Translasyonel Fare İnme Çalışmaları için Standartlaştırılmış Nörolojik Skorlama ile Fare Vuruşu Birimi Protokolü

Bu makale, büyük stroklu farelerde yüksek oranda ötelemeye dayalı ve bağımsız olarak kanıtlanmış fare Vuruş Birimi (mSU) kavramını yürütmek için bir protokol sunar. Ayrıca, farelerde fokal deneysel inme ölçeğinin yürütülmesi için standart bir protokol sağlar, bu da uzun vadede bile tespit edilen inme fokal eksikliklerini değerlendirir.

Orta arter oklüzyonunun filament modeli (fMCAo), intravasküler reperfüzyon/rekanalizasyon ile kontrollü iskemiye izin veren belki de en translasyonel fare vuruş modelidir. Bununla birlikte, inme bakımı için mevcut klinik gelişmelerle (örneğin, İnme Birimleri) uyumdan yoksundur, genellikle laboratuvarlar arasında subjektif veya belirsiz nörolojik skorlama kullanır ve yüksek akut faz mortalitesi sergiler. Burada, doğrulanmış video kılavuzlu protokollerle bu sınırlamaları ele alıyoruz. Fare Vuruş Birimi (mSU) protokolünü, klinik ve fare vuruşu modellemesi arasındaki boşluğu dolduran eğitici videolar ve bir karar algoritması (Risk Sınıflandırma Skoru) ile sunuyoruz. İnme nörolojik skorlamasının doğruluğunu ve duyarlılığını artırmak için, ilk kez fokal Deneysel İnme Ölçeği'nin (fESS) video standardize edilmiş bir formatını sunuyoruz ve değerini inme sonrası 6 aya kadar kanıtlıyoruz. Ek olarak, uzuvların motor fonksiyonunun tarafsız, kantitatif değerlendirmesi için fareler için Merdiven basamağı testi ve bilinen Silindir testi için protokoller sunulmaktadır. Sonuçlar mSU'nun translasyonel etkinliğini vurgulamaktadır. Fokal ESS (fESS), fokal inme açıklarını tespit etmede, iyileşmeyi yakalamada ve inme sonrası 6 aya kadar hassasiyeti korumada bilinen diğer ölçeklere göre üstündür. Merdiven basamağı ve Silindir testleri, ön ve arka bacak motor açıklarını uzun vadede objektif olarak ölçer ve izler. Özetle, mSU, fESS ve motor fonksiyon testlerini entegre etmek, klinik olarak ilgili inme araştırmaları için sağlam bir çerçeve sağlar. Protokollerimiz, fare darbesi araştırmalarında çeviri değerini artırır.

Büyük iskemik inme, tüm dünyada morbidite ve özürlülüğün en önemli nedenlerinden biridir¹. Yine de, fare inme araştırması, şimdiye kadar klinik olarak test edilmiş hemen hemen tüm tedavilerde translasyonel bir blokla karşı karşıyadır². Bu sorunun birden fazla nedeni ve üstesinden gelme çabaları önceki yayın^2'de ayrıntılı olarak gözden geçirilmiştir. Bu zorluklar, klinik ilerlemelerin ilgili hayvan modellerine sınırlı entegrasyonundan² ve inme sonrası eksiklikleri doğru ve hassas bir şekilde tespit etmedeki davranışsal ve nörolojik skorlama sistemlerinin zayıflıklarından^{kaynaklanmaktadır 2}.

Son keşifler³, farelerde orta arter tıkanıklığının (fMCAo) filament modelinin, açık kafatası yaralanması ve travması olan diğer modellere göre önemli translasyonel avantajlara sahip olduğunu desteklemektedir ^2,4. Bunun da ötesinde, klinik inme ortamlarının reperfüzyonunu ve mekanik trombektomisini ^{modelleyen tek şey budur 5,6,7}. Bununla birlikte, model, inme sonrası 3-7 gün arasında yüksek subakut mortalite ile karşı karşıyadır, bu da büyük felçlerin uzun süreli çalışmalarını yasaklar ve yakın zamana kadar modelin doğal ve aşılmaz eseri olarak kabul edilir. Ek olarak, inme sonrası nörolojik defisitlerin tespiti, özellikle klinisyen olmayanlar veya deneyimsiz araştırmacılar arasında, küçük boyutları nedeniyle farelerde nispeten zor ve önyargılıdır ^8,9. Bunu ele almak için, farklı gruplar açıkları tespit etmek için çeşitli ölçekler geliştirmiştir. En çok kullanılan ve bilinen ölçekler arasında 3 noktalı Bederson ölçeği (BS)¹⁰, 5 noktalı modifiye Bederson ölçeği (mBS)¹¹, 5 puanlık Longa skoru (LS) (mBS'ye benzer)⁶, modifiye Nörolojik İnme Ölçeği (mNSS)^12,13, 18 puanlık Garcia ölçeği (GS)⁹ ve daha ayrıntılı DeSimoni¹⁴ veya farklı olarak "Neuroscore" (^{NS) olarak} bilinir9^{, 15} ölçek. Ne yazık ki, bu ölçeklerin bazıları ya çok kabadır ve sadece inmeyi takip eden birkaç akut faz günüyle sınırlıdır (BS, mBS ve LS)^8,9 ya da yorumları genel eksiklikler (NS) tarafından bulanıktır.

Bu arka planla, daha önce fareler¹³ için deneysel vuruş ölçeği (ESS) ile birlikte fare Vuruş Birimi (mSU) destek protokolünü geliştirdik ve doğruladık. mSU'nun mantığı, klinik rutinden (yani insan inme birimleri) elde edilen bilgiyi klinik öncesi inme araştırmalarına uyarlamaktı, ESS ise daha önce var olan ancak "duyarsız" veya gereksiz inme ölçeklerini pratik, rafine edilmiş, hassas ve zaman açısından verimli bir ölçekte kritik bir şekilde konsolide etti. mSU, sağkalımı artırmak için hayvan desteğinin uyarlanmış uygulamasıyla farenin temel klinik parametrelerinin sık ve uyarlanmış olarak izlenmesinden oluşur¹³.

Gerçekten de, laboratuvarımızdan ve diğerlerinden elde edilen veriler her iki yöntemin de değerini doğrulamaktadır. mSU, klinik temel destekleyici önlemleri^{çevirir ve insanlardan farelere 7} ilerletir, farelerde fMCAo'nun mortalitesini %60-70'ten %10-15'e önemli ölçüde ^azaltır13, böylece daha büyük felçlerin çalışmasına izin verir ve o zamandan beri bağımsız laboratuvarlarda etkili bir şekilde uygulanabilir 16,17,18,19. Ek olarak, ESS, fokal (ESS'nin odak bileşeni, fESS) ve genel (ESS'nin genel bileşeni, gESS) inme sonrası eksiklikler ve semptomlar arasında ayrım yapabilir, insan klinik skorlamasını modeller (insanlarda fokal ve genel belirti ve semptomlar arasındaki ayrım), inme lezyonunun boyutuyla doğrusal olarak ilişkilidir ve açıklara uzun vadeli duyarlıdır^13,20. Yine de, hem mSU hem de ESS'nin kanıtlanmış değerine ve etkinliğine rağmen, deneyimsiz araştırmacılar için bile net, görselleştirilmiş, standartlaştırılmış talimatların olmaması, mSU uygulaması hakkında birkaç açık soru ve fESS'de fokal eksikliklerin puanlanması konusunda önemli bir öznellik bırakmaktadır.

Bu nedenle, bu makalemiz mSU ve fESS protokolleri için video destekli ve net talimatlar sağlamayı amaçlamaktadır. İnme araştırmacılarının inme çalışmalarının translasyonel verimliliğini artırmalarını, inmeden sonraki ilk 3-10 gün boyunca hayvan kaybını önemli ölçüde azaltmalarını, deney maliyetlerini azaltmalarını ve nihayetinde inmeden sonraki aylar boyunca nörolojik eksiklikleri tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirmelerini destekleyeceğine inanıyoruz¹³. Ek olarak, Merdiven basamağı testi ve Silindir testinin ek kombinasyonu, fMCAo'ya bağlı fokal ekstremite parezisini (ön ve arka ayaklar) kolayca ölçebilir.

mSU ve fESS verimliliğini göstermek için, fMCAo'dan sonra fareler hakkında orta (14 günlük) ve uzun vadeli (6 aylık) veriler sağlıyoruz. On iki haftalık erkek C57Bl / 6J fareleri (n = 31), 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngü periyodu ve peletlenmiş gıda ve suya erişim ile kontrollü sıcaklıkta (22 ± 2 ° C) kullanıldı ve barındırıldı. Fareler sırasıyla 14 gün (n = 10, kohort 1) ve 6 ay (n = 15, kohort 2) boyunca takip edilen iki kohorta ayrıldı. Bu fareler, izofluran anestezisi altında iyi tanımlanmış fMCAo ^13,20,21 modeli kullanılarak ⁶⁰ dakikalık bir serebral iskemiye tabi tutuldu. 6 ay boyunca takip edilen sahte ameliyatlı hayvanlar (n = 6, yukarıdaki iki kohort olarak çalıştırıldı, ancak iskemi indüklenmedi) kontrol olarak görev yaptı. Buprenorfin ameliyat öncesi ve sonrası 3 gün analjezik olarak kullanıldı. Nörolojik skorlamanın bir parçası olarak 6 aylık kohort için Merdiven basamağı ve silindir testleri de yapıldı.

Tüm hayvanlar, stoktan sonraki ilk 14 gün boyunca insancıl uç noktalar için günlük olarak kontrol edildi, şu şekilde tanımlandı: 1) şiddetli hipotermi (<33 ° C) ve / veya hareketsizlik (ör., fESS Test 6'da skor 4 veya gESS'nin "spontan aktivite" testi) "fare İnme Ünitesi" tedavisi ile iyileştirilmedi (yani, pasif ısıtma ve aktif besleme, bkz. 1.4, 1.6, 1.8) bir saat içinde, 2) protokole göre postoperatif analjeziden sonra bile ağrı veya anksiyete davranışı belirtileri (ör. gESS'nin "anksiyete / otomatik davranış" testinde >2 puan).

Bu protokolde, farelerin mSU şeklinde inme sonrası desteği, fMCAo işleminden fare kurtarmadan hemen sonra başlar. Bunun 3 aşaması vardır: faz A (reperfüzyon sonrası 0-48 saat), faz B (>48 saat ve "gerekli aktif desteğin sonuna" kadar, genellikle 10-14. günde, bireysel hayvanın B fazına bağlı olarak) ve faz C (14. günden itibaren). Her bir faza (A, B veya C) ve Risk Sınıflandırma Skoru (RSS) ile değerlendirilen günlük gerçek klinik durumuna göre, her bir hayvana göre uyarlanmış beş önemli müdahalesi (ziyaretler / Risk Sınıflandırma Skoru, besleme, sıvılar, sıcaklık ve yerel dezenfeksiyonlar; aşağıda bkz. 1.1. ila 1.8.) vardır, üç tipik örnekle Ek Şekil 1 ve Tablo 1'e bakınız. mSU için gerekli malzemeler ve araçlar Şekil 1a'da gösterilmiştir ve Malzeme Tablosunda açıklanmıştır. Ayrıca mSU sırasında hayvanların izlenmesi için bir şablon da sağlıyoruz (Ek Dosya 1'e bakınız).

Bu makalede bildirilen deneyler, deney hayvanlarının kullanımına ilişkin Ulusal ve Avrupa yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Yunan hükümet komiteleri tarafından onaylanmıştır (Atina, Lisans No "843895_06-09-2022").

1. "Fare Vuruş Birimi" (mSU)

1. Hayvanın klinik durumunu günlük olarak değerlendirin ("ziyaretler") ve RSS skorunu hesaplayın
   1. Verileri kaydetmek ve izlemek için Ek Dosya 1'i, tercihen hayvanın ameliyatından önce yazdırın.
   2. Her hayvanı standart zaman noktalarında (ziyaretler) klinik olarak değerlendirin: sabahın erken saatlerinde (yaklaşık 08:00'de), öğlen (14:00 ile 16:00 arasında) ve gece geç saatlerde (22:00 - 23:00 civarında).
      NOT: Bu standart ziyaretleri hayvanın takip aşamasına göre uyarlayın: Faz A için günde 2 kez (sabah-gece), Faz B için günde 3 kez ve Faz C için günde bir kez hayvanın durumunu kontrol edin. RSS puanına göre ziyaret sıklığını daha da artırın (bkz. 1.1.6). İş yükünü azaltmak için tercihen >2 kişilik bir ekipte çalışın. Sabah ve gece ziyaretleri başarılı destek, izleme ve mortalitenin azaltılması için çok önemlidir, çünkü farelerin gece (aktif) fazı metabolik ve enerji taleplerini^artırır 13,22,23 ve inme sonrası gece mortalitesinin artmasıyla bağlantılıdır.
   3. Sabah ziyareti sırasında fareyi hassas bir standart ölçek kullanarak tartın.
   4. Sabah ziyareti sırasında ventral vücut merkezinin üzerine yerleştirilen temassız bir termometre ile sıcaklığı ölçün. Fareyi sırtıyla tutun ve hareketsiz hale getirin. Okumayı immobilizasyondan sonraki ilk birkaç saniye içinde yapın (bkz. Şekil 1f).
      NOT: Eşlik eden peritonit ile tekrarlanan ölçümlerden sonra potansiyel bağırsak yırtılması nedeniyle rektal termometre kullanmayın.
   5. Farenin genel klinik durumunu (hareketlilik, yaralar, üretra başlığı, reaktivite, kürk, hidrasyon durumu vb.) sabah ziyaretinde her gün 14. güne kadar değerlendirin ve kaydedin.
   6. Ek Şekil 1'de açıklandığı gibi hayvanın ağırlığına, sıcaklığına ve fESS puanına göre puanları toplayarak sabah ziyaretinde RSS puanını hesaplayın. Bir elektronik tablo tablosundaki RSS'nin otomatik olarak hesaplanması için, Tablo 1'de bulunan formülü kullanın ve uyarlayın. İnsancıl uç noktalar varsa, hayvanı kurumsal olarak onaylanmış bir yöntemle ötenazi yapın (yukarıya bakın).
   7. Hem ziyaret sıklığını hem de destek yoğunluğunu günlük olarak RSS skoruna ve hayvanın inme sonrası fazına göre uyarlayın.
      NOT: Faz B, mortalite için en kritik olanıdır. RSS ≥3 için ziyaret sıklığını ve destek yoğunluğunu artırın (tanım ve talimatlar için Tablo 1'e bakın). Hayvan, Faz C'de bir RSS >3 göstermeye devam ederse, Faz B'de olduğu gibi ziyaret edin ve destekleyin. Destek ekibi arasında klinik durumunu tanımlamak için RSS'yi ve genel tanımlayıcıları (iyileşen, stabil, düşük / orta hasta ve kritik hasta gibi) kullanın. 14. günden sonra, hayvan ziyaretlerini yalnızca deneysel protokolün gerektirdiği ziyaretlere düşürün (ör. davranışsal / nörolojik değerlendirmeler için).
2. Beslenme desteği için jel mamanın hazırlanması
   1. Yaygın gıda peletlerini bir blender kullanarak toz haline getirin (Şekil 1a).
   2. Yiyeceklerin kalori içeriğini artırmak için% 5-10 oranında ticari şeker ekleyin.
   3. Jel benzeri bir sıvı doku oluşturmak için su ekleyin (Şekil 1b).
   4. Bu jel mamayı hem pasif hem de aktif beslenme desteği için kullanın.
      NOT: İsteğe bağlı olarak kullanıma hazır ticari jel mama kullanın. Hazırlanan yiyecekler buzdolabında 2-3 gün kalabilir.
3. Farelerin pasif beslenme desteği
   1. Bir Petri kabını jel gıda ile doldurun ve kafes zeminine yerleştirin (fareye kolay erişim için jel yem sağlayarak pasif beslenme desteği). Petri kabının yanına 2-3 yiyecek peleti bırakın.
   2. Petri kabını her gün jel yiyeceklerle yenileyin. İlk birkaç gün boyunca, fareler Petri kabını kafes yataklarıyla doldurabilir veya kaplayabilir. Bazıları ondan yemeye başlayacaktır (Şekil 1c).
4. Aktif beslenme desteği (aktif beslenme)
   NOT: Aktif besleme, Faz B sırasında gerçekleşir. Standart besleme sıklığı günde 3 kezdir ve RSS puanına göre daha fazla zamana uyarlanır (örneğin, günde 4-5 kez). Bazen, sürekli olarak RSS skoru 0-1 olan (yani küçük vuruş) ve kendi başlarına aktif olarak yemek yiyen fareler için frekansı günde 1-2'ye düşürün.
   1. 1 mL şırıngaları jel gıda ile önceden doldurun.
   2. Fareyi, Şekil 1d'de (kırmızı ok ucu) gösterildiği gibi, boynundaki kürkünden nazikçe ama sıkıca kavrayın ve tutun.
   3. Şekil 1d'de kırmızı oklarla gösterildiği gibi farenin yanağını orta parmakla sabitleyin: fareyi sıkıca tutarken, parmağınızı farenin burnuna doğru yanlamasına yanlarına doğru kaydırın. Pozisyonu tut.
   4. Şırınganın ucunu farenin ağzına dişlerinin arasına yerleştirin ve ucunu yanağının iç tarafına doğru yönlendirin (kırmızı ok, Şekil 1e).
   5. Her seferinde yaklaşık 40-50 μL jel gıda verin (bir ağız dolusu).
   6. Fareyi yavaşça kafes ızgarasına geri koyun. Çiğneme için zaman tanıyın.
   7. Her fare 1-1.5 mL jel yiyecek yiyene kadar 1-2 dakika sonra beslemeyi tekrarlayın.
      NOT: Çalışma başına 5-10 fare besleyin (1-2 kafes); Diğerleri, her fareye bir ağız dolusu verilirken jel yiyecekleri yer ve yutarlar. Bu işlem fareler üzerinde herhangi bir stres oluşturmaz. Bazı hayvanların sonunda kendilerini kavramak ve beslenmek için konumlandırdıkları da gözlemlenmiştir.
5. Normal tuzlu su takviyesi
   1. Sabah ziyareti sırasında fareyi tartın (bkz. 1.1.2 ve 1.1.3).
   2. Değerleri çıkararak önceki ölçüme kıyasla kilo kaybını/kazancını hesaplayın.
   3. Kilo açığını (gram cinsinden) mL normal salin (deri altı) ile tamamlayın.
      NOT: Her ne pahasına olursa olsun aşırı sıvı yüklenmesinden ve ödemden kaçının. Doz başına 1-2 mL'yi ve günde 3-4 mL sıvıyı aşmayın. fMCAo'dan 36 saat sonra başlayın.
6. Glikoz takviyesi
   1. Farenin hesaplanan RSS puanını ve genel hareketini kontrol edin.
   2. RSS >3 ise ve fare beraberinde hipotermi (<34 ° C) veya immobilizasyon / bradikinezi belirtileri gösteriyorsa deri altına 0,5 - 1 mL% 5 glikoz enjekte edin. Tercihen sadece gece ziyareti sırasında enjekte edin.
      NOT: Her ne pahasına olursa olsun inme sonrası hiperglisemiden kaçının. İnme sonrası hiperglisemi toksiktir⁷. Bu nedenle, sadece aktif beslenmeden sonra ve ciddi klinik durum durumlarında veya gece aktivitesi sırasında hipoglisemiyi önlemek için glikoz takviyesi yapın. Aktif beslenme (bkz. 1.4), daha düzgün ve daha uzun süreli enerji desteği sağladığı ve klinik kılavuzları tercüme ettiği için ana destek ölçümü olmalıdır ⁷. 3. Günden önce glikoz takviyesi yapmayın.
7. Sıcaklık yönetimi (pasif)
   1. Hayvanın yüzey vücut sıcaklığını başlangıçta ameliyat öncesi ve ameliyat sonrası her ziyarette ölçün (Şekil 1a). Şekil 1f'de gösterildiği ve 1.1.4'te açıklandığı gibi ölçün. Değerleri not edin.
      NOT: Farelerde hipotermi, vücut sıcaklığının <35 °C ^24,25 olarak tanımlanır. Önceki veriler¹³, 34 °C'nin altındaki herhangi bir sıcaklığın inme sonrası destek için bir uyarı işareti olduğunu göstermektedir (aşağıya bakınız).
   2. 33 ila 34 °C arasında hipotermi gözlendiğinde, fareyi vücut sıcaklığına >34 °C) ulaşana kadar bir ısıtma plakası (veya başka bir pasif ısıtma cihazı) üzerindeki bir kafeste pasif olarak ısıtın. Hayvanın aktif ısı üretimi için enerji sağlamak üzere fareyi aktif olarak besleyin (daha uzun süreli enerji kaynağı).
      NOT: Hayvanı 1 ila birkaç saat pasif ısıtmada tutun. Her ne pahasına olursa olsun pasif hipertermiden kaçının.
   3. Hipotermi gözlendiğinde, <33 °C, deri altına ek glikoz uygulaması ile desteği artırın (hızlı ancak kısa süreli enerji kaynağı; yukarıdaki 1.6'ya bakın).
8. Genital organların ve/veya boyun yarasının temizlenmesi (lokal "dezenfeksiyonlar")
   NOT: Bazen, bir yara ayrışması veya üretral tıkaç gözlenebilir. Yara ayrışması nadirdir. Üretra tıkacı, fare genital organlarının ucunda bulunan sert bir tıkaçtır (Şekil 1g) ve özellikle inme şiddeti daha yüksek olan hayvanlarda daha sık görülür. Tıkaç üretrayı tıkadığında, üriner obstrüktif sendrom ortaya çıkabilir ve morbidite ve ölüme yol açabilir²⁶. Bu nedenle iyi bir şekilde temizlenmelidir.
   1. Varsa, çıkarılmasını kolaylaştırmak için üretral tıkacı normal tuzlu su ile ıslatın.
   2. Her hayvan kontrolünde/ziyaretinde üretral tıkacı küçük bir çubukla veya basit bir cımbızla nazikçe çıkarın. Üretrayı antiseptik bir solüsyonla ıslatılmış bir gauge veya çubuk kullanarak dezenfekte edin.
   3. Bir yara ayrışması varsa, herhangi bir yaygın cerrahi antiseptik solüsyonla (örneğin, Octanisept) lokal olarak dezenfekte edin ve tercihen 5/0 ipek sütür kullanarak yarayı rutin olarak dikin.

2. Deneysel İnme Ölçeğinin (fESS) odak bileşeni

1. Test alanını hazırlayın
   1. Dış uyaranları (optik veya kokular) gidermek için bir tezgahı %70 alkolle temizleyin ve Şekil 2a'da gösterildiği gibi test malzemelerini hazırlayın.
   2. Ek dosya 2 olarak verilen ESS puanlama sayfasını yazdırın ve testleri tek tek takip edin.
2. Ön bacak parezi (Test 1)
   1. Fareyi kuyruk tabanından nazikçe kaldırın ve tutun.
   2. Fare hareket ettikçe ön ayakların simetrik öne uzamasını ve simetrik hareketliliğini görsel olarak kontrol edin ve değerlendirin (Şekil 2c).
   3. Görsel bulgulara bağlı olarak skor şu şekildedir: Ön ayakların normal, simetrik ekstansiyonu ve hareketi için 0; 1 hafif fleksiyon ve / veya kontralezyonel ekstremitenin hareketinin azalması veya ekstremite sertliği olarak tanımlanan "hafif asimetri" için; 2 kontralezyonel ekstremitenin "belirgin fleksiyonu" için; 3 kontralezyonel uzuvun gövdeye yapışması için; Vücut veya uzuv hareketi olmaması için 4 puan.
      NOT: Test, kontralezyonel ön ayağın parezisini tespit eder. Aynı zamanda BS, LS, mNSS ve NS ölçeklerinin bir parçasıdır. Hayvanın kaçış manevraları nedeniyle skor 1'i tanımlamak zor olabilir.
3. Arka bacak parezi (Test 2)
   1. Test 1'de anlatıldığı gibi fareyi kuyruk tabanından tutmaya devam edin.
   2. Arka ayakların ve ayak parmaklarının simetrik uzamasını ve hareketini görsel olarak kontrol edin (Şekil 2c).
   3. Bulgulara bağlı olarak aşağıdaki gibi skor: Normal, simetrik pozisyon/ekstansiyon ve arka bacakların ve ayak parmaklarının hareketi için 0; 1 belirgin asimetri için, kontralateral (sağ) arka bacağın hareketi ve asimetrik pozisyonu/ekstansiyonu önemli ölçüde azaldığında (Şekil 2d).
      NOT: Test, kontralezyonel arka bacağın parezisini tespit eder. Aynı zamanda mNSS ölçeğinin bir parçasıdır. Bu testin doğru bir şekilde puan alması zor olabilir.
4. Gövde simetrisi (Test 3)
   1. Fareyi kuyruk tabanından tutmaya devam edin (2.3'ü takip edin.) ve gövde hareketlerini değerlendirin.
   2. Bulgulara bağlı olarak aşağıdaki gibi skor: normal, gövde fleksiyonu yok veya her iki tarafa simetrik hafif gövde fleksiyonu/hareketi ("kaçış" manevrası olarak) için 0; İşaretli (>30°) baş/gövde fleksiyonu için 1, ağırlıklı olarak kontralezyonel (sağa), tutulduktan sonraki ilk 10 saniye içinde.
      NOT: Test, tek taraflı motor lezyonlarında asimetriyi tespit eder. Aynı zamanda mNSS puanlamasının bir parçasıdır.
5. Daire çizme davranışı (Test 4)
   1. Fareyi nazikçe düz bir yüzeye yerleştirin ve en az 1 dakika serbestçe hareket etmesine izin verin. Hareket modelini gözlemleyin.
   2. Bulgulara bağlı olarak aşağıdaki gibi puan: Daire davranışı olmadan keşifçi, canlı, doğrusal hareket için 0; 1 kapalı çevrelerde değil, bir tarafa dönme eğilimi için; 2 kapalı dairelerde bir tarafa tutarsız hareket için; 3 kapalı dairelerde bir tarafa sürekli hareket için; 4 Dönmek, sallanmak veya hiç hareket etmemek için.
      NOT: Test, sensorimotor ve uzamsal navigasyon eksikliklerini tespit eder. Aynı zamanda NS'nin bir parçasıdır.
6. Vücut simetrisi (Test 5)
   1. Test 4'ten devam edin ve farenin düz yüzey üzerinde serbestçe hareket etmesine izin verin. Burundan kuyruğa eksenini gözlemleyin.
   2. Bulgulara bağlı olarak aşağıdaki gibi skor: Benchten yükseltilmiş gövde ve düz kuyruk ile normal duruş için 0; 1 "hafif asimetri" için, hafif gövde bir tarafa eğilirse ve distal olarak bükülmüş kuyruk ise; 2 "orta derecede asimetri" için: eğer barizse, vücut bükülmesi veya proksimal bükülmüş kuyruk ve/veya uzuvlar vücuttan dışarı doğru uzanarak kontralezyonel tarafa eğilme; 3 "belirgin asimetri" için, belirgin vücut bükülmesi varsa, bir taraf sürekli olarak bankta uzanır ve kuyruk açıkça proksimal olarak bükülür (skor 2'den fazla); 4 "Aşırı asimetri" için Vücut bükülmüşse, bir taraf sürekli olarak bankta yatar ve kuyruk oldukça bükülür.
      NOT: Sensorimotor tek taraflı trunkal ve tail defisitlerini tespit eder. Aynı zamanda NS ölçeğinin bir parçasıdır.
7. Yürüyüş değerlendirmesi (Test 6)
   1. Test 5'ten devam edin ve farenin düz yüzey üzerinde serbestçe hareket etmesine izin verin. Şimdi yürüyüşünü gözlemleyin ve parezi, uzuv sertliği, spastik yürüyüş, uzuv gibi yürüme motor eksikliklerini kontrol edin.
   2. Bulgulara bağlı olarak aşağıdaki gibi puanlayın: Vücut altında "gizli" hareket eden esnek uzuvlarla keşifçi, simetrik ve hızlı ise normal yürüyüş için 0; 1 serbestçe hareket eden bir farenin topallamadan sert, esnek olmayan ve daha yavaş yürüyüşü için; 2 asimetrik (sol-sağ) hareketlerle net topallama için; 3 hafifçe ittikten sonra titreme, sürüklenme veya düşme için; 4 Spontan yürüyüş yapmamak için (hafif itme ile uyarıldığında 3 adımdan fazla yürümez).
      NOT: Kombine yürüyüş açıklarını tespit eder. Aynı zamanda NS'nin bir parçasıdır.
8. Zorunlu daire içi dolaşım (Test 7)
   1. Fareyi yüzeyden kaldırmak için kuyruk tabanından tutun ve sadece ön ayakları üzerinde yürümesine izin verin. Hareketini gözlemleyin.
   2. Bulgulara bağlı olarak aşağıdaki gibi puan: Normal doğrusal hareket için 0; 1 bir tarafa dönme eğilimi için; 2 kapalı dairelerde bir tarafa dönmek için; 3 beceriksiz hareketlerle bir tarafa dönüyorsa veya yavaş yavaş bir şekilde bir daireyi tamamlayamıyorsa; 4 İlerleme yoksa ve bagajın ön kısmı bankta bulunursa.
      NOT: Test, daire çizme davranışı testini tamamlar (test 4, bkz. 2.5). Muhtemelen sensorimotor ve mekansal eksiklikleri tespit eder. Aynı zamanda NS puanlama sisteminin bir parçasıdır.
9. Yanal kuvvetlere karşı duruş (Test 8)
   1. Fareyi, kuyruk burun ekseni (uzunlamasına) sagital avuç içi eksenine paralel olacak şekilde avuç içine yerleştirin.
   2. Uzunlamasına eksenine dik kuvvetler oluşturmak için fareyi sabit bir hızda ileri ve geri doğru sallayın.
      NOT: Bu, fareyi dik konumunu korumaya ve salınım sırasında yanal kuvvetlere karşı dengede kalmaya zorlar. Vücudu normalde avuç içi veya parmaklarla temas etmez.
   3. Görseli gözlemleyin ve farenin sol-sağ taraflarının avuç içi temaslarını, salınıma karşı dengede dururken hissedin. Herhangi bir asimetrik düşme olup olmadığını kontrol edin, avuç içine dokunun veya yanal zayıflık belirtisi olup olmadığını kontrol edin.
   4. Bulgulara bağlı olarak aşağıdaki gibi puanlayın: Fare, sırtı avuç içine paralel olacak şekilde normal dik pozisyonda duruyorsa ve avuç içine yoğun bir şekilde dokunmadan sallanmaya karşı denge sağlayabiliyorsa 0; 1 fare, stabilite kazanmak için salınım sırasında vücudunu düzleştirirse; 2 Farenin bir kısmı sallanma sırasında avuç içine kısa bir süre uzanır veya dokunursa; 3 fare bir tarafta yatarsa, dik pozisyonu zar zor geri kazanabilir; 4 Fare yüzüstü pozisyonda yatarsa, dik pozisyonu geri kazanamaz.
      NOT: Test, yanal ivmelenmeye karşı postüral eksiklikleri tespit eder, ancak puanlaması subjektif olabilir. Aynı zamanda mNSS, NS'nin bir parçasıdır.
10. Ön uzuv hedefli yerleştirme (Test 9)
    1. Fareyi sırtından veya kuyruk tabanından tutun. "Ulaşılacak hedef" olarak işlev gören ışına dik olarak yönlendirin. Simetrik "uzanma" ve kavrama için gözlemleyin.
    2. Işını sabit bir şekilde kavradıktan sonra, yavaşça çekin ve ön ayakların simetrik "serbest kalmasını" gözlemleyin.
    3. Bulgulara bağlı olarak aşağıdaki gibi puanlayın: simetrik "uzanma", kavrama ve "bırakma" için 0; 1 "Uzanma" ve/veya "serbest bırakma" asimetrisindeki herhangi bir asimetri için, kontralezyonel ön ayak zayıflığının göstergesidir.
11. Ön ayakların sensorimotor açığı (Test 10)
    1. Fareyi sırtından sıkıca tutun ve ventral olarak yüzünüzü çevirin (videoya veya Şekil 1e'ye bakın).
    2. Ön ayakları kör bir açıdan ince bir uçla (örneğin tahta kürdan) art arda uyarın. Ön pençenin tepkisini gözlemleyin.
    3. Bulgulara bağlı olarak aşağıdaki gibi puanlayın: Her iki taraftaki normal, hızlı kavrama hareketi için 0; 1 eksik veya açıkça gecikmiş kontralezyonel kavrama için.
       NOT: Hem 2.10 hem de 2.11, ön ayak ince sensorimotor eksiklikleri için test eder. Bunlar aynı zamanda mNSS'nin bir parçasıdır.
12. Kiriş yürüyüşü (Test 11)
    1. Yerden 1-1,5 m yükseklikte iki yükseltilmiş yüzeyi (örn. banklar, masalar) birbirine bağlamak için 1 m uzunluğunda bir ahşap kiriş (Malzeme Tablosu) yerleştirin. Titreşimleri veya dengesizliği önlemek için kirişin kenarlarını sabitleyin.
    2. Fareyi, burun-kuyruk ekseni kirişe paralel olacak şekilde kirişin ortasına yerleştirin (Şekil 2e). Kiriş üzerinde dengeye veya serbest yürüyüşe izin verin. Dengesini veya uzuv parezisini ve düşmelerini gözlemleyin.
       NOT: Fare, puanlamadan önce ışın üzerinde denge kazanmalıdır. Düşerse korumak için hayvanın altında (yaklaşık 15-20 cm mesafede) kalın bir eldiven tutun.
    3. Bulgulara bağlı olarak aşağıdaki gibi puanlayın: Fare dengede kalır ve ışının bir tarafına doğru sabit bir duruşla yürürse 0; 1 kirişin kenarını kavrar ve üzerinde yürümezse; 2 bir uzuv kirişten düşerse; 3 kirişten iki uzuv düşerse; 4 fare ışın üzerinde dengede durmaya çalışır ancak düşerse (40 saniye sonra); 5 20-40 saniye arasında düşerse; Kirişi dengelemeye veya asmaya teşebbüs etmeden düşerse 6 puan (<20s).
       NOT: Test, ön ayakların, arka ayakların ve gövdenin birleşik motor eksikliklerini tespit eder. Aynı zamanda mNSS ölçeğinin bir parçasıdır.
13. Bıyık hissi (Test 12)
    1. Fareyi açık bir tezgah üstüne yerleştirin (test 4 ve 5'te olduğu gibi). Konaklama için biraz zaman tanıyın.
    2. Sol ve sağ bıyıklarını ince, uzun uçlu bir pamuklu çubukla "kör açıdan" art arda uyarın. Başın stimülasyona doğru hızlı bir dönüş tepkisi olup olmadığını gözlemleyin.
    3. Bulgulara bağlı olarak skor aşağıdaki gibidir: stimülasyon üzerine normal, hızlı baş dönüşü için 0, iki taraflı; 1 stimülasyon üzerine daha yavaş kontralezyonel yanıt için; 2 kontralezyonel yanıt yok (dönüş yok); 3 eksik kontralezyonel ve daha yavaş ipsilezyonel yanıt için; İki taraflı eksik yanıt için 4.
       NOT: Pamuğun görsel olarak algılanmasından kaçının çünkü bu, yanlış bir şekilde ipsilateral bir kafa dönüşüne neden olur. Test, yalnızca fare bıyık stimülasyonuna "şaşırdığında" teknik olarak doğrudur. Test aynı zamanda NS'nin bir parçasıdır ve bıyıkların (varil korteksi) sensorimotor eksikliklerini tespit eder.
14. Tırmanma (Test 13)
    1. Kauçuk kaplı, 45° açılı, eğimli bir yüzey kullanın (Şekil 2a) ve fareyi ortasına yerleştirin. Farenin tırmanma çabasını gözlemleyin.
    2. Bulgulara bağlı olarak aşağıdaki gibi puanlayın: Fare hızlı ve zahmetsizce yüzeyin üstüne tırmanırsa 0 (normal); 1 zorlanma ile tırmanırsa, uzuv zayıflığı ile; 2 kaymadan veya tırmanmadan eğime tutunuyorsa; 3 düşmeyi önleme çabasına rağmen eğimden aşağı kayarsa; 4 Düşmeyi önlemek için çaba sarf etmeden kayarsa.
       NOT: Test aynı zamanda NS'nin bir parçasıdır ve genel motor gücünü tespit eder.
15. 1'den 13'e kadar olan tüm testlerden alınan puanları toplayarak fESS puanını hesaplayın
    NOT: 0 fESS puanı normal bir fareyi gösterir, maksimum puan 42'dir. Striatal ve kortikal lezyonları olan büyük enfarktlar genellikle >7-9 skorlara neden olur. Normal davranış varyasyonlarına uyum sağlamak ve yanlış pozitif fESS skorlamasını azaltmak için felç geçirmiş fareleri değerlendirmeye başlamadan önce birkaç normal fareyi inceleyin ve puanlayın. Tüm deney boyunca puanlamanın standardizasyonu için sağlanan video protokolünü sürekli olarak kullanın.

3. ESS'nin (gESS) genel bileşeni

NOT: Genellikle fMCAo'dan sonraki ilk 1-2 hafta boyunca mevcut olan iltihaplanma veya enfeksiyon gibi "genel fare hastalığı" belirtilerini tespit etmek için gESS'yi değerlendirin. Ek dosya 2'deki puanlama sayfasını kullanın. gESS'yi tercihen fESS'yi tamamladıktan sonra değerlendirin.

1. Fareyi düz bir yüzeye (bank) yerleştirin ve 2.5'teki gibi serbestçe hareket etmesini sağlayın. Aşağıdaki puanları sırayla değerlendirin.
2. Kürkünü gözlemleyin. gESS puanlama sayfasına göre puan verin (0-2 puanlar, Ek dosya 2'ye bakınız).
3. Farenin irkilme tepkisini kontrol edin: Rahatladığında kör bir açıdan ani bir alkışlama ile fareyi şaşırtın. Farenin kulaklarının reaksiyonunu gESS puanlama sayfasına göre kontrol edin ve puanlayın (0-2 puanları, bkz. Ek dosya 2).
4. Rahatlamış farenin gözlerini görsel olarak değerlendirin: açık/kapalı gözler veya mukus varlığını kontrol edin. gESS puanlama sayfasına göre puan verin (0-4 puanlar, Ek dosya 2'ye bakınız).
5. Farenin genel spontan aktivitesini ve uyanıklığını gözlemleyin. gESS puanlama sayfasına göre puan verin (0-4 puanlar, Ek dosya 2'ye bakınız).
6. Herhangi bir işlem sırasında herhangi bir kaygı, aşırı uyarılabilirlik, saldırganlık veya ekseni boyunca dönme varlığı için farenin genel spontan davranışını gözlemleyin. gESS puanlama sayfasına göre puan verin (0-4 puanlar, Ek dosya 2'ye bakınız).
7. Yukarıdaki tüm adımların puanlarını toplayarak gESS puanını hesaplayın (gözlemsel puanlama, 3.2. ila 3.6. adımlar).
   NOT: gESS skoru, inme lezyonlarının neden olduğu fokal eksiklikleri tespit etmez ve daha önce gösterildiği gibi mSU'dan etkilenmez ¹³. Tüm testler NS ölçeği ^9,15'ten uyarlanmıştır.

4. Silindir Testi ile ön ayak eksikliklerinin ölçülmesi

NOT: Silindir testi daha önce ^9,15,27 numaralı maddelerde açıklanmıştır ve burada ayrıntılı olarak açıklanmayacaktır. Silindir testi, ön ayakların eksikliklerini tarafsız bir şekilde ölçen bağımsız bir davranış testidir (bkz. 4.2).

1. Burada verilen talimatları izleyerek testi çalıştırın¹⁵. Videoları çekin ve ^15'teki gibi analiz edin. Duvarlara sağ ve sol ilk uzuv temasını ölçün. Şekil 3a,b, kurulumun resimlerini göstermektedir.
2. Kontralezyonel (sağ) parezi nedeniyle uzuv kullanımının lateralizasyonunu % yüzde olarak hesaplayın. Şu formülü kullanın: Sol adımlar için % tercih = [(sol - sağ) ilk kişiler / (sağ + sol) kişiler] x 100.
   NOT: Bir vuruş oluşturmadan önce her fare için bir temel silindir testi çalıştırın. Her deney planına göre zaman noktalarında testler yapın.

5. Merdiven basamağı Testi ile ön ve arka bacak eksikliklerinin ölçülmesi

NOT: Fareler için aparatı Pleksiglastan yapın ( Şekil 3c'de gösterilmiştir): 20 cm yüksekliğinde duvarları olan 1 m uzunluğunda bir koridor, 15 mm'lik düzenli aralıklarla yerleştirilmiş plastik basamaklar (3 mm çapında) (Şekil 3c1) ve distal uçta bir "sığınak" kutusu. Tanıdık olması için hayvan yataklarını sığınma kutusuna koyun ve ödül olarak biraz yiyecek peletleri veya fıstık ezmesi koyun. Koridorun genişliği 10 cm olmalı ve yerden yaklaşık 30 cm yükseltilmelidir.

1. Fareleri, deneyin taban çizgisinden 1-3 gün önce cihaz üzerinde eğitin. Eğitimi 5.1.1 ile 5.1.4 arasındaki adımlarda olduğu gibi çalıştırın.
   NOT: Hayvanları sabit hızda, basamaklı koridorda durmadan, dönmeden veya keşif davranışı olmadan normal bir yürüyüşe alıştırmak için eğitim gereklidir. Arka arkaya 2 gün (2 seans) egzersiz yapın. Her antrenman seansı 3 koşudan oluşur (koşu = tüm koridor boyunca sığınma kutusuna doğru tek bir yürüyüş). Takip için temel verilerin toplanması gereklidir.
   1. Kokuları ve farenin "keşfedici" dikkat dağıtıcı unsurlarını/duraklarını önlemek için her çalıştırmadan önce basamakları ve duvarları %70 alkolle temizleyin.
   2. Bir koşuya başlamak için fareyi merdiven basamağı koridorunun başına, sığınma kutusuna bakacak şekilde konumlandırın. Farenin koridorun sonundaki sığınma kutusuna doğru serbestçe yürümesine izin verin. Hayvanı yürümeye zorlamayın.
      NOT: Antrenman sırasındaki koşular normalde süre ve yürüyüş şekli açısından oldukça değişkendir. Eğitimin amacı, genellikle <10 s içinde, durmadan/dönüş yapmadan, sığınma kutusuna doğru istikrarlı bir yürüyüştür ve bu genellikle ikinci eğitim gününün sonunda elde edilir. Uygun eğitimin dikkatini dağıtacak stres indüksiyonunu önlemek için hayvanı her zaman nazikçe tutun. Hayvanları koridordan çıkarın ve koridorda kalırlarsa koşuyu yeniden yapın ve alışkanlıktan kaçınmak için >1 dakika boyunca yerel olarak keşfedin.
   3. 1^{. eğitim çalışmasını} gerçekleştirin. 1^{. koşudan} sonra hayvanı sığınma kutusunda 5 dakika dinlendirin.
      NOT: Bu uzun dinlenme süresi, farenin sığınma kutusunu tanımasına ve onu ulaşılması gereken bir "dinlenme/ödüllendirme" hedefi olarak algılamasına olanak tanır. Sığınma kutusunun "ödüllendirici bir algısını" elde etmek, başarılı koşular için çok önemlidir.
   4. Fareyi sığınma kutusundan çıkarın ve 5.1.2'deki gibi ikinci ve üçüncü eğitim çalıştırmalarını gerçekleştirin. Alışkanlığı önlemek için bu koşuların sonunda (30-60 s) sığınma kutusunda daha kısa dinlenme süresine izin verin.
      NOT: Eğitim 2. gün tamamlanmaktadır. 2. günde, hemen hemen tüm hayvanlar koridorda sabit bir hızda yürümeyi öğrenir. Öğrenmiyorlarsa hayvanları daha fazla deneyden dışlamayı düşünün.
2. Deneyi eğitimli fareler üzerinde çalıştırın. Fareleri, deneyin ve taban çizgisinin tüm zaman noktaları boyunca her seferinde 2 çalıştırma için test edin.
   1. Çalıştırmaları adım 5.1.1 ve 5.1.2'de açıklandığı gibi gerçekleştirin. Sığınma kutusundaki 5 çalışma arasında en fazla 2 dakika dinlenme süresi tanıyın.
   2. Hayvanların videolarını (verileri) belirli bir mesafeden hafif ventral ve "kör" bir açıyla yakalamak için bir akıllı telefon (veya eşdeğer kamera) ve bir "selfie çubuğu" kullanın ( Şekil 3c2'de gösterildiği gibi). Hayvan koridorda yürürken uzuvları yakaladığınızdan emin olun. Koşu sırasında farenin dikkatini görsel olarak dağıtmayın ve koşusu sırasında uzuvlarını takip edin (Şekil 3c2).
   3. Her iki çalıştırmayı da kaydedin, ancak ikinci çalıştırmadaki verileri kullanın ve analiz edin.
   4. Her bir uzuv (sol/sağ, ön/arka bacak) için basamaklar arasındaki hata adımlarının (düşme) sayısını ölçün (Şekil 3c3), videoyu ağır çekim seçeneklerine sahip herhangi bir medya oynatıcı yazılımı kullanarak inceleyin. Ön ve arka ayaklar için ayrı ayrı sağ ve sol kol arıza adımları arasındaki mutlak veya % farkı hesaplayın.
      NOT: İkinci çalıştırma daha güvenilir sonuçlar verir. Sağlıklı bir fare, ikinci çalışması sırasında genellikle uzuv başına (sağ veya sol) 0-1 keyfi hata adımına sahiptir, bu da normalde 0 ±1'lik bir fark aralığı verir. İnme geçirmiş bir fare, sağ (kontralezyonel) paretik uzvu (ön veya arka bacak) ile hata adımları atacak ve bu da pozitif bir "sağa doğru" yanallaşma ile sonuçlanacaktır. Şiddetli şekilde inme geçirmiş bir hayvan, inmeden sonraki ilk 7-10 gün boyunca daha yavaş olabilir veya koşuyu tamamlayamayabilir, ancak daha sonra uygun koşular elde edecek ve ciddi eksiklikler gösterecektir.

mSU, yukarıda açıklandığı gibi, fMCAo işleminden sonra başlar. fMCAo stroke ve sham'ın iki bağımsız fare kohortundaki temsili sonuçlarımız (Şekil 4a), özellikle 3. ve 10. günler arasındaki kritik dönemde daha önce kanıtlanmış mSU'nun değerini doğrulamaktadır¹³. Kohortlarımızda, inme patofizyolojisinin bir parçası olarak Kohort 1'in 3/15'inde (inme, 6 aylık takip), Kohort 2'nin 2/10'unda (inme, 14 günlük takip) ve sahte ameliyatlı hayvanlarda (Şekil 4a) 0/6'sında mortalite meydana geldi (tümü sabah ziyaretleri sırasında ölü bulundu) ve skorlamaya dahil edildi. Önceden tanımlanmış insancıl uç noktalara göre hiçbir hayvana ötenazi uygulanmadı. Faz A (fMCAo'dan sonraki ilk 24-48 saat) (Şekil 4a) içindeki bu akut mortalite (% 10-15), büyük bölgesel inmelerden⁽¹³) kaynaklanan hemisferik ödem ve fıtıklaşmaya bağlandı ve translasyonel inme modellemesinin bir parçası olarak bekleniyordu. Faz B sırasında gecikmiş mortalite (kohort 1 için 1/15, kohort 2 için 1/10) mSU protokolü kapsamında maksimum %5-10 eklenmiştir (Şekil 4a) ve genellikle mSU desteğine rağmen kurtarılamayan çok büyük felçli hayvanlarda görülür. Bu aynı zamanda şiddete bağlı insan inme sonrası mortaliteyi de doğrudan tercüme eder²⁹. mSU'nun hiç uygulanmaması veya ilkelerine düşük bağlılık, Faz B mortalitesinin %60-90'a bile ulaşabilen artmasına neden ^olur13. Faz C normalde daha fazla mortaliteden yoksundur.

mSU'nun uygulanmasından sonra, büyük felçli fareler kritik faz B'nin ötesinde hayatta kalır ve önemli nörolojik eksiklikler gösterir. Verilerimiz, fESS'in standartlaştırılmış kullanımının farelerde hem fMCAo'nun neden olduğu eksiklikleri hem de spontan iyileşmeyi tespit ettiğini ve ölçtüğünü göstermektedir (Şekil 4b) ve fokal Neuroscore (NS), mNSS ve Bederson (BE) ölçekleri ^9,10,12,14 gibi önceki ölçeklerden daha iyi performans gösterir veya bunlarla eşleşir. Doğrudan istatistiksel olarak karşılaştırılabilir olmasa da, fESS akut fazda benzer veya daha yüksek duyarlılık gösterir, fMCAo'dan sonra spontan nörolojik iyileşmeyi yakalar ve diğer ölçeklere kıyasla inme sonrası 6 aya kadar açığa duyarlı kalır. Bu, fare vuruşundan sonra translasyonel ve hassas puanlama için kullanımını destekler ve mevcut video protokolü, puanlama nesnelliğinin artmasını sağlar.

fESS'ye ek olarak, Merdiven basamağı ve Silindir testleri, ön ve arka bacak parezisini ölçerek uzun süreli nörolojik skorlama ve izlemeyi tamamlayabilir. Her test, video çekimi için hayvan başına yaklaşık 5-7 dakika ve manuel video analizi için 5-15 dakika gerektirir. Temsili sonuçlar, fare Merdiven basamağı testinde yürürken basamaklar arasında artan uzuv düşüşleridir (sol vuruş için sağ % lateralizasyon ile sonuçlanır) ve Silindir testi için sağlıklı sol ön ayak ile "tercih edilen" bir duvara dokunma (sol vuruş için sol % lateralizasyon ile sonuçlanır). 6 aylık kohort için temsili verilerimiz, Merdiven basamağı testinin akut/subakut fazlarda ön ayak parezisini tespit edebildiğini, ancak daha sonra spontan iyileşme nedeniyle duyarlılığını kaybettiğini göstermektedir (Şekil 4c, zaman için p<0.05 ve grup farkı için p<0.01, karma etkiler modeli), ancak 6 aya kadar arka bacak parezisini tespit etmede ve ölçmede daha sağlam kalmaktadır (Şekil 4d, s<0.05 grup farkı, karışık etkiler modeli için). Paralel olarak, Silindir testi, fMCAo'dan 6 ay sonrasına kadar ön ayak parezisini tespit etmede mükemmel bir hassasiyet sağlar (Şekil 4e, grup farkı için p<0.001, karışık etkiler modeli). Kombine olarak, her iki test de uzun vadeli ön ve arka bacak parezisini etkili bir şekilde tespit eder, ölçer ve izler.

Şekil 1. fMCAo sonrası mSU destek protokolü. (A) mSU için kullanılan araç ve gereçler. (B) normal gıdanın toz haline getirilmesi (gıda blenderi veya başka bir cihaz ile) ve jel gıdanın aktif (şırınga ile) ve pasif (petri kabı) besleme desteği için yapılması. (C) Jel-gıda ve katı peletler, hayvanların kafesine birkaç gün önce (konaklama için) ve fMCAo'dan sonra yerleştirilmelidir (ve her gün taze olarak değiştirilmelidir); Hayvanların jel yiyecekleri yatakların altına saklaması beklenir. (D) şırınga beslemesi için aktif kavrama (kırmızı oklar parmaklarla sol yanak stabilizasyonunu, ok ucu kürk kavramayı gösterir). (E) şırınganın ağza sokulması, sağ yanağa işaret etmesi (ok). (F) Vücut yüzey sıcaklığı ölçümünün vitrini (sıcaklık ölçümü için ventral gövdenin ortasındaki kırmızı alan ve ok noktası). (G) üretra tıkacı (ok). (H) mSU desteği altında kronik inme deneyleri için önerilen zaman çizelgesi (bsl: başlangıç, h: saat, d: gün ve m: değerlendirme zaman noktaları olarak aylar), ESS, Merdiven basamağı ve Silindir testleri kullanılarak önerilen puanlama. Bu zaman çizelgesi burada 1 (6 günlük takip) ve 2 (14 günlük takip) numaralı kohortlar için kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Deneysel vuruş ölçeği. (A) ESS testi için araçlar, (B) inmeli temsili beyin dilimleri (sol yarı, Nissl boyası) ve bunların karşılık gelen Allen Beyin haritasının örtüşmesi, öneroposterior olarak bregma+1.0 ve -0.3 mm'de (Bu şekil Allen Mouse Brain Atlas, mouse.brain-map.org ve atlas.brain-map.org'dan değiştirilmiştir)³⁰. (C) fESS'nin ön ayak, arka bacak ve gövde simetri testleri için kuyruk tabanı tarafından hayvan süspansiyonu, gri noktalı daireler ön ve arka ayakların normal simetrisini gösterir. (D) Paretik sağ arka bacağın açık asimetrisi (asimetrik pozisyon/ekstansiyon). (E) bir hayvanın kiriş üzerindeki normal konumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Merdiven basamağı ve Silindir testlerinin kurulumu. (A) Silindir testinin kurulumu, dikey aynalar ön ayaklarının 360 ° görünümünü kolaylaştırırken silindirin içinde bir fare bulunur. (B) sol ön ayakla silindir duvarına temas (kullanım) ile hayvanın yakından görünümü. (C) Fareler için Merdiven basamağı testinin ayrıntılarını görüntüleyin ve tasarlayın (boyutlar ve yapım talimatları için ayrıca metne bakınız); (C1) Merdiven basamağı koridorunda yukarıdan normal bir fareyi gösterir, (C2) basamaklara doğru adım atan normal bir fareyi gösterir (düşme yok), (C3) basamaklar arasında bir ön ayak düşüşünü gösterir (görüntüler videolardan alınmıştır). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. fMCAo sonrası uzun süreli sağkalım ve nörolojik eksiklikler. (A) İki bağımsız hayvan kohortunda mSU etkinliğinin replikasyonu: ilkinde fareler 6 ay boyunca gözlendi ve ikinci hayvanlarda inmeyi takiben 14 gün boyunca gözlendi. (B) Her iki kohort için farklı, iyi kurulmuş, nörolojik ölçeklerin puanları. (C) Ön bacak ve (D) sağ tarafın arka bacak motor eksiklikleri (= sırasıyla ön ve arka bacaklar için sağ - sol yanlış adımlar), 6 aylık hayvan kohortumuzda Merdiven basamağı testi ile tespit edildi, sahte olarak ameliyat edilen hayvanlara karşı. (E) 6 aylık hayvan kohortumuzda, sahte olarak ameliyat edilen hayvanlara karşı Silindir testi ile tespit edilen ön bacak asimetrisi sonuçları (sağlıklı sol ön ayağın kullanımı için % tercih olarak). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. Yazılım arayüzü: Günlük RSS puanlarını hesaplayan 3 hayvan örneği. Eylemler ve RSS, Aşama B ve C için geçerlidir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1. Günlük Risk Sınıflandırma Skorunun (RSS) tanımı ve her hayvan için ortaya çıkan destek eylemleri. Skoru 0-1 olan hayvanlar minimum ölüm riskine sahipken, 5-6 arası olanlar maksimum bir ölüm riskine sahiptir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1. fMCAo işlemi ve mSU takibi sırasında hayvanların izlenmesi ve belgelenmesi için önerilen şablon. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2. Odak ve genel ESS için önerilen puanlama sayfası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Mevcut protokol, fMCAo model¹³ tarafından büyük bölgesel vuruşlara maruz kalan farelerde 3-10. günler arasındaki artefakt mortalitesini azaltmak için tasarlanmış mSU destek protokolü için kapsamlı bir kılavuzdur. Ek olarak, mevcut protokol, inme sonrası farelerde nörolojik fokal skorlamanın genişletilmiş öznelliğini ve yanlılığını azaltmak için ESS ölçeğinin (fESS) odak bileşeni için standartlaştırılmış bir video kılavuzu içerir. Bunun yanı sıra, uzun süreli (6 aya kadar) kontralezyonel ön ve arka bacak motor eksikliklerini ölçmek için Merdiven basamağı testini tanıtıyoruz.

mSU kullanıcı dostu ve etkilidir. Video destekli protokolümüz, mSU'yu deneyimli olmayan araştırmacılar için bile uygulama için net hale getirir. mSU'nun 3 aşaması (yani faz A, B ve C, yukarıdaki protokolün 1. bölümüne bakınız ve Şekil 1h), değerlendirmesini ve destekleyici tedbirlerini uyarlamak için ampirik olarak tanımlanmıştır. mSU, müdahalelerini günlük olarak her aşamaya göre ve her farenin Risk Sınıflandırma Skoru (RSS) puanına bağlı olarak uyarlar. Bu skor klinik şiddetini yansıtır, gerçek mortalite riski için bir tahmin verir ve fare başına özel desteğini yönlendirir. Buna ek olarak, hayvanın sadece klinik gözlemi, özel mSU desteği için her zaman bilgi eklemelidir. Sonunda, mSU, farelerde fMCAo sonrası ilk ^3-10 günün kritik aşamasında sıcaklık kontrolü, sıvı dengesi, enfeksiyon önleme/tedavisi, beslenme desteği ve normoglisemi ^1,2,7 dahil olmak üzere insan İnme Ünitesi (SU) desteğinin temel bileşenlerini translasyonel olarak uygular ¹³. Daha da önemlisi, mSU'nun artefakt mortaliteyi %60-90'dan %<15'e13,31 düşürmedeki etkinliği bağımsız araştırma gruplarında başarılı bir şekilde yeniden üretilmiştir 17,18,32,33.

mSU protokolünün başarısı için birkaç kritik adım gereklidir. İlk olarak, mSU yakın klinik gözlem ve optimal hayvan desteğine dayanırken, iş yükünü azaltmak için vardiyalı olarak çalışan en az iki araştırmacıdan oluşan bir ekibin olması tavsiye edilir, ancak bir araştırmacı bunu tek başına da yönetebilir. İkincisi, destek için en kritik zaman noktaları, enerji taleplerinin daha yüksek olduğu gece artış fare aktivitesinin başlangıcına ve bitişine karşılık gelen 22:00 ve⁰⁸:00 civarındadır 13,22,23. Üçüncüsü, mevcut klinik inme kılavuzlarına⁷ uygun olarak, nörotoksik inme sonrası hiperglisemiyi önlemek için glikoz takviyesi dikkatli bir şekilde uyarlanmalı ve minimal olmalıdır. Dördüncüsü, azaltılmış iş yükünü etkili yemleme ile dengelemek için aktif yemleme, ağız dolusu 40-60μl'lik kademeli olarak uygulanan 5-10 hayvanlık bloklar halinde gerçekleştirilmelidir. Son olarak, mSU'nun yoğunluğu, vuruş şiddetine bağlı olarak her farenin ihtiyaçlarına ve RSS puanına göre uyarlanmalıdır. Bu pratik, küçük vuruşlu farelerin daha kısa ve daha az yoğun desteğe ihtiyaç duyabileceği anlamına gelirken, daha büyük vuruşlu farelerin ölüm riskini azaltmak için 14. günden sonra bile desteğe ihtiyaç duyabileceği anlamına gelir.

Farelerde nörolojik puanlama, küçük boyutları ve eksiklikleri tespit etme zorluğu nedeniyle her zaman oldukça öznel ve zorlayıcı olmuştur. Bunlara bağlı olarak, önceki tüm inme ölçekleri (BS, mBS, LS, mNSS, GS, NS, ayrıca girişe bakınız) ya ham belirtileri tespit eder (örneğin, BS, mBS ve LS'nin 3 ila 5 puanlık ölçekleri), fokal ile genel inme sonrası semptomları karıştırır (örn., NS), inmenin akut fazının ötesindeki ince açıkları yakalayamaz ^8,9 (örneğin, 3 noktalı BS ¹⁰, 5 noktalı mBS ¹¹ veya 5 noktalı LS⁶) veya inme sonrası uzun vadeli spontan iyileşmeyi ölçemez. Tüm bunları iyileştirmek için, daha önce¹³, önceki ölçeklerdeki bileşenleri eleştirel bir şekilde birleştirerek veya çıkararak, fMCAo model²⁰ tarafından yaygın olarak etkilenen alanları değerlendirebilen bir araç oluşturarak ESS'yi (fESS/gESS) geliştirdik (Şekil 2b). Şimdi, görsel rehberlik sunmak ve laboratuvarlar ve araştırmacılar arasında uzun süredir devam eden öznellik sınırlamasını çözmek için fESS'in ilk video standardizasyonunu da sağlıyoruz. Verilerimiz, fESS'nin farelerde odak, inme ile ilgili eksiklikleri tespit etmede mBS ve mNSS ölçeklerinden daha iyi performans gösterdiğini veya NS'ye eşit olduğunu desteklemektedir (Şekil 4b) ve aynı zamanda devam eden uzun vadeli inme sonrası spontan iyileşmeyi de yakalar. Sağlanan video standardizasyonu, inme sonrası eksikliklerin tutarlı bir şekilde değerlendirilmesi için artık güvenilir bir eğitim aracı olarak hizmet vermektedir.

fESS'ye ek olarak, ön ayak ve arka bacak parezisini veya uzun vadede (6 aya kadar) karşılık gelen iyileşmeleri ölçmek için bir dizi test olarak Merdiven basamağı testini ve daha önce açıklanan Silindir testi^15'i kullanmanızı öneririz. Hayvan içi uzuv analizi için, her iki test için de temel değerlendirmeler gereklidir. Daha önce ^{sıçanlarda 34,35} kullanılan merdiven basamağı testi, burada fareler için uyarlanmış ve açıklanmıştır. Pratik olarak, test kritik bir şekilde, basamak koridorunda dönüş veya durma olmaksızın sabit bir yürüyüş modeline bağlıdır. Bunun için, her bir zaman noktasındaki ikinci çalışmayı analiz etmenizi öneririz, çünkü tipik olarak en stabil yürüme pattenini verir. Alışkanlık olmadan uygun eğitim, yukarıdaki protokolde belirtildiği gibi güvenilir sonuçlar için çok önemlidir. Hem Merdiven basamağı hem de Silindir testlerinin bir sınırlaması, büyük stroklu farelerin AB fazı sırasında (Şekil 4c-e'de 3. ve 7. günler) hiç hareket edememesidir, bu nedenle veri sağlamaz ve varyansı artırır; bu fareler genellikle faz C sırasında maksimum hata adımlarını gösterir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek ve hayvanların stresini en aza indirmek için, fareleri Faz B'nin sonundan itibaren (örneğin, 10. gün >) test etmenizi öneririz. Diğer bir sınırlama, Merdiven basamağı testinin ön ayak açıkları için duyarlılığını kaybetmiş gibi görünmesidir, ancak bu, Silindir testi ile telafi edilir. Sonunda, bu testler birleştirildiğinde hem ön hem de arka bacak eksikliklerini ve bunların uzun vadeli spontan iyileşmelerini objektif olarak ölçebilir.

Sonuç olarak, translasyonel fare vuruşu modelleri için standart bakım olarak mSU'yu öneriyoruz. Aynı zamanda, farelerde uzun vadeli strok eksikliklerini ölçmek için basit, zaman açısından verimli, uygun maliyetli, kantitatif olarak hassas bir test bataryası olarak eşlik eden ESS (fESS/gESS), Merdiven basamağı testi ve Silindir testini öneriyoruz. Sonunda, mSU gelecekte, yoğun, klinik olarak translasyonel, fare desteğinin gerekli olduğu ciddi beyin lezyonlarını (örneğin travmatik beyin hasarı, beyin kanaması modelleri, vb.) içeren başka herhangi bir fare modelinde uygulanabilir.

Bildirilecek açıklama yok.

Çalışmanın bazı bölümlerinde değerli cerrahi destek için Nikolaos Plakopitis ve Ioannis Tatsidis'e teşekkür ederiz.