פרוטוקול יחידת שבץ עכבר עם ניקוד נוירולוגי סטנדרטי למחקרי שבץ עכבר תרגומיים

מאמר זה מציג פרוטוקול לביצוע הרעיון של יחידת שבץ עכבר (mSU) בעכברים בעלי פעימות גדולות ומוכח באופן עצמאי. הוא גם מספק פרוטוקול סטנדרטי לביצוע סולם שבץ ניסיוני מוקד בעכברים, אשר מעריך ליקויים מוקדיים שבץ שזוהו אפילו לטווח ארוך.

מודל חוט הלהט של חסימת עורק אמצעי (fMCAo) הוא אולי מודל שבץ העכבר התרגומי ביותר, המאפשר איסכמיה מבוקרת עם reperfusion/recanalization תוך וסקולרי. עם זאת, הוא אינו עולה בקנה אחד עם ההתקדמות הקלינית הנוכחית לטיפול בשבץ מוחי (למשל, יחידות שבץ), בדרך כלל משתמש בניקוד נוירולוגי סובייקטיבי או מעורפל בין מעבדות, ומציג תמותה גבוהה בשלב חריף. כאן, אנו מטפלים במגבלות אלה באמצעות פרוטוקולים מאומתים מונחי וידאו. אנו מציגים את פרוטוקול יחידת שבץ העכבר (mSU) עם סרטוני הדרכה ואלגוריתם החלטה (Risk Stratification Score), המגשרים על הפער בין מודלים קליניים למודלים של שבץ עכבר. כדי להגביר את הדיוק והרגישות של ניקוד נוירולוגי של שבץ, אנו מציגים לראשונה פורמט סטנדרטי בווידאו של סולם שבץ ניסיוני מוקדי (fESS) ומוכיחים את ערכו עד 6 חודשים לאחר שבץ. בנוסף, מוצגים פרוטוקולים לבדיקת סולם לעכברים, כמו גם בדיקת הצילינדר הידועה, להערכה כמותית בלתי משוחדת של תפקוד מוטורי של גפיים. התוצאות מדגישות את היעילות התרגומית של mSU. ESS מוקד (fESS) מצטיין על פני קני מידה ידועים אחרים באיתור ליקויים בשבץ מוקדי, לכידת התאוששות ושמירה על רגישות עד 6 חודשים לאחר שבץ. בדיקות סולם וצילינדר מכמתות באופן אובייקטיבי ומנטרות ליקויים מוטוריים בגפיים הקדמיות והאחוריות, לטווח ארוך. לסיכום, שילוב mSU, fESS ובדיקות תפקוד מוטורי מספק מסגרת איתנה לחקירות שבץ רלוונטיות מבחינה קלינית. הפרוטוקולים שלנו משפרים את הערך התרגומי במחקר משיכות עכבר.

שבץ איסכמי גדול הוא אחד הגורמים העיקריים לתחלואה ונכות בעולם¹. ובכל זאת, מחקר משיכת עכבר עומד בפני מחסום תרגומי כמעט בכל הטיפולים שנבדקו פרה-קלינית עד כה². הסיבות המרובות לבעיה זו והמאמצים להתגבר עליה נסקרו בפירוט בפרסום הקודם². אתגרים אלה נובעים מהשילוב המוגבל של ההתקדמות הקלינית במודלים רלוונטיים של בעלי חיים² והחולשות של מערכות ניקוד התנהגותיות ונוירולוגיות בזיהוי מדויק ורגיש של ליקויים לאחר שבץ^{מוחי 2}.

תגליות אחרונות³ תומכות בכך שלמודל חוט הלהט של חסימת עורק אמצעי (fMCAo) בעכברים יש יתרונות תרגום משמעותיים על פני מודלים אחרים עם פגיעה בגולגולת פתוחה וטראומה ^2,4. נוסף על כך, זהו היחיד שמודל את הרפרפוזיה והטרומבקטומיה המכנית של הגדרות שבץ קליני ^5,6,7. עם זאת, המודל מתמודד עם תמותה תת-חריפה גבוהה בין 3-7 ימים לאחר שבץ מוחי, מה שאוסר על מחקרים ארוכי טווח של שבץ מוחי גדול ונחשב עד לאחרונה לחפץ הטבוע והבלתי עביר של המודל. בנוסף, איתור ליקויים נוירולוגיים לאחר שבץ הוא קשה יחסית ומוטה בעכברים בשל גודלם הקטן, במיוחד בקרב חוקרים שאינם קלינאים או חסרי ניסיון ^8,9. כדי להתמודד עם זה, קבוצות שונות פיתחו סולמות שונים כדי לזהות גירעונות. הסולמות הנפוצים והידועים ביותר כוללים את סולם בדרסון בן 3 הנקודות (BS)¹⁰, סולם בדרסון בן 5 הנקודות (mBS)¹¹, ציון לונגה בן 5 הנקודות (LS) (הדומה ל- mBS)⁶, סולם שבץ נוירולוגי שונה (mNSS) ^12,13, סולם גרסיה בן 18 הנקודות (GS)⁹ ומדד DeSimoni¹⁴ המפורט יותר או הידוע אחרת בשם "Neuroscore" (NS)^{9, סולם 15}. למרבה הצער, חלק ממאזניים אלה הם גסים מדי ומוגבלים רק לימים המעטים בשלב החריף שלאחר שבץ מוחי (BS, mBS ו- LS)^8,9 או שהפרשנות שלהם מטושטשת על ידי ליקויים כלליים (NS).

על רקע זה, פיתחנו ותיקפנו בעבר את פרוטוקול התמיכה של יחידת שבץ העכבר (mSU), יחד עם סולם שבץ ניסיוני (ESS) עבור עכברים¹³. הרציונל של mSU היה להתאים ידע מהשגרה הקלינית (כלומר, יחידות שבץ אנושיות) למחקר פרה-קליני של שבץ מוחי, בעוד ESS איחדה באופן ביקורתי סולמות שבץ שהיו קיימים בעבר אך "לא רגישים" או מיותרים לכדי אחד מעשי, מעודן, רגיש וחסכוני בזמן. mSU מורכב ניטור תכוף ומותאם של הפרמטרים הקליניים הבסיסיים של עכבר עם יישום מותאם של תמיכה בבעלי חיים כדי לשפר את הישרדות¹³.

ואכן, נתונים מהמעבדה שלנו ומאחרים מאמתים את הערך של שתי השיטות. mSU מתרגם אמצעים קליניים בסיסיים תומכים ומקדם⁷ מבני אדם לעכברים, מפחית באופן משמעותי את התמותה של fMCAo בעכברים מ 60-70% ל 10-15% ¹³ ובכך מאפשר מחקרים של שבץ גדול יותר, והוא יכול להיות מיושם ביעילות במעבדות עצמאיות מאז 16,17,18,19. בנוסף, ה-ESS יכול להבחין בין ליקויים ותסמינים מוקדיים (מרכיב מוקדי של ESS, fESS) וכלליים (מרכיב כללי של ESS, gESS) לאחר שבץ, מודלים של הניקוד הקליני האנושי (הבחנה בין סימנים ותסמינים מוקדיים וכלליים בבני אדם), קשור באופן ליניארי לגודל נגע השבץ ורגיש לטווח ארוך לליקויים^13,20. ובכל זאת, למרות הערך והיעילות המוכחים הן של mSU והן של ESS, היעדר הוראות ברורות, חזותיות וסטנדרטיות אפילו לחוקרים חסרי ניסיון משאיר מספר שאלות פתוחות על יישום mSU וסובייקטיביות משמעותית על ניקוד ליקויים מוקדיים על fESS.

ככזה, המאמר הנוכחי שלנו נועד לספק הוראות ברורות בסיוע וידאו עבור פרוטוקולי mSU ו- fESS. אנו מאמינים כי הדבר יתמוך בחוקרי שבץ כדי להגביר את יעילות התרגום של מחקרי השבץ שלהם, להפחית באופן משמעותי את אובדן בעלי החיים במהלך 3-10 הימים הראשונים לאחר שבץ, להפחית את עלויות הניסויים, ובסופו של דבר להעריך מחדש ליקויים נוירולוגיים במשך חודשים לאחר שבץ¹³. בנוסף, השילוב הנוסף של בדיקת שלב הסולם ובדיקת הצילינדר יכול לכמת בקלות את פרזיס הגפיים המוקדיות (הגפיים הקדמיות והאחוריות) עקב fMCAo.

כדי להציג יעילות mSU ו-fESS, אנו מספקים נתונים לטווח בינוני (14 יום) וארוך טווח (6 חודשים) על עכברים לאחר fMCAo. עכברי C57Bl/6J זכרים בני שנים-עשר שבועות (n = 31) שימשו ושוכנו תחת טמפרטורה מבוקרת (22 ± 2 מעלות צלזיוס), עם תקופת מחזור אור-חושך של 12 שעות וגישה למזון ומים כדוריים עד ליביטום. עכברים חולקו לשתי קבוצות מעקב במשך 14 יום (n=10, עוקבה 1) ו-6 חודשים (n=15, עוקבה 2) בהתאמה. עכברים אלה היו נתונים לאיסכמיה מוחית של 60 דקות באמצעות המודל המתואר היטב של fMCAo 13,20,21 תחת הרדמה איזופלורנית. בעלי חיים המופעלים על ידי שאם (n=6, פעלו כשתי הקבוצות הנ"ל, אך לא נגרמה איסכמיה) שאחריהם עקבו במשך 6 חודשים שימשו כקבוצת ביקורת. Buprenorphine שימש משכך כאבים לפני ו 3 ימים לאחר הניתוח. בדיקות שלב הסולם והצילינדר בוצעו גם עבור קבוצת 6 החודשים כחלק מהניקוד הנוירולוגי.

כל בעלי החיים נבדקו מדי יום לנקודות קצה הומניות במהלך 14 הימים הראשונים שלאחר הסטוק, שהוגדרו כ: 1) היפותרמיה חמורה (<33 מעלות צלזיוס) ו / או חוסר תנועה (למשל, ציון 4 במבחן 6 של fESS או "פעילות ספונטנית" מבחן של gESS) שלא השתפר על ידי טיפול "יחידת שבץ עכבר" (כלומר, חימום פסיבי והאכלה אקטיבית, ראה 1.4, 1.6, 1.8) תוך שעה, 2) סימנים של כאב או התנהגות חרדה (למשל ציון >2 במבחן "חרדה/התנהגות אוטומטית" של gESS), גם לאחר שיכוך כאבים לאחר הניתוח בהתאם לפרוטוקול.

בפרוטוקול זה, תמיכה לאחר שבץ של עכברים בצורה של mSU מתחילה מיד לאחר התאוששות העכבר מפעולת fMCAo. יש לכך 3 שלבים: שלב A (0-48 שעות לאחר הרפרפוזיה), שלב B (>48 שעות ועד "סוף התמיכה הפעילה הדרושה", בדרך כלל ביום 10-14, תלוי בשלב B של בעל חיים בודד), ושלב C (יום 14 ואילך). יש לו חמש התערבויות משמעותיות (ביקורים/ציון ריבוד סיכונים, האכלה, נוזלים, טמפרטורה וחיטוי מקומי; ראו 1.1 עד 1.8 להלן) המותאמות לכל בעל חיים, בהתאם לכל שלב (A, B או C) והמצב הקליני היומי שלו בפועל המוערך על ידי ציון ריבוד הסיכון (RSS), ראו איור משלים 1 וטבלה 1 עם שלוש דוגמאות אופייניות. החומרים והכלים הדרושים עבור mSU מוצגים באיור 1a ומתוארים בטבלת החומרים. אנו מספקים גם תבנית לניטור בעלי חיים במהלך mSU (ראה קובץ משלים 1).

הניסויים המדווחים במאמר זה נערכו בהתאם להנחיות הלאומיות והאירופאיות לשימוש בחיות ניסוי ואושרו על ידי הוועדות הממשלתיות היווניות (אתונה, מספר רישיון "843895_06-09-2022").

1. "יחידת שבץ עכבר" (mSU)

1. להעריך את המצב הקליני של בעל החיים מדי יום ("ביקורים") ולחשב את ציון ה- RSS שלו
   1. הדפס את הקובץ המשלים 1, רצוי לפני ניתוח בעל חיים, לצורך רישום נתונים וניטור.
   2. להעריך כל בעל חיים באופן קליני בנקודות זמן סטנדרטיות (ביקורים): מוקדם בבוקר (בסביבות 08:00), צהריים (בין 14:00 ל 16:00) ומאוחר בלילה (בסביבות 22:00 - 23:00).
      הערה: התאימו את הביקורים הסטנדרטיים האלה בהתאם לשלב המעקב של בעל החיים: בדקו את מצב בעל החיים 2x ליום (בוקר-לילה) לשלב A, 3x ליום לשלב B, ופעם ביום לשלב C. התאימו עוד יותר את תדירות הביקורים בהתאם לציון RSS (ראה 1.1.6). עבודה רצוי בצוות של >2 אנשים להפחתת עומס עבודה. ביקורי הבוקר והלילה חיוניים להצלחה בתמיכה, ניטור והפחתת תמותה מכיוון שהשלב הלילי (הפעיל) של העכברים מגביר את הדרישות המטבוליות והאנרגטיות 13,22,23 וקשור לתמותה לילית מוגברת לאחר שבץ.
   3. שקול את העכבר באמצעות סולם סטנדרטי רגיש במהלך ביקור הבוקר.
   4. מדדו את הטמפרטורה באמצעות מדחום ללא מגע הממוקם מעל מרכז הגוף הגחוני שלו במהלך ביקור הבוקר. החזק והשתק את העכבר בגבו. בצעו את הקריאה בשניות הראשונות לאחר ההשתקה (ראו איור 1f).
      הערה: אין להשתמש במדחום רקטלי עקב קרע אפשרי במעי לאחר מדידות חוזרות ונשנות עם דלקת צפק במקביל.
   5. להעריך ולתעד את המצב הקליני הכללי של העכבר (ניידות, פצעים, כובע שופכה, תגובתיות, פרווה, מצב הידרציה וכו ') בביקור הבוקר לכל השלבים, מדי יום עד יום 14.
   6. חשב את ציון ה- RSS בביקור הבוקר על-ידי סיכום הנקודות בהתאם למשקל, הטמפרטורה וציון ה- fESS של בעל החיים כמתואר באיור משלים 1. לחישוב אוטומטי של ה- RSS בטבלת גיליון אלקטרוני, השתמש והתאם את הנוסחה הנמצאת בטבלה 1. להרדים את בעל החיים בשיטה מאושרת מוסדית, אם קיימות נקודות קצה הומניות (ראה לעיל).
   7. התאימו הן את תדירות הביקורים והן את עוצמת התמיכה, מדי יום בהתאם לציון RSS ולשלב של בעלי החיים לאחר שבץ.
      הערה: שלב B הוא הקריטי ביותר לתמותה. הגדלת תדירות הביקורים ועוצמת התמיכה ב-RSS ≥3 (להגדרה ולהנחיות, ראו טבלה 1). אם בעל החיים ממשיך להראות RSS >3 בשלב C, בקר ותמוך בו כמו בשלב B. השתמש ב- RSS ובתיאורים כלליים (כגון מחלים, יציב, נמוך/בינוני וחולה קריטי) כדי לתאר את מצבו הקליני בקרב צוות התמיכה. לאחר היום ה-14, הפחיתו את ביקורי בעלי החיים רק לאלה הנדרשים על פי פרוטוקול הניסוי (למשל לצורך הערכות התנהגותיות/נוירולוגיות).
2. הכנת מזון הג'ל לתמיכה תזונתית
   1. כתשו כדורי מזון נפוצים באמצעות בלנדר (איור 1a).
   2. מוסיפים סוכר מסחרי ב 5-10% כדי להגדיל את התוכן הקלורי של המזון.
   3. הוסיפו מים כדי ליצור מרקם נוזלי דמוי ג'ל (איור 1b).
   4. השתמש במזון ג'ל זה לתמיכה תזונתית פסיבית ואקטיבית כאחד.
      הערה: לחלופין, יש להשתמש במזון ג'ל מסחרי מוכן לשימוש. מזון מוכן יכול להישאר במקרר במשך 2-3 ימים.
3. תמיכה תזונתית פסיבית של העכברים
   1. ממלאים צלחת פטרי במזון ג'ל ומניחים אותה על רצפת הכלוב (תמיכה תזונתית פסיבית על ידי אספקת מזון ג'ל לגישה נוחה לעכבר). השאירו 2-3 כדורי מזון ליד צלחת הפטרי.
   2. רעננו את צלחת הפטרי עם מזון ג'ל מדי יום. במהלך הימים הראשונים, עכברים עשויים למלא או לכסות את צלחת הפטרי במצעי כלוב. חלק יתחילו לאכול ממנו (איור 1c).
4. תמיכה תזונתית פעילה (הזנה פעילה)
   הערה: הזנה פעילה מתרחשת במהלך שלב B. תדירות ההאכלה הסטנדרטית היא פי 3 ליום והיא מותאמת ליותר פעמים בהתאם לציון RSS (למשל, אפילו 4-5 פעמים ביום). לעיתים, עבור עכברים שיש להם כל הזמן ציון RSS של 0-1 (כלומר, שבץ קטן) ואוכלים באופן פעיל בעצמם להוריד את התדירות ל 1-2 ליום.
   1. ממלאים מראש מזרקים של 1 מ"ל במזון ג'ל.
   2. אחזו והחזיקו את העכבר בעדינות אך בחוזקה מפרוות הצוואר שלו, כפי שמוצג באיור 1d (ראש חץ אדום).
   3. ייצבו את לחי העכבר בעזרת האצבע האמצעית, כפי שמוצג בחצים אדומים באיור 1d: בזמן שאתם מחזיקים את העכבר בחוזקה, החליקו את האצבע הצידה לכיוון אפו של העכבר כנגד לחיו. תחזיקו מעמד.
   4. הניחו את קצה המזרק בפיו של העכבר בין שיניו וכוונו את הקצה לכיוון הצד הפנימי של לחיו (חץ אדום, איור 1e).
   5. תן כ 40-50 μL של מזון ג'ל בכל פעם (פה).
   6. החזירו בעדינות את העכבר לסורג הכלוב. אפשר זמן ללעיסה.
   7. חזור על האכלה לאחר 1-2 דקות, עד שכל עכבר אכל 1-1.5 מ"ל של מזון ג'ל.
      הערה: האכילו 5-10 עכברים בכל ריצה (1-2 כלובים); האחרים אוכלים ובולעים את מזון הג'ל כאשר כל עכבר מקבל פיה. התהליך אינו יוצר לחץ על עכברים. כמו כן נצפה כי חלק מבעלי החיים בסופו של דבר ממקמים את עצמם לאחיזה ולהאכלה.
5. תוספת מלח רגילה
   1. שקלו את העכבר במהלך ביקור הבוקר (ראו 1.1.2 ו-1.1.3).
   2. חשב את הירידה / העלייה במשקל בהשוואה למדידה הקודמת על ידי הפחתת הערכים.
   3. להשלים את הגירעון במשקל שלה (בגרמים) עם מ"ל של מלוחים רגילים (תת עורית).
      הערה: הימנע מעומס נוזלים ובצקת בכל מחיר. אין לחרוג מ-1-2 מ"ל למנה ו-3-4 מ"ל נוזלים ליום. התחל לאחר 36 שעות לאחר fMCAo.
6. תוספת גלוקוז
   1. בדוק את ציון ה- RSS המחושב של העכבר ואת התנועה הכוללת שלו.
   2. יש להזריק 0.5 - 1 מ"ל של 5% גלוקוז תת עורית אם RSS >3 והעכבר מראה סימנים מקבילים של היפותרמיה (<34 מעלות צלזיוס) או אימוביליזציה/ברדיקינזיה. עדיף להזריק רק במהלך הביקור הלילי.
      הערה: הימנע היפרגליקמיה לאחר שבץ בכל מחיר. היפרגליקמיה לאחר שבץ היא רעילה⁷. לכן, יש להשלים גלוקוז רק לאחר האכלה פעילה ובמקרים של מצב קליני חמור או כדי למנוע היפוגליקמיה במהלך פעילות לילה. הזנה פעילה (ראה 1.4) צריכה להיות מדד התמיכה העיקרי, מכיוון שהיא מספקת תמיכה אנרגטית חלקה ומתמשכת יותר ומתרגמת הנחיות קליניות ⁷. אין להשלים גלוקוז לפני היום השלישי.
7. ניהול טמפרטורה (פסיבי)
   1. מדדו את טמפרטורת הגוף של פני השטח של החיה לפני הניתוח בתחילת הניתוח ולאחר הניתוח בכל ביקור (איור 1a). מדידה כפי שמוצג באיור 1f ומתואר ב-1.1.4. רשום את הערכים.
      הערה: היפותרמיה בעכברים מוגדרת כטמפרטורת גוף <35 °C ^24,25. נתונים קודמים¹³ מצביעים על כך שכל טמפרטורה מתחת ל -34 מעלות צלזיוס היא תמרור אזהרה לתמיכה לאחר שבץ מוחי (ראה להלן).
   2. כאשר היפותרמיה בין 33 ל 34 מעלות צלזיוס הוא ציין, לחמם את העכבר באופן פסיבי בכלוב על צלחת חימום (או כל מכשיר התחממות פסיבית אחר) עד שהוא מגיע לטמפרטורת הגוף > 34 מעלות צלזיוס. להאכיל באופן פעיל את העכבר כדי לספק אנרגיה לייצור חום פעיל על ידי החיה (אספקה מתמשכת של אנרגיה).
      הערה: יש לשמור את בעל החיים על חימום פסיבי למשך 1 עד כמה שעות. הימנע היפרתרמיה פסיבית בכל מחיר.
   3. כאשר היפותרמיה נצפית, <33 מעלות צלזיוס, להגביר את התמיכה עם מתן גלוקוז נוסף תת עורית (אספקת אנרגיה מהירה אך קצרת טווח; ראה 1.6 לעיל).
8. ניקוי איברי מין ו/או פצעי צוואר ("חיטוי" מקומי)
   הערה: לעיתים, ניתן להבחין בפצע או בפקק שופכה. הלחשת פצעים היא נדירה. תקע שופכה הוא תקע קשיח בקצה איברי המין של העכבר (איור 1g), והוא נפוץ יותר, במיוחד אצל חיות עם חומרת שבץ גבוהה יותר. כאשר פקק חוסם את השופכה, עלולה להתרחש תסמונת חסימתית במתן שתן ויכולה להוביל לתחלואה ומוות²⁶. לכן, יש לנקות אותו היטב.
   1. השרו את פקק השופכה, אם קיים, במי מלח רגילים כדי להקל על הסרתו.
   2. הסירו את פקק השופכה בעדינות באמצעות מטוש קטן או פינצטה פשוטה בכל בדיקה/ביקור של בעלי חיים. לחטא את השופכה באמצעות מד או מטוש, ספוג בתמיסת חיטוי.
   3. אם קיים פצע, יש לחטא אותו באופן מקומי בכל תמיסת חיטוי כירורגית נפוצה (למשל, אוקטניספט) ולתפור את הפצע באופן שגרתי באמצעות עדיף תפר משי 5/0.

2. המרכיב המרכזי של סולם שבץ ניסיוני (fESS)

1. הכנת שדה הבדיקה
   1. נקו ספסל עם 70% אלכוהול כדי להסיר גירויים חיצוניים (אופטיים או ריחות) והכינו את חומרי הבדיקה, כפי שמוצג באיור 2a.
   2. הדפס את גיליון הניקוד של ESS המסופק כקובץ משלים 2 ועקוב אחר הבדיקות בזו אחר זו.
2. Forelimb paresis (מבחן 1)
   1. הרימו והחזיקו את העכבר בעדינות מבסיס הזנב שלו.
   2. בדקו והעריכו ויזואלית הרחבה סימטרית קדימה וניידות סימטרית של הגפיים הקדמיות בזמן שהעכבר זז (איור 2c).
   3. ציון בהתאם לממצאים החזותיים כדלקמן: 0 עבור הרחבה תקינה וסימטרית ותנועה של הגפיים הקדמיות; 1 עבור "אסימטריה קלה" המוגדרת ככיפוף קל ו/או תנועה מופחתת של הגפה הנגדית או נוקשות הגפיים; 2 עבור "כיפוף מסומן" של האיבר הקונטרלסיונלי; 3 על היצמדות של איבר contralesional לתא המטען; ציון 4 ללא תנועת גוף או גפיים.
      הערה: הבדיקה מזהה paresis של הגפה הקדמית contralesional. זה גם חלק BS, LS, mNSS ו NS סולמות. ציון 1 עשוי להיות מאתגר להגדרה בשל תמרוני המילוט של החיה.
3. פרזיס בגפיים האחוריות (מבחן 2)
   1. המשך להחזיק את העכבר בבסיס הזנב שלו, כמתואר בדיקה 1.
   2. בדקו ויזואלית את ההארכה הסימטרית ואת התנועה של הגפיים האחוריות והבהונות (איור 2c).
   3. ציון בהתאם לממצאים כדלקמן: 0 עבור מיקום/הרחבה סימטריים תקינים ותנועה של הגפיים האחוריות והבהונות; 1 עבור אסימטריה ברורה, כאשר ירידה משמעותית בתנועה ובמיקום/הרחבה אסימטרית של הגפה האחורית הנגדית (הימנית) (איור 2d).
      הערה: הבדיקה מזהה paresis של הגפה האחורית contralesional. זה גם חלק בקנה מידה mNSS. מבחן זה עשוי להיות מסובך כדי לקבל ציון מדויק.
4. סימטריה בתא המטען (מבחן 3)
   1. המשך להחזיק את העכבר בבסיס זנבו (לאחר 2.3.) ולהעריך את תנועות תא המטען שלו.
   2. ציון בהתאם לממצאים כדלקמן: 0 עבור נורמלי, ללא כיפוף תא המטען או כיפוף/תנועה סימטרית קלה של תא המטען לשני הצדדים (כתמרון "בריחה"); 1 לכיפוף מסומן (>30°) של הראש/תא המטען בעיקר קונטרלסיוני (מימין), בטווח של 10 שניות ראשונות מהאחיזה.
      הערה: הבדיקה מזהה אסימטריה על ידי נגעים מוטוריים חד צדדיים. זה גם חלק ניקוד mNSS.
5. התנהגות מעגלית (מבחן 4)
   1. הנח את העכבר בעדינות על משטח שטוח והשאר אותו לנוע בחופשיות במשך דקה אחת לפחות. שימו לב לתבנית התנועה שלו.
   2. ציון בהתאם לממצאים כדלקמן: 0 עבור תנועה חקרנית, חיה, ליניארית ללא התנהגות מעגלית; 1 על הנטייה לפנות לצד אחד אך לא במעגלים סגורים; 2 לתנועה בלתי פוסקת במעגלים סגורים לצד אחד; 3 לתנועה מתמדת במעגלים סגורים לצד אחד; 4 עבור ציר, מתנדנד או ללא תנועה כלל.
      הערה: הבדיקה מזהה ליקויים בניווט סנסומוטורי ומרחבי. זה גם חלק NS.
6. סימטריה בגוף (מבחן 5)
   1. המשך מבדיקה 4 ותן לעכבר לנוע בחופשיות על המשטח השטוח. שימו לב לציר האף אל הזנב שלו.
   2. ציון בהתאם לממצאים כדלקמן: 0 עבור יציבה נורמלית עם גזע מוגבה מהספסל, וזנב ישר; 1 עבור "אסימטריה קלה" אם גוף קל מתכופף לצד אחד וזנב כפוף באופן מרוחק; 2 עבור "אסימטריה מתונה" אם הגוף מתכופף בבירור או נשען לצד הקונטרלסיוני עם זנב כפוף פרוקסימלי ו / או גפיים נמתחות מחוץ לגוף; 3 עבור "אסימטריה בולטת" אם מסומן כיפוף גוף, צד אחד מונח כל הזמן על הספסל והזנב כפוף בבירור (יותר מציון 2); 4 עבור "אסימטריה קיצונית" אם הגוף כפוף, צד אחד שוכב כל הזמן על הספסל והזנב כפוף מאוד.
      הערה: הוא מזהה גירעונות חד-צדדיים חד-צדדיים תחושתיים. זה גם חלק מקנה מידה NS.
7. הערכת הליכה (מבחן 6)
   1. המשך מבדיקה 5, ותן לעכבר לנוע בחופשיות על המשטח השטוח. התבונן כעת בהליכה שלו ובדוק גירעונות מוטוריים בהליכה כגון פרזיס, נוקשות גפיים, הליכה ספסטית, גפיים.
   2. ציון בהתאם לממצאים כדלקמן: 0 עבור הליכה רגילה אם גישוש, סימטרי ומהיר עם גפיים גמישות הנעות "מוסתרות" מתחת לגוף; 1 להליכה נוקשה, לא גמישה ואיטית יותר של עכבר הנע בחופשיות ללא צליעה; 2 לצליעה ברורה עם תנועות אסימטריות (שמאל-ימין); 3 לרעד, היסחפות או נפילה לאחר דחיפה עדינה; 4 ללא הליכה ספונטנית (הליכה לא יותר מ 3 צעדים כאשר מגורה על ידי דחיפה עדינה).
      הערה: הוא מזהה ליקויים משולבים בהליכה. זה גם חלק NS.
8. הקפת חובה (מבחן 7)
   1. החזיקו את העכבר בבסיס הזנב שלו כדי להרים אותו מפני השטח ותנו לו ללכת רק על הגפיים הקדמיות שלו. שימו לב לתנועתו.
   2. ציון בהתאם לממצאים כדלקמן: 0 עבור תנועה ליניארית נורמלית; 1 לנטייה לפנות לצד אחד; 2 על פנייה לצד אחד במעגלים סגורים; 3 אם מסתובב לצד אחד בתנועות מגושמות או נכשל בעצלתיים להשלים מעגל; 4 אם אין התקדמות והחלק הקדמי של תא המטען מונח על הספסל.
      הערה: המבחן משלים את מבחן התנהגות ההקפות (מבחן 4, ראה 2.5). הוא כנראה מזהה ליקויים סנסומוטוריים ומרחביים. זה גם חלק ממערכת הניקוד NS.
9. יציבה נגד כוחות רוחביים (מבחן 8)
   1. הניחו את העכבר על כף היד, כאשר ציר אף הזנב שלו (אורכי) מקביל לציר כף היד הסגיטלי.
   2. הניף את העכבר קדימה לאחור במהירות קבועה כדי לעורר כוחות בניצב לציר האורך שלו.
      הערה: פעולה זו מאלצת את העכבר לשמור על מיקומו הזקוף ועל שיווי משקלו כנגד הכוחות הרוחביים במהלך הנדנדה. גופו בדרך כלל אינו בא במגע עם כף היד או האצבעות.
   3. התבונן חזותית והרגש כל מגע כף יד של הצד השמאלי והימני של העכבר כשהוא מתאזן כנגד הנדנדה. בדוק אם יש נפילה אסימטרית, נגיעה בכף היד או אינדיקציה לחולשה רוחבית.
   4. ציון בהתאם לממצאים כדלקמן: 0 אם העכבר עומד במצב זקוף רגיל עם גבו מקביל לכף היד ויכול לאזן נגד נדנדה מבלי לגעת בכבדות בכף היד; 1 אם העכבר משטח את גופו במהלך הנדנדה כדי להשיג יציבות; 2 אם חלק מהעכבר שוכב או נוגע לזמן קצר בכף היד במהלך הנדנדה; 3 אם העכבר שוכב בצד אחד, בקושי מסוגל לשחזר את המיקום הזקוף; 4 אם העכבר שוכב על מצב נוטה, לא מסוגל לשחזר את המיקום הזקוף.
      הערה: הבדיקה מזהה ליקויים ביציבה כנגד תאוצה רוחבית, אך הניקוד שלה עשוי להיות סובייקטיבי. זה גם חלק mNSS, NS.
10. הצבה ממוקדת פורלימב (מבחן 9)
    1. החזק את העכבר מגבו או מבסיס הזנב שלו. כוונו אותו בניצב לעבר הקורה, המתפקדת כ"מטרה להגיע אליה". שימו לב ל"הושטת יד" ואחיזה סימטרית.
    2. ברגע שהוא תופס את הקרן ביציבות, משוך אותה בעדינות משם והתבונן ב"שחרור" סימטרי של הגפיים הקדמיות.
    3. ציון בהתאם לממצאים כדלקמן: 0 עבור "הושטת יד" סימטרית, אחיזה ו"שחרור"; 1 לכל אסימטריה ב"הושטת יד" ו/או "שחרור", המעידה על חולשה נגדית של הגפיים הקדמיות.
11. גירעון סנסומוטורי של הגפיים הקדמיות (מבחן 10)
    1. החזיקו את העכבר בחוזקה בגבו ופנו אליו בגחון (ראו וידאו או איור 1e).
    2. גרו את הכפות הקדמיות ברצף עם קצה דק (למשל קיסם עץ) מזווית עיוורת. שימו לב לתגובת הכף הקדמית.
    3. ציון בהתאם לממצאים כדלקמן: 0 עבור תנועת אחיזה רגילה ומהירה בשני הצדדים; 1 עבור אחיזה נעדרת או מאוחרת בבירור באופן קונטרה.
       הערה: בדיקת 2.10 ובדיקה 2.11 לליקויים סנסומוטוריים עדינים בגפיים הקדמיות. הם גם חלק mNSS.
12. הליכת קרן (מבחן 11)
    1. הניחו קורת עץ באורך 1 מ' (Table of Materials) לחיבור שני משטחים מוגבהים (למשל ספסלים, שולחנות) בגובה של 1-1.5 מ' מעל הקרקע. ייצב את קצוות הקרן כדי למנוע רעידות או חוסר יציבות.
    2. הניחו את העכבר במרכז הקרן כשציר האף-זנב שלו מקביל לקרן (איור 2e). לאפשר איזון או הליכה חופשית על הקורה. שימו לב לשיווי המשקל שלה או לפרזיס הגפיים והנפילות.
       הערה: העכבר צריך להשיג איזון על הקרן לפני שהוא מבקיע אותה. החזיקו כפפה עבה מתחת לבעל החיים (במרחק של כ-15-20 ס"מ) כדי להגן עליו במקרה של נפילה.
    3. ציון בהתאם לממצאים כדלקמן: 0 אם העכבר מתאזן והולך בתנוחה יציבה לכיוון צד אחד של הקורה; 1 אם הוא תופס את דופן הקורה ואינו הולך עליה; 2 אם איבר אחד נופל מהקורה; 3 אם שתי גפיים נופלות מהקורה; 4 אם העכבר מנסה לאזן את הקרן אך נופל (לאחר 40 שניות); 5 אם זה נופל בין 20-40 שניות; ציון 6 אם הוא נופל ללא ניסיון לאזן או להיתלות על הקורה (<20 שניות).
       הערה: הבדיקה מזהה ליקויים מוטוריים משולבים של הגפיים הקדמיות, הגפיים האחוריות ותא המטען. זה גם חלק בקנה מידה mNSS.
13. תחושת שפם (מבחן 12)
    1. הניחו את העכבר על ספסל פתוח (כמו במבחנים 4 ו-5). הקדישו זמן ללינה.
    2. מגרים את השפם השמאלי והימני שלו ברצף, עם צמר גפן דק וארוך, מ"זווית עיוורת". שימו לב לתגובה מהירה של הראש לכיוון הגירוי.
    3. ציון בהתאם לממצאים כדלקמן: 0 עבור נורמלי, סיבוב ראש מהיר על גירוי, דו צדדי; 1 לתגובה קונטרלסיונלית איטית יותר בעת גירוי; 2 עבור תגובה נוגדת נעדרת (ללא תור); 3 עבור תגובה קונטרלסיונלית נעדרת ואיפסילזיונלית איטית יותר; 4 להיעדר תגובה דו-צדדית.
       הערה: הימנע מזיהוי חזותי של הכותנה מכיוון שהדבר יגרום באופן שגוי לסיבוב ראש ipsilateral. הבדיקה נכונה טכנית רק כאשר העכבר "מופתע" מגירוי השפם. הבדיקה היא גם חלק NS ומזהה ליקויים סנסומוטוריים של שפם (קליפת החבית).
14. טיפוס (מבחן 13)
    1. השתמשו במשטח משופע מצופה גומי בזווית של 45° (איור 2a) ומקמו את העכבר במרכזו. שימו לב למאמץ של העכבר לטפס.
    2. ציון בהתאם לממצאים כדלקמן: 0 (נורמלי) אם העכבר מטפס במהירות וללא מאמץ לראש המשטח; 1 אם הוא מטפס במתח, עם חולשת גפיים; 2 אם הוא נאחז במדרון מבלי להחליק או לטפס; 3 אם הוא מחליק במורד המדרון למרות המאמץ למנוע נפילה; 4 אם הוא מחליק ללא מאמץ למנוע נפילה.
       הערה: הבדיקה היא גם חלק NS ומזהה כוח מוטורי כללי.
15. חשב את הציון של fESS על ידי סיכום כל הציונים ממבחנים 1 עד 13
    הערה: ציון fESS של 0 מציין עכבר רגיל, הציון המרבי הוא 42. אוטמים גדולים עם נגעים סטריאטליים וקליפת המוח בדרך כלל גורמים לציונים >7-9. בחנו ודרגו מספר עכברים נורמליים לפני שתתחילו להעריך עכברים שעברו שבץ, כדי להתאים לווריאציות של התנהגות נורמלית ולהפחית ניקוד fESS חיובי כוזב. השתמש בפרוטוקול הווידאו שסופק כל הזמן לסטנדרטיזציה של ניקוד לאורך כל הניסוי.

3. רכיב כללי של ESS (gESS)

הערה: הערך את gESS כדי לזהות סימנים של "מחלת עכבר כללית", למשל, דלקת או זיהום, בדרך כלל נוכחים במהלך 1-2 השבועות הראשונים לאחר fMCAo. השתמש בגיליון הניקוד בקובץ משלים 2. הערך gESS רצוי לאחר השלמת fESS.

1. הניחו את העכבר על משטח שטוח (ספסל) והניחו לו לנוע בחופשיות כמו ב-2.5. הערך ברצף את הציונים הבאים.
2. שימו לב לפרוותו. ניקוד לפי גיליון ניקוד gESS (ציונים 0-2, ראה קובץ משלים 2).
3. בדוק את תגובת הבהלה של העכבר: הפתיע את העכבר במחיאות כפיים פתאומיות מזווית עיוורת, כאשר הוא רגוע. בדוק ודרג את תגובת אוזני העכבר על פי גיליון הניקוד gESS (ציונים 0-2, ראה קובץ משלים 2).
4. העריכו ויזואלית את העיניים של העכבר הנינוח: בדקו אם יש עיניים פקוחות/עצומות או נוכחות ריר. ציון לפי גיליון ניקוד gESS (ציונים 0-4, ראה קובץ משלים 2).
5. שימו לב לפעילות הספונטנית הכללית ולערנות של העכבר. ציון לפי גיליון ניקוד gESS (ציונים 0-4, ראה קובץ משלים 2).
6. שימו לב להתנהגות הספונטנית הכללית של העכבר לכל נוכחות של חרדה, רגישות יתר, תוקפנות או סיבוב לאורך צירו במהלך כל טיפול. ציון לפי גיליון ניקוד gESS (ציונים 0-4, ראה קובץ משלים 2).
7. חשב את הציון של gESS על ידי הוספת הציונים של כל השלבים לעיל (ניקוד תצפיתי, שלבים 3.2. עד 3.6).
   הערה: ציון gESS אינו מזהה את הליקויים המוקדיים הנגרמים על ידי נגעי שבץ ואינו מושפע מ- mSU, כפי שהוצג קודם לכן ¹³. כל הבדיקות מותאמות מסולם NS ^9,15.

4. כימות ליקויים בגפיים הקדמיות באמצעות בדיקת צילינדר

הערה: בדיקת צילינדר תוארה בעבר בפירוט ^9,15,27 ולא תתואר בפירוט כאן. מבחן הצילינדר הוא מבחן התנהגותי עצמאי המכמת באופן בלתי משוחד ליקויים של הגפיים הקדמיות (ראה 4.2).

1. הפעל את הבדיקה בהתאם להוראות המופיעות כאן¹⁵. צלם סרטונים ונתח אותם כמו ב ^-15. מדדו ימין ושמאל מגעי גפיים ראשונים לקירות. איור 3a,b מציג תמונות של ההתקנה.
2. חישוב הלטרליזציה של השימוש בגפיים עקב paresis contralesional (ימין) כאחוז באחוז. השתמש בנוסחה: % העדפה עבור צעדים שמאליים = [(שמאל - ימין) אנשי קשר ראשונים / (ימין + שמאל) אנשי קשר] x 100.
   הערה: הפעל בדיקת צילינדר בסיסי עבור כל עכבר לפני גרימת שבץ. הפעל בדיקות בנקודות זמן בהתאם לכל תוכנית ניסוי.

5. כימות ליקויים בגפיים הקדמיות והאחוריות באמצעות מבחן שלב הסולם

הערה: בנו את המכשיר לעכברים מפרספקס (מוצג באיור 3c): מסדרון באורך 1 מ' עם קירות בגובה 20 ס"מ, דרגות פלסטיק (קוטר 3 מ"מ) שהונחו במרווחים קבועים של 15 מ"מ (איור 3c1) וקופסת "מקלט" בקצה הדיסטלי. הניחו מצעי בעלי חיים בקופסת המקלט להיכרות וכמה כדורי מזון או חמאת בוטנים כפרס. רוחב המסדרון צריך להיות 10 ס"מ ויש להגביה אותו כ -30 ס"מ מהקרקע.

1. אמן את העכברים על המכשיר 1-3 ימים לפני קו הבסיס של הניסוי. הפעל את האימון כמו בשלבים 5.1.1 עד 5.1.4.
   הערה: יש צורך באילוף על מנת להתאים את בעלי החיים להליכה קבועה ונורמלית במסדרון השלבים, ללא עצירות, פניות או התנהגות חקרנית. בצעו אימונים במשך יומיים רצופים (2 מפגשים). כל אימון מורכב מ-3 ריצות (ריצה = הליכה אחת לאורך כל המסדרון לכיוון תיבת המקלט). איסוף נתונים בסיסיים נחוץ למעקב.
   1. נקו את השלבים והקירות לפני כל ריצה עם 70% אלכוהול, כדי למנוע ריחות והסחות דעת/עצירות "גישושיות" של העכבר.
   2. מקם את העכבר בתחילת המסדרון בסולם, מול תיבת המקלט, כדי להתחיל בריצה. הניחו לעכבר ללכת בחופשיות לעבר תיבת המקלט שבקצה המסדרון. אין להכריח את בעל החיים ללכת.
      הערה: ריצות במהלך אימון הן בדרך כלל משתנות מאוד מבחינת משך הזמן ודפוס ההליכה. מטרת האימון היא הליכה יציבה לכיוון תיבת המקלט, בדרך כלל תוך <10 שניות, ללא עצירות/סיבובים, המושגת בדרך כלל בסוף יום האימון השני. טפל בבעל החיים תמיד בעדינות כדי למנוע השראת מתח אשר תסיח את הדעת אימון נכון. הוציאו בעלי חיים מהמסדרון ובצעו מחדש את הריצה אם הם נשארים במסדרון וחקרו באופן מקומי במשך > דקה, כדי למנוע הרגלה.
   3. בצע את ריצת האימון^{הראשונה} . תן לחיה לנוח בתיבת המקלט במשך 5 דקות לאחר ריצת^הרחוב 1.
      הערה: זמן מנוחה ממושך זה מאפשר לעכבר להכיר את תיבת המקלט ולתפוס אותה כיעד "נח/מתגמל" להגיע אליו. השגת "תפיסה מתגמלת" של תיבת המקלט היא קריטית לריצות מוצלחות.
   4. הוציאו את העכבר מקופסת המקלט ובצעו את ריצות האימון השנייה והשלישית כמו ב-5.1.2. אפשר זמן מנוחה קצר יותר בתיבת המקלט בסוף ריצות אלה (30-60 שניות), כדי למנוע הרגלה.
      הערה: האימון מסתיים ביום השני. ביום השני כמעט כל בעלי החיים לומדים ללכת במסדרון בקצב קבוע. שקול להחריג בעלי חיים מניסויים נוספים אם הם לא לומדים.
2. הפעל את הניסוי על עכברים מאומנים. בדוק עכברים במשך 2 ריצות בכל פעם במהלך כל נקודות הזמן של הניסוי וקו הבסיס.
   1. בצע ריצות כמתואר בשלבים 5.1.1 ו- 5.1.2. אפשר מקסימום 5 דקות של זמן מנוחה בין 2 הריצות בתיבת המקלט.
   2. השתמשו בטלפון חכם (או במצלמה מקבילה) וב"מקל סלפי" כדי לצלם סרטונים (נתונים) של החיות בזווית גחון ו"עיוורת" קלה ממרחק כלשהו (כפי שמוצג באיור 3c2). הקפד ללכוד את הגפיים כאשר החיה הולכת במסדרון. אל תסיח את דעתו של העכבר באופן חזותי במהלך ריצתו ואל תעקוב אחר גפיו במהלך ריצתו (איור 3c2).
   3. הקלט את שתי הריצות אך השתמש ונתח נתונים מהריצה השנייה.
   4. מדוד את מספר שלבי השבר (נפילות) בין השלבים עבור כל גפה (שמאל/ימין, קדמי/אחורי) (איור 3c3), על-ידי סקירת הווידאו באמצעות כל תוכנת נגן מדיה עם אפשרויות הילוך איטי. חשב את ההפרש המוחלט או ה% בין שלבי התקלה בגפה הימנית והשמאלית, בנפרד עבור הגפיים הקדמיות והאחוריות.
      הערה: הריצה השנייה מספקת תוצאות אמינות יותר. עכבר בריא בדרך כלל יש 0-1 צעדים שרירותיים לכל גפה (ימין או שמאל) במהלך הריצה השנייה שלו, אשר בדרך כלל נותן טווח הפרש של 0 ±1. עכבר מלטף יבצע צעדי שבר עם הגפה הפארטית הימנית (קונטרה-לסיונלית) שלו (גפה קדמית או אחורית), וכתוצאה מכך צידיות "ימנית" חיובית. בעל חיים שעבר שבץ חמור עשוי להיות איטי יותר או לא להשלים את הריצה במהלך 7-10 הימים הראשונים לאחר שבץ מוחי, עם זאת, הוא ישיג ריצות נכונות לאחר מכן ויראה ליקויים חמורים.

ה- mSU, כמתואר לעיל, מתחיל לאחר פעולת fMCAo. התוצאות המייצגות שלנו בשתי קבוצות עכברים בלתי תלויות של שבץ fMCAo ודמה (איור 4a) מאשרות את הערך המוכח בעבר של mSU, במיוחד בתקופה הקריטית שבין ימים 3 ו-10¹³. בקבוצות שלנו, התמותה התרחשה עבור 3/15 בעלי חיים מעוקבה 1 (שבץ, מעקב של 6 חודשים), 2/10 מעוקבה 2 (שבץ, מעקב של 14 יום) ו-0/6 של בעלי חיים המופעלים על ידי דמה (איור 4a) כחלק מפתופיזיולוגיה של שבץ מוחי (כולם נמצאו מתים במהלך ביקורי הבוקר), ונכללה בניקוד. אף בעל חיים לא הומת חסד לפי נקודות קצה הומניות שהוגדרו מראש. תמותה חריפה זו (10-15%) בשלב A (24-48 שעות ראשוניות לאחר fMCAo) (איור 4a) יוחסה לבצקת חצי ספרית ולפריצות כתוצאה משבץ טריטוריאלי גדול¹³, והיא הייתה צפויה כחלק ממידול שבץ תרגומי. התמותה המאוחרת במהלך שלב B (1/15 עבור עוקבה 1, 1/10 עבור קבוצה 2) הוסיפה מקסימום של 5-10% תחת פרוטוקול mSU (איור 4a), ומתרחשת בדרך כלל עבור בעלי חיים עם שבץ גדול מאוד שלא ניתן להציל למרות תמיכת mSU. זה גם מתרגם ישירות את התמותה האנושית לאחר שבץ²⁹ הקשורה לחומרה. שום יישום של mSU או דבקות נמוכה בעקרונותיה אינם מביאים לתמותה מוגברת בשלב B שיכולה להגיע אפילו ל-60-90%¹³. שלב C הוא בדרך כלל ללא תמותה נוספת.

עם היישום של mSU, עכברים עם שבץ גדול לשרוד מעבר לשלב B קריטי ולהראות ליקויים נוירולוגיים משמעותיים. הנתונים שלנו מראים שהשימוש הסטנדרטי ב-fESS מזהה ומכמת הן ליקויים הנגרמים על-ידי fMCAo והן שיפור ספונטני בעכברים (איור 4b), וביצועיו עולים או תואמים סולמות קודמים כמו Neuroscore (NS) מוקדי, mNSS וסולמות Bederson (BE) 9,10,12,14. למרות שלא ניתן להשוות סטטיסטית באופן ישיר, fESS מראה רגישות דומה או גבוהה יותר בשלב החריף, לוכד שיפור נוירולוגי ספונטני לאחר fMCAo, ונשאר רגיש לגירעון עד 6 חודשים לאחר שבץ, בהשוואה לסולמות האחרים. זה תומך בשימוש בניקוד תרגומי ורגיש לאחר לחיצת עכבר ופרוטוקול הווידאו הנוכחי מבטיח אובייקטיביות ניקוד מוגברת.

בנוסף ל- fESS, בדיקות שלב הסולם והצילינדר יכולות להשלים ניקוד וניטור נוירולוגיים ארוכי טווח על ידי כימות פרזיס של הגפיים הקדמיות והאחוריות. כל בדיקה דורשת כ-5-7 דקות לכל בעל חיים לרכישת וידאו ו-5-15 דקות לניתוח וידאו ידני. התוצאות המייצגות הן נפילות גפיים מוגברות בין השלבים כאשר העכבר הולך במבחן שלב הסולם (וכתוצאה מכך צידיות % ימין לשבץ שמאלי), ונגיעה "מועדפת" בקיר עם הגפה השמאלית הקדמית הבריאה לבדיקת צילינדר (וכתוצאה מכך צידיות % שמאלית לשבץ שמאלי). הנתונים המייצגים שלנו עבור קבוצת 6 החודשים מראים כי בדיקת שלב הסולם יכולה לזהות פרזיס של הגפיים הקדמיות בשלב החריף / תת-חריף אך מאבדת את רגישותה עקב שיפור ספונטני לאחר מכן (איור 4c, p<0.05 עבור זמן ו- p<0.01 עבור הבדל קבוצתי, מודל אפקטים מעורבים), אולם נותרה חזקה יותר בזיהוי וכימות פרזיס של הגפיים האחוריות למשך עד 6 חודשים (איור 4dp<0.05 עבור הפרש קבוצות, מודל אפקטים מעורבים)., במקביל, בדיקת הצילינדר שומרת על רגישות מצוינת בגילוי פרזיס של הגפיים הקדמיות עד 6 חודשים לאחר fMCAo (איור 4e, p<0.001 עבור הבדל קבוצתי, מודל אפקטים מעורבים). יחד, שתי הבדיקות מזהות, מכמתות ומנטרות ביעילות פרזיס ארוך טווח של הגפיים הקדמיות והאחוריות.

איור 1. פרוטוקול תמיכה ב-mSU לאחר fMCAo. (A) כלים וחומרים המשמשים עבור mSU. (B) כתישה של מזון רגיל (עם בלנדר מזון או מכשיר אחר) והפיכת הג'ל-פוד לתמיכה אקטיבית (עם מזרק) ופסיבית (צלחת פטרי). (ג) יש להניח (ולהחליף כדורי ג'ל ומוצק) בכלוב של בעלי החיים מספר ימים לפני (ללינה) ואחרי fMCAo; צפוי כי בעלי החיים יסתירו את מזון הג'ל מתחת למצעים. (D) אחיזה פעילה להזנת מזרקים (חיצים אדומים מצביעים על ייצוב לחי שמאל עם אצבעות, ראש חץ מצביע על אחיזת פרווה). (E) החדרת מזרק לפה, המצביע על לחי ימין (חץ). (F) תצוגה של מדידת טמפרטורת פני הגוף (אזור אדום ונקודת חץ במרכז גוף הגחון למדידת טמפרטורה). (G) פקק שופכה (חץ). (H) ציר זמן מוצע לניסויי שבץ כרוני בתמיכת mSU (bsl: baseline, h: hours, d: days and m: months as evaluat timepoints), עם ניקוד מוצע באמצעות מבחני ESS, Ladder-rung ו-Cylinder. ציר זמן זה שימש כאן עבור עוקבות 1 (מעקב של 6 מטר) ו- 2 (מעקב של 14D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2. סולם שבץ ניסיוני. (A) כלים לבדיקת ESS, (B) פרוסות מוח מייצגות עם שבץ (חצי שמאלי, כתם ניסל) והחפיפה המקבילה שלהן למפת אלן מוח המתאימה, בברגמה +1.0 ו-0.3- מ"מ קדמית (איור זה שונה מאטלס המוח של אלן מאוס, mouse.brain-map.org ו-atlas.brain-map.org)³⁰. (C) מתלה בעל חיים על ידי בסיס זנבו לבדיקות סימטריה של הגפיים הקדמיות, האחוריות והגזע של fESS, עיגולים מנוקדים אפורים מראים סימטריה תקינה של הגפיים הקדמיות והאחוריות. (D) אסימטריה ברורה של הגפה האחורית הימנית הפארטית (מיקום/הרחבה אסימטרית). (E) מיקום תקין של בעל חיים על הקורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3. הגדרת בדיקות סולם וצילינדרים. (A) התקנה של בדיקת צילינדר, עכבר נמצא בתוך הצילינדר בעוד מראות אנכיות מאפשרות מבט של 360° על הגפיים הקדמיות שלו. (B) מבט מקרוב על בעל החיים עם מגע (שימוש) של הגפה הקדמית השמאלית עם דופן הגליל. (ג) להציג ולתכנן פרטים של בדיקת שלב הסולם לעכברים (ראה גם טקסט למידות והוראות בנייה); (C1) מראה עכבר רגיל במסדרון שלב הסולם מלמעלה, (C2) מראה עכבר רגיל עם דריכה נכונה על השלבים (ללא נפילות), (C3) מראה נפילה של גפה קדמית בין השלבים (התמונות מצולמות מסרטונים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4. הישרדות לטווח ארוך וליקויים נוירולוגיים לאחר fMCAo. (A) שכפול יעילות mSU בשתי קבוצות חיות עצמאיות: בראשונה נצפו העכברים במשך 6 חודשים ובשנייה נצפו בעלי חיים במשך 14 יום לאחר שבץ. (B) עשרות סולמות נוירולוגיים שונים, מבוססים היטב, עבור שתי הקבוצות. (C) ליקויים מוטוריים קדמיים ו-(D) בגפיים האחוריות של צד ימין (= צעדים שגויים מימין לשמאל, עבור הגפיים הקדמיות והאחוריות בהתאמה) שזוהו במבחן סולם בקבוצת בעלי החיים שלנו שנמשכה 6 חודשים, לעומת בעלי חיים המופעלים על ידי דמה. (E) תוצאות אסימטריה בפורלימב (כהעדפת % לשימוש בגפה הקדמית השמאלית הבריאה) שזוהו על ידי בדיקת גליל בקבוצת בעלי החיים שלנו בת 6 חודשים, לעומת בעלי חיים המופעלים על ידי דמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1. ממשק תוכנה: דוגמה של 3 בעלי חיים עם החישוב היומי שלהם של ציוני RSS. פעולות ו- RSS חלים על שלבים B ו- C. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

איור משלים S1. הגדרת ציון ריבוד הסיכון היומי (RSS) ופעולות התמיכה הנובעות מכך עבור כל בעל חיים. בעלי חיים עם ציונים 0-1 נמצאים בסיכון תמותה מינימלי ואילו בעלי חיים עם 5-6 סיכון מקסימלי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1. תבנית מוצעת לניטור ותיעוד בעלי חיים במהלך פעולת fMCAo ומעקב mSU. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2. גיליון ניקוד מוצע עבור ESS מוקד וכללי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

הפרוטוקול הנוכחי הוא מדריך מקיף לפרוטוקול התמיכה ב-mSU, שנועד להפחית תמותה מלאכותית בין ימים 3-10 בעכברים שהיו נתונים לשבץ טריטוריאלי גדול על ידי מודל fMCAo¹³. בנוסף, הפרוטוקול הנוכחי כולל מדריך וידאו סטנדרטי עבור המרכיב המוקדי של סולם ESS (fESS) כדי להפחית את הסובייקטיביות המורחבת וההטיה של ניקוד מוקד נוירולוגי בעכברים לאחר שבץ. לצד זאת, אנו מציגים את מבחן שלב הסולם לכימות ליקויים מוטוריים קדמיים ואחוריים ארוכי טווח (עד 6 חודשים).

mSU הוא ידידותי למשתמש ויעיל. פרוטוקול בעזרת וידאו שלנו מבהיר mSU ליישום גם עבור חוקרים שאינם מנוסים. שלושת השלבים של mSU (כלומר שלב A, B ו-C, ראה סעיף 1 של הפרוטוקול לעיל ואיור 1h) מוגדרים אמפירית להתאמת אמצעי ההערכה והתמיכה. mSU מתאימה את ההתערבויות שלה מדי יום בהתאם לכל שלב ובהתאם לציון ריבוד הסיכון (RSS) של כל עכבר. ציון זה משקף את חומרתו הקלינית, נותן הערכה לסיכון האמיתי שלו לתמותה, ומנחה את התמיכה המותאמת לו לכל עכבר. משלים לכך, עצם התצפית הקלינית על בעל החיים צריכה תמיד להוסיף מידע לתמיכה מותאמת ב- mSU. בסופו של דבר, mSU מיישמת באופן תרגומי רכיבי מפתח של תמיכה ביחידת שבץ אנושי (SU), כולל בקרת טמפרטורה, איזון נוזלים, מניעה/טיפול בזיהומים, תמיכה תזונתית ונורמה ^1,2,7, במהלך השלב הקריטי של 3-10 הימים הראשונים שלאחר fMCAo בעכברים¹³. חשוב לציין, היעילות של mSU להפחית את התמותה המלאכותית מ 60-90% עד <15% ^13,31 שוחזרה בהצלחה בקבוצות מחקר עצמאיות 17,18,32,33.

מספר שלבים קריטיים חיוניים להצלחת פרוטוקול mSU. ראשית, בעוד mSU מסתמך על תצפית קלינית צמודה ותמיכה אופטימלית בבעלי חיים, רצוי שיהיה צוות של לפחות שני חוקרים העובדים במשמרות כדי להפחית את עומס העבודה, אם כי חוקר אחד יכול גם לנהל את זה לבד. שנית, נקודות הזמן הקריטיות ביותר לתמיכה הן בסביבות השעה 22:00 והשעה 08:00, המקבילות לתחילת וסוף פעילות העכברים הלילית, כאשר דרישות האנרגיה גבוהות יותר 13,22,23. שלישית, בהתאם להנחיות הנוכחיות לשבץ קליני⁷, תוספת גלוקוז צריכה להיות מותאמת בקפידה ומינימלית כדי למנוע היפרגליקמיה נוירוטוקסית לאחר שבץ. רביעית, האכלה פעילה צריכה להתבצע בבלוקים של 5-10 בעלי חיים הנותנים פה של 40-60μl בשלבים, כדי לאזן עומס עבודה מופחת עם האכלה יעילה. לבסוף, יש להתאים את עוצמת mSU לצרכים של כל עכבר ולציון RSS, בהתבסס על חומרת שבץ. משמעות מעשית זו היא שעכברים עם שבץ קטן עשויים להזדקק לתמיכה קצרה יותר ואינטנסיבית פחות, בעוד שאלו עם שבץ גדול יותר עשויים להזדקק לתמיכה אפילו מעבר ליום ה -14 כדי להפחית את הסיכון למוות.

הניקוד הנוירולוגי בעכברים תמיד היה סובייקטיבי ומאתגר מאוד בשל גודלם הקטן והקושי שלהם לזהות ליקויים. בשל אלה, כל סולמות השבץ הקודמים (BS, mBS, LS, mNSS, GS, NS, ראה גם מבוא) מזהים סימנים גסים (למשל, סולמות 3 עד 5 נקודות של BS, mBS ו- LS), מערבבים מוקד עם סימפטומים כלליים לאחר שבץ (למשל, NS), נכשלים ללכוד גירעונות עדינים מעבר לשלב החריף של שבץ ^8,9 (למשל, 3 נקודות BS ¹⁰, 5 נקודות mBS ¹¹ או 5 נקודות LS⁶), או לא מצליחים לכמת שיפור ספונטני לטווח ארוך לאחר שבץ. כדי לשפר את כל אלה, פיתחנו^{בעבר 13} את ה-ESS (fESS/gESS) על-ידי שילוב ביקורתי או השמטה של רכיבים מסולמות קודמים, ויצרנו כלי המסוגל להעריך אזורים מושפעים בדרך כלל על-ידי מודל fMCAo²⁰ (איור 2b). כעת, אנו מספקים גם את תקינת הווידאו הראשונה של fESS כדי להציע הדרכה חזותית ולפתור את המגבלה ארוכת השנים של סובייקטיביות בקרב מעבדות וחוקרים. הנתונים שלנו תומכים בכך שה-fESS עולה בביצועיו על סולמות mBS ו-mNSS או שווה ל-NS (איור 4b) בזיהוי ליקויים מוקדיים הקשורים לשבץ בעכברים, תוך לכידת ההתאוששות הספונטנית המתמשכת לטווח ארוך לאחר שבץ. תקינת הווידאו שסופקה משמשת כעת ככלי אימון אמין להערכה עקבית של ליקויים לאחר שבץ.

כהשלמה ל- fESS, אנו ממליצים להשתמש במבחן שלב הסולם ובמבחן צילינדר¹⁵ שתואר קודם לכן כסוללה של בדיקות לכימות פרזיס של הגפיים הקדמיות והגפיים האחוריות או שיפורים מתאימים בטווח הארוך (עד 6 חודשים). עבור ניתוח גפיים תוך בעלי חיים, יש צורך בהערכות בסיסיות עבור שתי הבדיקות. מבחן שלב הסולם, ששימש בעבר בחולדות ^34,35, הותאם ותואר כאן לעכברים. מעשית, הבדיקה תלויה באופן קריטי בדפוס הליכה יציב במסדרון השלבים, ללא פניות או עצירות. לשם כך, אנו ממליצים לנתח את הריצה השנייה בכל נקודת זמן, מכיוון שהיא בדרך כלל מניבה את טפח ההליכה היציב ביותר. אימון נכון ללא התרגלות הוא חיוני לתוצאות אמינות, כפי שמתואר בפרוטוקול לעיל. מגבלה הן של בדיקות שלב הסולם והן של בדיקות הצילינדר היא שעכברים עם שבץ גדול עשויים שלא לזוז כלל במהלך שלב A-B (ימים 3 ו-7 באיור 4c-e), ובכך לא לספק נתונים ולהגדיל את השונות; עכברים אלה מראים לעתים קרובות שלבי תקלה מקסימליים במהלך שלב C. כדי להתגבר על מגבלה זו ולמזער את הלחץ של בעלי החיים אנו מציעים לבדוק עכברים מסוף שלב B ואילך (למשל, > יום 10). מגבלה נוספת היא העובדה שנראה כי בדיקת סולם מאבדת את רגישותה לליקויים בגפיים הקדמיות, אך על כך מפצה מבחן הצילינדר. בסופו של דבר, בדיקות אלה יחד יכולות לכמת באופן אובייקטיבי הן את הגירעונות הקדמיים והן את השיפור הספונטני ארוך הטווח שלהם.

לסיכום, אנו ממליצים על mSU כסטנדרט לטיפול במודלים של משיכת עכבר תרגומית. יחד עם זאת, אנו ממליצים על בדיקת ESS (fESS/gESS), בדיקת שלב סולם ובדיקת צילינדר כסוללה פשוטה, חסכונית בזמן, חסכונית ורגישה כמותית לכימות ליקויים ארוכי טווח של שבץ מוחי בעכברים. בסופו של דבר, mSU יכול להיות מיושם בעתיד בכל מודל עכבר אחר המשלב נגעים מוחיים חמורים (למשל פגיעה מוחית טראומטית, מודלים של דימומים מוחיים וכו '), שבו יש צורך בתמיכה אינטנסיבית, קלינית תרגומית, בעכבר.

אין גילויים לדווח.

ברצוננו להודות לניקולאוס פלקופיטיס וליואניס טטסידיס על התמיכה הכירורגית רבת הערך במהלך חלקים מהמחקר.