トランスレーショナルマウス脳卒中研究のための標準化された神経学的スコアリングを備えたマウス脳卒中ユニットプロトコル

この記事では、高度に翻訳され、独立して証明されたマウスストロークユニット(mSU)の概念を大脳卒中マウスで実行するためのプロトコルを紹介します。また、マウスの焦点実験脳卒中スケールを実行するための標準化されたプロトコルを提供し、長期的に検出された脳卒中焦点欠損を評価します。

中動脈閉塞症のフィラメントモデル (fMCAo) は、おそらく最も並進的なマウス脳卒中モデルであり、血管内再灌流/再開通を伴う制御された虚血を可能にします。しかし、脳卒中治療の現在の臨床の進歩(脳卒中ユニットなど)との整合性が欠けており、通常は検査室間で主観的または曖昧な神経学的スコアリングを採用しており、急性期の死亡率が高いことを示しています。ここでは、検証済みのビデオガイド付きプロトコルでこれらの制限に対処します。マウス脳卒中ユニット(mSU)プロトコルと、教育ビデオと決定アルゴリズム(Risk Stratification Score)を紹介し、臨床とマウス脳卒中モデリングの間のギャップを埋めます。脳卒中の神経学的スコアリングの精度と感度を向上させるために、焦点実験脳卒中スケール (fESS) のビデオ標準化された形式を初めて提示し、脳卒中後 6 か月までその値を証明します。さらに、マウスのはしご段試験のプロトコル、および既知のシリンダー試験が、四肢の運動機能の偏りのない定量的評価のために提示されます。結果は、mSUの翻訳効果を強調しています。フォーカルESS(fESS)は、フォーカルストロークの欠損を検出し、回復を捉え、脳卒中後最大6か月間の感度を維持する点で、他の既知のスケールよりも優れています。ラダーラングテストとシリンダーテストは、前肢と後肢の運動障害を長期的に客観的に定量化し、監視します。要約すると、mSU、fESS、および運動機能検査を統合することで、臨床的に関連性のある脳卒中調査のための堅牢なフレームワークが提供されます。当社のプロトコルは、マウス脳卒中研究におけるトランスレーショナルバリューを向上させます。

大虚血性脳卒中は、世界中の罹患率と障害の主な原因の 1 つです¹。それでも、マウス脳卒中の研究は、これまでに臨床で検証されたほぼすべての治療法でトランスレーショナルブロックに直面しています²。この問題の複数の理由とそれを克服するための努力については、以前の出版物²で詳細にレビューされています。これらの課題は、臨床の進歩を関連する動物モデル² に限定的に統合することと、脳卒中後の欠損を正確かつ高感度に検出する際の行動学的および神経学的スコアリングシステムの弱点²から生じます。

最近の発見³は、マウスにおける中動脈閉塞症(fMCAo)のフィラメントモデルが、頭蓋骨開放損傷および外傷を有する他のモデルよりも有意な並進的優位性を有することを裏付けている^2,4。その上、これは臨床脳卒中設定の再灌流と機械的血栓摘出術をモデル化する唯一のものです^5,6,7。しかし、このモデルは脳卒中後3〜7日で高い亜急性死亡率に直面しており、大規模な脳卒中の長期的な研究は禁止されており、最近までモデルに内在する克服不可能な人工物と考えられていました。さらに、脳卒中後の神経学的欠損の検出は、マウスではサイズが小さいため、特に非臨床医や経験の浅い研究者の間で比較的困難で偏っています^8,9。これに対処するために、さまざまなグループが赤字を検出するためのさまざまなスケールを開発しました。最も使用され知られているスケールには、3点ベダーソンスケール(BS)¹⁰、5点修正ベダーソンスケール(mBS)¹¹、5ポイントロンガスコア(LS)(mBSに類似)⁶、修正神経学的脳卒中スケール(mNSS)^12,13、18ポイントガルシアスケール(GS)⁹、およびより詳細なデシモーニ¹⁴または「ニューロスコア」(NS)⁹として知られているものが含まれます^。15スケール。残念ながら、これらのスケールのいくつかは粗雑すぎて、脳卒中後の数日間の急性期(BS、mBS、LS)^8,9のみに制限されているか、またはそれらの解釈が一般的な欠損(NS)によってぼやけています。

このような背景から、マウスのストロークユニット(mSU)サポートプロトコルと、マウス¹³の実験的ストロークスケール(ESS)を開発し、検証しました。mSUの理論的根拠は、臨床ルーチン(すなわち、ヒト脳卒中ユニット)からの知識を脳卒中の前臨床研究に適応させることでしたが、ESSは、以前に存在していたが「鈍感な」または冗長な脳卒中スケールを実用的で洗練された、感度が高く、時間効率の良いものに大幅に統合しました。mSUは、マウスの基本的な臨床パラメータの頻繁かつ適応的なモニタリングと、生存率を高めるための動物サポートの適応適用からなる¹³。

実際、私たちの研究室や他の研究室からのデータは、両方の方法の価値を証明しています。mSUは、臨床的な基本的な支持措置を翻訳し、ヒトからマウスへの^進歩7、マウスのfMCAoの死亡率を60〜70%から10〜15%に大幅に減少させ¹³、より大きな脳卒中の研究を可能にし、それ以来、独立した実験室で効果的に適用することができます^16,17,18,19.さらに、ESSは、脳卒中後の病巣(ESSの焦点成分、fESS)と一般(ESSの一般成分、gESS)の欠損および症状を区別することができ、ヒトの臨床スコアリング(ヒトの限局性と一般的な徴候および症状との区別)をモデル化し、脳卒中病変のサイズに線形に関連しており、長期的に欠損に敏感です^13,20.それでも、mSUとESSの両方の価値と有効性が証明されているにもかかわらず、経験の浅い研究者でさえも明確で視覚化された標準化された指示がないため、mSUの適用に関するいくつかの未解決の問題と、fESSの焦点欠損のスコアリングに関する大きな主観性が残されています。

そのため、本稿では、mSUおよびfESSプロトコルのビデオ支援による明確な指示を提供することを目的としています。脳卒中研究者が脳卒中研究の翻訳効率を高め、脳卒中後最初の3〜10日間の動物の損失を大幅に減らし、実験コストを削減し、最終的には脳卒中後数か月間の神経学的欠損を再現性よく評価するのに役立つと強く信じています¹³。さらに、ラダーラングテストとシリンダーテストの追加の組み合わせにより、fMCAoによる焦点肢麻痺(前肢と後肢)を簡単に定量化できます。

mSUとfESSの効率を示すために、fMCAo後のマウスの中期(14日)および長期(6か月)のデータを提供します。12週齢の雄C57Bl/6Jマウス(n = 31)を使用し、制御された温度(22±2°C)で飼育し、12時間の明暗サイクル期間とペレット状の食物と水を自由に利用できるようにしました。マウスを2つのコホートに分け、それぞれ14日間(n=10、コホート1)と6ヶ月(n=15、コホート2)追跡した。これらのマウスは、イソフルラン麻酔下でfMCAo 13,20,21のよく記述されたモデルを使用して、60分間の脳虚血に供されました。偽手術動物(n = 6、上記の2つのコホートとして操作されたが、虚血は誘発されなかった)を6か月間追跡し、対照として役立った。ブプレノルフィンは、術前および術後3日間の鎮痛薬として使用されました。.ラダーラングテストとシリンダーテストも、神経学的スコアリングの一部として6か月のコホートに対して実施されました。

すべての動物は、ストーク後最初の 14 日間、人道的なエンドポイントについて毎日チェックされました: 1) 重度の低体温症 (<33 °C) および/または不動 (例: fESS のテスト 6 でスコア 4 または gESS の「自発的活動」テスト) 「マウス脳卒中ユニット」治療 (すなわち、受動的加熱および能動的摂食、1.4 を参照) によって改善されなかった 1.6、1.8) 1 時間以内、2) 痛みまたは不安行動の兆候 (例: gESS の「不安/自動行動」テストのスコア >2)、プロトコルに従って術後鎮痛後でも。

このプロトコルでは、mSUの形態でのマウスの脳卒中後サポートは、fMCAo操作からのマウスの回復直後に開始されます。これには3つのフェーズがあります: フェーズA (再灌流後0〜48時間)、 フェーズB (>48時間以上、通常は個々の動物のフェーズBに応じて10〜14日目の「必要なアクティブサポートの終了まで」)、および フェーズC (14日目以降)。各動物に合わせた5つの有意な介入(訪問/リスク層別化スコア、摂食、水分、体温、および局所消毒;下記1.1.から1.8を参照)があり、各フェーズ(A、B、またはC)およびリスク層別化スコア(RSS)によって評価されるその毎日の実際の臨床状態に従って、 補足図1 および 表1 と3つの典型的な例を参照。mSUに必要な材料とツールを 図1a に示し、 材料表で説明しています。また、mSU中の動物モニタリング用のテンプレートも提供しています( 補足ファイル1を参照)。

本稿で報告した実験は、実験動物の使用に関する国内および欧州のガイドラインに従って実施され、ギリシャ政府委員会(アテネ、ライセンス番号「843895_06-09-2022」)によって承認されました。

1.「マウスストロークユニット」(mSU)

1. 動物の臨床状態を毎日評価し(「訪問」)、RSSスコアを計算します
   1. 補足ファイル1を、できれば動物の手術前に印刷して、データの記録とモニタリングを行います。
   2. 早朝(08:00頃)、正午(14:00〜16:00)、深夜(22:00〜23:00頃)の標準的な時点(訪問)で各動物を臨床的に評価します。
      注:動物のフォローアップフェーズに応じて、これらの標準的な訪問を適応させます:フェーズAは1日2回(朝-夜)、フェーズBは3回/日、フェーズCは1日1回、動物の状態を確認しますRSSスコア(1.1.6を参照)に従って訪問の頻度をさらに適応させます。できれば>2人のチームで作業し、作業負荷を軽減します。マウスの夜間(活動的)相は代謝とエネルギー需要を増加させるため、朝と夜の訪問は、成功したサポート、モニタリング、および死亡率の減少にとって重要です13,22,23そして、脳卒中後の夜間の死亡率の増加に関連しています。
   3. 朝の訪問中に、感度の高い標準スケールを使用してマウスの体重を量ります。
   4. 朝の訪問中に、非接触型体温計を腹側の中心に置いて温度を測定します。マウスを背中で保持して固定します。固定後数秒以内に読み取りを行います( 図1fを参照)。
      注:腹膜炎を伴って繰り返し測定した後、腸が破裂する可能性があるため、直腸体温計を使用しないでください。
   5. マウスの一般的な臨床状態 (可動性、創傷、尿道キャップ、反応性、毛皮、水分補給状態など) を、14 日目までの毎日、すべてのフェーズの朝の訪問で評価および記録します。
   6. 補足図1で説明されているように、動物の体重、体温、およびfESSスコアに従ってポイントを合計することにより、午前の訪問でRSSスコアを計算します。スプレッドシート表の RSS の自動計算には、表 1 の式を使用して適応させます。人道的なエンドポイントが存在する場合は、施設で承認された方法で動物を安楽死させます(上記を参照)。
   7. 訪問の頻度とサポートの強度の両方を、RSSスコアと脳卒中後の動物のフェーズに従って毎日適応させます。
      注:フェーズBは死亡率にとって最も重要です。RSS ≥3 の訪問頻度とサポートの強度を高めます (定義と手順については、 表 1 を参照してください)。動物がフェーズCでRSS>3を示し続ける場合は、フェーズBと同様に訪問してサポートします。RSSと一般的な説明(回復中、安定、低/中程度、重篤な病気など)を使用して、サポートチーム内でその臨床状態を説明します。14日目以降、動物への訪問を実験プロトコルで必要なもののみに減らします(例:. 行動/神経学的評価のため)。
2. 栄養サポートのためのゲル食品の調製
   1. ブレンダーを使用して一般的な食品ペレットを粉砕します(図1a)。
   2. 市販の砂糖を5〜10%で加えて、食品のカロリー量を増やします。
   3. 水を加えて、ゲル状の液体テクスチャーを作成します(図1b)。
   4. このジェル食品は、受動的および能動的な栄養サポートの両方に使用できます。
      注:オプションで、すぐに使用できる市販のゲル食品を使用してください。調理済みの食品は冷蔵庫で2〜3日間保存できます。
3. マウスの受動的な栄養サポート
   1. ペトリ皿にゲルフードを入れ、ケージの床に置きます(マウスに簡単にアクセスできるようにゲルフードを提供することによる受動的な栄養サポート)。ペトリ皿の隣に2〜3個の食品ペレットを残します。
   2. 毎日ジェル食品でペトリ皿をリフレッシュしてください。最初の数日間、マウスはペトリ皿をケージの寝具で満たすか覆うことがあります。それから食べ始める人もいます(図1c)。
4. 積極的な栄養サポート(積極的な摂食)
   注:アクティブな摂食はフェーズB中に行われます。標準的な給餌頻度は3回/日で、RSSスコアに応じてより多くの回に適応します(例:4〜5回/日)。時折、RSSスコアが常に0〜1(つまり、小さな脳卒中)で、自分で積極的に食事をするマウスの場合は、頻度を1〜2 /日に下げます。
   1. 1mLシリンジにゲルフードをあらかじめ充填します。
   2. 図1d(赤い矢印)に示すように、マウスを首の毛からそっと、しかししっかりとつかんで保持します。
   3. 図1dの赤い矢印で示されているように、中指でマウスの頬を安定させます:マウスをしっかりと保持しながら、マウスの鼻に向かって指を横にスライドさせます。ポジションを保持します。
   4. 注射器の先端をマウスの口の歯の間に入れ、先端を頬の内側に向けます(赤い矢印、 図1e)。
   5. 毎回約40〜50μLのゲルフードを与えます(一口)。
   6. マウスをケージの火格子にそっと戻します。噛む時間を確保してください。
   7. 1〜2分後、各マウスが1〜1.5mLのゲル食品を食べるまで、給餌を繰り返します。
      注:実行ごとに5〜10匹のマウスを給餌します(1〜2ケージ)。他のマウスは、各マウスが一口与えられると、ゲルフードを食べて飲み込みます。このプロセスはマウスにストレスを与えません。また、一部の動物は最終的につかんで餌をやるために自分自身を配置することも観察されています。
5. 通常の生理食塩水の補給
   1. 午前中の訪問中にマウスの体重を量ります(1.1.2および1.1.3を参照)。
   2. 値を差し引いて、前の測定値と比較した体重の減少/増加を計算します。
   3. その体重不足(グラム単位)を通常の生理食塩水(皮下)で補います。.
      注:体液の過負荷や浮腫は絶対に避けてください。1回の投与で1〜2 mL、1日あたり3〜4 mLの水分を超えないようにしてください。.fMCAoの36時間後に開始します。
6. グルコースサプリメント
   1. マウスの計算されたRSSスコアとその全体的な動きを確認します。
   2. RSS >3とマウスが低体温症(<34°C)または固定化/運動緩慢の付随徴候を示している場合は、0.5〜1 mLの5%グルコースを皮下注射します。.できれば夜間の訪問中にのみ注射してください。.
      注:脳卒中後の高血糖は絶対に避けてください。脳卒中後の高血糖は有毒です⁷.そのため、グルコースを補給するのは、積極的な摂食後、および重度の臨床状態の場合、または夜間活動中の低血糖を予防するためのみです。.アクティブフィーディング(1.4を参照)は、よりスムーズで長持ちするエネルギーサポートを提供し、臨床ガイドライン ⁷を翻訳するため、主要なサポート測定である必要があります。3日目より前にブドウ糖を補給しないでください。
7. 温度管理(パッシブ)
   1. 動物の表層体温を術前とベースラインで、術後は毎回の訪問で測定します(図1a)。 図 1f で示され、1.1.4 で説明されているように測定します。値をメモします。
      注:マウスの低体温症は、体温<35°^C24,25と定義されています。以前のデータ¹³は、34°C未満の温度は脳卒中後のサポートの警告サインであることを示しています(以下を参照)。
   2. 33〜34°Cの低体温が観察された場合は、マウスを加熱プレート(またはその他の受動的加温装置)のケージ内で受動的に温め、体温>34°Cに達するまで温めます。 マウスに積極的に餌を与えて、動物による活発な熱産生のためのエネルギーを提供します(エネルギーの持続性供給)。
      注意: 動物を受動的な暖房に1〜数時間置いてください。受動的な温熱療法は絶対に避けてください。
   3. 低体温症が観察された場合、<33°Cで、追加のグルコース皮下投与でサポートをエスカレートします(エネルギーの高速ですが短時間の供給;上記の1.6を参照)。
8. 性器および/または首の傷の洗浄(局所的な「消毒」)
   注:時折、創傷の裂開または尿道栓が観察されることがあります。創傷の裂開はまれです。尿道栓は、マウスの生殖器の先端にある硬い栓(図1g)で、特に脳卒中の重症度が高い動物でより一般的に観察されます。プラグが尿道を塞ぐと、尿閉塞症候群が発生し、罹患率や死に至る可能性があります²⁶。したがって、それはよく掃除されるべきです。
   1. 尿道プラグがある場合は、通常の生理食塩水に浸して、その除去を容易にします。.
   2. 動物のチェック/訪問のたびに、小さな綿棒または簡単なピンセットを使用して尿道プラグをそっと取り外します。消毒液に浸したゲージまたは綿棒を使用して尿道を消毒します。
   3. 創傷裂開が存在する場合は、一般的な外科用消毒液(オクタニセプトなど)で局所的に消毒し、できれば5/0シルク縫合糸を使用して創傷を定期的に縫合します。.

2. Experimental Stroke Scale(fESS)の焦点成分

1. テストフィールドを準備する
   1. 図2aに示すように、ベンチを70%アルコールで洗浄して外部刺激(光学または臭気)を取り除き、試験材料を準備します。
   2. 補足ファイル2として提供されているESSスコアリングシートを印刷し、1つずつテストに従ってください。
2. 前肢麻痺(テスト1)
   1. マウスをテールベースからそっと持ち上げて保持します。
   2. マウスが動くときの前肢の対称的な前方伸展と対称的な可動性を視覚的に確認し、評価します(図2c)。
   3. 視覚所見に応じて、次のようにスコアを付けます: 前肢の正常で対称的な伸展と動きの場合は 0。1 は、軽度の屈曲および/または対岸肢または四肢のこわばりの動きの減少として定義される「わずかな非対称性」の場合。2は、対側肢の「顕著な屈曲」の場合。3 対病変肢の体幹への付着用。体や手足が動かない場合は4点。
      注:このテストは、対側前肢の麻痺を検出します。また、BS、LS、mNSS、NSスケールの一部でもあります。スコア1は、動物の脱出操作のために定義するのが難しい場合があります。
3. 後肢麻痺(テスト2)
   1. テスト1で説明されているように、マウスのテールベースを持ち続けます。
   2. 後肢とつま先の対称的な伸展と動きを視覚的に確認します(図2c)。
   3. 所見に応じて、次のようにスコアを付けます: 正常で対称的な位置/伸展、および後肢とつま先の動きの場合は 0。1 は、運動が大幅に減少し、反対側(右)後肢の位置/伸展が非対称である場合の明確な非対称性の場合です(図2d)。
      注:このテストは、対病変性後肢の麻痺を検出します。また、mNSSスケールの一部でもあります。このテストは、正確に採点するのは難しいかもしれません。
4. 体幹対称性(テスト3)
   1. マウスのテールベースを持ち続け(2.3に準拠)、マウスの体幹の動きを評価します。
   2. スコアは、次のように所見によって異なります: 0 正常、体幹の屈曲なし、または対称的な軽度の体幹の屈曲/両側への動き (「エスケープ」操作として)。1 は、主に対病変性 (右側) のマーク付き (>30°) 頭/体幹の屈曲の場合で、保持から最初の 10 秒以内です。
      注:このテストは、片側運動病変による非対称性を検出します。また、mNSSスコアリングの一部でもあります。
5. 旋回動作(テスト4)
   1. マウスを平らな面にそっと置き、少なくとも1分間自由に動かしておきます。その動きのパターンを観察します。
   2. 調査結果に応じて、次のようにスコアを付けます:0:旋回行動のない探索的で鮮やかで直線的な動きの場合。1 片側を向く傾向が、閉じた円ではない場合。2 は、閉じた円の片側への不規則な動きの場合。3は、閉じた円を片側に一定に移動させるためのものです。4は、ピボット、揺れ、またはまったく動かない場合。
      注:このテストは、感覚運動および空間ナビゲーションの欠損を検出します。NSの一部でもあります。
6. 体の対称性(テスト5)
   1. テスト4から続行し、マウスを平らな面上で自由に動かします。その機首から尾までの軸を観察します。
   2. 調査結果に応じて、次のようにスコアを付けます:ベンチから体幹が高く、尾がまっすぐな通常の姿勢の場合は0。1は、わずかに体が片側に曲がり、尾が遠位に曲がっている場合の「わずかな非対称性」の場合。2 「中程度の非対称性」の場合、明らかな体が曲がったり、反対側に傾いたりして、近位に曲がった尾や手足が体から伸びている場合。3 「顕著な非対称性」の場合、体が曲がっているとマークされ、片側がベンチに不規則に横たわり、尾が明らかに近位に曲がっている(スコア2以上)。4は「極端な非対称性」の場合、体が曲がっている場合、片側は常にベンチに横たわり、尾は大きく曲がっています。
      注:感覚運動片側の体幹と尾の欠損を検出します。NSスケールの一部でもあります。
7. 歩行評価(テスト6)
   1. テスト 5 から続けて、マウスを平らな面上で自由に動かします。今すぐその歩行を観察し、麻痺、四肢のこわばり、痙攣性歩行、手足などの歩行運動障害を確認します。
   2. 次のように所見に応じたスコア: 探索的で、対称的で、体の下に「隠れて」動く柔軟な手足を持つ迅速な場合、通常の歩行の場合は 0。1は、足を引きずることなく自由に動くマウスの硬く、柔軟性がなく、ゆっくりとした歩行用です。2は、非対称(左右)の動きで明確な足を引きずるためのものです。3は、軽く押した後の震え、漂流、または落下用。自発的な歩行がない場合、4(穏やかな押しで刺激された場合、3歩以上歩かないでください)。
      注:複合歩行障害を検出します。NSの一部でもあります。
8. 強制旋回(テスト7)
   1. マウスの尾根を持って表面から持ち上げ、前肢だけで歩かせます。その動きを観察します。
   2. 調査結果に応じて、次のようにスコアを付けます:通常の直線運動の場合は0。1は片側を向く傾向。閉じた円で片側を回すための2。不器用な動きで片側に回転したり、ゆっくりと円を完成させることができなかった場合3。4前進していない場合は、トランクの前部がベンチにあります。
      注:このテストは、旋回動作テスト(テスト4、2.5を参照)を補完するものです。おそらく、感覚運動障害と空間障害を検出します。また、NSスコアリングシステムの一部でもあります。
9. 横方向の力に対する姿勢(テスト8)
   1. マウスを手のひらに置き、尾の鼻軸(縦方向)を矢状側の手のひら軸と平行にします。
   2. マウスを一定の速度で前方から後方に振って、縦軸に垂直な力を誘導します。
      注意: これにより、マウスはスイング中に直立位置を維持し、横方向の力とバランスをとるようになります。通常、その体は手のひらや指に接触しません。
   3. 視覚的に観察し、マウスの左右の手のひらがぶらに対してバランスをとるのを感じます。非対称の転倒、手のひらへの接触、または横方向の脱力感の兆候がないか確認してください。
   4. 調査結果に応じて、次のようにスコアを付けます:マウスが背中を手のひらと平行にして通常の直立位置に立っており、手のひらに大きく触れることなくスイングに対してバランスをとることができる場合は0。1 マウスがスイング中に体を平らにして安定性を得る場合。2 スイング中にマウスの一部が手のひらに横たわったり、手のひらに触れたりした場合。マウスが片側に横たわっている場合、直立位置を回復するのがやっとの場合。4マウスが腹臥位にある場合、直立位置を回復することができません。
      注:このテストでは、横方向の加速度に対する姿勢の欠損が検出されますが、そのスコアリングは主観的なものである可能性があります。また、mNSS、NSの一部でもあります。
10. 前肢のターゲット配置(テスト9)
    1. マウスを背面またはテールベースから持ちます。ビームに対して垂直に向けると、「到達するターゲット」として機能します。対称的な「手を伸ばす」こととつかむことを観察します。
    2. ビームをしっかりとつかんだら、そっと引き離し、前肢の対称的な「解放」を観察します。
    3. 調査結果に応じて、次のようにスコアを付けます:対称的な「リーチアウト」、「把握」、「リリース」の場合は0。1 「reach out」および/または「release」の非対称性で、対症性前肢の衰弱を示します。
11. 前肢の感覚運動障害(テスト10)
    1. マウスを背中でしっかりと持ち、腹側を向けます(ビデオまたは 図1eを参照)。
    2. ブラインドアングルから細い先端(木製のつまようじなど)で前足を連続して刺激します。前足の反応を観察します。
    3. 調査結果に応じて、次のようにスコアを付けます:正常で迅速な把持動作の両側の場合は0。1 は、逆に把握が不在または明らかに遅れている場合。
       注:2.10と2.11の両方で、前肢の細かい感覚運動障害をテストします。また、mNSSの一部でもあります。
12. ビーム歩行(テスト11)
    1. 長さ1 mの木製の梁(材料のテーブル)を配置して、地上1〜1.5 mの高さにある2つの高架面(ベンチ、テーブルなど)を接続します。ビームのエッジを安定させて、振動や不安定性を避けます。
    2. マウスをビームの中央に置き、マウスのノーズテール軸をビームと平行にします(図2e)。バランスをとるか、ビームで自由に歩くことができます。そのバランスや手足の麻痺や転倒を観察します。
       注:マウスは、スコアリングする前にビームでバランスをとる必要があります。動物の下に厚い手袋を(約15〜20cmの距離で)保持して、落下した場合に動物を保護します。
    3. 調査結果に応じて次のようにスコアを付けます:マウスがバランスを取り、ビームの片側に向かって安定した姿勢で歩く場合は0。1 梁の側面をつかみ、その上を歩かない場合。片方の手足が梁から落ちた場合、2。3 2本の手足が梁から落ちた場合。マウスがビームでバランスを取ろうとしたが、外れた場合(40秒後)。5〜20秒の間に落ちる場合。バランスを取ろうとしたり、ビームにぶら下がったりせずに落下した場合は、スコア6(<20秒)。
       注:このテストは、前肢、後肢、体幹の複合運動障害を検出します。また、mNSSスケールの一部でもあります。
13. ウィスカーの感覚(テスト12)
    1. マウスを開いたベンチトップに置きます(テスト4および5と同様)。ご宿泊の時間を確保してください。
    2. 先端の長い細い綿棒で「ブラインドアングル」から左右のヒゲを連続して刺激します。刺激に対する頭の迅速な回転反応を観察します。
    3. 次のように所見に応じたスコア:0:両側の刺激による正常で速い頭の回転。1 刺激時の対症反応が遅い場合。2 は、不在の対症反応 (ターンなし) の場合。3 は、対病変性反応がなく、イプシレシオナル反応が遅い場合。4は二国間不在応答の場合。
       注意: 綿の目視検出は、同側の頭の回転を誤って引き起こすため、避けてください。このテストが技術的に正しいのは、マウスがひげの刺激に「驚いた」ときだけです。このテストもNSの一部であり、ひげ(バレル皮質)の感覚運動障害を検出します。
14. クライミング(テスト13)
    1. ゴムコーティングされた45°の傾斜面(図2a)を使用し、マウスをその中央に置きます。ネズミが登ろうとする努力を観察します。
    2. 次のように調査結果に応じたスコア:マウスが迅速かつ楽に表面の上部に登る場合は0(正常)。1 手足の衰弱を伴う緊張を伴う登り。2 滑ったり登ったりせずに斜面につかまっている場合。3 転倒を防ぐための努力にもかかわらず斜面を滑り落ちた場合。4転倒を防ぐ努力なしに滑る場合。
       注:このテストはNSの一部でもあり、一般的なモーター強度を検出します。
15. テスト1から13までのすべてのスコアを合計して、fESSのスコアを計算します
    注:fESSスコア0は正常なマウスを示し、最大スコアは42です。線条体および皮質病変を伴う大きな梗塞は、通常、スコア>7〜9を誘発します。ストロークされたマウスの評価を開始する前に、いくつかの正常なマウスを調べてスコアリングし、正常な行動のバリエーションに対応し、偽陽性のfESSスコアリングを減らします。実験全体を通じてスコアリングを標準化するために、付属のビデオプロトコルを常に使用します。

3. ESS(gESS)の一般成分

注:gESSを評価して、炎症や感染などの「一般的なマウス疾患」の兆候を検出し、通常はfMCAo後の最初の1〜2週間に存在します。 補足ファイル2のスコアリングシートを使用してください。gESSは、できればfESSの完了後に評価してください。

1. マウスを平らな面(ベンチ)に置き、2.5のように自由に動くようにします。次のスコアを順番に評価します。
2. その毛皮を観察してください。gESSスコアリングシートによるスコアリング(スコア0-2、 補足ファイル2を参照)。
3. マウスの驚愕の反応を確認してください:マウスがリラックスしているときに、ブラインドアングルから突然拍手してマウスを驚かせます。マウスの耳の反応をgESSスコアリングシート(スコア0-2、 補足ファイル2参照)で確認し、採点する。
4. リラックスしたマウスの目を視覚的に評価します:開いた/閉じた目または粘液の存在を確認します。gESSスコアリングシート(スコア0〜4、 補足ファイル2を参照)に従ってスコアを付けます。
5. マウスの一般的な自発的な活動と覚醒を観察します。gESSスコアリングシート(スコア0〜4、 補足ファイル2を参照)に従ってスコアを付けます。
6. マウスの一般的な自発的な行動を観察し、不安、過興奮性、攻撃性、または取り扱い中にその軸に沿って回転する存在がないか観察します。gESSスコアリングシート(スコア0〜4、 補足ファイル2を参照)に従ってスコアを付けます。
7. 上記のすべてのステップ(観測スコアリング、ステップ3.2.から3.6)のスコアを加算して、gESSのスコアを計算します。
   注: gESS スコアは、脳卒中病変によって誘発された焦点欠損を検出しず、前に示した ¹³ のように mSU の影響を受けません。すべてのテストはNSスケール^9,15から適応されています。

4. シリンダーテストによる前肢欠損の定量化

注:シリンダーテストは以前に^詳細に説明されており^、ここでは詳しく説明しません。シリンダーテストは、前肢の欠損を偏りなく定量化する独立した行動テストです(4.2を参照)。

1. ここ¹⁵に記載されている手順に従ってテストを実行します。¹⁵のようにビデオをキャプチャして分析します。壁への最初の手足の接触を左右で測定します。図 3a,b は、セットアップのイメージを示しています。
2. 対症性(右)麻痺による四肢使用の側方化を%パーセンテージで計算します。式を使用します: 左ステップの % 優先度 = [(左 - 右) 最初の連絡先 / (右 + 左) 連絡先] x 100。
   注:脳卒中を誘発する前に、各マウスのベースラインシリンダーテストを実行します。各実験計画に従って、ある時点でテストを実行します。

5. ラダーラングテストによる前肢と後肢の欠損の定量化

注:プレキシガラスからマウス用の装置を構築します( 図3cに表示):高さ20 cmの壁を持つ長さ1 mの廊下、15 mmの一定間隔で配置されたプラスチック製の横木(直径3 mm)(図3c1)、および遠位端に「避難」ボックス。親しみやすさのために避難箱に動物の寝具を置き、ご褒美としていくつかの食品ペレットまたはピーナッツバターを置きます。廊下の幅は10cmで、地面から約30cm高くする必要があります。

1. 実験のベースラインの1〜3日前に、装置上でマウスを訓練します。ステップ 5.1.1 から 5.1.4 のようにトレーニングを実行します。
   注:動物が止まったり、曲がったり、探索的な行動をとったりすることなく、横木の廊下を安定した速度で通常の歩行できるようにするためには、トレーニングが必要です。2日間連続(2セッション)のトレーニングを行います。各トレーニングセッションは3回のランで構成されています(ラン =避難ボックスに向かって廊下全体を1回歩きます)。ベースラインデータの収集は、フォローアップに必要です。
   1. 毎回のランニングの前に、70%のアルコールで横木と壁を掃除して、マウスの臭いや「探索的」な気晴らし/停止を避けてください。
   2. はしご段の廊下の先頭、避難ボックスに向かってマウスを置き、実行を開始します。マウスを廊下の端にある避難ボックスに向かって自由に歩きます。動物を無理に歩かせないでください。
      注:トレーニング中のランニングは、通常、時間と歩行パターンの点で大きく異なります。トレーニングの目標は、通常<10秒以内に、停止/ターンなしで避難ボックスに向かって安定して歩くことです。これは通常、2日目のトレーニング日の終わりまでに達成されます。適切なトレーニングの妨げとなるストレス誘発を避けるために、常に動物を優しく扱ってください。動物を廊下から取り除き、廊下にとどまり、>1分間地元を探索した場合は、馴染みを避けるために走り直してください。
   3. 1^回目の トレーニングを実行します。1^回目 の実行後、動物を避難箱で5分間休ませます。
      注:この長時間の休息により、マウスは避難箱に慣れ、それを「休息/報酬のある」目標として認識することができます。避難箱の「やりがいのある認識」を達成することは、ランニングを成功させるために重要です。
   4. マウスを避難箱から取り出し、5.1.2と同様に2回目と3回目のトレーニングを実行します。これらのランの終わり(30〜60秒)に避難ボックスでの休息時間を短くして、慣れないようにします。
      注:トレーニングは2日目に完了します。2日目までに、ほとんどすべての動物が安定したペースで廊下を歩くことを学びます。動物が学習していない場合は、さらなる実験から除外することを検討してください。
2. 訓練済みのマウスで実験を実行します。実験のすべての時点とベースラインで、マウスを毎回 2 回実行します。
   1. ステップ 5.1.1 および 5.1.2 の説明に従って実行を実行します。避難ボックス内の2つのランの間に最大5分間の休息時間を確保してください。
   2. スマートフォン(または同等のカメラ)と「自撮り棒」を使用して、少し腹側と「ブラインド」角度で動物のビデオ(データ)をある程度の距離からキャプチャします( 図3c2を参照)。動物が廊下を歩くときに手足を捉えるようにしてください。マウスの実行中にマウスの注意を視覚的にそらしたり、マウスの実行中にマウスの手足を追いかけたりしないでください(図3c2)。
   3. 両方の実行を記録しますが、2 回目の実行のデータを使用して分析します。
   4. スローモーションオプションを備えたメディアプレーヤーソフトウェアを使用してビデオを確認することにより、各肢(左/右、前肢/後肢)のラング間の障害ステップ(落下)の数を測定します(図3c3)。右肢と左肢の断層ステップ間の絶対差または%差を、前肢と後肢で別々に計算します。
      注: 2 回目の実行では、より信頼性の高い結果が得られます。健康なマウスは通常、2回目の実行中に手足(右または左)ごとに0〜1の任意の障害ステップがあり、通常、0±1の差の範囲が得られます。ストロークされたマウスは、右(対側)の麻痺肢(前肢または後肢)でフォールトステップを行い、その結果、正の「右向き」の側方化が起こります。重度の脳卒中を起こした動物は、脳卒中後の最初の7〜10日間は走行が遅くなったり、完了しなかったりすることがありますが、その後は適切な走行を達成し、深刻な欠損を示します。

mSUは、上述したように、fMCAo操作後に開始する。fMCAo脳卒中と偽の2つの独立したマウスコホート(図4a)の代表的な結果は、特に3日目から10日目までの臨界期に、以前に証明されたmSUの値を確認します¹³。我々のコホートでは、脳卒中の病態生理学の一部として、コホート1の3/15動物(脳卒中、6カ月追跡)、コホート2の2/10動物(脳卒中、14日間の追跡)、および偽手術動物の0/6(図4a)で死亡が発生しました(全員が午前中の訪問中に死亡していることが判明)ため、スコアリングに含まれました。事前に定義された人道的エンドポイントに従って安楽死させられた動物はいません。この急性死亡率 (10-15%) は、フェーズ A (fMCAo 後 24-48 時間) 内 (図 4a) は、大きな縄張り脳卒中¹³ に起因する半球浮腫とヘルニアに起因し、トランスレーショナル脳卒中モデリングの一部として予想されました。フェーズB(コホート1は1/15、コホート2は1/10)中の遅延死亡率は、mSUプロトコル(図4a)の下で最大5〜10%追加され、通常、mSUのサポートにもかかわらず救助できない非常に大きな脳卒中の動物に発生します。これは、重症度に関連したヒトの脳卒中後の死亡率²⁹も直接変換します。mSUを適用しないか、その原則への遵守が低いと、フェーズBの死亡率が増加し、60〜90%に達することさえあります¹³。フェーズCは通常、それ以上の死亡率を欠いています。

mSUを適用すると、大きな脳卒中のマウスは、重大なフェーズBを超えて生存し、重大な神経学的欠損を示します。私たちのデータは、fESSの標準化された使用が、マウスのfMCAo誘発欠損と自発的改善の両方を検出して定量化し(図4b)、焦点ニューロスコア(NS)、mNSS、ベダーソン(BE)スケール9,10,12,14などの以前のスケールを上回るか、それと一致することを示しています。直接統計的に比較することはできませんが、fESSは急性期に同等またはそれ以上の感度を示し、fMCAo後の自発的な神経学的改善を捉え、他のスケールと比較して脳卒中後6か月まで欠損感受性のままです。これは、マウスストローク後の並進および高感度スコアリングでの使用をサポートし、現在のビデオプロトコルはスコアリングの客観性の向上を保証します。

fESSに加えて、ラダーラングテストとシリンダーテストは、前肢と後肢の麻痺を定量化することにより、長期的な神経学的スコアリングとモニタリングを補完できます。各テストでは、ビデオ取得に1匹あたり約5〜7分、手動ビデオ分析に5〜15分かかります。代表的な結果は、ラダーラングテストでマウスが歩くとラダーラングテストでラング間の四肢の落下が増加し(左ストロークでは右%の横方向化がもたらされます)、シリンダーテストでは健康な左前肢と壁に触れることが「好ましい」ことです(左ストロークでは左の横方向化が最大になります)。6か月のコホートの代表的なデータは、ラダーラングテストは急性/亜急性期の前肢麻痺を検出できるが、その後の自発的な改善により感度を失うことを示しています(図4c、時間についてはp<0.05、グループ差についてはp<0.01、混合効果モデル)が、最大6か月間の後肢麻痺の検出と定量化においてより堅牢であることを示しています(図4d、p<0.05 (群差、混合効果モデル)。並行して、シリンダーテストは、fMCAoの6か月後まで前肢麻痺を検出する際に優れた感度を維持します(図4e、グループ差、混合効果モデルの場合はp<0.001)。両方のテストを組み合わせることで、長期的な前肢および後肢麻痺を効果的に検出、定量化、および監視できます。

図 1.ポストfMCAo mSUサポートプロトコル。 (A)mSUに用いる工具・材料(B)通常の食品を粉砕し(フードブレンダーまたはその他の装置を使用)、およびゲル食品を能動的(注射器を使用)および受動的(ペトリ皿)給餌サポート用に作製する。(C)ゲルフードと固形ペレットは、数日前(宿泊用)とfMCAoの後に動物のケージに入れる(そして毎日新鮮に交換する)必要があります。動物はゲルフードを寝具の下に隠すことが期待されます。(D)シリンジ栄養のためのアクティブ把持(赤い矢印は指で左頬を安定させ、矢じりは毛皮をつかむときを指します)。(E)右頬を指差して、口に注射器を挿入します(矢印)。(F)体表面温度測定のショーケース(赤い部分と矢印が体温測定用の腹側体の中心を指しています)。(G)尿道栓(矢印)。(H) mSU サポートの下での慢性脳卒中実験の推奨タイムライン (bsl: ベースライン、h: 時間、d: 日、m: 月を評価タイムポイントとして)、ESS、ラダーラング、およびシリンダー テストを使用したスコアリングが推奨されています。このタイムラインは、ここではコホート 1 (6 分経過観察) と 2 (14 日追跡調査) で使用されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.実験的なストロークスケール。 (A)ESSテスト用のツール、(B)脳卒中(左半分、ニッスル染色)を伴う代表的な脳スライスと、それに対応するAllen Brainマップの重なり、前後のブレグマ+1.0および-0.3mm（この図は、Allen Mouse Brain Atlas、mouse.brain-map.org、atlas.brain-map.org)³⁰から修正されています。(C)fESSの前肢、後肢、および体幹の対称性試験のための尾基部による動物の懸濁液、灰色の点線の円は前肢と後肢の正常な対称性を示しています。(D)麻痺性のある右後肢の明確な非対称性(非対称な位置/伸展)。(E)ビーム上の動物の通常の位置。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 3.ラダーラングとシリンダーテストのセットアップ。 (A)シリンダーテストのセットアップでは、マウスがシリンダー内にあり、垂直ミラーが前肢の360°ビューを容易にします。(B)左前肢がシリンダー壁に接触(使用法)した動物のクローズビュー。(C)マウス用のラダーラングテストのビューと設計の詳細(寸法と組み立て説明書のテキストも参照してください)。(C1)ははしご横廊下を上から見た正常なマウス、(C2)は正常なマウスで段を正しく踏んだ(転倒なし)、(C3)は段間の前肢の転倒を示しています(画像はビデオからキャプチャされています)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 4.fMCAo後の長期生存と神経学的欠損。 (A)2つの独立した動物コホートにおけるmSUの有効性の再現:最初のコホートではマウスを6ヶ月間観察し、2番目の動物では脳卒中後14日間観察しました。(B)両方のコホートについて、異なる、十分に確立された、神経学的スケールのスコア。(C) 前肢および (D) 右側の後肢運動障害 (= 右 - 左の誤ったステップ、それぞれ前肢と後肢) は、6 か月の動物コホートでラダー ラング テストによって検出され、偽の手術を受けた動物と比較されます。(E) 前肢の非対称性の結果 (健康な左前肢の使用に対する好感度の割合) は、6 か月の動物コホートと偽の動物でシリンダー テストによって検出されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

テーブル 1.ソフトウェアインターフェース:RSSスコアの毎日の計算を行う3匹の動物の例。 アクションとRSSはフェーズBおよびCに適用されます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S1。毎日のリスク層別化スコア(RSS)の定義 と、その結果として得られる各動物のサポートアクション。スコアが0〜1の動物は死亡リスクが最小限であり、5〜6の動物は最大1です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1。 fMCAo手術およびmSUフォローアップ中の動物モニタリングと文書化のためのテンプレートの提案。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2。 フォーカルおよび一般的なESSのスコアリングシートを提案しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

本プロトコルは、mSUサポートプロトコルの包括的なガイドであり、fMCAoモデル¹³によって大きな縄張り脳卒中を受けたマウスの3〜10日目の人工物死亡率を減らすように設計されています。さらに、現在のプロトコルには、脳卒中後のマウスにおける神経学的焦点スコアリングの拡張された主観性とバイアスを減らすための ESS スケール (fESS) の焦点成分の標準化されたビデオ ガイドが含まれています。それに加えて、長期(最大6か月)の対病変性前肢および後肢運動障害を定量化するためのラダーラングテストを紹介します。

mSUはユーザーフレンドリーで効果的です。当社のビデオ支援プロトコルにより、経験の浅い研究者でもmSUを明確に適用できます。mSUの3つのフェーズ(つまり、フェーズA、B、C、上記のプロトコルのセクション1および図1hを参照)は、その評価とサポート対策を調整するために経験的に定義されています。mSUは、各フェーズに応じて、各マウスのリスク層別化スコア(RSS)スコアに応じて、介入を毎日調整します。このスコアは、その臨床的重症度を反映し、実際の死亡リスクを推定し、マウスごとに調整されたサポートを導きます。それを補完するものとして、動物の単なる臨床観察では、常にカスタマイズされたmSUサポートのための情報を追加する必要があります。最終的に、mSUは、マウス¹³のfMCAo後の最初の3-10日間の重要な段階で、温度制御、体液バランス、感染予防/治療、栄養サポート、および正常血糖^1,2,7を含むヒト脳卒中ユニット(SU)サポートの主要コンポーネントを翻訳的に実装します。重要なことに、人工物死亡率を60〜90%から<15%に減少させるmSUの有効性^13,31は、独立した研究グループ^17,18,32,33で成功裏に再現されました。

mSUプロトコルを成功させるには、いくつかの重要なステップが不可欠です。まず、mSUは綿密な臨床観察と最適な動物支援に依存していますが、作業負荷を軽減するために少なくとも2人の研究者からなるチームを交代で作業することをお勧めしますが、1人の研究者が単独で管理することもできます。次に、サポートの最も重要なタイムポイントは、エネルギー需要が高い夜行性の増加マウス活動の開始と終了に対応する²²:00と08:00頃です^13,22,23。第三に、現在の臨床脳卒中ガイドライン⁷に沿って、グルコース補給は慎重に調整され、脳卒中後の神経毒性高血糖を避けるために最小限に抑えられるべきです。第四に、能動的な摂食は、5〜10匹の動物のブロックで40〜60μlの口を段階的に投与して、作業負荷の軽減と効果的な給餌のバランスをとるために実行する必要があります。最後に、mSUの強度は、脳卒中の重症度に基づいて、各マウスのニーズとRSSスコアに合わせて調整する必要があります。この実際的なことは、脳卒中の小さなマウスは、より短く、より集中的なサポートを必要とするかもしれないが、より大きな脳卒中のマウスは、死亡リスクを軽減するために14日目以降もサポートを必要とするかもしれないということである。

マウスの神経学的スコアリングは、サイズが小さく、欠損を検出するのが難しいため、常に非常に主観的で困難でした。これらにより、以前のすべての脳卒中スケール(BS、mBS、LS、mNSS、GS、NS、はじめにも参照)は、粗い兆候(例:BS、mBS、LSの3〜5点スケール)を検出し、一般的な脳卒中後症状(NSなど)と局所性を混合し、脳卒中^8,9の急性期(例:3点^BS10、 5点mBS ¹¹または5点LS⁶)、または脳卒中後の長期的な自発的改善を定量化できない。これらすべてを改善するために、私たちは以前に¹³で、以前のスケールのコンポーネントを批判的に組み合わせたり省略したりしてESS(fESS / gESS)を開発し、fMCAoモデル²⁰によって一般的に影響を受ける領域を評価できるツールを作成しました(図2b)。現在、私たちはさらに、fESSの初のビデオ標準化を提供し、視覚的なガイダンスを提供し、研究室や研究者間の長年の主観性の制限を解決します。私たちのデータは、fESSがマウスの焦点、脳卒中関連の欠損を検出することにおいて、mBSおよびmNSSスケール(図4b)を上回るか、それと同等であること、および進行中の長期的な脳卒中後の自発的回復を捕捉することを裏付けています。提供されたビデオ標準化は、脳卒中後の赤字を一貫して評価するための信頼性の高いトレーニングツールとして現在役立っています。

fESSを補足するものとして、前肢および後肢の麻痺または長期(最大6か月)にわたる対応する改善を定量化するための一連のテストとして、ラダーラングテストおよび前述のシリンダーテスト¹⁵を使用することをお勧めします。動物内肢分析では、両方のテストのベースライン評価が必要です。以前にラット^34,35で使用されていたラダーラングテストは、マウスに適合され、ここで説明されています。実際には、テストは、横木廊下での安定した歩行パターンに大きく依存し、曲がり角や停止はありません。このためには、各時点での 2 回目の実行を分析することをお勧めします。これは、通常、最も安定した歩行パターンが得られるためです。上記のプロトコルで概説されているように、慣れない適切なトレーニングは、信頼性の高い結果を得るために重要です。ラダーラングテストとシリンダーテストの両方の制限は、大きなストロークを持つマウスがフェーズA-B(図4c-eの3日目と7日目)にまったく動かない可能性があるため、データが得られず、分散が増加することです。これらのマウスは、フェーズC中に最大の故障ステップを示すことがよくあります。この制限を克服し、動物のストレスを最小限に抑えるために、フェーズBの終了以降(例:10日目)にマウス>試験することをお勧めします。別の制限は、ラダーラングテストが前肢の欠損に対する感度を失うように見えるという事実ですが、これはシリンダーテストによって補われます。最終的には、これらのテストを組み合わせることで、前肢と後肢の両方の欠損とそれらの長期的な自発的改善を客観的に定量化できます。

結論として、mSUをトランスレーショナルマウスストロークモデルの標準治療として推奨します。同時に、マウスの長期的な脳卒中欠損を定量化するための、シンプルで時間効率が良く、費用対効果が高く、定量的に感度の高い一連のテストとして、付属のESS(fESS/gESS)、ラダーラングテスト、およびシリンダーテストをお勧めします。最終的には、mSUは、重度の脳病変(外傷性脳損傷、脳出血のモデルなど)を組み込んだ他のマウスモデルに適用できる可能性があり、強力で臨床的に並進的なマウスサポートが必要です。

報告すべき開示はありません。

研究の一部で貴重な外科的サポートを提供してくださったNikolaos Plakopitis氏とIoannis Tatsidis氏に感謝します。