Aislamiento de células epiteliales primarias del túbulo proximal humano y su uso en la creación de un modelo microfisiológico del túbulo proximal renal

Presentamos un protocolo optimizado para el procesamiento de riñones humanos completos para aislar y cultivar células epiteliales primarias del túbulo proximal renal y la aplicación de estas células en una plataforma tridimensional, microfluídica y microfisiológica para recapitular el túbulo proximal renal.

La enfermedad renal afecta a más de 850 millones de personas en todo el mundo, incluidos 37 millones de estadounidenses. Los factores de riesgo para la enfermedad renal crónica incluyen influencias ambientales, predisposiciones genéticas, afecciones médicas coexistentes y antecedentes de lesión renal aguda. Estos factores a menudo tardan meses o años en desarrollarse, lo que complica los estudios longitudinales de la etiología y la fisiopatología de la enfermedad. Se necesitan modelos renales avanzados para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de la enfermedad y mejorar la predicción de la nefrotoxicidad en el desarrollo de fármacos. Las células epiteliales de los túbulos proximales (PTEC) en el riñón desempeñan un papel fundamental en la eliminación de xenobióticos y toxinas, así como en la reabsorción de nutrientes esenciales. Hemos demostrado previamente que las plataformas tridimensionales (3D) del sistema microfisiológico (MPS), pobladas con PTEC primarios aislados, se pueden utilizar para investigar las interacciones renales con los fármacos, evaluar la nefrotoxicidad de los compuestos y predecir la eliminación de los fármacos. Aquí, presentamos protocolos para aislar y cultivar PTECs primarios de riñones humanos completos y para sembrarlos en una plataforma MPS 3D que imita la fisiología renal in vivo . Este protocolo permite realizar estudios a largo plazo que respalden la viabilidad de PTEC, la morfología fisiológica y la polarización funcional de las proteínas transportadoras clave en dispositivos MPS durante un máximo de 6 meses.

El riñón desempeña un papel fundamental en la eliminación de una amplia gama de xenobióticos, toxinas y compuestos endógenos del cuerpo. Esto se logra filtrando la sangre para eliminar los productos de desecho y regulando el equilibrio electrolítico, los niveles de líquidos y el pH. Cada riñón humano contiene alrededor de un millón de nefronas, las unidades estructurales y funcionales del riñón^. Dentro de estas nefronas, las células epiteliales especializadas en los túbulos proximales, conocidas como células epiteliales de los túbulos proximales (PTEC), son responsables de reabsorber moléculas esenciales como la glucosa, los aminoácidos y los iones, así como de secretar sustratos de fármacos y sustancias potencialmente tóxicas en la orina ^2,3,4. En algunos casos, los PTEC también pueden reabsorber compuestos de la orina de vuelta^{al torrente} sanguíneo. Debido a su papel crítico en las interacciones entre fármacos y toxinas, los PTEC primarios aislados de riñones humanos proporcionan una valiosa herramienta para estudiar las interacciones renales entre fármacos (DDI) y evaluar la nefrotoxicidad de los compuestos.

La nefrotoxicidad inducida por fármacos plantea un importante desafío clínico, ya que puede conducir a una lesión renal aguda y a una enfermedad renal crónica⁵. Por lo tanto, una comprensión más profunda de la fisiología del túbulo proximal renal es esencial para predecir y caracterizar con precisión el potencial nefrotóxico de los fármacos y las toxinas. Los modelos in vitro tradicionales, incluidas las líneas celulares renales inmortalizadas (por ejemplo, RPTEC-TERT1, HK-2), tienen limitaciones para imitar la compleja estructura y función de los túbulos proximales humanos⁶, que operan bajo flujo laminar dinámico (con un número de Reynolds bajo) y una matriz extracelular (MEC) uniforme in vivo ^7,8. Además, los modelos bidimensionales (2D) tradicionales a menudo fallan en expresar funcionalmente los principales transportadores renales (por ejemplo, transportador de aniones orgánicos 1 y 3 (OAT1 y OAT3), transportador de cationes orgánicos 2 (OCT2)) debido a la rápida degradación e internalización de estas proteínas 6,9,10,11 . Los modelos animales, si bien son informativos, pueden no replicar completamente la fisiología renal humana y, a menudo, carecen de traducibilidad debido a las diferencias de las especies en la expresión y actividad de los transportadores¹². Por ejemplo, mOct1 se expresa basolateralmente en los PTEC de ratón, mientras que en los humanos, la expresión de la proteína de membrana de OCT1 en el riñón es indetectable^13,14.

Los avances en los sistemas microfisiológicos (MPS) y las tecnologías de órganos en un chip han permitido a los investigadores desarrollar modelos in vitro que imitan de cerca la arquitectura tridimensional (3D) y las condiciones^{dinámicas de} flujo de fluidos de los órganos humanos. Nuestro grupo ha caracterizado previamente dos modelos de MPS con PTECs^16,17, y ha utilizado estos modelos para realizar estudios de toxicidad 18,19,20 y predecir con precisión la disposición del fármaco²¹. El uso de PTECs primarios en estos modelos proporciona ventajas significativas debido a su capacidad para retener las características funcionales observadas in vivo.

Aquí, presentamos los protocolos para el aislamiento de PTECs humanos de un riñón humano intacto obtenido de un donante fallecido a través de una organización de procuración de órganos aprobada por la United Network for Organ Sharing (UNOS) y la aplicación de estos PTECs humanos cultivados dentro de una plataforma MPS.

Todo el trabajo se llevó a cabo de acuerdo con las pautas de manejo de tejidos humanos de la Universidad de Washington. Los donantes adecuados cumplen con los siguientes requisitos: menos de 36 h de tiempo de isquemia fría (CIT), sin antecedentes conocidos de enfermedades renales, diálisis o cualquier otra condición médica (por ejemplo, diabetes mellitus tipo 1 o 2, hepatitis B, hepatitis C, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), meningitis viral/bacteriana, infección por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, sífilis, sepsis o Covid-19). Los riñones humanos completos utilizados en este estudio se obtuvieron a través de una OPO aprobada por UNOS.

1. Preparación de la cabina de bioseguridad

1. Rocíe el capó con etanol al 70%. Descontamine todas las superficies y elementos dentro del gabinete para crear un ambiente estéril.
2. Coloque almohadillas absorbentes azules. Realice todo el trabajo de papel sobre estas almohadillas.
3. Asegúrese de que el equipo necesario esté disponible en la cabina de bioseguridad y debidamente esterilizado (hojas de afeitar, puntas de pipeta serológica, pistola de pipeta serológica, filtros de células de 100 μm, puntas p1000, micropipeta de 1000 μL, placas de cultivo circulares de 15 cm y tubos cónicos).

2. Preparación del preprocesamiento del riñón

1. Prepare la solución de digestión renal añadiendo 0,75 mg/mL de colagenasa IV + 0,75 mg/mL de dispasa II en la solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco con calcio y magnesio. Filtre la solución a través de un filtro de membrana estéril de 0,2 μm.
   NOTA: Para un riñón humano adulto completo, se requieren aproximadamente 14 tubos cónicos de 50 ml, cada uno de los cuales contiene ~ 35 ml de solución de digestión (un total de 500 ml).
2. Prepare los medios PTEC añadiendo 4,425 g de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 en polvo sin glucosa, 0,5 g de D-glucosa en polvo, 0,6 g de bicarbonato de sodio en polvo, 5 mL de suplemento de insulina-transferrina-selenio 100x (que contiene 1000 mg/L de insulina, 550 mg/L de transferrina y 0,67 mg/L de selenito de sodio), 0,5 mL de hidrocortisona de 50 μM y 5 mL de solución antibiótica-antimicótica 100x (que contiene 10000 unidades/mL de penicilina G sódica, 10000 μg/mL de sulfato de estreptomicina y 25 μg/mL de anfotericina B en solución salina al 0,85%) en 500 mL de agua ultrapura estéril esterilizada en autoclave (Tipo 1). Filtre el medio a través de un filtro de membrana estéril de 0,2 μm. Descongele el suero fetal bovino (FBS) y haga 10 mL de alícuotas en 14 tubos cónicos de 50 mL.
3. Reúna y etiquete un juego adicional de tubos cónicos de 50 ml. En este paso, asegúrese de que haya 3 juegos de tubos de 14 50 mL.
4. Precalentar el agitador orbital a 37 °C.

3. Aislamiento de PTECs de todo el riñón

1. Utilizando una técnica estéril, coloque el contenedor de envío con la muestra de tejido en la campana de bioseguridad. Retire la bolsa de la caja y rocíe el exterior con etanol al 70% antes de ponerla en la campana.
2. Coloque el riñón en una placa de cultivo redonda de 15 cm. Aspirar/desechar los medios restantes.
3. Retire la grasa circundante y la cápsula renal con hojas de afeitar estériles. Marque suavemente la cápsula renal para crear una hendidura en el centro.
4. Con unas pinzas, retira la cápsula y usa hojas de afeitar para cortar la grasa adherida al riñón. Deseche tanto la cápsula como la grasa en otra placa de cultivo de 15 cm.
5. Separe la corteza (~1 cm de grosor) de la médula. Deseche la médula.
   NOTA: La corteza tiene un color amarillo parduzco más claro en comparación con la médula.
6. Con una cuchilla de afeitar, pica el pañuelo en <1 cm³ pedazos hasta obtener una apariencia similar a una suspensión.
7. Agregue una pequeña cantidad de tampón de digestión renal en el plato y transfiera la suspensión al primer juego de tubos de 50 ml que contiene 35 ml de la solución de digestión renal. Distribuir uniformemente y no exceder un volumen total de 45 mL por cada tubo.
8. Transfiera todos los tubos al agitador orbital de 37 °C e incube durante 30 minutos a la velocidad más alta que no provoque la caída de los tubos. Transfiera los tubos de nuevo a la cabina de bioseguridad después de rociarlos con etanol al 70%.
9. Invierta los tubos para mezclar y permitir que los trozos más grandes de tejido se asienten en el fondo. Transfiera la mayor cantidad posible de solución a los tubos cónicos de 50 mL que contienen 10 mL de suero fetal bovino (FBS) sin transferir tejido intacto. Distribuir uniformemente y no exceder un volumen total de 45 mL por cada tubo.
10. Centrifugar los tubos a 200 g durante 7 min. Vuelva a colocar los tubos en la cabina de bioseguridad después de rociarlos con etanol al 70%.
11. Aspire con cuidado el sobrenadante. Agregue 10 mL de medio PTEC en cada tubo y vuelva a suspender los gránulos.
12. Cuele las suspensiones celulares resultantes a través de filtros celulares de 100 μm en nuevos tubos cónicos de 50 mL.
13. Centrifugar la célula resultante filtrada a 400 g durante 5 min. Vuelva a colocar los tubos en la cabina de bioseguridad después de rociarlos con etanol al 70%.
14. Lave los pellets con 5 mL de DPBS. Vuelva a suspender los gránulos con una punta p1000.
15. Centrifugar los tubos a 400 g durante 5 min. Vuelva a colocar los tubos en la cabina de bioseguridad después de rociarlos con etanol al 70% y, a continuación, aspire los sobrenadantes.
16. Repita el paso 3.15 dos veces más para un total de tres lavados. A continuación, vuelva a suspender los gránulos celulares con 15 mL de medio PTEC y coloque las células en matraces T-75 de cultivo celular estériles.
17. Etiquete los matraces adecuadamente y deje que las células crezcan en una incubadora estéril a 37 °C y 5% de CO₂. Deje que los PTEC crezcan sin ser perturbados en la incubadora durante 48 h antes del primer cambio de medio.

4. Cambios en los medios de comunicación

1. Aspire los medios de los matraces.
2. Lave las celdas con 5 mL de DPBS precalentado.
3. Añada 5 mL de medios PTEC precalentados a los matraces T-25.
4. Regrese el matraz a la incubadora.
5. Cambie el medio cada 48 h hasta que el matraz alcance al menos el 70% de confluencia para su paso o uso en experimentos.

5. Pasar los PTEC

1. Aspire el medio del matraz. Añadir 5 mL de tripsina-EDTA precalentado al 0,05% en cada matraz T-25 e incubar a 37 °C durante 1 a 2 minutos para permitir la digestión de la tripsina.
2. Una vez que las células se hayan desprendido, neutralice la tripsina con 5 mL de solución inhibidora definida de tripsina precalentada.
3. Vuelva a suspender 5 veces para desalojar las células que aún estén adheridas al matraz. A continuación, transfiera la suspensión de la célula a tubos cónicos de 15 ml y centrifugue a 400 g durante 5 min.
4. Aspira el sobrenadante.
   NOTA: Deténgase aquí para criopreservar PTEC y pasar a ese protocolo.
5. Resuspenda los gránulos celulares con 14 mL de medio PTEC por tubo. Trasvasar las suspensiones de las celdas a matraces T-75 (1 tubo por matraz).
6. Realice un batido en T para distribuir las células por el matraz de manera uniforme. Monitoree las celdas y cambie los medios cada 48 h.

6. Criopreservación de PTECs

1. Después del paso 5.6., vuelva a suspender los gránulos celulares en 2 mL de medios PTEC con 10% de DMSO y 90% de baja glucosa por cada tubo cónico de 15 mL, y transfiera 1 mL a un criovial.
2. Transfiera los crioviales a un recipiente de congelación celular que permita la congelación a temperatura controlada y coloque el recipiente en un congelador de -80 °C durante 24 h. Después de 24 h a -80 °C, transfiera los crioviales a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

7. Descongelación de PTEC

1. Descongele el vial a -80 °C en el baño de agua a 37 °C. No descongele a temperatura ambiente (RT). Una vez que el vial se haya descongelado parcialmente (debe haber un pequeño trozo de hielo visible), agregue 1 mL de suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL con 10 mL de medio PTEC precalentado.
2. Girar la suspensión celular a 400 g durante 5 min. Aspire el sobrenadante y resuspenda las células en 5 mL de medio PTEC precalentado con baja glucosa.
3. Transfiera la suspensión de celdas de 5 mL a un matraz T-25 y realice una agitación en T para distribuir las celdas por el matraz de manera uniforme. A partir de aquí, siga la sección 4 para ver los cambios en los medios.

8. Recubrimiento del dispositivo MPS con matriz de colágeno tipo I

1. Aspire el PBS del dispositivo MPS y retire el dispositivo del paquete. Seque el dispositivo con toallitas médicas y etiquételo como desee.
2. Coloque el dispositivo MPS en una placa de cultivo circular de 15 cm y colóquelo a 4 °C hasta que esté listo para su uso. Mantenga las toallitas médicas en el fondo del plato para evitar la humedad en el dispositivo MPS.
3. Mantenga las jeringas de 1 ml con romos de aguja Luer-Lok de 22 g adheridas a -20 °C hasta su uso para la inyección de colágeno I.
4. Por cada cuatro dispositivos MPS que deban llenarse, mantenga un tubo cónico de 15 ml en hielo. Use una jeringa de 1 mL con la aguja sin filo adherida por cada tubo cónico de 15 mL.
5. Utilizando una técnica estéril en un gabinete de bioseguridad, abra todos los puertos del dispositivo MPS. Asegúrese de que las ranuras en la parte superior de cada válvula de tornillo estén alineadas verticalmente con el puerto.
6. Usando un conjunto de jeringa/aguja roma de 1 mL, enjuague la cámara ECM con 1 mL de etanol en los puertos # 1, # 3 y # 6. Aspire el etanol y deje que se evapore por completo (al menos 30 s) para que no penetre en el dispositivo MPS desde los puertos # 2, # 4 y # 5.
7. Vuelva a colocar el dispositivo MPS a 4 °C y mantenga los medios PTEC, M199 y 1 N NaOH en hielo.
8. Calcule la composición de la matriz para 1 mL de la mezcla de colágeno tipo I para aproximadamente cuatro dispositivos MPS de acuerdo con la Tabla 1 (escala según sea necesario). En la cabina de bioseguridad, mezcle los medios PTEC, M199 y 1 N NaOH en este orden, de acuerdo con los cálculos anteriores, y mantenga todos los tubos en hielo.
9. Agregue con cuidado el caldo de colágeno tipo I con una jeringa de 1 ml a la mezcla prefabricada. Mezcle la mezcla de colágeno pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que la mezcla tenga un color rosa anaranjado salmón estable.
10. Centrifuga brevemente el tubo para recoger la solución en el fondo. Asegúrese de que no haya burbujas en la solución.
11. Coloque las jeringas de 1 ml preenfriadas con romos de aguja Luer-Lok de 22 G y el dispositivo MPS en el armario de bioseguridad y sobre hielo. Llene la jeringa preenfriada de 1 ml con la mezcla de colágeno y evite las burbujas por completo.
12. Inyecte muy lenta y suavemente la solución de colágeno en los puertos # 1, # 3 y # 6 de las cámaras del dispositivo refrigerado. Sostenga el dispositivo verticalmente con los puertos hacia abajo para permitir que las burbujas de aire fluyan hacia arriba y hacia afuera de los puertos # 2, # 4 y # 5.
    NOTA: Debe haber una gota de la mezcla de colágeno en los puertos # 2, # 4 y # 5, lo que indica que las cámaras están completamente cubiertas.
13. Retire la jeringa y vuelva a colocarla en el tubo de 15 ml sobre hielo. Gire la válvula de tornillo de los puertos #2, #4 y #5 para sellar la viruta llena y colóquela en la placa de cultivo a 4 °C durante 30 min.
14. Después de 30 minutos, transfiera la papa frita con el plato a la cabina de bioseguridad de manera estéril y extienda las papas fritas de manera uniforme e individual para que se calienten uniformemente.
15. Coloque una toallita médica humedecida en cada plato (para evitar que la matriz de colágeno I se seque y se desprenda de las paredes del dispositivo MPS) y selle los platos con una película de sellado flexible semitransparente. Deje que el colágeno se polimerice durante la noche en RT.

9. Creación de un lumen tubular con colágeno tipo IV como ECM en un dispositivo MPS

1. Esterilice los tubos C-flex enjuagándolos con agua ultrapura (Tipo 1) y etanol puro, luego autoclave toda la línea de tubos.
2. En el gabinete de bioseguridad, abra todos los puertos del dispositivo MPS lleno de colágeno tipo I (la válvula de tornillo estará vertical con los puertos) y retire el cable que sobresale de los puertos # 1, # 3 y # 6 para formar los lúmenes tubulares.
3. Inserte los acopladores de metal en los puertos # 1, # 3 y # 6.
4. Prepare una solución de 10 mL de colágeno tipo IV de 5 μg/mL en medio PTEC.
5. Inserte 24 pulgadas de tubo C-flex estéril en los porros metálicos que sobresalen de los puertos # 1, # 3 y # 6.
6. Llene jeringas de 1 mL equipadas con una aguja Luer-Lok de 22 g sin filo con 0,5 mL de solución de colágeno tipo IV.
7. Coloque la jeringa llena en una bomba de infusión de jeringa y conecte el tubo desde el puerto #1 a la jeringa. Repita este paso para los puertos #3 y #6.
8. Con la bomba de jeringa, administre la solución de colágeno tipo IV en los puertos MPS a una velocidad de 10 μL/min durante 30 min. Una vez que se hayan infundido los puertos, deje que el colágeno se solidifique en una incubadora a 37 °C durante la noche antes de usarlos al día siguiente.
   NOTA: Los dispositivos MPS recubiertos de colágeno tipo IV pueden almacenarse hasta 1 semana a 4 °C.

10. Siembra de PTEC primarios en un dispositivo MPS

1. Inspeccione el dispositivo MPS bajo el microscopio para asegurarse de que el lumen se haya formado correctamente.
2. Coloque una jeringa preesterilizada de 5 ml con una aguja de 22 g en un tubo de 15 ml que contenga 5 ml de etanol.
3. Obtenga un pellet de celda PTEC en un tubo cónico de 15 mL a partir de un matraz T-25 siguiendo los pasos 5.1. al punto 5.3. Añada 80 μL de medio PTEC al pellet de la célula y vuelva a suspender suavemente.
4. Transfiera la suspensión celular a un microtubo de 1,5 mL.
5. Retire la placa que contiene el dispositivo MPS de la incubadora y colóquela en el gabinete de bioseguridad. Cierre los puertos # 2, # 4 y # 5 y gire la válvula de tornillo horizontalmente hacia los puertos.
6. Agite suavemente el tubo que contiene PTEC para volver a suspender las células. Llene la jeringa con células e inserte la aguja en el puerto de inyección que está más alejado de los puertos de las válvulas de tornillo.
7. Empuje con cuidado el émbolo de la jeringa para inyectar las células. Visualice las células después de la inyección bajo un microscopio.
   NOTA: Las células deben moverse a través del lumen. Si no se observan células en el lumen, compruebe si la aguja se ha insertado de forma segura en el puerto de inyección y vuelva a insertar la aguja si es necesario. Una jeringa llena de células puede llenar los tres lúmenes del dispositivo.
8. Continúe con las inyecciones de células con los otros dos puertos. Después de las inyecciones, cierre los puertos #2, #4 y #5 y vuelva a colocar el dispositivo MPS en la incubadora a 37 °C. Mantenga la placa nivelada para que las células no se muevan fuera del lumen por gravedad.
9. Para dispositivos MPS adicionales, lave la jeringa con etanol después de vaciarla y lávela con DPBS antes de extraer las celdas.
10. Permita que los dispositivos MPS permanezcan durante la noche sin ser molestados.
11. Al día siguiente, conecte los dispositivos MPS a las bombas de jeringa.
12. En la cabina de bioseguridad, llene jeringas de 5 ml con medios PTEC. A continuación, coloque los blunts de punta Luer-Lok de 22 G con la sección de 24 pulgadas de tubo C-flex unido a las jeringas.
13. Coloque las jeringas cargadas con medios PTEC en la bomba de jeringa. Imprima las líneas para eliminar las burbujas de aire.
14. Conecte las líneas de tubería cebadas a los puertos # 1, # 3 y # 6 y gire las válvulas de tornillo a una posición vertical para introducir el flujo de medios.
15. Ajuste el caudal de la bomba de jeringa a 0,5 μL/min. Vuelva a colocar la placa con el dispositivo MPS en la incubadora a 37 °C y permita que las células formen túbulos (dentro de 5 a 7 días) bajo perfusión continua del medio antes de comenzar un experimento.

Morfología y confluencia de PTECs primarias aisladas a lo largo del tiempo en cultivo 2D
Tras el aislamiento de la corteza renal, se permitió que las PTEC crecieran sin perturbaciones durante al menos 48 horas antes del primer cambio de medio. Aproximadamente una semana después del cultivo de las células, deberían aparecer pequeños lotes de PTECs en todo el matraz de cultivo con una morfología epitelial uniforme, similar a un adoquín (Figura 1A,B). Dependiendo de las tasas de crecimiento de los PTEC de diferentes donantes, la confluencia celular debería alcanzar aproximadamente el 50%-60% después de 10 días en cultivo (en promedio) (Figura 1C). Después de aproximadamente 14 días en cultivo, las células deben alcanzar la confluencia completa (Figura 1D) y estar listas para ser pasadas, criopreservadas o sembradas en un dispositivo MPS. En promedio, un riñón humano completo es capaz de proporcionar 14 frascos llenos de T-75 llenos de PTEC. Para evitar la contaminación, es fundamental emplear técnicas estériles e incluir antibióticos en los medios durante el período de cultivo.

Inyección de PTECs en un dispositivo MPS
Una vez que los dispositivos MPS se recubren con colágeno de tipo I y tipo IV, están listos para cultivar PTEC en formato 3D. Como se muestra en el Video 1 y la Figura 2, se pudo ver que los PTEC fluyen en el lumen desde el puerto de inyección (Figura 3). Si no se observan células, esto podría indicar una fuga o desalineación de la inyección y la aguja de la jeringa desafilada. Como se muestra en los estudios publicados anteriormente^17-28, los túbulos PTEC se formarán aproximadamente una semana después de la inyección en un dispositivo MPS.

Figura 1: Morfología y confluencia de células epiteliales de túbulos proximales primarios aisladas (PTECs) a lo largo del tiempo. Los PTEC aislados de un solo riñón adulto se siembran típicamente en 14 matraces de cultivo celular T-75. (A) Para este riñón representativo, después de 6 días en cultivo, se pudieron observar pequeños parches de PTECs (en caja roja) con apariencia epitelial y de adoquín en todo el matraz de cultivo celular, con células sanguíneas aún visualmente presentes. (B) En el día 8, aparecieron parches PTEC definidos con células sanguíneas reducidas después del cambio de medio. (C) La confluencia alcanzó del 50 al 60% en el día 10 en promedio y (D) alcanzó aproximadamente el 100% alrededor de 2 semanas después del aislamiento y están listos para ser pasados, criopreservados o utilizados en un dispositivo MPS. Las imágenes se tomaron con un aumento de 4x utilizando un microscopio. Las barras de escala representan 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Descripción general del flujo de trabajo para crear un modelo de túbulo proximal utilizando PTEC en una plataforma MPS. Este diagrama de flujo describe el flujo de trabajo general para el uso de PTEC en un dispositivo MPS. Por lo general, se tarda aproximadamente 3 semanas en aislar los PTEC de los riñones humanos para crear un túbulo proximal 3D in vitro maduro y estable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: PTECs después de ser inyectadas en un dispositivo MPS. Después de la formación del lumen en el dispositivo MPS con colágeno I y IV, se pueden inyectar PTEC. Como se muestra en esta figura y en el video, después de inyectar correctamente los PTEC, se pudo ver que las células fluyen a través del lumen desde el puerto de inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Ejemplos de cálculos para preparar 1 mL de la mezcla de recubrimiento de colágeno MPS tipo I. El volumen de stock de colágeno necesario debe ajustarse de acuerdo con la concentración de stock. El volumen de los medios PTEC se puede ajustar para aumentar o disminuir el volumen total a aproximadamente 1 mL.

Vídeo 1: PTECs que fluyen en el lumen desde el puerto de inyección. Haga clic aquí para descargar este video.

Las tecnologías MPS, o de órganos en un chip, ofrecen una plataforma in vitro muy relevante para recapitular aspectos clave de la fisiología humana, reduciendo así la dependencia de modelos animales en el desarrollo de fármacos y evaluaciones toxicológicas. Recientemente, la Ley de Modernización de la FDA 2.0 (2022) ha permitido la inclusión de MPS, entre otras alternativas, en las solicitudes de nuevos medicamentos en investigación²⁹. Este protocolo detalla un procedimiento operativo estándar para la disociación de PTECs del tejido cortical de donante humano y su posterior uso en plataformas MPS, con el objetivo de modelar la función del túbulo proximal humano y evaluar las respuestas toxicológicas renales a los xenobióticos (Figura 2).

Un factor importante para mantener una alta viabilidad de PTEC es minimizar el tiempo de isquemia caliente (WIT). Recomendamos utilizar riñones con menos de 1 h de WIT. Si bien lo ideal es una CIT inferior a 24 h, se pueden tolerar hasta 36 h cuando la disponibilidad renal es limitada. Otro paso crítico es la preparación adecuada del tejido, que incluye la eliminación de las membranas externas, la grasa visceral y la separación completa de la corteza de la médula para maximizar la pureza de PTEC. Hemos encontrado que la digestión del tejido con colagenasa IV y dispasa en lugar de colagenasa I sola 10,11,30,31 ofrece una disociación más suave que preserva la integridad de la membrana celular. Además, otras mezclas o la inclusión de DNasa pueden ser beneficiosas cuando hay desechos celulares significativos o aglomeración celular en la suspensión. También es esencial picar los tejidos en trozos de menos de 1^cm3 y mantenerlos fríos en hielo o a 4 °C inmediatamente después de la digestión para evitar un daño celular excesivo.

Para aplicaciones a corto plazo de PTECs en plataformas de cultivo estáticas como transwells, la eliminación de la mayoría de los glóbulos rojos durante el procesamiento de tejidos es clave para prevenir el estrés oxidativo causado por la hemoglobina libre³². Los diferentes tipos de células en la corteza renal, incluidas las células sanguíneas, se pueden separar mediante un gradiente de Percoll³³. Alternativamente, las células sanguíneas pueden ser lisadas selectivamente utilizando un tampón a base de cloruro de amonio³⁴. Por otro lado, cuando se utilizan PTEC en dispositivos MPS, se pueden tolerar niveles moderados de células sanguíneas contaminantes, ya que estas PTEC deben cultivarse en un formato de cultivo estándar hasta la confluencia. Además, se debe evitar la digestión prolongada más de una hora, ya que puede aumentar drásticamente el riesgo de contaminación que puede no resolverse simplemente agregando agentes antimicrobianos. Una digestión de 30 minutos generalmente proporciona suspensiones unicelulares adecuadas, y si el rendimiento es menor de lo esperado, lavar el tejido digerido una o dos veces más con tampones isotónicos como PBS a menudo puede liberar PTEC que se adhieren al tejido parcialmente digerido. Si la viabilidad celular es baja o la adherencia es tardía, es aconsejable volver a examinar la digestión, asegurar un mínimo de WIT y confirmar que las condiciones del medio de cultivo (hormonalmente definido, sin suero, 1 g/L de glucosa) son correctas. Verificar que los pasos posteriores a la digestión se realicen en hielo o a 4 °C (hasta la siembra) también es esencial para reducir el estrés celular. Para la posterior siembra de células en las plataformas MPS, es importante no introducir burbujas de aire al recubrir con soluciones de colágeno para mantener una ECM uniforme para que los PTEC formen túbulos estructurados. Las técnicas estériles son especialmente importantes durante la configuración de MPS, ya que la naturaleza multicompartimentaria de los dispositivos MPS aumenta el riesgo de contaminación.

Una de las principales limitaciones de este protocolo es la dependencia de los tejidos de los donantes, que pueden variar en calidad y disponibilidad. El WIT prolongado o el CIT alto pueden reducir el rendimiento de células viables y limitar la reproducibilidad experimental. Otra limitación es la vida útil finita de los PTEC primarios, que normalmente se puede mantener durante 3 o 4 pasajes antes de que se produzca la senescencia celular. Por último, este método produce inicialmente una población mixta de células, que contiene tanto PTECs como células epiteliales de túbulos distales (DTECs), tras la digestión de la corteza renal. Si bien esto puede no ser ideal para aplicaciones a corto plazo, el propósito es propagar los PTEC para su uso posterior en plataformas MPS. Dado que empleamos un medio de cultivo definido sin suero, otros tipos de células de porcentajes mucho más bajos, a saber, células mesangiales y fibroblastos, no crecerán a un ritmo significativo. Además, mediante citometría de flujo y tinción inmunohistoquímica (IHC), demostramos previamente que la mayoría de las células primarias cultivadas con este método son PTEC, con una minoría de células que expresan marcadores DTEC basados en los datos de tinción de los marcadores de células epiteliales renales. En concreto, los PTECs cultivados en 3D forman túbulos polarizados con fenotipo citométrico de flujo PTEC para neprilisina (CD10) y alanina aminopeptidasa (CD13)²³. Los datos de tinción IHQ también demostraron que estas células, tanto en formato 2D como 3D, expresan marcadores PTEC como la lectina tetragonolobus del loto (LTL), el cotransportador de sodio-glucosa 2 (SGLT2) y la acuaporina-1 (AQP1), con una expresión mínima de marcadores de nefrona distal, como promina-2 (PROM2), uromodulina (UMOD) y acuaporina 2 (AQP2)¹⁶. Esto es esperable, ya que se ha demostrado que los DTEC se desdiferencian y transdiferencian hacia los PTEC en el cultivo 2D³⁰.

Si bien los cultivos de células renales estáticas y las líneas celulares inmortalizadas se utilizan ampliamente, a menudo no logran replicar los niveles fisiológicos de estrés cortante y la arquitectura tridimensional que se encuentra en el riñón. Por el contrario, las plataformas MPS 3D aproximan mejor el entorno del túbulo proximal in vivo al incorporar andamios de flujo y ECM, mejorando así la precisión predictiva para las evaluaciones de nefrotoxicidad, como hemos demostrado anteriormente 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27^,28. El uso de PTEC primarias en lugar de líneas inmortalizadas confiere una mayor relevancia fisiológica, ya que estas células retienen transportadores y enzimas clave esenciales para el metabolismo y la eliminación de xenobióticos. La combinación de un manejo cuidadoso de los tejidos, una digestión enzimática optimizada y unas condiciones de cultivo adecuadas garantiza que este método de MPS se alinee con los objetivos generales de reducir las pruebas en animales y mejorar el valor traslacional de la investigación preclínica del riñón²⁹.

Este protocolo permite el establecimiento de modelos robustos de túbulos proximales humanos en dispositivos microfisiológicos, lo que facilita el cribado de fármacos, las predicciones de nefrotoxicidad y las investigaciones detalladas de la fisiopatología renal, en particular de los mecanismos de aclaramiento renal, las interacciones entre fármacos y transportadores y las vías de lesión renal. Al reducir o reemplazar el uso de modelos animales, estos enfoques primarios de MPS basados en humanos promueven el principio de las 3R (reducir, refinar, reemplazar) y pueden acelerar las líneas de desarrollo de fármacos. Al mismo tiempo, la MPS específica del paciente es prometedora para las aplicaciones de medicina de precisión, como el cribado personalizado de fármacos y la elaboración de perfiles de toxicidad. En general, este método reproducible para aislar y cultivar PTEC a partir de tejidos de donantes humanos proporciona pasos críticos para preservar la viabilidad y la funcionalidad de las células y, cuando se combina con plataformas MPS 3D, mejora significativamente el poder predictivo de los modelos renales in vitro , al tiempo que avanza en la investigación toxicológica y el descubrimiento de fármacos.

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses ni divulgaciones financieras relevantes para este estudio.

Partes de este trabajo fueron apoyadas por el contrato de la NASA 80ARC023CA001, el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (NCATS) (U2CTR004867, UH3TR000504, UG3TR002158), conjuntamente por el NCATS y el Centro para el Avance de la Ciencia en el Espacio (CASIS) (UG3TR002178), el Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental (NIEHS) (P30ES00703), el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (T32GM007750), una donación sin restricciones de los Centros del Riñón del Noroeste a la Investigación del Riñón y la Facultad de Farmacia de la Universidad de Washington (Premio Ji-Ping Wang y Beca Bradley).