 혼합물 1mL에 대한 매트릭스 조성을 계산합니다. 생물 안전 캐비닛에서 위의 계산에 따라 PTEC 매체, M199 및 1 N NaOH를 순서대로 혼합하고 모든 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
9. 1mL 주사기가 있는 Type I 콜라겐 스톡을 미리 만들어진 혼합물에 조심스럽게 추가합니다. 콜라겐 혼합물이 안정된 연어색-분홍색이 될 때까지 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
10. 튜브를 짧게 원심분리하여 바닥에 용액을 수집합니다. 용액에 기포가 없는지 확인하십시오.
11. 미리 냉각된 1mL 주사기와 22G Luer-Lok 바늘 둔기 및 MPS 장치를 생물 안전 캐비닛과 얼음 위에 놓습니다. 미리 냉각된 1mL 주사기에 콜라겐 혼합물을 채우고 거품이 생기지 않도록 합니다.
12. 콜라겐 용액을 냉각 장치 챔버의 포트 #1, #3 및 #6에 매우 천천히 부드럽게 주입합니다. 포트가 아래를 향하도록 장치를 수직으로 잡고 기포가 포트 #2, #4 및 #5 밖으로 흐를 수 있도록 합니다.
    참고: 포트 #2, #4 및 #5에 콜라겐 혼합물의 방울이 있어야 하며, 이는 챔버가 완전히 코팅되었음을 나타냅니다.
13. 주사기를 제거하고 얼음을 탄 15mL 튜브에 다시 넣습니다. 포트 #2, #4 및 #5의 나사 밸브를 돌려 채워진 칩을 밀봉하고 칩을 4°C에서 30분 동안 배양 접시에 놓습니다.
14. 30분 후, 접시가 있는 칩을 멸균 방식으로 생물 안전 캐비닛에 옮기고 칩을 균일하고 개별적으로 펴서 균일하게 예열되도록 합니다.
15. 물에 적신 의료용 물티슈를 각 접시에 넣고(콜라겐 I 매트릭스가 마르거나 MPS 장치 벽에서 벗겨지는 것을 방지하기 위해) 반투명 유연한 밀봉 필름으로 접시를 밀봉합니다. 콜라겐이 RT에서 하룻밤 동안 중합되도록 합니다.

9. MPS 장치에서 ECM으로 Type IV Collagen을 사용하는 관형 내강 생성

1. 튜브를 초순수(유형 1) 물과 순수 에탄올로 세척하여 C-flex 튜브를 살균한 다음 전체 튜브 라인을 고압 멸균합니다.
2. 생물 안전 캐비닛에서 유형 I 콜라겐으로 채워진 MPS 장치의 모든 포트(스크류 밸브는 포트와 수직임)를 열고 포트 #1, #3 및 #6에서 돌출된 와이어를 제거하여 관형 루멘을 형성합니다.
3. 금속 커플러를 포트 #1, #3 및 #6에 삽입합니다.
4. PTEC 배지에 5μg/mL IV형 콜라겐 10mL 용액을 준비합니다.
5. 포트 #24, #1 및 #3에서 돌출된 금속 둔기에 6인치의 멸균 C-flex 튜브를 삽입합니다.
6. 22-G Luer-Lok 니들 블런트가 장착된 1mL 주사기에 0.5mL의 IV형 콜라겐 용액을 채웁니다.
7. 채워진 주사기를 주사기 주입 펌프에 놓고 포트 #1의 튜브를 주사기에 연결합니다. 포트 #3 및 #6에 대해 이 단계를 반복합니다.
8. 주사기 펌프를 사용하여 IV형 콜라겐 용액을 30분 동안 10μL/분의 속도로 MPS 포트로 전달합니다. 포트가 주입되면 콜라겐이 37°C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 응고된 후 다음 날 사용하십시오.
   참고: IV형 콜라겐 코팅 MPS 장치는 4°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.

10. MPS 장치에서 기본 PTEC 시딩

1. 현미경으로 MPS 장치를 검사하여 루멘이 올바르게 형성되었는지 확인합니다.
2. 5mL의 에탄올이 들어 있는 15mL 튜브에 22G 바늘이 있는 사전 멸균된 22mL 주사기를 놓습니다.
3. 5.1단계에 따라 T-25 플라스크에서 15mL 원뿔형 튜브에 담긴 PTEC 세포 펠릿을 얻습니다. 5.3으로. 80μL의 PTEC 배지를 세포 펠릿에 추가하고 부드럽게 재현탁합니다.
4. 세포 현탁액을 1.5mL 마이크로튜브로 옮깁니다.
5. 인큐베이터에서 MPS 장치가 들어 있는 접시를 제거하고 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 포트 #2, #4, #5를 닫고 나사 밸브를 포트까지 수평으로 돌립니다.
6. PTEC 함유 튜브를 부드럽게 튕겨 세포를 재현탁시킵니다. 주사기에 셀을 채우고 스크류 밸브 포트에서 가장 먼 주입 포트에 바늘을 삽입합니다.
7. 주사기의 플런저를 조심스럽게 눌러 세포를 주입합니다. 현미경으로 주입 후 세포를 시각화합니다.
   참고: 세포는 내강을 통해 이동해야 합니다. 내강에서 세포가 관찰되지 않으면 바늘이 주입 포트에 단단히 삽입되었는지 확인하고 필요한 경우 바늘을 다시 삽입하십시오. 세포의 전체 주사기는 장치의 3 루멘을 모두 채울 수 있습니다.
8. 다른 두 포트로 세포 주입을 계속합니다. 주입 후 포트 #2, #4 및 #5를 닫고 MPS 장치를 37°C 인큐베이터에 다시 넣습니다. 세포가 중력에 의해 내강 밖으로 이동하지 않도록 플레이트를 수평으로 유지하십시오.
9. 추가 MPS 장치의 경우 주사기를 비운 후 에탄올로 주사기를 세척하고 세포를 추출하기 전에 DPBS로 세척합니다.
10. MPS 장치를 밤새 방해받지 않고 그대로 두십시오.
11. 다음 날에는 MPS 장치를 주사기 펌프에 연결합니다.
12. 생물 안전성 작업대에서 5mL 주사기를 PTEC 배지로 채웁니다. 그런 다음 주사기에 부착된 24인치 C-flex 튜빙 섹션에 22G Luer-Lok 팁 블런트를 끼웁니다.
13. PTEC 매체가 장착된 주사기를 주사기 펌프에 넣습니다. 라인을 프라이밍하여 기포를 제거합니다.
14. 프라이밍된 튜빙 라인을 포트 #1, #3 및 #6에 연결하고 스크류 밸브를 수직 위치로 돌려 매체 흐름을 도입합니다.
15. 실린지 펌프 유량을 0.5μL/min으로 설정합니다. MPS 장치가 있는 접시를 37°C 인큐베이터에 다시 넣고 실험을 시작하기 전에 세포가 지속적인 배지 관류에서 세뇨관을 형성하도록(5-7일 이내) 합니다.

2D 배양에서 시간 경과에 따른 고립된 1차 PTEC의 형태 및 포화도
신장 피질에서 분리된 후, PTEC는 첫 번째 배지 변경 전에 최소 48시간 동안 방해받지 않고 성장할 수 있었습니다. 세포를 배양한 후 약 일주일 후에 배양 플라스크 전체에 걸쳐 균일한 상피, 조약돌 같은 형태를 가진 작은 배치의 PTEC가 나타나야 합니다(그림 1A, B). 다른 공여자의 PTEC의 성장 속도에 따라 세포 밀도는 배양 10일 후(평균적으로) 약 50%-60%에 도달해야 합니다(그림 1C). 배양에서 약 14일이 지나면 세포가 완전한 포화도에 도달해야 하며(그림 1D) MPS 장치에서 계대배양, 동결 보존 또는 파종할 준비가 됩니다. 평균적으로 인간의 신장 전체는 PTEC로 가득 찬 14개의 T-75 플라스크를 제공할 수 있습니다. 오염을 방지하려면 멸균 기술을 사용하고 배양 기간 동안 배지에 항생제를 포함하는 것이 필수적입니다.

MPS 장치에 PTEC 주입
MPS 장치는 Type I 및 Type IV 콜라겐으로 코팅된 후 3D 형식으로 PTEC를 배양할 준비가 된 것입니다. 비디오 1과 그림 2에서 볼 수 있듯이 PTEC는 주입 포트에서 내강으로 흐르는 것을 볼 수 있습니다(그림 3). 관찰된 세포가 없으면 주사와 주사기 바늘이 무뎌졌는지 누출 또는 정렬 불량을 나타낼 수 있습니다. 이전에 발표된 연구^17-28에서 알 수 있듯이 PTEC 세뇨관은 MPS 장치에 주입된 후 약 일주일 후에 형성됩니다.

그림 1: 시간 경과에 따른 고립된 원발성 근위세뇨관 상피 세포(PTEC)의 형태 및 밀도. 단일 성인 신장에서 분리된 PTEC는 일반적으로 14개의 T-75 세포 배양 플라스크에 도금됩니다. (A) 이 대표적인 신장의 경우, 배양 6일 후, 상피 및 조약돌과 같은 모양의 PTECs(빨간색으로 표시)의 작은 패치가 세포 배양 플라스크 전체에서 관찰될 수 있었고 혈액 세포는 여전히 시각적으로 존재했습니다. (B) 8일째에, 배지 변화 후 혈액 세포가 감소된 정의된 PTEC 패치가 나타났습니다. (C) 포화도는 평균 10일째까지 50-60%에 도달했고 (D) 분리 후 약 2주 후에 약 100%에 도달했으며 계대, 동결 보존 또는 MPS 장치에서 사용할 준비가 되어 있습니다. 이미지는 현미경을 사용하여 4배 배율로 촬영했습니다. 스케일 바는 100μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: MPS 플랫폼에서 PTEC를 사용하여 근위세뇨관 모델을 생성하기 위한 워크플로우 개요. 이 순서도는 MPS 장치에서 PTEC를 사용하기 위한 일반적인 워크플로를 설명합니다. 일반적으로 인간 신장에서 PTEC를 분리하여 성숙하고 안정적인 체외 3D 근위세뇨관을 만드는 데 약 3주가 걸립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: MPS 장치에 주입된 후의 PTEC. 콜라겐 I 및 IV로 MPS 장치에서 내강을 형성한 후 PTEC를 주입할 수 있습니다. 이 그림과 비디오에서 볼 수 있듯이 PTEC를 올바르게 주입한 후 주입 포트에서 내강을 통해 세포가 흐르는 것을 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 1mL의 Type I 콜라겐 MPS 코팅 혼합물을 준비하기 위한 샘플 계산. 필요한 콜라겐 스톡의 양은 스톡 농도에 따라 조정해야 합니다. PTEC 매체의 부피를 조정하여 총 부피를 약 1mL로 높이거나 낮출 수 있습니다.

비디오 1: 주입 포트에서 내강으로 흐르는 PTEC. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

MPS(Organ-on-a-Chip) 기술은 인체 생리학의 주요 측면을 요약할 수 있는 관련성이 높은 체외 플랫폼을 제공하여 약물 개발 및 독성 평가에서 동물 모델에 대한 의존도를 줄입니다. 최근 FDA 현대화법 2.0(2022)은 임상시험용 신약 신청에 다른 대안 중에서 MPS를 포함할 수 있도록 허용했습니다²⁹. 이 프로토콜은 인간 근위세뇨관 기능을 모델링하고 생체이물이물(xenobiotics)에 대한 신장 독성학적 반응을 평가하는 것을 목표로 인간 기증자 피질 조직에서 PTEC를 해리하고 MPS 플랫폼에서의 후속 사용을 위한 표준 운영 절차를 자세히 설명합니다(그림 2).

높은 PTEC 생존력을 유지하기 위한 중요한 요소는 온열 허혈 시간(WIT)을 최소화하는 것입니다. WIT가 1시간 미만인 신장을 사용하는 것이 좋습니다. 24시간 미만의 법인세가 이상적이지만 신장 가용성이 제한된 경우 최대 36시간까지 견딜 수 있습니다. 또 다른 중요한 단계는 적절한 조직 준비인데, 여기에는 외막, 내장 지방을 제거하고 피질과 수질을 철저히 분리하여 PTEC의 순도를 극대화하는 것이 포함됩니다. 우리는 콜라겐 분해 효소 I 단독이 아닌 콜라겐 분해 효소 IV 및 디스 페이스로 조직을 소화하는 것이^{10 , 11 , 30 , 31} , 세포막의 무결성을 보존하는보다 부드러운 해리를 제공한다는 것을 발견했습니다. 또한, 다른 혼합물 또는 DNase의 포함은 현탁액에 상당한 세포 파편이나 세포 응집이 있을 때 도움이 될 수 있습니다. 또한 조직을 1cm³ 미만의 조각으로 다지고 얼음 또는 소화 직후 4 °C에서 차갑게 보관하여 과도한 세포 손상을 방지하는 것이 중요합니다.

트랜스웰과 같은 정적 배양 플랫폼에서 PTEC를 단기간 적용하는 경우, 조직 처리 중 대부분의 적혈구를 제거하는 것이 유리 헤모글로빈으로 인한 산화 스트레스를 예방하는 데 중요합니다³². 혈액 세포를 포함한 신장 피질의 다양한 세포 유형은 Percoll gradient³³을 사용하여 분리할 수 있습니다. 대안적으로, 혈액 세포는 염화암모늄-기반 완충액(³⁴)을 사용하여 선택적으로 용해될 수 있다. 반면에, MPS 장치에서 PTEC를 사용할 때, 이러한 PTEC는 융합될 때까지 표준 배양 형식으로 성장해야 하기 때문에 중간 수준의 오염 혈액 세포가 허용될 수 있습니다. 또한 1시간 이상 소화를 오래 하는 것은 단순히 항균제를 첨가하는 것만으로는 해결되지 않을 수 있는 오염 위험을 크게 증가시킬 수 있으므로 피해야 합니다. 30분 분해는 일반적으로 적절한 단일 세포 현탁액을 제공하며, 수율이 예상보다 낮으면 PBS와 같은 등장성 완충액으로 소화된 조직을 한두 번 더 세척하면 부분적으로 소화된 조직에 달라붙는 PTEC를 제거할 수 있습니다. 세포 생존율이 낮거나 순응도가 지연되는 경우, 분해를 재검사하고, WIT를 최소화하고, 배양 배지 조건(호르몬 정의, 무혈청, 1g/L 포도당)이 올바른지 확인하는 것이 좋습니다. 분해 후 단계가 얼음 위 또는 4°C(도금 때까지)에서 수행되는지 확인하는 것도 세포 스트레스를 줄이는 데 필수적입니다. MPS 플랫폼에서 후속 세포 파종을 위해 PTEC가 구조화된 세뇨관을 형성할 수 있도록 균일한 ECM을 유지하기 위해 콜라겐 용액으로 코팅할 때 기포를 도입하지 않는 것이 중요합니다. MPS 장치의 다구획 특성으로 인해 오염 위험이 증가하기 때문에 멸균 기술은 MPS 설정 중에 특히 중요합니다.

이 프로토콜의 주요 제한 사항 중 하나는 기증자 조직에 의존한다는 것이며, 이는 품질과 가용성이 다를 수 있습니다. WIT 또는 높은 CIT가 장기화되면 생존 가능한 세포 수율이 감소하고 실험 재현성이 제한될 수 있습니다. 또 다른 한계는 일차 PTEC의 수명이 유한하다는 것인데, 이는 일반적으로 세포 노화가 발생하기 전에 3-4 계대 동안 유지될 수 있습니다. 마지막으로, 이 방법은 신장 피질의 소화 후 PTEC와 원위 세뇨관 상피 세포(DTEC)를 모두 포함하는 혼합된 세포 집단을 초기에 생성합니다. 이는 단기 애플리케이션에는 적합하지 않을 수 있지만 목적은 MPS 플랫폼에서 나중에 사용할 수 있도록 PTEC를 전파하는 것입니다. 우리는 혈청이 없는 정의된 배양 배지를 사용하기 때문에 훨씬 낮은 비율의 다른 세포 유형, 즉 중간막 세포 및 섬유아세포는 상당한 속도로 성장하지 않습니다. 또한, 유세포 분석 및 면역조직화학(IHC) 염색을 사용하여 이 방법을 사용하여 배양된 일차 세포의 대다수가 PTEC이며, 소수의 세포는 신장 상피 세포 마커의 염색 데이터를 기반으로 DTEC 마커를 발현한다는 것을 입증했습니다. 특히, 3D 배양된 PTEC는 네프릴리신(CD10) 및 알라닌 아미노펩티다아제(CD13)에 대한 PTEC 유세포 분석 표현형을 가진 편광 세뇨관을 형성합니다⁽²³). IHC 염색 데이터는 또한 2D 및 3D 형식의 이러한 세포가 PTEC 마커 lotus tetragonolobus lectin(LTL), sodium-glucose co-transporter 2(SGLT2) 및 aquaporin-1(AQP1)을 발현하며, prominin-2(PROM2), uromodulin(UMOD) 및 aquaporin 2(AQP2)를 포함한 원위 네프론 마커의 발현을 최소화한다는 것을 보여주었습니다¹⁶. 이는 DTEC가 2D 배양에서 PTEC에 대해 역분화되고 전분화되는 것으로 나타났기 때문에 예상된 결과입니다³⁰.

정적 신세포 배양과 불멸 세포주가 널리 사용되지만, 생리학적 수준의 전단 응력과 신장에서 발견되는 3차원 구조를 복제하지 못하는 경우가 많습니다. 대조적으로, 3D MPS 플랫폼은 유동 및 ECM 스캐폴드를 통합하여 생체 내 근위세뇨관 환경을 더 잘 근사화하여 이전에 보여준 바와 같이 신독성 평가에 대한 예측 정확도를 향상시킵니다 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27^,28. 불멸화된 계통 대신 1차 PTEC를 사용하면 이러한 세포가 생체 이물 대사 및 제거에 필수적인 주요 수송체와 효소를 유지하기 때문에 생리학적 관련성이 향상됩니다. 신중한 조직 취급, 최적화된 효소 분해 및 적절한 배양 조건의 조합은 이 MPS 방법이 전임상 신장 연구의 중개 가치를 높이는 동시에 동물 실험을 줄인다는 가장 중요한 목표에 부합하도록 보장합니다²⁹.

이 프로토콜은 미세생리학 장치에서 강력한 인간 근위세뇨관 모델을 확립할 수 있도록 하여 약물 스크리닝, 신독성 예측 및 특히 신장 제거 메커니즘, 약물 수송체 상호 작용 및 신장 손상 경로에 대한 신장 병태생리학에 대한 자세한 조사를 용이하게 합니다. 이러한 주요 인간 기반 MPS 접근 방식은 동물 모델의 사용을 줄이거나 대체함으로써 3R 원칙(감소, 개선, 대체)을 더욱 발전시키고 약물 개발 파이프라인을 가속화할 수 있습니다. 동시에 환자별 MPS는 맞춤형 약물 스크리닝 및 독성 프로파일링과 같은 정밀 의학 응용 분야에 대한 약속을 가지고 있습니다. 전반적으로, 인간 기증자 조직에서 PTEC를 분리하고 배양하기 위한 이 재현 가능한 방법은 세포 생존력과 기능을 보존하는 데 중요한 단계를 제공하며, 3D MPS 플랫폼과 결합될 경우 독성학 연구 및 약물 발견을 발전시키는 동시에 체외 신장 모델의 예측 능력을 크게 향상시킵니다.

저자는 이 연구와 관련된 이해 상충이나 재무 공개가 없음을 선언합니다.

이 작업의 일부는 NASA 계약 80ARC023CA001, NCATS(National Center for Advancing Translational Sciences)(U2CTR004867, UH3TR000504, UG3TR002158), NCATS와 CASIS(Center for the Advancement of Science in Space)(UG3TR002178), NIEHS(National Institute of Environmental Health Sciences)(P30ES00703), National Institute of General Medical Sciences(T32GM007750)의 지원을 받았으며, Northwest Kidney Centers가 Kidney Research에 제공한 무제한 기부 연구소 및 워싱턴 대학교 약학 대학(Ji-Ping Wang Award 및 Bradley Fellowship).